Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung der hohen Spezifität Ionenaustausch-Chromatographie mit Multiwinkel Lichtstreuung für eine genaue molare Masse Bestimmung von Proteinen, Protein-komplexe und Peptide in einer heterogenen Stichprobe. Diese Methode ist wertvoll für die Qualitätsbewertung, sowie für die Charakterisierung der native Oligomere, kostenlos Varianten und gemischt Proteinproben.
Abstract
Ionenaustausch Chromatographie mit Multiwinkel Lichtstreuung (IEX-MALS) ist eine leistungsfähige Methode für die Trennung von Eiweiß und Charakterisierung. Die Kombination der hohen Spezifität Trenntechnik IEX mit der molaren Masse Analyse durch MALS erreicht ermöglicht die Charakterisierung von heterogenen Proteinproben, einschließlich Mischungen von Oligomeren Formen oder Protein Populationen, auch bei sehr ähnlichen Molaren Massen. Daher bietet ein zusätzliches Maß an Protein Charakterisierung IEX-MALS und ist eine Ergänzung zu den standard Größe-Ausschluss-Chromatographie mit Multiwinkel Lichtstreuung (SEC-MALS) Technik.
Hier beschreiben wir ein Protokoll für eine grundlegende IEX-MALS zu experimentieren und demonstrieren diese Methode auf bovine Serum Albumin (BSA). IEX trennt BSA zu seinen Oligomeren Formen erlauben eine molare Masse Analyse von MALS der einzelnen Formulare. Optimierung der IEX-MALS Experiment ist auch vorgestellt und demonstriert auf BSA, hervorragende Trennung zwischen BSA Monomere und größeren Oligomere zu erreichen. IEX-MALS ist eine wertvolle Technik zur Beurteilung der Protein-Qualität, da es bietet feine Trennung und molare Masse Bestimmung mehrere Protein-Arten, die in einer Probe vorhanden sind.
Introduction
Quantitative Charakterisierung von Protein-Produkte ist von zunehmender Bedeutung als Mittel der Qualitätskontrolle (QC), beide für regulatorische Zwecke in der biopharmazeutischen Industrie und zur Gewährleistung der Zuverlässigkeit und Integrität der Life-Science Forschung1 , 2. wie beschrieben auf den Webseiten der Protein-Netzwerke Proteinproduktion und Reinigung Partnerschaft in Europa (P4EU) und der Association of Resources für biophysikalische Forschung in Europa und molekulare Biophysik in Europa (ARBRE-MOBIEU) (https://p4eu.org/protein-quality-standard-pqs und https://arbre-mobieu.eu/guidelines-on-protein-quality-control, beziehungsweise), Protein QC muss nicht nur die Reinheit der das Endprodukt, aber auch den Oligomeren Zustand, Homogenität, Identität, charakterisieren Konformation, Struktur, posttranslationale Modifikationen und andere Eigenschaften3,4.
Eines der häufigsten QC Charakterisierungsmethoden ist SEC-MALS. Bei dieser Methode wird eine Trennsäule SEC, MALS und photometrische und refractometric Detektoren, ermöglicht präzise Messungen der Protein molare Masse jeder Peak5gekoppelt. SEC-MALS bestimmt die molare Masse der eluierten Gipfel unabhängig von der Elution Lautstärke und überwindet die Ungenauigkeit der analytischen SEC mit Spalte Kalibrierung. Der Zusatz von ein dynamisches-Lichtstreuung (DLS) Modul fügt Größe Messkapazitäten hydrodynamischen Radius Bestimmung ermöglicht. In der akademischen Forschung, SEC-MALS dient in der Regel zur Bestimmung der Oligomeren stand seine Konformation, ein Protein, das Niveau der Reinheit, der Aggregation und modifizierte Proteine, wie z.B. Glykoproteine oder Lipid solubilisiert Membranproteine (bestimmen der molare Masse des Proteins und die Komponenten einzeln konjugieren)6,7,8.
In vielen Fällen das endgültige Protein ein Reinigungsprozess ist kein gut-definierten Molekülsorten sondern eher umfasst einige Heterogenität. Die Proteine in solch eine Mischung können in Bezug auf die Struktur (z. B. verschiedene Formen Oligomere), Konformationen oder Protein Isoformen variiert werden. Protein Heterogenität kann auch eine Folge der kleine chemische Unterschiede verursacht durch C-terminale Lysin Verarbeitung oder Asparagin/Glutamin Deamination, führt zu Variation9,10kostenlos sein. Unterschiede in posttranslationale Modifikationen wie Glykosylierung können auch zu heterogenen Proben mit kostenlos Variationen9führen. Diese verschiedenen Arten von Heterogenität spiegelt sich in das Protein biophysikalischen Eigenschaften und können Auswirkungen auf die Stabilität und die biologische Aktivität von der Ziel-Protein-11.
Zuverlässige Qualitätskontrolle Assays solcher heterogener Proben erfordern eine hoch auflösende analytischen Trennung Technik. Es gibt Fälle, wo gute Trennung angefochten werden kann, um mit analytischen SEC-Säulen, aufgrund ihrer begrenzten Auflösung und Trennung Fähigkeiten12, wodurch fehlerhafte SEC-MALS Analyse zu erreichen. Kombiniert eine hohe Spezifität Trenntechnik wie IEX mit MALS kann die Einschränkung der SEC-MALS in heterogene Proben überwinden und eine ergänzende Methode zur Charakterisierung von Protein (Tabelle 1 in Amartely Et Al.12) geben. Im Gegensatz zu SEC, die Makromoleküle durch ihre hydrodynamischen Größe13trennt, trennt IEX Makromoleküle durch die Oberflächenladung14. Anion Austausch (AIEX) und Kationenaustausch (CIEX) Matrizen Bind Rechnung negativ und positiv Varianten, beziehungsweise. Mit einer feinen Trennung zwischen Protein-Populationen, die eine relativ enge Masse oder Form Teilen bestimmt IEX-MALS erfolgreich die molare Masse jedes einzelne Protein-Staates in einem Gemisch Probe12.
Hier präsentieren wir ein standard-Protokoll für die Ausführung von IEX-MALS Experiment für die Trennung und Analyse von BSA Oligomere Formen, die vorhanden sind in der gleichen Probe. Die Wahl einer IEX-Spalte für ein bestimmtes Protein ist wichtig und diskutiert, sowie die pH und Leitfähigkeit Bedingungen der Puffer. Die Analyse der IEX-MALS experimentellen Daten wird auch Schritt für Schritt beschrieben. Obwohl die Trennung von BSA Oligomere gut und ausreichend im SEC-MALS, ist BSA ein gutes Beispiel, die IEX-MALS-Fähigkeiten zu zeigen und um die Optimierung eines Experiments zu demonstrieren. Beispiele für schlechte Trennung durch die SEC-MALS und saubere Trennung und Analyse von IEX-MALS aktiviert werden in einer früheren Studie12diskutiert.
Protocol
1. Vorbereitung des Systems
- Installieren Sie die schnellen Protein Flüssigkeitschromatographie (FPLC) System und MALS/refractive Index (RI)-Detektoren (siehe Tabelle der Materialien) zusammen mit ihrer jeweiligen Software-Pakete für Steuerung, Datenerfassung und Analyse pro Hersteller Anweisungen.
- MALS und RI Detektoren stromabwärts von der FPLC UV- und Leitfähigkeit Detektoren zu verbinden. Den pH-Detektor zu umgehen, es sei denn, es absolut notwendig für pH Gradienten ist, um das interdetector Volumen zwischen den UV- und MALS Detektoren zu minimieren. Verwenden Sie Kapillare Schläuche von 0,25 – 0,5 mm Innendurchmesser (ID) zwischen der Spalte und Detektoren und 0,75 mm i.d. Kapillare Schläuche am Ausgang des RI-Detektor an den Abfall oder Bruchteil Sammler.
- Stellen Sie sicher, dass die notwendige Signal-Verbindungen zwischen der FPLC und Detektoren hergestellt wurden, einschließlich einer UV-Analogausgang vom FPLC Melder an die MALS Aux-Eingang und digitalen Ausgang aus der FPLC zum MALS Autoinject In, über die i/o-Box.
2. Vorbereitung der Probe und Puffer
- Filtern Sie alle Reagenzien, einschließlich die Wasch- und Elution Puffer mit einem 0,1 µm-Filter. Filtern Sie die ersten 50 – 100 mL Puffer in einer Abfallflasche zu, um Partikel von den trockenen Filtern zu beseitigen, und halten Sie den Rest des Puffers in eine saubere, sterile Flasche, die mit gefilterten Wasser gründlich gewaschen wurde und verschlossen, um Eindringen von Staub zu verhindern.
- Stellen Sie eine BSA-Probe zu einem pH und der Ionenstärke (z.B., pH = 8, 50 mM NaCl), mit denen Bindung an der IEX Spalte während der Verdünnung, Ultrafiltration oder Puffer-Wechsel-Verfahren.
Hinweis: Es empfiehlt sich, die Protein-Probe auf die kleinste Porengröße Vorfiltern, die nicht das Material des Interesses zu entfernen (0,02 – 0,1 µm). Alternativ kann die Probe mit hoher Geschwindigkeit (13.000-16.000 X g) für 10 min ermöglichen die Ausfällung von großen Partikeln zentrifugiert werden. - Bereiten Sie mindestens 0,3 – 0,5 mg des BSA (siehe Tabelle der Materialien), in einer Spalte 1 mL (5/50 mm) für das Erreichen einer guten MALS Analysis zu injizieren. Beachten Sie, dass das Volumen der Injektion unbegrenzt ist.
3. Wahl und Entwicklung einer IEX-Methode für ein protein
- Berechnen Sie den isoelektrischen Punkt (pI) des Proteins basierend auf der primären Sequenz, für welche, die Server wie Protparam-Tool auf der ExPASy Website verwendeten15sein kann. Beachten Sie, dass die pI BSA 5.8.
- Wählen Sie die Spalte Typ und Buffer-Parameter.
- Verwenden Sie verschiedene Puffer für AIEX und CIEX, abhängig von der pKein des Puffers und die ionische Natur des Puffers. Verwenden Sie kationischen Puffer, wenn die AIEX Spalte und anionischen Puffer ausgeführt, wenn die CIEX-Spalte mit kleinen Gegenionen ausgeführt. Verwenden Sie in diesem Beispiel 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8, für die Analyse der BSA auf eine Spalte AIEX.
- Verwenden Sie für ein Protein mit einem pI niedriger als 7, wie BSA eine AIEX Spalte und Puffer mit einem pH-Wert höher als die pI durch mindestens zwei Einheiten. Verwenden Sie für ein Protein mit einem pI höher als 7 eine CIEX Spalte und Puffer mit einem pH Wert niedriger als der Protein-pI von mindestens zwei Einheiten.
- Optimieren Sie den Puffer pH-Wert nach der Stärke der Bindung zwischen dem Protein und die Spalte Matrix. Wenn ein Protein nicht gut auf die Spalte bindet, benutzen Sie einen pH weiter von der pI. Stellen Sie sicher, dass das Protein mit der verwendeten pH-Wert stabil ist.
- Verwenden Sie eine niedrige Salzkonzentration in der Bindung und waschen Sie die Puffer um Bindung des Proteins in der Matrix zu ermöglichen, da Proteinbindung hängt von der Ionenstärke der Probe geladen. Proteine benötigen in der Regel etwas Salz für ihre Stabilität; Verwenden Sie daher 50 mM NaCl (oder alternative Salz), während der Protein-Loading und Spalte-Wasch-Schritte.
- Verwenden Sie für Elution Puffer maximal 0,5 M NaCl, um das Protein aus der Spalte zu lösen.
Hinweis: Höhere Salzkonzentrationen sind nicht empfohlen, bei der Arbeit mit dem Standard-Modell RI Refraktometer aufgrund der Bandbreite Begrenzung des Instruments. Jedoch ein hoher Konzentration-Modell kann benutzt werden und wird für 2 M NaCl.
- Führen Sie eine erste Methode folgendermaßen.
- Laden 1 mg BSA (170 µL von 6 mg/mL) in einen Puffer beladen mit 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8, ~0.5 mL enthält 50 mM NaCl. Waschen Sie die Spalte mit dem gleichen Puffer für eine 10 – 15 Spalte Volumen (CV) ermöglicht die vollständige Elution der ungebundenen Moleküle und Partikel aus dem System bis die Lichtstreuung (LS), UV, und RI-Signale sind voll stabilisiert.
- Führen Sie eine kurze, lineare Salz Steigung von 20 – 30 CV, mit Elution Puffer von 20 mM Tris-HCl, pH 8, enthält 0,5 M NaCl um das Protein aus der Spalte zu entfernen. Führen Sie ein Gefälle von 0 – 100 % (oder alternative weit verbreiteten Neigung) des Puffers Elution oder teilen Sie es zwei Gradienten: 0 % – 50 % der Elution Buffer gefolgt von einer weiteren Steigung von 50 – 100 % der Elution Buffer, jeder Verlauf für 10 – 20 CV. Verwenden Sie für BSA, eine weit verbreiteten Steigung von 15 % – 70 % für 30 CV für die erste Methode.
Hinweis: In einigen Fällen die erste Methode kann Trennung für eine zuverlässige Analyse von MALS, und zusätzliche Abfahrten sind nicht notwendig. In vielen Fällen enthält die ursprüngliche Methode nur Anleitungen für weitere Methode Optimierung.
- Die IEX-Methode, um die Auflösung zu erhöhen und verbessern die Peak-Trennung, indem verschiedene Parameter zu optimieren.
- Ändern Sie die gradient Steigung und Länge. Kurze Steigungen mit hohen Hänge bieten intensive Gipfel mit weniger Trennung während lange Steigungen mit leichten Steigungen niedrigeren Gipfel mit bessere Trennung bieten. Finden Sie das Gleichgewicht zwischen Auflösung und Signal Peak-Intensität für optimale MALS Analyse.
Hinweis: Laden eine größere Menge an Protein kann LS, UV, erhöhen und RI Signale tut dies aber auf Kosten der Auflösung. - Verwenden Sie eine schrittweise Salzkonzentration Profil für die Elution. Denken Sie daran, dass eine Kombination von Schritten und linearen Farbverlauf allgemein verwendet ist.
- Verringern Sie den Durchfluss um Gipfel Trennung zu verbessern.
Hinweis: Für Matrizen mit sehr kleinen Partikeln ist dies nicht sehr bedeutend. - Ändern Sie den Puffer pH-Wert um erhöhen die Ladung Variation zwischen den Protein-Populationen in der Probe und die Trennung zwischen diesen Varianten. Beachten Sie, dass Proteine, die bei einem pH nicht ordnungsgemäß getrennt sind bei verschiedenen pH-Werten getrennt werden können.
- Benutzen Sie einen pH Steigung, linear oder schrittweise, Proteine aus der Spalte "IEX" lösen. Verwenden Sie Elution Steigungen, die pH-Wert und Salzgehalt Variationen bei Bedarf verbinden.
- Verwenden Sie stärkere Salzen, z. B. MgCl2oder schwächeren Salze wie Natriumacetat, um Empfindlichkeit und Auflösung16zu erhöhen.
- Verwenden Sie längere IEX Spalten oder eine andere Spalte Matrix mit kleineren Partikeln, um Trennung Fähigkeiten zu verbessern.
- Ändern Sie den Typ der Spalte (AIEX/CIEX), ein anderes Muster der Trennung zu bieten. Beachten Sie, dass Matrizen mit starken, schwachen oder kombiniert (mixed-Mode-) Liganden ebenfalls erhältlich sind und können die Auflösung von einigen Proben verbessern.
- Verwenden Sie eine Spalte von einem anderen Hersteller mit den gleichen Liganden, der die andere Matrix Harze zugeordnet ist. Das Harz selbst, unabhängig von den Liganden kann anders mit den Proteinen zu interagieren und beeinflussen die Trennung Profil.
- Enthalten Sie Zusatzstoffe (Moleküle, die das Protein in der Lösung zu stabilisieren) in den Puffern zur Verbesserung Proteinstabilität und Vermeidung Proteinaggregation, Verbesserung der IEX-Experiment.
Hinweis: Beispiele für solche Zusatzstoffe sind Zucker, Alkohole, Harnstoff, nichtionische oder auch Reinigungsmittel und chaotropen und Kosmotropic Salze17,18.
- Ändern Sie die gradient Steigung und Länge. Kurze Steigungen mit hohen Hänge bieten intensive Gipfel mit weniger Trennung während lange Steigungen mit leichten Steigungen niedrigeren Gipfel mit bessere Trennung bieten. Finden Sie das Gleichgewicht zwischen Auflösung und Signal Peak-Intensität für optimale MALS Analyse.
(4) IEX-MALS experimentieren
- Öffnen Sie New\Experiment Methode in MALS-Software und wählen Sie die Online- Methode aus dem Systemordner Methoden Lichtstreuung . Das DLS-Modul ist erhältlich und DLS Daten sollen erworben werden, wählen Sie die Online- Methode aus dem Licht Scattering\With QELS -Unterordner.
- Legen Sie die Parameter des Laufs unter dem Abschnitt " Konfiguration ".
- Legen Sie die Durchflussmenge des Laufs im Abschnitt Allgemeine Pumpe um die Durchflussmenge in FPLC (1,5 mL/min), verwendet und geben Sie ein oder überprüfen Sie die Puffer-Parameter im Abschnitt Lösungsmittel .
- Geben Sie den Proteinnamen (BSA), Brechungsindex Inkrement (dn/dc; der Standard Wert für Proteine ist 0,185 mL/g), UV-Aussterben-Koeffizient bei der Wellenlänge von 280 nm (0,66 g/L-1·cm-1) und die Konzentration des Proteins Samples (6 mg/mL) in der Sample -Sektion unter dem Injektor -Abschnitt. Das Probenvolumen Injektionslösung (170 µL) sowie unter der gleichen Rubrik einfügen.
- In der Registerkarte " Basic-Kollektion " Abschnitt " Verfahren " aktivieren Sie das Kontrollkästchen Trigger auf Autoinject und die Dauer der Ausführung festlegen, sodass Datenerhebung für mindestens 5 min fortgesetzt wird, nachdem das Gefälle erreicht hat seine Endwert.
- Die Experiment-Parameter in der FPLC Software einstellen.
- Erstellen Sie ein neues Experiment in der Registerkarte " Method Editor ". Das erste Experiment werden einen linearen Farbverlauf von Salz oder pH (siehe Punkt 3.3). Für die optimierte Methode, erstellen einen spezifischeren Farbverlauf oder ein schrittweises Programm nach der Elution Ergebnisse während der ersten Methode (siehe Schritt 3.4 und Abb. 1). Gehören Sie ein Impulssignal in der Methode, die Datenerhebung in MALS Software auslösen wird.
- Waschen Sie die Spalte und Ventile mit den entsprechenden Puffer: 20 mM Tris-HCl, pH 8, mit 50 mM NaCl für die Wasch-Puffer (ein Ventil) und den gleichen Puffer mit 500 mM NaCl für die Elution Buffer (B Ventil). Stellen Sie sicher, dass die letzte Spalte Waschen den Bindung Puffer, mit einem niedrigen Salzgehalt, verwendet um die Bindung des Proteins in der Spalte Matrix zu ermöglichen. Verwenden Sie für eine massive Waschen stark gebundenen Verunreinigungen 0,5 M NaOH vor dem Waschen mit den entsprechenden Puffern, gefolgt von einer Neutralisierung Puffer waschen.
- Legen Sie die Protein-Probe in der Schleife mit einer Spritze. Wenn mehr als 10 mL der Probe geladen wird, verwenden Sie eine Superloop oder Pumpe-Ventil des Instruments FPLC unter Umgehung der Filterpumpe und dem Mischer der FPLC.
- Zuerst das Experiment in der MALS-Software durch Klicken auf die Schaltfläche " Ausführen " und dann in der FPLC Software. Daten werden nach Erhalt das Pulssignal vom FPLC Instrument über MALS Detektor erhoben.
- Gelten Sie die gleichen Parameter ausführen und Anweisungen in Schritten 4.1 – 4.4 beschrieben, wenn die IEX-MALS manuell mit einem kontinuierlichen Fluss-Modus statt einer Stand-alone-Methode ausgeführt wird.
- Sobald die letzte Methode verifiziert und ausgeführt wurde, führen Sie genau die gleiche Methode, die mit einem leeren Injektion (Beladung Puffer anstelle der Probe). Es ist wichtig, dass das Timing zwischen Autoinject Puls und dem Gefälle der leere Ausführung identisch mit der Probe laufen ist.
5. Analyse experimenteller Daten IEX-MALS
- Führen Sie die Analyse Schritt für Schritt unter Abschnitt Verfahren in MALS-Software. Die Basic-Kollektion -Ansicht zeigt die raw-Daten-Sammlung des Experiments.
- Verwenden Sie die Registerkarte " Despiking ", um die Chromatogramme zu glätten, wenn sie eine Menge Lärm aufweisen. Verwenden Sie normalerweise die normalen Niveau.
- Definieren Sie die Basis für alle Signale (alle LS, UV- und RI Detektoren) in der Baseline -Ansicht.
- Definieren Sie die Spitzen für die Analyse in der Gipfel -Ansicht. Überprüfen Sie die korrekten Werte für dn/dc und der UV-Aussterben-Koeffizient für das Protein unter jedem Gipfel.
Hinweis: Für Proteine, ist es üblich, ein standard RI Inkrementwert von 0,185 mL/g zu verwenden, aber für andere Makromoleküle sollte verschiedene dn/dc Werte verwendet werden, je nach Art des Moleküls. Die durchschnittliche dn/dc von Polynukleotide (DNA/RNA) ist 0,17 mL/g19, während Saccharide, wie Saccharose, eine durchschnittliche dn/dc-Wert 0,145 mL/g-20 und die dn/dc-Werte der Lipide und Waschmittel liegen zwischen 0,1 – 0,16 haben mL/g21. - Analysieren der molaren Masse und der Radius mit Formstück-Parameter und die Korrelationsfunktion unter der molaren Masse und Radius von LS und Rh aus QELS Ansichten.
- Die RI Signal ändert sich erheblich während der IEX-MALS laufen durch den Anstieg der Salzkonzentration. Daher, subtrahieren Sie die Grundlinie Signal aus der leere Injektion für Massenberechnungen, die RI-Daten benötigen.
- Öffnen Sie das Protein und die leere IEX-MALS Experimente. Mit der rechten Maustaste auf den Namen des Protein-Experiment, wählen Sie Methode anwenden, und wählen Sie den Basisplan Subtraktion -Ordner im Datei-Dialog. Wählen Sie die richtige Art der Methode (z. B. Online-) für die Standardanalyse der molaren Masse. Beachten Sie, dass die Parameter und Einstellungen definiert für das Protein-Experiment auf der neu eröffneten Methode gespeichert werden.
- Klicken Sie unter der Grundlinie Subtraktion Ansicht auf Importieren leer um die Signale von der leere Flucht zu importieren. Überprüfen Sie unter Instrumente (neben der Import leer -Taste) alle Detektoren zu subtrahieren.
- In der Gipfel -Ansicht die Werte dn/dc (falls erforderlich) durch die Leitfähigkeit der Lösung im Bereich Protein-Gipfel, da die RI der Lösung während der Laufzeit12geändert wird.
- Kalibrieren der IEX-MALS-System mit BSA Monomer.
Hinweis: Normalerweise, IEX-MALS-System ist in regelmäßigen Abständen kalibriert für Peak Ausrichtung, Band Erweiterung und Normalisierung der eckigen Detektoren an den 90°-Detektor mit einem monodispersen Protein mit einem Radius von Gyration (Rg) von < 10 nm, wie BSA Monomer. In diesem Beispiel BSA dient sowohl als Kalibrierung-Molekül und ist selbst der molaren Masse Analyse unterzogen.- Richten Sie die Gipfel, nach dem Verfahren > Konfigurationsansicht .
- Normalisierung unter die Normalisierung Ansicht Eingabe 3.0 durchführen nm als die R-g -Wert.
- Wählen Sie den Gipfel unter Band erweitert , in der gleichen Registerkarte " Konfiguration " und passen Sie die UV- und LS Signale an die RI-Signal, mit dem Button Ausführen passen .
- Die Grafik der Ergebnisse ist in der Ansicht Ergebnisse passend angezeigt. Ändern der Achse Skalen und andere Grafik-Parameter durch einen Rechtsklick auf das Diagramm, auswählen, Bearbeitenund anschließend auf die Schaltfläche " erweitert " klicken. Eine Grafik Figur mit mehr Display-Optionen gibt es auch in der Registerkarte " EASI-Graph ": Molare Masse von Anzeigen Dropdown-Menü am oberen Rand des Fensters auswählen.
- Beachten Sie, dass alle Ergebnisse, einschließlich der molaren Masse, Radius, Reinheitsgrad und andere, in der Berichtsansicht (Zusammenfassung oder detaillierte) unter dem Abschnitt " Ergebnisse " zur Verfügung stehen. Verwenden Sie die Schaltfläche " Report Designer " mehr Ergebnisse oder Parameter, sowie Zahlen, zu dem Bericht hinzufügen.
Representative Results
BSA ist ein gemeinsames Protein die Chromatographie zur Kalibrierung der experimentellen System22 verwendet und eignet sich hervorragend zum üben IEX-MALS sowie SEC-MALS. Es ist in erster Linie Monomere mit einer theoretischen Monomer Masse von 66,7 kDa und in der Regel enthält eine kleine Anzahl von Dimere und höhere Oligomere23.
BSA wurde analysiert, auf IEX-MALS mit einem Anion Austausch Trennsäule (siehe Tabelle der Materialien). Einem breiten linearen Farbverlauf bestehend aus 30 CV von 75 mM bis 350 mM NaCl BSA Monomere von getrennt die höhere Oligomere. Nachgeschalteten MALS Analyse führte in einer berechneten Monomer molare Masse von 66,8 ± 0,7 kDa und in eine berechnete Dimer molare Masse von 130 ± 5 kDa (Abb. 1A).
Basierend auf die Puffer Leitfähigkeit an der eluierten Peaks, die Steigung wurde geändert, um ein anderes Programm: ein langer Schritt von 175 mM NaCl gefolgt von einem linearen Farbverlauf von 175 mM bis 500 mM NaCl. Der neue Verlauf erheblich verbessert, die Auflösung und hervorragende Trennung zwischen BSA Monomer (mit einer berechneten molaren Masse von 66,1 ± 0,7 kDa) und seine höhere Oligomeren Arten (mit einer berechneten durchschnittlichen Masse von 132 ± 2 kDa) (Abbildung 1B). Um auch auf die hohen Oligomeren Arten konzentrieren und Molmassen von jede Oligomere Form der BSA zu berechnen, wurde eine schrittweise Programm von 200 mM und 250 mM NaCl angewendet. Dieses Experiment führte die hervorragende Trennung von BSA Monomer (mit einer berechneten Masse von 62,4 ± 0,4 kDa), Dimer (mit einer berechneten Masse von 130 ± 10 kDa) und Trimer (mit einer berechneten Masse von 170 ± 10 kDa) (Abbildung 1C). Alle IEX-MALS Experimente zeigen, dass BSA meist als ein Monomer mit einer Reinheit von 80 %, im Einvernehmen mit SEC-MALS Ergebnisse elutes wo BSA Monomere mit einer Reinheit von 85 %12eluieren.
Abbildung 1 : Optimierung der IEX-MALS Experiment für BSA. (A) IEX-MALS zu experimentieren von BSA mit einem Farbverlauf Programm von 75 bis 350 mM NaCl. (B) IEX-MALS zu experimentieren von BSA mit einem Programm eine 175 mM NaCl Schritt, gefolgt von einem linearen Farbverlauf Programm von 175 – 500 mM NaCl. (C) IEX-MALS zu experimentieren von BSA mit einem Schritt-Programm von 200 mM und 250 mM NaCl. Die Chromatogramme zeigen die UV bei 280 nm (blau), Lichtstreuung in einem 90° Winkel (rot), und der Brechungsindex (rosa) und die Leitfähigkeit (grau) Kurven zusammen mit der molaren Masse von jeder Gipfel von MALS (schwarz) berechnet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Discussion
IEX-MALS ist eine leistungsfähige Methode für Protein Trennung und Charakterisierung, die die genaue molare Masse Bestimmung der reine Proteine sowie ab heterogene Proben ermöglicht native Oligomere, nicht verwandte Aggregate, kovalente und nichtkovalente Charakterisierung komplexe und Conjugated Proteine. Eine Programm bestehend aus einem linearen Farbverlauf oder eine Reihe von Schritten Salzkonzentration kann erreichen eine gute Trennung der Protein-Populationen und genaue Analyse jedes einzelnen Peak durch die MALS. Eine weitere Optimierung durch Variation verschiedener Parameter wie Gefälle Hanglage (siehe Punkt 3.4 des Protokolls), durchgeführt werden kann, wenn eine höhere Auflösung erforderlich ist. IEX-MALS kann ein wertvolles Protein-Qualitätskontrolle-Assay, da es eine zusätzliche, wichtige Protein Charakterisierung, ergänzend zu anderen Methoden wie SEC-MALS bietet.
SEC-MALS eine Standard- und gemeinsame Technik zur Proteinbestimmung molare Masse ist, kann die relativ geringe Auflösung des analytischen SEC Standardschächte molare Masse Messgenauigkeit erreicht durch MALS12beschränken. Einige Beispiele für die Grenzen der SEC-MALS Lösungen, die in Folge Oligomere, hohe Ebenen der Aggregation enthalten, die nicht vollständig aus dem Monomer Peak und heterogene Populationen mit ähnlichen Molaren Massen, wie zum Beispiel modifizierte Proteine getrennt sind.
IEX ist eine komplexere Chromatographie-Methode zu entwerfen und durchzuführen als SEC, aber ein IEX-MALS Experiment gewonnene Informationen ergänzen und manchmal sogar mehr als SEC-MALS Analyse informativ sein. IEX-MALS hat erfolgreich Antikörper Varianten gekennzeichnet, die die gleiche molare Masse, Oligomere, die nicht vollständig getrennt sind auf SEC und kurze Peptide, die schwer teilen zu analysieren sind durch SEC12,24. Darüber hinaus können makromolekulare Versammlungen, die zu groß, um durch SEC, wie voll (mit viralen DNA) und leere Partikel Adeno-assoziierte Virus (AAV), getrennt werden durch IEX25 vor MALS Analyse gelöst werden. Im Vergleich zu SEC, IEX bietet vielfältigere Trennung Fähigkeiten14 und es hat die Flexibilität zur Anpassung verschiedener Parameter um Gipfel Auflösung, wie Puffer pH-Wert, Arten von Salz, Art und Länge der Spalte, und andere zu erhöhen. Im Gegensatz zu SEK, gibt es keine Volumenbegrenzung für Probeninjektion in IEX und jedes Molekül kann analysiert werden, unabhängig von seiner Größe (siehe Tabelle 1 in Amartely Et Al.12). Dies ist ein großer Vorteil der IEX-MALS, vor allem für Proben mit geringer Intensität LS wie sehr kleine Proteine oder verdünnten Proteine mit einer Tendenz zur Aggregation auf Konzentration. Da analytische IEX Säulen stabiler sind und neigen dazu, weniger Partikel als SEC-Säulen release, IEX-MALS sehr kurze Gleichgewichtherstellung Zeit erfordert und LS Signale sind sehr schnell stabilisiert. Dies ermöglicht den Betrieb der einzelnen Experimente wie beschrieben in diesem Protokoll und das Anhalten der Ausführung je nach Bedarf.
Im Gegensatz zu SEK, bietet die in der Regel gute Ergebnisse mit nur einem experiment (unter Verwendung einer Spalte mit der richtigen Fraktionierung), IEX erfordern mehrere Experimente, optimale Auflösung zu erreichen durch tuning die Methodenparameter. In IEX-MALS Experimente erfolgen, die mit einem Salz Gradienten, die Puffer-Leitfähigkeit und somit der RI dramatisch verändern während des Laufs mit daraus resultierenden Änderungen an den RI-Signal. Dies erfordert eine zusätzliche Leerzeichen für jedes IEX-MALS-Experiment und eine Analyse mit Grundlinie Subtraktion (wie im Schritt 5.2 des Protokolls beschrieben) ausgeführt werden, wenn die Konzentration-Analyse auf UV-Detektion (a-priori Kenntnisse des Aussterbens erfordern beschränkt Koeffizienten für jeden Peak). Die Analyse mit Grundlinie Subtraktion ist robust für lineare Verläufe, obwohl Weiterentwicklung der Methode für die erfolgreiche Grundlinie Subtraktion von Salz schrittweise Programme noch erforderlich ist. Die dn/dc-Werte für jede Spitze sollte nach der speziellen Puffer Leitfähigkeit auf dem eluierten Höhepunkt angepasst werden (Berechnungen finden Sie in der Literatur12). Wenn ein Protein in einer NaCl-Konzentration kleiner als 200 mM (wie im Beispiel BSA), diese Anpassung eluiert ist vernachlässigbar.
Die relativ große Menge an Protein in IEX-MALS (wie im Schritt 2.3 des Protokolls) im Vergleich zu SEC-MALS verwendet ist wichtig, den dramatischen Wandel verursacht durch das Salz Gefälle und die RI-Schwankungen durch unvollkommene Mischen von RI-Signal zu überwinden die Gradient Puffer. Wenn nur UV-Detektion für Massenmessung verwendet wird, können kleinere Mengen verwendet werden. Die Menge des Proteins zu injizieren hängt von der molaren Masse des Proteins, Homogenität und Reinheit der UV-Aussterben-Koeffizient. Die notwendige eingespritzte Masse sollte für kleinere Proteine höhere und niedrigere für größere Proteine (~ 1 mg für eine 20 kDa-Protein und ~0.2 mg für ein 150-kDa-Protein). Heterogene Proben erfordern Injektion mehr Probe, da die Menge zwischen verschiedenen Populationen aufgeteilt ist. Analytische Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) erfordern weniger Material als ein FPLC-System.
Inline-Analyse mit MALS während der Reinigung Verfahren wurde vor kurzem berichtet. Eine Echtzeit-Analyse ist sehr effizient für die Erkennung von Aggregation-Produkte, die auftreten, während der Reinigung und die Notwendigkeit für weitere Analysen des Proteins nach Reinigung26beseitigen können. IEX Chromatographie wird häufig als ein Zwischenprodukt Reinigungsstufe eingesetzt; so kann die Kombination von präparativen IEX Spalten mit MALS nicht nur als eine Methode der analytischen Charakterisierung sondern auch als eine Echtzeit-Analyse von großflächigen Reinigung Verfahren hilfreich sein. Nichtanalytische IEX Spalten sind auch stabil, mit einem niedrigen Grad der Freigabe von Teilchen und können daher mit MALS verwendet werden. Anderen Trennverfahren, wie Affinitätschromatographie oder hydrophoben Austausch-Chromatographie, kombinierbar auch mit MALS bei relativ reines Proben (zur Vermeidung von Kontaminationen von MALS und RI-Detektoren). Dies erfordert die Anpassung und Optimierung der Methode erhalten nicht nur gute Spitze Trennung aber auch ausreichend sauber LS und RI-Signale für eine erfolgreiche MALS-Analyse.
Disclosures
D.S. ist ein Mitarbeiter von Wyatt Technology Corporation, deren Produkte in diesem Protokoll genutzt werden. A.t. ist Angestellter der Danyel Biotech, ein Händler von Wyatt und ÄKTA Instrumente.
Acknowledgments
Die Autoren danken Dr. Tsafi Danieli (Wolfson Zentrum für angewandte strukturelle Biologie, Hebrew University) für ihre Beratung und Kooperationen. Die Autoren danken auch Danyel Biotech Ltd. (Rehovot, Israel) für die Unterstützung und Etablierung des Systems der analytischen FPLC-MALS in dieser Studie verwendet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ÄKTA pure | GE Healthcare | 29-0182-26 | FPLC |
| 0.02 µm Anotop Whatman Filter 10 mm | GE Healthcare | 6809-1002 | Sample Filter |
| 0.1 µm Anotop Whatman Filter 10 mm | GE Healthcare | 6809-1012 | Sample Filter |
| 0.1 µm Anotop Whatman Filter 25 mm | GE Healthcare | 6809-2012 | Mobile phase filter |
| BSA (purity >97%) | Sigma | A1900 | Bovine serum albumin |
| miniDAWN TREOS | Wyatt Technology | WTREOS | MALS |
| mono Q HR 5/50 GL | GE Healthcare | 17-5166-01 | Anion exchange analytical column |
| Optilab T-rEX | Wyatt Technology | WTREX | Refractometer |
| 0.1 mm PES 1000 mL Stericup | Millipore | SCVPU11RE | Mobile phase filter |
| Sodium chloride | Sigma | 71382 | HPLC grade NaCl |
| TRISMA base | Sigma | T-1503 | TRIS buffer |
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