Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

יונים כרומטוגרפיה (IEX) מצמידים מרובה זווית פיזור אור (MALS) עבור חלבון הפרדה ואפיון

Published: April 5, 2019 doi: 10.3791/59408
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Wolfson Centre for Applied Structural Biology, The Alexander Silberman Institute of Life Science, The Hebrew University of Jerusalem, 2Wyatt Technology Corporation, 3Danyel Biotech Ltd

Summary

פרוטוקול זה מתאר השימוש כרומטוגרפיה גבוהה-ירידה לפרטים-יונים עם פיזור אור רב זווית נחישות המוני טוחנת מדויק של חלבונים, חלבונים מתחמי פפטידים במדגם הטרוגנית. שיטה זו היא ערך להערכת איכות, כמו גם באשר אפיון oligomers מקורית, מטען גרסאות ודוגמאות מעורב-חלבון.

Abstract

כרומטוגרפיה יונים עם פיזור אור רב זווית (IEX-MALS) היא שיטה חזקה בשביל חלבון הפרדה ואפיון. השילוב של הטכניקה הפרדה גבוהה-ירידה לפרטים IEX בניתוח מדויק טוחנת המוני מושגת על-ידי MALS מאפשרת אפיון דגימות חלבון הטרוגנית, כולל תערובות של טפסים oligomeric או חלבון אוכלוסיות, בכלל עם מאוד ההמונים טוחנת דומה. לכן, IEX-MALS מספק רמה נוספת של חלבון אפיון, משלים כרומטוגרפיה הוצאת בגודל סטנדרטי עם טכניקת פיזור אור רב זווית (שניה-MALS).

כאן נתאר פרוטוקול IEX-MALS הבסיסית הניסוי, להדגים בשיטה זו על שור אלבומין (BSA). IEX מפריד BSA כדי צורותיה oligomeric המאפשר ניתוח המוני טוחנת מאת MALS של כל טופס בודדים. אופטימיזציה של ניסוי IEX-MALS הוא גם הציג, הפגינו על BSA, להשגת הפרדה מצוינת בין מונומרים BSA oligomers גדול יותר. IEX-MALS היא טכניקה חשוב להערכת איכות חלבון מאז שהיא מספקת ההפרדה בסדר והן טוחנת המוני קביעה של מספר מינים חלבון קיים במדגם.

Introduction

אפיון כמותי של מוצרי חלבון חיוני יותר ויותר כאמצעי בקרת איכות (QC), שניהם למטרות רגולציה בענף ביולוגיות וכדי להבטיח את אמינות ויושרה של מדעי החיים מחקר1 , 2. כפי שמתואר על האתרים של חלבונים רשתות ייצור החלבון ושותפות טיהור ב אירופה (P4EU), איגוד של משאבים עבור מחקר Biophysical באירופה, ביופיסיקה מולקולרית באירופה (ארברה-MOBIEU) (https://p4eu.org/protein-quality-standard-pqs ו- https://arbre-mobieu.eu/guidelines-on-protein-quality-control, בהתאמה), חלבון QC יש לאפיין לא רק את הטוהר של המוצר הסופי, אבל מצבו oligomeric גם, הומוגניות, זהות. קונפורמציה, מבנה, שינויים posttranslational ואחרים מאפיינים3,4.

אחת השיטות הנפוצות ביותר של אפיון QC היא שניה-MALS. בשיטה זו, טור שניה אנליטי רתומה MALS, גלאי spectrophotometric, refractometric, המאפשרים מדידות מדויקות של המסה טוחנת חלבון של כל שיא5 שניה-MALS קובע את המסה טוחנת פסגות eluted ללא תלות • תנאי האחסון, מתגבר על אי-הדיוק של ה-SEC אנליטי באמצעות כיול עמודה. התוספת של מודול דינאמי (DLS) אור-פיזור מוסיף יכולת המדידה בגודל המאפשר קביעת הרדיוס hydrodynamic. במחקר אקדמי, שניה-MALS משמש בדרך כלל כדי לקבוע את מצב oligomeric של חלבון, קונפורמציה שלה, הרמה של טוהר, ברמה של צבירת, וחלבונים שונה, כגון glycoproteins או solubilized-השומנים קרום חלבונים (לקבוע המסה טוחנת של חלבון ו נזווג את הרכיבים בנפרד)6,7,8.

במקרים רבים, החלבון הסופי של תהליך טיהור אינו זן מולקולרית טוב-defined אך מעדיף כוללת כמה הטרוגניות. החלבונים בתערובת כאלה יכולים להיות מגוונים מבחינת מבנה (לדוגמה, oligomeric בצורות שונות), הייצורים החיים, או חלבון איזופורמים. החלבון הזה יכול להיות גם תוצאה של הבדלים משניים כימי הנגרם על ידי עיבוד ליזין C-מסוף או דיאמינציה אספרגין/גלוטמין, מובילים להאשים וריאציה9,10. הבדלים posttranslational שינויים כגון גליקוזילציה יכול גם להוביל דגימות הטרוגנית עם תשלום וריאציות9. אלה סוגים שונים של הטרוגניות משתקפים מאפיינים ביופיזיקלי של החלבון, יכולים להשפיע על יציבות, פעילות ביולוגית של חלבון המטרה11.

בקרת איכות אמינים מבחני דוגמאות כאלה הטרוגנית דורשים טכניקה מאוד resolutive ההפרדה האנליטית. ישנם מקרים שבהם ניתן לערער הפרדה טובה להשיג עם עמודות שניה אנליטית, עקב שלהם מוגבל רזולוציה והפרדה היכולות12, וכתוצאה מכך ניתוח שניה-MALS פגום. שילוב של טכניקה הפרדה גבוהה-ירידה לפרטים כגון IEX עם MALS ניתן להתגבר על המגבלה של שניה-MALS בדגימות הטרוגנית, מספקות שיטה משלימה איפיון חלבונים (טבלה 1 Amartely et al.12). בניגוד שניה, המפריד בין מקרומולקולות מאת שלהם גודל hydrodynamic13, IEX מפריד מקרומולקולות מאת שלהם תשלום משטח14. Exchange אניון (AIEX) ו- bind מטריצות קטיון (CIEX) באופן שלילי ולא חיובי טעונה גרסאות, בהתאמה. עם הפרדה בסדר בין אוכלוסיות חלבון המשתפים מסה יחסית קרוב או צורה, IEX-MALS בהצלחה קובע את המסה טוחנת של כל מדינה חלבונים בודדים גם עם תערובת מדגם12.

כאן אנו מציגים פרוטוקול תקני לביצוע ניסוי IEX-MALS ההפרדה וניתוח של צורות oligomeric BSA הקיימים במדגם זהה. הבחירה של עמודת IEX על חלבון ספציפי היא חשובה ולא נדונה, כמו גם התנאים pH, מוליכות של מאגרי. הניתוח של נתוני הניסוי IEX-MALS גם מתואר צעד אחר צעד. למרות ההפרדה של BSA oligomers טובה ומספקת ב- SEC-MALS, BSA היא דוגמה טובה כדי להראות את היכולות IEX-MALS וכדי להדגים אופטימיזציה של ניסוי. דוגמאות המסכן ההפרדה מושגת על ידי שניה-MALS, הפרדה נכונה וניתוח מופעל על-ידי IEX-MALS הם דנו גם עם המחקר הקודם12.

Protocol

1. הכנת המערכת

  1. להתקין את חלבון מהיר כרומטוגרפיה נוזלית (FPLC) ומערכת גלאי אינדקס (RI) MALS/השבירה (ראה טבלה של חומרים) יחד עם חבילות תוכנה בהתאמה שלהם בקרה, חדרי קירור והקפאה של ניתוח לכל היצרנים הוראות.
  2. לחבר את MALS ואת RI גלאי במורד הזרם של גלאי UV ו מוליכות של FPLC. לעקוף את גלאי ה-pH אלא אם הדבר הכרחי עבור מעברי צבע pH, כדי למזער את אמצעי האחסון interdetector בין הגלאים UV ו MALS. השתמש צינורות קפילר של 0.25-0.5 הקוטר הפנימי מ"מ (זהות) בין עמודת, גלאי, 0.75 מ מ זהות צינורות קפילר על הפלט של הגלאי RI האספן פסולת או לשבר.
  3. ודא כי החיבורים הדרושים אות בין FPLC לבין גלאי הוקמו, כולל פלט אנלוגי של UV של הגלאי FPLC לקלט MALS Aux ו פלט דיגיטלי מ FPLC MALS Autoinject ב, דרך תיבת קלט/פלט.

2. הכנת המדגם, מאגר

  1. לסנן כל ריאגנטים, כולל המאגרים כביסה ו • תנאי, עם מסנן 0.1 מיקרומטר. לסנן את הראשון 50 – 100 מ של מאגר לתוך בקבוק פסולת כדי לחסל את החלקיקים של המסננים יבש, ולשמור את השארית של המאגר בתוך בקבוק נקי, סטרילי, יש כבר שטפו ביסודיות עם מים מסוננים, הכתיר כדי למנוע אבק מלהיכנס.
  2. התאם מדגם BSA pH ו כוח יונית (למשל, pH = 8, 50 מ מ NaCl) המאפשרות קשירה העמודה IEX במהלך הדילול, אולטראפילטרציה או מאגר exchange הליכים.
    הערה: מומלץ לסנן מראש את הדגימה חלבון לגודל נקבובית הקטן ביותר אינו מסיר את החומר של ריבית (0.02 – 0.1 µm). לחלופין, הדגימה יכול להיות centrifuged במהירות גבוהה (13,000 – 16,000 x g) למשך 10 דקות לאפשר את המשקעים של חלקיקים גדולים.
  3. להכין לפחות 0.3-0.5 מ ג של BSA (ראה טבלה של חומרים) כדי להזריק בעמודה 1 מ"ל (5/50 מ מ) להשגת ניתוח MALS באיכות טובה. שימו לב כי הנפח של הזרקת ללא הגבלה.

3. בחירה ופיתוח של שיטה IEX עבור חלבון

  1. לחשב את איזואלקטרית (pI) של החלבון בהתבסס על הרצף העיקרי, עבור השרתים שאליהם כגון כלי Protparam על ExPASy האתר יכול להיות בשימוש15. שימו לב כי החוקר של BSA 5.8.
  2. בחר עמודה מאגר וסוג הפרמטרים.
    1. השתמש מאגרים שונים עבור AIEX ו- CIEX, בהתאם pK המאגר ואת הטבע יוניים של המאגר. שימוש מאגרי cationic בעת הפעלת AIEX עמודה על מאגרי anionic בעת הפעלת העמודה CIEX עם counterions קטן. בדוגמה זו, השתמש 20 מ מ טריס-HCl מאגר, pH 8, לניתוח של BSA על עמודת AIEX.
    2. חלבון עם חזה ענק נמוך יותר מאשר 7, כגון BSA, לשימוש של עמודה AIEX, מאגר עם pH גבוה יותר מאשר החוקר על ידי לפחות שתי יחידות. על חלבון עם חזה ענק גבוה מ- 7, להשתמש CIEX עמודה בעלת מאגר עם pH נמוך יותר החוקר חלבון לפחות שתי יחידות.
    3. למטב את מאגר ה-pH לפי עוצמת איגוד בין החלבון המטריקס עמודה. אם חלבון שאינו בקשירה. ובכן אל העמודה להשתמש pH רחוק יותר החוקר. ודא כי החלבון הוא יציב על ה-pH בשימוש.
    4. השתמש ריכוז מלח נמוך באיגוד, לשטוף את המאגרים כדי לאפשר קשירה של החלבון למטריקס, מאז חלבון מחייב תלוי כוח יונית המדגם טעון. חלבונים דורשות בדרך כלל קצת מלח ליציבות שלהם; לכן, השתמש NaCl 50 מ מ (או מלח חלופי) במהלך השלבים חלבון-וטעינה של שטיפת העמודה.
    5. • תנאי מאגר, לשימוש לכל היותר 0.5 M NaCl כדי לנתק את החלבון מן העמודה.
      הערה: ריכוז המלח גבוה לא מומלצים בעת עבודה עם משאבות-מעבדות RI תקן-דגם עקב המגבלה טווח של המכשיר. עם זאת, מודל ריכוז גבוהה יכול לשמש, יוכל להכיל 2 M NaCl.
  3. לבצע שיטה ראשונית כדלקמן.
    1. לטעון 1 מ ג של BSA (170 µL של 6 מ"ג/מ"ל) ב- ~0.5 מ של מאגר טעינת מאגר 20 מ מ טריס-HCl, pH 8, המכיל 50 מ"מ NaCl. רוחצים את העמודה עם המאגר באותו אמצעי אחסון עמודה 10 – 15 (CV) לאפשר את השלם • תנאי של מולקולות לא מאוגד, חלקיקים מן המערכת עד פיזור אור (האם), UV, את אותות RI מלא התייצבו.
    2. לבצע מעבר הדרגתי מלח קצר, ליניארי של 20 – 30 CV, באמצעות מאגר • תנאי של 20 מ מ טריס-HCl, pH 8, המכילה 0.5 M NaCl כדי לנתק את החלבון מן העמודה. לבצע מעבר הדרגתי של 0%-100% (או צבע נפוצה חלופי) המאגר • תנאי או לפצל את זה ל שני מעברי צבע: 0% – 50% • תנאי מאגר ואחריו צבע נוסף של 50%-100% • תנאי מאגר, מעבר הצבע עבור CV 10 – 20. עבור BSA, השתמש הדרגתי נרחבת של 15% – 70% עבור 30 קורות חיים עבור פעולת השירות הראשוני.
      הערה: במקרים מסוימים, השיטה הראשוני עשוי מספקים הפרדה ניתוח MALS אמין, מסלולים נוספים אינם הכרחיים. במקרים רבים, השיטה הראשונית מספקת רק הנחיות נוספות שיטת אופטימיזציה.
  4. לייעל את השיטה IEX להגדיל את הרזולוציה ולשפר את ההפרדה שיא על-ידי שינוי פרמטרים שונים.
    1. לשנות את שיפוע הדרגתי ואת אורך. קצר מעברי צבע עם מדרונות גבוהה מספקים פסגות אינטנסיבי עם הפרדה פחות, בזמן ארוך מעברי צבע עם מדרונות מתונים לספק פסגות נמוך עם הפרדה טובה יותר. למצוא את האיזון בין עוצמת האות של רזולוציה שיא לניתוח MALS אופטימלית.
      הערה: טעינת כמות גבוהה יותר של חלבון יכול להגדיל LS, UV, ו רי אותות אבל עושה זאת על חשבון רזולוציה.
    2. השתמש פרופיל stepwise ריכוז המלחים • תנאי. זכור כי שילוב של צעדים, צבע ליניארי משמש בדרך כלל.
    3. להקטין את קצב הזרימה כדי לשפר את השיא ההפרדה.
      הערה: עבור מטריצות עם חלקיקים קטנים מאוד, זה לא מאוד משמעותי.
    4. לשנות את ה-pH המאגר כדי להגדיל את הווריאציה תשלום בין האוכלוסיות חלבון במדגם ולשפר את ההפרדה בין משתנים אלה. שימו לב כי ניתן להפריד חלבונים שאינם מופרדים כראוי ב- pH אחד ב- pH שונים.
    5. השתמש pH הדרגתיות, ליניארי או stepwise, כדי לנתק חלבונים מן העמודה IEX. • תנאי שימוש הדרגתיים המשלבות pH והן וריאציות ריכוז מלח במידת הצורך.
    6. השתמש מלחים חזקים יותר, כגון MgCl2או מלחי חלש יותר, כמו סודיום אצטט, כדי להגדיל את הרגישות ואת הרזולוציה16.
    7. להשתמש יותר IEX עמודות או טורים שונה מטריצה עם חלקיקים קטנים יותר כדי לשפר את היכולות ההפרדה.
    8. לשנות את סוג עמודה (AIEX/CIEX) כדי לספק דפוס שונה של הפרדה. שים לב מטריצות עם חזק, חלש או משולב ליגנדים (מצב מעורב) זמינים גם, יכול לשפר את הרזולוציה של דגימות.
    9. להשתמש בעמודת מן הספק שונים עם ליגנד באותו שאליו מחובר שרפים מטריקס שונים. שרף עצמו, ללא תלות ליגנד, ניתן לקיים אינטראקציה באופן שונה עם החלבונים, להשפיע על הפרופיל ההפרדה.
    10. כוללים תוספות (מולקולות לייצב את החלבון של הפתרון) במאגרי כדי לשפר את יציבות החלבון ולהימנע מצבור חלבון, כדי לשפר את הניסוי IEX.
      הערה: דוגמאות של תוספים כאלה הם סוכרים, כהלים, שתנן, חומרי ניקוי nonionic או zwitterionic, chaotropic ו- kosmotropic מלחי17,18.

4. ניסוי IEX-MALS

  1. פתח New\Experiment של שיטת בתוכנה MALS ובחר את השיטה המקוונת מתיקיית שיטות מערכת פיזור אור . אם המודול DLS זמין והם DLS נתונים כדי לרכוש, בחר את השיטה המקוונת מתוך תיקיית המשנה אור Scattering\With QELS .
  2. להגדיר את הפרמטרים של ההפעלה תחת מקטע התצורה .
    1. להגדיר את קצב הזרימה המרוץ במקטע משאבה כלליים את קצב הזרימה המשמשים את FPLC (1.5 mL/min), הזן או לאמת את הפרמטרים מאגר תחת המקטע הממס .
    2. הזן את השם חלבון (BSA), מקדם שבירה קבועה (dn/dc; התקן ערך עבור חלבונים הוא 0.185 mL/g), UV מקדם הכחדה-אורך הגל של 280 ננומטר (0.66 g/L-1·cm-1), הריכוז של המדגם חלבון (6 מ"ג/מ"ל) ב- הכרטיסיה הדגימה תחת המקטע מזרק . הכנס את אמצעי האחסון מדגם להזרקה (170 µL) כמו גם תחת אותו סעיף.
    3. בכרטיסיה בייסיק , תחת המקטע הליך , בחר בתיבת הסימון הדק על Autoinject , להגדיר את משך ההפעלה כך איסוף נתונים תימשך לפחות 5 דקות לאחר המילוי ההדרגתי הגיעה שלה הערך הסופי.
  3. להגדיר את הפרמטרים ניסוי בתוכנה FPLC.
    1. ליצור התנסות חדשה בכרטיסיה עורך שיטות . הניסוי הראשוני יהיה הדרגתי ליניארי של מלח או pH (ראה שלב 3.3). שיטת אופטימיזציה, צור הדרגתי יותר ספציפי או תוכנית stepwise לפי התוצאות • תנאי במהלך שיטת הראשונית (ראה צעד 3.4 ו איור 1). לכלול אות הדופק השיטה שיפעילו איסוף נתונים בתוכנת MALS.
    2. לשטוף את העמודה ואת שסתומים עם המאגרים הרלוונטיים: 20 מ מ טריס-HCl, pH 8, עם 50 מ"מ NaCl המאגר כביסה (שסתום), המאגר אותו עם 500 מ מ NaCl עבור המאגר • תנאי (B שסתום). ודא כי לשטוף את העמודה האחרונה משתמשת המאגר מחייב, המכילים ריכוז מלח נמוך, כדי לאפשר את הכריכה של החלבון אל המטריקס עמודה. לרחיצה מסיבית של זיהומים חריפה מאוגד, להשתמש 0.5 M NaOH לפני כביסה עם המאגרים הרלוונטיים, ולאחריה שטיפה מאגר ניטרול.
    3. מקם את הדגימה חלבון בתמונה באמצעות מזרק. אם יותר מ 10 מ"ל של המדגם נטען, להשתמש superloop או את משאבת השסתום של המכשיר FPLC בעת שעקף מסנן המשאבה ואת המיקסר של FPLC.
  4. להתחיל את הניסוי קודם בתוכנה MALS על-ידי לחיצה על לחצן הפעל ולאחר מכן גם את התוכנה FPLC. נתונים ייאספו לאחר קבלת האות הדופק של המכשיר FPLC באמצעות גלאי MALS.
  5. החל באותם הפרמטרים של במנוסה, ההוראות המתוארות צעדים 4.1-4.4 אם IEX-MALS מתבצע באופן ידני עם מצב זרימה רציפה במקום שיטה עצמאי.
  6. ברגע השיטה הסופי מאומתים, לרוץ, לבצע בדיוק באותה שיטה באמצעות זריקה ריק (טעינת מאגר במקום המדגם). חשוב כי התזמון בין הדופק autoinject ה גרדיאנט הפעלה ריק הוא זהה לזה של הדגימה להפעיל.

5. ניתוח של נתוני הניסוי IEX-MALS

  1. ביצוע הניתוח של צעד אחר צעד תחת המקטע הליך התוכנה MALS. התצוגה בייסיק מציגה אוסף נתונים גולמיים של הניסוי.
    1. השתמש בכרטיסיה ' Despiking ' כדי להחליק את chromatograms אם הם מציגים הרבה רעש. בדרך כלל, השתמש ברמה נורמלית .
    2. להגדיר את התוכנית הבסיסית עבור כל הסימנים (כל LS, UV ו רי גלאי) תצוגה בסיסית .
    3. להגדיר את הפסגות לניתוח בתצוגה פסגות . בדוק את הערכים הנכונים של dn/dc, המקדם הכחדה UV עבור החלבון תחת כל שיא.
      הערה: חלבונים, נהוג להשתמש RI סטנדרטי תוספת הערך 0.185 mL/g, אך עבור מקרומולקולות אחרות, ערכים שונים dn/dc יש להשתמש, על-פי האופי של המולקולה. Dn/dc הממוצע של polynucleotides (DNA/RNA) הוא 0.17 מ"ל/g19, בעוד saccharides, כגון סוכרוז, יש ערך ממוצע dn/dc של g/0.145 mL20 ואת הערכים dn/dc של ליפידים ודטרגנטים נע בין 0.1-0.16 g21.
    4. לנתח את המסה טוחנת ואת הרדיוס באמצעות הפרמטרים התאמה והפונקציה המתאם מתחת לתצוגות המסה טוחנת & רדיוס של LS ו Rh מ QELS .
  2. השינויים אות רי באופן משמעותי במהלך IEX-MALS לפעול עקב העלייה בריכוז המלח. לכן, להחסיר את האות הבסיסית של הזריקה ריק לחישובי המוני הדורשים RI נתונים.
    1. פתח גם חלבון וגם ניסויים IEX-MALS ריק. לחץ לחיצה ימנית על שם הניסוי חלבון בחר להחיל את השיטה, בחר את תיקיית הבסיס חיסור מתיבת דו-שיח קובץ. בחר בסוג הנכון של השיטה (למשל, באינטרנט) לניתוח המוני טוחנת סטנדרטי. שימו הפרמטרים ואת ההגדרות שהוגדרו עבור הניסוי חלבון יישמרו על שיטת נפתח חדש.
    2. תחת התצוגה חיסור בסיסית , לחץ על ייבוא ריק כדי לייבא את האותות המרוץ ריק. תחת כלי נגינה (לצד לחצן ייבוא ריק ), לבדוק את כולם גלאי כדי לחסר.
    3. בתצוגה ' פסגות ', התאם את הערכים dn/dc (במקרה הצורך) בשל מוליכות הפתרון באזור שיא חלבון, מאז המהלכים הנכונים של הפתרון הוא השתנה במהלך ריצה12.
  3. לכייל את המערכת IEX-MALS עם מונומר BSA.
    הערה: בדרך כלל, מערכת IEX-MALS מעת לעת מכויל שיא יישור, הלהקה הרחבה של נורמליזציה של גלאי זוויתי. הגלאי 90° באמצעות חלבון monodisperse עם רדיוס של רגע (Rg) של < 10 ננומטר, כמו BSA מונומר. בדוגמה זו, BSA מגישה גם מולקולת כיול, הוא עצמו הנושא של הניתוח המוני טוחנת.
    1. יישר את הפסגות, תחת נהלים > תצורת תצוגה.
    2. לבצע נרמול תחת התצוגה נורמליזציה , הזנת 3.0 nm כערךg R.
    3. תחת הלהקה הרחבת בכרטיסייה תצורה זהה, לבחור הפסגה, להתאים את האותות UV ו LS לאות רי, באמצעות הלחצן בצע להתאים .
  4. הגרף של התוצאות מוצג בתצוגה תוצאות התאמה . לשנות את המאזניים ציר ופרמטרים אחרים של גרף על-ידי לחיצה ימנית על הגרף, בחירת לערוךולאחר מכן לחיצה על לחצן מתקדם . דמות גרף עם יותר אפשרויות התצוגה זמינה גם בכרטיסיה EASI גרף : בחר המסה טוחנת מתוך התפריט הנפתח להציג בחלק העליון של החלון.
  5. שים לב כי כל התוצאות, כולל המסה טוחנת, רדיוס, דרגת טוהר של אחרים, זמינים בתצוגת דוח (סיכום או מפורט) תחת המקטע תוצאות . השתמש בלחצן מעצב הדוחות כדי להוסיף עוד תוצאות או פרמטרים, כמו גם דמויות, לדוח.

Representative Results

BSA הוא חלבון נפוץ אשר משמש הכרומטוגרפיה כיול של מערכת ניסויית22 ומתאים מאוד לתרגול IEX-MALS, כמו גם שניה-MALS. היא בעיקר monomeric עם מסה מונומר תיאורטי של 66.7 kDa, בדרך כלל משלבת מספר קטן של הדימרים ו oligomers גבוהה23.

BSA נותחו על IEX-MALS באמצעות עמודת אנליטית של exchange אניון (ראה טבלה של חומרים). פונקציה קווית רחב הדרגתי בהיקף של 30 CV מן 75 מ"מ עד 350 מ"מ NaCl הופרדו BSA מונומרים oligomers גבוה יותר. ניתוח MALS במורד הזרם הביא מסה טוחנת מונומר מחושב של 66.8 kDa ± 0.7, מסה טוחנת דימר מחושב של 130 ± 5 kDa (איור 1א').

על סמך את מוליכות מאגר על הפסגות eluted, מעבר הצבע שונתה תוכנית אחרת: שלב ארוך של 175 מ מ NaCl ואחריו הדרגתי לינארית מ- 175 מ מ עד 500 מ מ NaCl. מעבר הצבע החדש לשפר באופן משמעותי את הרזולוציה ואת ההפרדה מעולה BSA מונומר (עם מסה טוחנת מחושב של 66.1 ± 0.7 kDa) בין המינים oligomeric העליונים שלה (עם מסה הממוצע המחושב של 132 ± 2 kDa) (איור 1B). להתמקד גם המין oligomeric גבוהה וכדי לחשב טוחנת המוני בכל צורה oligomeric אישית של BSA, הוחלה תוכנית stepwise של 200 מ מ, 250 מ מ NaCl. הניסוי הזה, גרמו הפרדה מצוינת בין BSA מונומר (עם מסה מחושב של 62.4 ± 0.4 kDa) דיימר (עם מסה מחושב של 130 ± 10 kDa), trimer (עם מסה מחושב של 170 ± 10 kDa) (איור 1C). כל הניסויים IEX-MALS מראים כי BSA elutes בעיקר בתור מונומר עם טוהר של 80%, מסכים עם תוצאות שניה-MALS שבו מונומרים BSA elute עם טוהר של 85%12.

Figure 1
איור 1 : אופטימיזציה של הניסוי IEX-MALS עבור BSA. (א) IEX-MALS הניסוי של BSA עם תוכנית הדרגתי של 75 – 350 מ"מ NaCl. (B) IEX-MALS הניסוי של BSA עם תוכנית של צעד NaCl 175 מ מ, ואחריו תוכנית מעבר צבע ליניארי של 175 – 500 מ מ NaCl. (ג) IEX-MALS הניסוי של BSA עם תוכנית שלב של 200 מ מ, 250 מ מ NaCl. Chromatograms הצג UV באור 280 nm (כחול), מפזרים על זווית 90 מעלות (אדום), ואת את מקדם שבירה (ורוד). את עקומות מוליכות (אפור) יחד עם המסה טוחנת של כל שיא המחושב על-ידי MALS (שחור). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

IEX-MALS היא שיטת רב עוצמה חלבון הפרדה ואפיון המאפשרת קביעת המוני טוחנת מדויק טהור חלבונים כמו גם החל מדגמים הטרוגנית, אפיון oligomers מקורית, אגרגטים לא מקוריים, קוולנטיות, noncovalent מתחמי ולאחר conjugated חלבונים. תוכנית בהיקף של מעבר צבע ליניארי או סדרה של צעדים ריכוז המלחים ניתן להשיג הפרדה טובה של אוכלוסיות חלבון ולאפשר ניתוח נכון של כל שיא בודדים על-ידי MALS. נוספים מיטוב על ידי שינוי פרמטרים שונים, כגון שיפוע המדרון (ראה שלב 3.4 לפרוטוקול), יכול להתבצע אם נדרשת רזולוציה טובה יותר. IEX-MALS יכול להיות assay בקרת איכות חלבון בעל ערך מאז שהיא מספקת רמה נוספים, קריטי של חלבון אפיון, משלים בשיטות אחרות כגון שניה-MALS.

בעוד שניה-MALS היא טכניקה סטנדרטי, נפוץ לקביעת מסה טוחנת חלבון, ברזולוציה נמוכה יחסית של הטורים התקניים שניה אנליטי עלולה להגביל מדידות מדויקות טוחנת המוני מושגת על ידי MALS12. כמה דוגמאות של המגבלות של שניה-MALS כוללים פתרונות המכילים oligomers רצופים, רמות גבוהות של צבירת שאינם מופרדים לחלוטין מתוך מונומר שיא ולאחר אוכלוסיות הטרוגניות עם ההמונים טוחנת דומים, כגון חלבונים ששונה.

IEX היא שיטת כרומטוגרפיה מורכבים יותר לעצב ולבצע יותר שניה, אבל המידע המתקבל ניסוי IEX-MALS יכול להשלים, לפעמים להיות אינפורמטיבי אפילו יותר מאשר ניתוח שניה-MALS. IEX-MALS בהצלחה אפיינו את גרסאות נוגדן המשתפים oligomers אותה מסה, טוחנת שהרווח לא לגמרי שניה ולאחר פפטידים קצרים קשה לנתח שניה12,24. כמו כן, הרכבות macromolecular גדולים מדי כדי להיות מופרדים על-ידי שניה, מלא (המכיל DNA נגיפי) ו ריק חלקיקי וירוס adeno-הקשורים (AAV), יכולים להיפתר על ידי IEX25 לפני ניתוח MALS. בהשוואה ל- SEC, IEX מציע הפרדה יותר מגוונת יכולות14 ויש לו את הגמישות של התאמת מספר פרמטרים כדי להגדיל את הרזולוציה שיא, כגון מאגר pH, סוגי מלח, סוגי ואת האורך של העמודה, ואחרים. בניגוד שניה, יש ללא מגבלה נפח להזרקה מדגם ב IEX, בכל מולקולה ניתן לנתח באופן עצמאי את גודלו (Amartely et al.12, ראה טבלה 1). זהו יתרון גדול של IEX-MALS, בעיקר עבור דגימות בעוצמה נמוכה LS, כגון חלבונים קטנים מאוד או חלבונים מדולל עם נטייה לצורך צבירת על ריכוז. מאז עמודות IEX אנליטי יציבים יותר, נוטים לשחרר חלקיקים פחות מאשר שניה טורים, IEX-MALS דורש זמן קצר מאוד equilibration, האם אותות התייצבו מהר מאוד. דבר זה מאפשר הפעלה של ניסויים בודדים כפי שמתואר פרוטוקול זה, לעצור את המרוץ כנדרש.

בניגוד שניה, אשר בדרך כלל מספק תוצאות בסדר עם היחידה להתנסות (באמצעות עמודה עם הטווח fractionation נכון), IEX עשויים לדרוש מספר ניסויים כדי להשיג רזולוציה מיטבית על-ידי כיוונון הפרמטרים בשיטה. בניסויים IEX-MALS המבוצעים במילוי הדרגתי מלח, מוליכות מאגר ושנה, לפיכך, המהלכים הנכונים באופן דרמטי במהלך הריצה, עם שינויים הסוגר האות רי. פעולה זו דורשת של ריק נוספים להפעיל עבור ניסוי IEX-MALS וניתוח עם חיסור בסיסית (כפי שמתואר בשלב 5.2 לפרוטוקול), אלא אם כן הניתוח ריכוז מוגבלת לזיהוי UV (הדורשים ידע א-פריורי של הכחדה המקדמים עבור כל שיא). הניתוח עם חיסור בסיסית היא חזקה למעברי צבע קוויים, אף-על-פי בהמשך פיתוח של שיטת נדרש עדיין עבור חיסור בסיסית מוצלחת של תוכניות stepwise מלח. הערכים dn/dc של כל שיא צריך להיות מותאם על פי מוליכות מאגר ספציפי על פסגת eluted (חישובים ניתן למצוא ספרות12). אם חלבון eluted-NaCl ריכוז נמוך מ-200 מ מ (כמו בדוגמה של BSA), התאמה זו הוא זניח.

כמות יחסית גדולה של חלבון בשימוש IEX-MALS (כמו שלב ושלב ב 2.3 לפרוטוקול) בהשוואה ל- SEC-MALS חשוב להתגבר על השינוי הדרמטי של האות רי הנגרמת על ידי מעבר הצבע המלח ותנודות רי עקב ערבוב לא מושלם של מאגרי הדרגתיות. אם רק לזיהוי UV משמש למדידה המוני, עשוי לשמש כמויות קטנות יותר. כמות חלבון כדי להזריק תלוי המסה טוחנת של החלבון, הומוגניות, טוהר, המקדם הכחדה UV. המסה מוזרק הכרחי צריך להיות גבוה יותר עבור חלבונים קטנים יותר נמוך יותר עבור חלבונים גדולים יותר (~ 1 מ"ג עבור 20 kDa חלבונים ו ~0.2 מ"ג ל חלבון 150 kDa). דוגמאות הטרוגנית דורשות הזרקה מדגם יותר מאז הכמות מחולק בין מספר אוכלוסיות. ביצועים גבוהים אנליטי כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) עשוי לדרוש פחות חומר מאשר מערכת FPLC.

לאחרונה, דווח בשורה ניתוח באמצעות MALS במהלך הליכי טיהור. ניתוח כזה בזמן אמת יעיל מאוד לזיהוי מוצרים צבירת להתרחש במהלך טיהור יכול לבטל את הצורך עבור כל ניתוח נוסף של החלבון לאחר טיהור26. כרומטוגרפיה IEX משמש לעתים קרובות כשלב ביניים טיהור; לפיכך, השילוב של עמודות IEX מפוח עם MALS יכול להיות שימושי לא רק כמו שיטת אפיון האנליטית אלא גם כמו ניתוח בזמן אמת של תהליכי טיהור בקנה מידה גדול. עמודות IEX nonanalytical גם הם יציבים, עם רמה נמוכה של חלקיקים שחרור, לכן, ניתן להשתמש עם MALS. שיטות ההפרדה אחרים, כגון כרומטוגרפיית זיקה או כרומטוגרפיה הידרופובית, יכול גם להיות משולב עם MALS כאשר נתון דגימות יחסית טהורה (כדי למנוע זיהום של גלאי MALS ואת RI). זה ידרוש ההסתגלות, אופטימיזציה של השיטה כדי להשיג לא רק הפרדה שיא טוב אבל האם גם מספיק נקי ואת RI אותות עבור ניתוח מוצלח MALS.

Disclosures

ד. ש. הוא עובד של תאגיד הטכנולוגיה וויאט, שאת מוצריו מנוצלים של פרוטוקול זה. ש א הוא מועסק ע י דניאל ביוטק, מפיץ של מכשירים וויאט ואת ÄKTA.

Acknowledgments

המחברים מודים ד ר צאפי דניאלי (מרכז וולפסון עבור להחיל ביולוגיה מבנית, האוניברסיטה העברית) על לה עצות ושיתופי פעולה. המחברים מודים גם דניאל ביוטק בע מ (רחובות) על סיוע והקמת מערכת FPLC-MALS אנליטית מנוצל במחקר זה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ÄKTA pure GE Healthcare 29-0182-26 FPLC 
0.02 µm Anotop Whatman Filter 10 mm GE Healthcare 6809-1002 Sample Filter
0.1 µm Anotop Whatman Filter 10 mm GE Healthcare 6809-1012 Sample Filter
0.1 µm Anotop Whatman Filter 25 mm GE Healthcare 6809-2012 Mobile phase filter
BSA (purity >97%) Sigma  A1900 Bovine serum albumin
miniDAWN TREOS  Wyatt Technology WTREOS MALS
mono Q HR 5/50 GL GE Healthcare 17-5166-01 Anion exchange analytical column
Optilab T-rEX Wyatt Technology WTREX Refractometer
0.1 mm PES 1000 mL Stericup Millipore SCVPU11RE Mobile phase filter
Sodium chloride Sigma  71382 HPLC grade NaCl
TRISMA base Sigma  T-1503 TRIS buffer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lebendiker, M., Danieli, T., de Marco, A. The Trip Adviser guide to the protein science world: a proposal to improve the awareness concerning the quality of recombinant proteins. BMC Research Notes. 7, 585 (2014).
  2. Raynal, B., Lenormand, P., Baron, B., Hoos, S., England, P. Quality assessment and optimization of purified protein samples: why and how. Microbial Cell Factories. 13, 180 (2014).
  3. Oliveira, C., Domingues, L. Guidelines to reach high-quality purified recombinant proteins. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (1), 81-92 (2018).
  4. Manta, B., Obal, G., Ricciardi, A., Pritsch, O., Denicola, A. Tools to evaluate the conformation of protein products. Biotechnology Journal. 6 (6), 731-741 (2011).
  5. Minton, A. P. Recent applications of light scattering measurement in the biological and biopharmaceutical sciences. Analytical Biochemistry. 501, 4-22 (2016).
  6. Sahin, E., Roberts, C. J. Size-Exclusion Chromatography with Multi-angle Light Scattering for Elucidating Protein Aggregation Mechanisms. Methods in Molecular Biology. 899, 403-423 (2012).
  7. Ogawa, T., Hirokawa, N. Multiple analyses of protein dynamics in solution. Biophysical Reviews. 10 (2), 299-306 (2018).
  8. Rebolj, K., Pahovnik, D., Žagar, E. Characterization of a Protein Conjugate Using an Asymmetrical-Flow Field-Flow Fractionation and a Size-Exclusion Chromatography with Multi-Detection System. Analytical Chemistry. 84 (17), 7374-7383 (2012).
  9. Liu, H., Gaza-Bulseco, G., Faldu, D., Chumsae, C., Sun, J. Heterogeneity of Monoclonal Antibodies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (7), 2426-2447 (2008).
  10. Hintersteiner, B., et al. Charge heterogeneity: Basic antibody charge variants with increased binding to Fc receptors. mAbs. 8 (8), 1548-1560 (2016).
  11. Wei, B., Berning, K., Quan, C., Zhang, Y. T. Glycation of antibodies: Modification, methods and potential effects on biological functions. mAbs. 9 (4), 586-594 (2017).
  12. Amartely, H., Avraham, O., Friedler, A., Livnah, O., Lebendiker, M. Coupling Multi Angle Light Scattering to Ion Exchange chromatography (IEX-MALS) for protein characterization. Scientific Reports. 8 (1), 6907 (2018).
  13. Goyon, A., et al. Evaluation of size exclusion chromatography columns packed with sub-3μm particles for the analysis of biopharmaceutical proteins. Journal of Chromatography A. 1498, 80-89 (2016).
  14. Fekete, S., Beck, A., Veuthey, J. -L., Guillarme, D. Ion-exchange chromatography for the characterization of biopharmaceuticals. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 113, 43-55 (2015).
  15. Gasteiger, E., et al. ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3784-3788 (2003).
  16. Kopaciewicz, W., Regnier, F. E. Mobile phase selection for the high-performance ion-exchange chromatography of proteins. Analytical Biochemistry. 133 (1), 251-259 (1983).
  17. Lebendiker, M., Danieli, T. Production of prone-to-aggregate proteins. FEBS Letters. 588 (2), 236-246 (2014).
  18. Lebendiker, M., Maes, M., Friedler, A. A screening methodology for purifying proteins with aggregation problems. Methods in Molecular Biology. 1258, 261-281 (2015).
  19. Fu, D., et al. Ultraviolet refractometry using field-based light scattering spectroscopy. Optics Express. 17 (21), 18878-18886 (2009).
  20. Scafati, A. R., Stornaiuolo, M. R., Novaro, P. Physicochemical and Light Scattering Studies on Ribosome Particles. Biophysical Journal. 11 (4), 370-384 (1971).
  21. Berthaud, A., Manzi, J., Pérez, J., Mangenot, S. Modeling Detergent Organization around Aquaporin-0 Using Small-Angle X-ray Scattering. Journal of the American Chemical Society. 134 (24), 10080-10088 (2012).
  22. Umrethia, M., Kett, V. L., Andrews, G. P., Malcolm, R. K., Woolfson, A. D. Selection of an analytical method for evaluating bovine serum albumin concentrations in pharmaceutical polymeric formulations. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 51 (5), 1175-1179 (2010).
  23. Hirano, A., Arakawa, T., Kameda, T. Effects of arginine on multimodal anion exchange chromatography. Protein Expression and Purification. 116, 105-112 (2015).
  24. Avraham, O., Bayer, E. A., Livnah, O. Crystal structure of afifavidin reveals common features of molecular assemblage in the bacterial dimeric avidins. The FEBS Journal. , (2018).
  25. Lock, M., Alvira, M. R., Wilson, J. M. Analysis of Particle Content of Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 8 Vectors by Ion-Exchange Chromatography. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 56-64 (2012).
  26. Patel, B. A., et al. Multi-angle light scattering as a process analytical technology measuring real-time molecular weight for downstream process control. mAbs. 10 (7), 945-950 (2018).

Tags

ביוכימיה גיליון 146 חילוף יונים (IEX) ריבוי זווית פיזור אור (MALS) כרומטוגרפיה הפרדת חלבונים משקל מולקולרי אלבומין שור (BSA) oligomers בקרת איכות
יונים כרומטוגרפיה (IEX) מצמידים מרובה זווית פיזור אור (MALS) עבור חלבון הפרדה ואפיון
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Amartely, H., Some, D., Tsadok, A.,… More

Amartely, H., Some, D., Tsadok, A., Lebendiker, M. Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization. J. Vis. Exp. (146), e59408, doi:10.3791/59408 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter