Summary
Este protocolo describe el uso de cromatografía de intercambio iónico de alta especificidad con dispersión de la luz múltiples ángulo para una determinación de masa molar exacta de proteínas, complejos de proteínas y péptidos en una muestra heterogénea. Este método es valioso para la evaluación de la calidad, así como para la caracterización de oligómeros nativos, variantes de carga y las muestras de proteína mezclado.
Abstract
Cromatografía de intercambio iónico con múltiples ángulo de dispersión ligera (IEX-MALS) es un método poderoso para separación de proteínas y caracterización. La combinación de la técnica de separación de alta especificidad IEX con el análisis de la masa molar exacta alcanzada por MALS permite la caracterización de las muestras de proteína heterogéneos, incluidas las mezclas de formas oligoméricas o proteína poblaciones, incluso con muy masas molares similares. Por lo tanto, MALS IEX proporciona un nivel adicional de caracterización de proteínas y es complementaria a la cromatografía de exclusión de tamaño estándar con la técnica de dispersión de la luz de múltiples ángulos (SEC-MALS).
Aquí se describe un protocolo para una básica IEX-MALS experimentar y demostrar este método en albúmina de suero bovino (BSA). IEX separa BSA a sus formas oligoméricas que permite un análisis de la masa molar por MALS de cada forma individual. Optimización de un experimento de IEX-MALS es también presentado y demostrado en BSA, lográndose excelente separación entre BSA monómeros y oligómeros más grandes. IEX-MALS es una técnica valiosa para la evaluación de la calidad de la proteína puesto que proporciona separación fina y determinación de masas molar de múltiples especies de proteínas que existen en una muestra.
Introduction
Caracterización cuantitativa de productos proteicos es cada vez más indispensable como medio de control de calidad (QC), tanto con fines regulatorios en la industria biofarmacéutica y para garantizar la fiabilidad e integridad de la ciencia de la vida investigación1 , 2. como se describe en las páginas web de proteína redes purificación Alianza en Europa (P4EU) y la Asociación de recursos y producción de proteínas para la investigación biofísica en Europa y Biofísica Molecular en Europa (ARBRE-MOBIEU) (https://p4eu.org/protein-quality-standard-pqs y https://arbre-mobieu.eu/guidelines-on-protein-quality-control, respectivamente), control de calidad de la proteína debe caracterizar no sólo la pureza del producto final, sino también su estado oligomérico, homogeneidad, identidad, conformación, estructura, modificaciones del posttranslational y otros propiedades3,4.
Uno de los métodos de caracterización más comunes de control de calidad es SEC-MALS. En este método, una columna analítica de la SEC se acopla a MALS y detectores espectrofotométricos y REFRACTOMÉTRICOS, lo que permite mediciones precisas de la masa molar de la proteína de cada pico5. SEC-MALS determina la masa molar de los picos eluídas independientemente el volumen de elución y supera la imprecisión de la SEC analítica utilizando la calibración de la columna. La adición de un módulo de (DLS) de dispersión de luz dinámica añade capacidad de medición de tamaño permitiendo determinación radio hidrodinámico. En la investigación académica, SEC-MALS se suele utilizar para determinar el estado oligomérico de una proteína, su conformación, el nivel de pureza, nivel de agregación y proteínas modificadas, como glicoproteínas o proteínas de la membrana lípidos solubilizados (determinar la masa molar de la proteína y conjugar los componentes individualmente)6,7,8.
En muchos casos, la proteína final de un proceso de purificación no es una especie molecular bien definido sino más bien comprende cierta heterogeneidad. Las proteínas en tal mezcla pueden ser variadas en cuanto a la estructura (por ejemplo, diferentes formas oligoméricas), conformaciones o isoformas de la proteína. Heterogeneidad de la proteína también puede ser resultado de diferencias químicas menores causados por el procesamiento de lisina c-terminal o desaminación de la asparragina/glutamina, a cargo de9,de variación10. Las diferencias en las modificaciones postraduccionales como la glicosilación también pueden conducir a las muestras heterogéneas con las variaciones de carga9. Estos tipos de heterogeneidad se reflejaban en las características biofísicas de la proteína y pueden afectar a la estabilidad y la actividad biológica de la proteína blanco del11.
Análisis confiable de control de calidad de dichas muestras heterogéneas requieren una técnica de separación analítica altamente resolutivo. Hay casos donde la buena separación puede ser impugnada con columnas analíticas de la SEC, debido a su limitada resolución y separación habilidades12, resultando deficiente análisis SEC-MALS. La combinación de una técnica de separación de alta especificidad como IEX con MALS puede superar la limitación de la SEC-MALS en muestras heterogéneas y proporcionan un método complementario para la caracterización de la proteína (tabla 1 en Amartely et al.12). A diferencia de la SEC, que separa macromoléculas por su tamaño hidrodinámico13, IEX separa macromoléculas por su carga de superficie14. Intercambio de aniones (AIEX) y lazo de matrices de intercambio catiónico (CIEX) negativamente y positivamente habían cargado variantes, respectivamente. Con una separación fina entre las poblaciones de proteínas que comparten una masa relativamente cercano o forma, IEX-MALS con éxito determina la masa molar de cada Estado individual de la proteína en una muestra de mezcla12.
Aquí presentamos un protocolo estándar para el funcionamiento de un experimento de IEX-MALS para la separación y análisis de formas oligoméricas BSA que existen en la misma muestra. La elección de una columna IEX para una proteína específica es importante y discutido, así como las condiciones de pH y conductividad de los amortiguadores. El análisis de datos experimentales de IEX-MALS se describe paso a paso. Aunque la separación de oligómeros de BSA es buena y suficiente en SEC-MALS, BSA es un buen ejemplo para demostrar las capacidades de IEX-MALS y demostrar la optimización de un experimento. Ejemplos de mala separación alcanzada por SEC-MALS y adecuada separación y análisis de IEX-MALS se discuten en un anterior estudio12.
Protocol
1. preparación del sistema de
- Instale el sistema de cromatografía líquida (FPLC) proteína rápida y MALS/refractivo detectores de índice (RI) (véase Tabla de materiales) junto con sus respectivos programas para control, adquisición de datos y análisis por los fabricantes instrucciones.
- Conectar los detectores de MALS y RI abajo de detectores UV y conductividad de FPLC. Puente el detector de pH a menos que sea absolutamente necesario que los gradientes de pH, para reducir al mínimo el volumen interdetector entre los detectores UV y MALS. Use tubería capilar de 0.25 – 0.5 Diámetro mm interior (d.i.) entre la columna y detectores y tubo capilar de 0, 75 mm i.d. en la salida del detector RI al recolector de basura o fracción.
- Asegurar que se han establecido las conexiones de señal necesario entre los detectores y FPLC, incluyendo una salida analógica de UV del detector a la entrada Aux de MALS FPLC y salida digital de la FPLC al MALS Autoinject, cajas de la entrada-salida.
2. preparación de la muestra y tampón
- Filtro de todos los reactivos, incluyendo los tampones de lavado y elución con filtro de 0.1 μm. Los primeros 50 – 100 mL de tampón del filtro en una botella de residuos para eliminar las partículas de los filtros secos y mantener el resto del búfer en un frasco limpio y estéril que se ha lavado bien con agua filtrada y tapar para evitar que el polvo penetre.
- Ajustar una muestra de BSA a un pH y fuerza iónica (p. ej., pH = 8, 50 mM NaCl) que permiten unirse a la columna IEX durante procedimientos de cambio de tampón, ultrafiltración o dilución.
Nota: Se recomienda para prefiltro la muestra de proteína para el tamaño de poro más pequeño que no retire el material de interés (0.02-0.1 μm). Alternativamente, la muestra se puede centrifugar a alta velocidad (13.000 – 16.000 x g) durante 10 min permitir la precipitación de las partículas grandes. - Preparar por lo menos 0.3 – 0.5 mg de BSA (véase Tabla de materiales) que se inyecta en una columna de 1 mL (5/50 mm) para lograr un análisis MALS de buena calidad. Tenga en cuenta que el volumen de inyección es ilimitado.
3. opción y desarrollo de un método IEX para una proteína
- Calcular el punto isoeléctrico (pI) de la proteína basada en la secuencia principal, para que servidores como herramienta Protparam en el ExPASy sitio web puede ser utilizado15. Tenga en cuenta que el pI de BSA es 5.8.
- Seleccione los parámetros de tipo y búfer de columna.
- Utilizar diferentes buffers para AIEX y CIEX, dependiendo del pK del búfer y la naturaleza iónica del buffer. Uso de almacenadores intermediarios catiónicos cuando se ejecuta la columna AIEX y aniónicos búferes cuando se ejecuta la columna CIEX con counterions pequeño. En este ejemplo, utilice tampón 20 mM Tris-HCl, pH 8, para el análisis de BSA en una columna AIEX.
- Para una proteína con un pI menor de 7, como BSA, use una columna AIEX y buffer con un pH más alto que la pI por al menos dos unidades. Para una proteína con un IP superior a 7, use una columna CIEX y un buffer con un pH más bajo que el pI de la proteína por al menos dos unidades.
- Optimizar la solución amortiguadora de pH según la fuerza de unión entre la proteína y la matriz columna. Si una proteína no se une bien a la columna, utilizar un pH más lejos de la pI. Asegúrese de que la proteína es estable a pH utilizado.
- Una baja concentración de sal en el enlace y los almacenadores intermediarios para permitir el atascamiento de la proteína de la matriz, ya que la Unión a proteínas depende de la fuerza iónica de la muestra cargada. Las proteínas generalmente requieren sal para su estabilidad; por lo tanto, usar 50 mM NaCl (o alternativa sal) durante la carga de proteína y el lavado de la columna.
- Para el tampón de elución, utilice un máximo de 0,5 M de NaCl para separar la proteína de la columna.
Nota: Altas concentraciones de sal no se recomiendan cuando se trabaja con el refractómetro de RI modelo estándar debido a la limitación de la gama del instrumento. Sin embargo, un modelo de alta concentración puede ser utilizado y acomode a 2 M de NaCl.
- Realizar un método inicial como sigue.
- Carga 1 mg de BSA (170 μl de 6 mg/mL) en ~0.5 mL de un tampón de carga de tampón 20 mM Tris-HCl, pH 8, que contiene 50 mM de NaCl. Lavar la columna con el mismo buffer para un volumen de columna de 10 – 15 (CV) permitir la elución completa de las moléculas no consolidadas y las partículas en el sistema hasta la dispersión de la luz (LS), Ultravioleta, y señales de RI están completamente estabilizadas.
- Realizar un gradiente de sal corto y lineal de 20-30 CV, con tampón de elución de 20 mM Tris-HCl, pH 8, que contiene de 0,5 M de NaCl para separar la proteína de la columna. Realizar un degradado de 0% – 100% (o gradiente generalizado alternativo) del buffer de elución o dividir a los dos gradientes: 0%-50% de tampón de elución seguido de un gradiente adicional de 50% – 100% de tampón de elución, cada gradiente para 10-20 CV. Para BSA, use un extenso gradiente de 15 – 70% de 30 CV para el método inicial.
Nota: En algunos casos, el método inicial puede proporcionar separación para un análisis fiable de MALS y funcionamientos adicionales no son necesarios. En muchos casos, el método inicial orienta sólo para la optimización del método más.
- Optimizar el método IEX para aumentar la resolución y mejorar la separación del pico cambiando diferentes parámetros.
- Cambiar la pendiente del gradiente y la longitud. Corto degradados con elevadas pendientes proporcionan intensos picos con menos separación, mientras que largos degradados con pendientes suaves proporcionan picos inferiores con mejor separación. Encontrar el equilibrio entre la máxima resolución y señal de intensidad para el óptimo análisis MALS.
Nota: Cargar una mayor cantidad de proteína puede aumentar LS, Ultravioleta, y las señales de RI pero lo hace a expensas de la resolución. - Utilice un perfil de concentración de sal paso a paso para la elución. Recuerde que comúnmente se utiliza una combinación de pasos y degradado lineal.
- Disminuir la tasa de flujo para mejorar la separación de picos.
Nota: Para matrices con partículas muy pequeñas, esto no es muy significativo. - Cambiar el pH del tampón para aumentar la variación de la carga entre las poblaciones de proteína en la muestra y mejorar la separación entre esas variantes. Tenga en cuenta que se pueden separar proteínas que no son separadas adecuadamente en un pH a un pH diferente.
- Utilizar un pH degradado, lineal o progresivo, para separar las proteínas de la columna IEX. Utilizar gradientes de elución que combinan pH y variaciones de la concentración de sal si es necesario.
- Utilizar sales más fuerte, como MgCl2, o sales más débiles, como el acetato de sodio, para aumentar la sensibilidad y resolución16.
- Uso más IEX columnas o una matriz de columna diferentes con partículas más pequeñas a mejorar capacidades de separación.
- Cambiar el tipo de columna (AIEX/CIEX) para proporcionar un patrón diferente de separación. Nota que matrices con ligandos (modo mixto) fuertes, débiles o combinados también están disponibles y pueden mejorar la resolución de algunas muestras.
- Utilice una columna de un proveedor diferente con el mismo ligando que se une a las resinas de matriz diferente. La resina sí mismo, independientemente del ligando, puede interactuar de manera diferente con las proteínas y afectan el perfil de separación.
- Incluir aditivos (moléculas que estabilizan la proteína en la solución) en los amortiguadores para mejorar la estabilidad de proteínas y evitar la agregación de proteína, para mejorar la experiencia IEX.
Nota: Los ejemplos de tales aditivos son azúcares, urea, alcoholes, detergentes no iónicos o zwitteriónico y caotrópico y kosmotropic sales17,18.
- Cambiar la pendiente del gradiente y la longitud. Corto degradados con elevadas pendientes proporcionan intensos picos con menos separación, mientras que largos degradados con pendientes suaves proporcionan picos inferiores con mejor separación. Encontrar el equilibrio entre la máxima resolución y señal de intensidad para el óptimo análisis MALS.
4. experimento IEX-MALS
- Abra New\Experiment de método en el software MALS y seleccione el método en línea desde la carpeta de métodos del sistema de Dispersión de la luz . Si está disponible el módulo DLS DLS datos deben ser adquiridos, seleccionar el método en línea de la subcarpeta de Luz Scattering\With QELS .
- Configure los parámetros del funcionamiento en la sección de configuración .
- Fijar el caudal de la ejecución en la sección Genérica de la bomba para el caudal utilizado en FPLC (1.5 mL/min) y entrar o verificar los parámetros de amortiguamiento en la sección de solvente .
- Introduzca el nombre de proteína (BSA), aumento del índice de refracción (dn/dc, el estándar es de valor para las proteínas 0,185 mL/g), coeficiente de extinción de la UV en la longitud de onda de 280 nm (0,66 g/L-1·cm-1) y la concentración de la muestra de proteínas (6 mg/mL) en la ficha de muestra en la sección de inyector . Inserte el volumen de muestra para la inyección (μL 170) así como en la misma sección.
- En la ficha de la Colección Basic , en la sección de procedimiento , seleccione la casilla de verificación activación en Autoinject y establecer la duración de la carrera para que la recolección de datos se continuará durante al menos 5 minutos después de que el gradiente ha alcanzado su valor final.
- Configure los parámetros del experimento en el software FPLC.
- Crear un nuevo experimento en la ficha Editor de método . El experimento inicial será un degradado lineal de sal o pH (vea el paso 3.3). Para el método optimizado, crear un gradiente más específico o un programa paso a paso según los resultados de elución durante el método inicial (ver paso 3.4 y figura 1). Son una señal de pulso en el método que se activará la toma de datos en el software MALS.
- Lavar la columna y las válvulas con los topes pertinentes: 20 mM Tris-HCl, pH 8, con 50 mM de NaCl para el tampón de lavado (una válvula) y el mismo buffer con 500 mM de NaCl para el tampón de elución (válvula de B). Asegúrese de que el lavado de la columna final utiliza el tampón de Unión, que contiene una baja concentración de sal, para permitir al atascamiento de la proteína de la matriz de la columna. Para un lavado masivo de impurezas fuertemente consolidados, utilice 0.5 M NaOH antes de lavar con los topes pertinentes, seguidos de un lavado de tampón de neutralización.
- Coloque la muestra de proteína en el bucle utilizando una jeringa. Si se carga más de 10 mL de la muestra, utilice un superloop o la válvula de la bomba del instrumento FPLC mientras pasar por la bomba del filtro y el mezclador de la FPLC.
- Iniciar el experimento primero en el software MALS haciendo clic en el botón Ejecutar y luego en el software FPLC. Los datos se recogerán después de recibir la señal de pulso del instrumento a través del detector MALS FPLC.
- Se aplican los mismos parámetros de la gestión y las instrucciones descritas en los pasos 4.1-4.4 Si la IEX-MALS se realiza manualmente con un modo de flujo continuo en lugar de un método independiente.
- Una vez verificado y ejecutar el método final realizar exactamente el mismo método mediante una inyección en blanco (tampón de carga en lugar de la muestra). Es importante que el tiempo entre el pulso de la autoinject y la pendiente de la carrera en blanco es idéntico a la de la muestra que se ejecute.
5. Análisis de datos experimentales de IEX-MALS
- Realizar el análisis paso a paso en la sección de procedimiento en el software MALS. La vista de Colección Basic muestra la colección de datos del experimento.
- Utilice la pestaña Despiking para suavizar los cromatogramas si exhiben mucho ruido. Normalmente, utilizar el nivel normal .
- Definir la línea de base para todas las señales (todos LS, UV y RI detectores) en la vista de línea de base .
- Definir los picos para el análisis en la vista de picos . Verificar los valores correctos de dn/dc y el coeficiente de extinción de UV para la proteína debajo de cada pico.
Nota: Para las proteínas, es común utilizar un valor estándar del incremento de la RI de 0,185 mL/g, pero para otras macromoléculas, se deben utilizar valores diferentes dn/dc, según la naturaleza de la molécula. El dn/dc promedio de polinucleótidos (ADN/ARN) es 0,17 mL/g19, mientras que los sacáridos como la sacarosa, tienen un valor promedio de dn/dc de 0,145 mL/g20 y los valores de dn/dc de lípidos y detergentes oscilan entre 0.1-0.16 mL/g21. - Analizar la masa molar y el radio usando los parámetros de ajuste y la función de correlación con la masa Molar y radio de LS Rh de QELS vistas.
- Los cambios de la señal de RI significativamente durante la IEX-MALS ejecutan debido al aumento en la concentración de sal. Por lo tanto, restar la señal de línea de base de la inyección en blanco para los cálculos de masa que requieren datos de RI.
- Abrir tanto la proteína como experimentos de IEX-MALS en blanco. Haga clic en el nombre de experimento de la proteína, seleccione El método de aplicary elegir la carpeta de Referencia sustracción desde el cuadro de diálogo de archivo. Seleccione el tipo correcto del método (p. ej., en línea) para el análisis estándar de la masa molar. Tenga en cuenta que los parámetros y opciones definidas para el experimento de la proteína se guardarán en el nuevo método abierto.
- En la vista Basal resta , haga clic en Importar en blanco para importar las señales de la carrera en blanco. Instrumentos (junto al botón de Importación en blanco ), revise todo los detectores para restar.
- En la vista de picos , ajuste los valores de dn/dc (si es necesario) debido a la conductividad de la solución en el área de pico de la proteína, ya que la RI de la solución cambia durante la ejecución de12.
- Calibrar el sistema IEX-MALS con monómero de BSA.
Nota: Normalmente, el sistema IEX-MALS es periódicamente calibrado para la alineación de pico, banda ampliación y normalización de los detectores angulares para el detector de 90 º usando una proteína monodispersa con un radio de giro (Rg) de < 10 nm, como monómero de BSA. En este ejemplo, BSA sirve tanto como la molécula de calibración y sí mismo es objeto de análisis molar de la masa.- Alinee las cumbres, bajo los procedimientos > configuración de vista.
- Realizar la normalización bajo la vista de la normalización , entrar a 3.0 nm como el valor deg R.
- Bajo Ampliación de banda en la misma pestaña de configuración , elija el pico y coincide con las UV y LS señales a la señal de RI, utilizando el botón Realizar ajuste .
- El gráfico de los resultados se muestra en la vista de Ajuste de resultados . Cambiar las escalas del eje y otros parámetros del gráfico haciendo clic derecho sobre el gráfico, seleccionar Editary luego haciendo clic en el botón avanzado . Una figura gráfica con más opciones de visualización también está disponible en la ficha Gráfico de EASI : seleccione la Masa Molar en el Mostrar menú desplegable en la parte superior de la ventana.
- Tenga en cuenta que todos los resultados, incluyendo masa molar, radio, nivel de pureza y otros, están disponibles en el Informe (resumido o detallado) en la sección de resultados . Utilice el botón de Report Designer para agregar más resultados o parámetros, así como figuras, al informe.
Representative Results
BSA es una proteína común que se utiliza en cromatografía para la calibración del sistema experimental22 y es muy adecuado para la práctica de IEX-MALS, así como SEC-MALS. Es principalmente monomérica con una masa de monómero teórica de 66,7 kDa y generalmente incorpora un pequeño número de dímeros y oligómeros superiores23.
BSA se analizó en IEX-MALS mediante una columna analítica de intercambio del anión (véase Tabla de materiales). Un ancho lineal gradiente de 30 CV de 75 mM a 350 mM NaCl separada monómeros de BSA de los oligómeros superiores. Posteriores análisis MALS dio lugar a una masa molar de monómero calculado de 66,8 ± 0,7 kDa y una masa molar calculada dimer de 130 ± 5 kDa (figura 1A).
Basado en la conductividad de búfer en los picos eluídas, cambió el gradiente a un programa diferente: un paso largo de 175 mM NaCl seguido de un degradado lineal de 175 mM a 500 mM de NaCl. El nuevo gradiente mejorado considerablemente la resolución y excelente separación entre monómeros de BSA (con una masa molar calculada de 66.1 ± 0,7 kDa) y sus especies oligoméricas superiores (con una masa promedio calculada de 132 ± 2 kDa) (figura 1B). Para centrarse también en las especies oligoméricas alta y calcular las masas molares de cada forma individual oligomérica de la BSA, se aplicó un programa gradual de 200 mM y 250 mM de NaCl. Este experimento dio como resultado una excelente separación entre BSA monómero (con una masa calculada de 62.4 ± 0.4 kDa), dímero (con una masa calculada de 130 ± 10 kDa) y trímero (con una masa calculada de 170 ± 10 kDa) (figura 1C). Todos los experimentos de IEX-MALS muestran que BSA elutes principalmente como monómero con una pureza de 80%, de acuerdo con resultados de SEC-MALS donde monómeros BSA elución con una pureza de 85%12.
Figura 1 : Optimización del experimento de IEX-MALS para BSA. (A) IEX-MALS experimento de BSA con un programa de gradiente de 75 – 350 mM NaCl. (B) IEX-MALS experimento de BSA con un programa de un 175 mM NaCl paso seguido un programa de gradiente lineal de 175 – 500 mM NaCl. (C) IEX-MALS experimento de BSA con un programa de paso de 200 mM y 250 mM de NaCl. Los cromatogramas muestran la UV a 280 luz nm (azul), dispersándose en un ángulo de 90° (rojo) y el índice de refracción (rosa) y las curvas de conductividad (gris) junto con la masa molar de cada pico calculado por MALS (negro). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
IEX-MALS es un método poderoso para separación de proteínas y la caracterización que permite la determinación de masa molar exacta de proteínas puras así como de muestras heterogéneas, caracterización de oligómeros nativos, no nativos agregados, covalentes y no covalente complejos y conjugados de proteínas. Un programa que consta de un degradado lineal o una serie de medidas de concentración de sal puede lograr una buena separación de las poblaciones de proteína y permiten el análisis adecuado de cada pico individual por el MALS. Otra optimización variando diferentes parámetros, como el gradiente de pendiente (ver paso 3.4 del Protocolo), se puede realizar si se requiere una mejor resolución. IEX-MALS puede ser un ensayo de control de calidad de proteína valiosa ya que proporciona un nivel adicional, crítico de la caracterización de la proteína, complementario a otros métodos como la SEC-MALS.
SEC-MALS es una técnica estándar y común para la determinación de masa molar de la proteína, la resolución relativamente baja de las columnas analíticas estándar de la SEC puede limitar medidas masa molares exacta alcanzadas por MALS12. Algunos ejemplos de las limitaciones de la SEC-MALS soluciones que contengan consecutivos oligómeros, altos niveles de agregación que no están totalmente separados del pico de monómero y poblaciones heterogéneas con masas molares similares, tales como proteínas modificadas.
IEX es un método de cromatografía más complejo para diseñar y llevar a cabo de seg, pero la información obtenida de un experimento de IEX-MALS puede complementar y a veces incluso más informativo que análisis SEC-MALS. IEX-MALS ha caracterizado con éxito variantes de anticuerpos que comparten el mismo oligómeros molares masivos, que no están totalmente separados en SEC y péptidos cortos que son difíciles de analizar por SEC12,24. También, ensamblados macromoleculares que son demasiado grandes para ser separados por SEC, como partículas vacías de virus adeno-asociado (AAV), completo (que contiene ADN viral) pueden resolverse por IEX25 antes del análisis MALS. Comparado con el SEC, IEX ofrece mayor diversidad de capacidades de separación14 y tiene la flexibilidad de ajustar varios parámetros para aumentar la resolución máxima, como tampón de pH, tipo de sal, tipo y longitud de la columna y otros. A diferencia de la SEC, no hay ninguna limitación de volumen para la inyección de la muestra en IEX, y cualquier molécula puede ser analizada independientemente de su tamaño (ver tabla 1 en Amartely et al.12). Esto es una gran ventaja de IEX-MALS, principalmente para las muestras con una baja intensidad de LS, proteínas de muy pequeño tamaño como proteínas diluidas con tendencia a la agregación a la concentración. Columnas analíticas de IEX son más estables y tienden a liberar partículas de menos de columnas de la SEC, IEX-MALS requiere equilibrar muy corto tiempo y señales de LS se estabilizan rápidamente. Esto permite la ejecución de experimentos individuales como se describe en este protocolo y la suspensión de la ejecución según sea necesario.
A diferencia de la SEC, que generalmente proporciona buenos resultados con una sola experimento (utilizando una columna con el rango adecuado fraccionamiento), IEX puede requerir varios experimentos para lograr la óptima resolución de ajuste los parámetros del método. En experimentos de IEX-MALS que se realizan con un gradiente de la sal, la conductividad de búfer y, por lo tanto, la RI cambiar drásticamente durante el arranque, con los consiguientes cambios en la señal de RI. Esto requiere un espacio en blanco adicional de ejecutar para cada experimento de IEX-MALS y un análisis con resta de línea de base (como se describe en el paso 5.2 del Protocolo), a menos que el análisis de la concentración se limita a la detección de UV (que requieren conocimiento a priori de la extinción coeficientes para cada pico). El análisis con sustracción de base es robusto para gradientes lineales, aunque más es todavía hoy requerida para la sustracción de la exitosa línea de base de sal programas paso a paso desarrollo del método. Los valores de dn/dc de cada pico deben ajustarse según la conductividad del búfer específico en el pico eluída (cálculos pueden encontrarse en la literatura12). Si una proteína eluyó a una concentración de NaCl menor que 200 mM (como en el ejemplo de BSA), este ajuste es insignificante.
La relativamente gran cantidad de proteína utilizada en IEX-MALS (como detalla en el paso 2.3 del Protocolo) en comparación con el SEC-MALS es importante superar el dramático cambio de la señal de RI causada por el gradiente de la sal y las fluctuaciones de RI debido a la mezcla imperfecta de la búferes de gradiente. Si sólo detección de UV se utiliza para la medición de la masa, pueden utilizarse cantidades más pequeñas. La cantidad de proteína que se inyecta depende de la masa molar de la proteína, homogeneidad, pureza y el coeficiente de extinción de la UV. La masa necesaria de la inyección debe ser mayor para las proteínas más pequeñas y más bajas para las proteínas más grandes (~ 1 mg a 20 kDa proteína y ~0.2 mg para una proteína de 150 kDa). Muestras heterogéneas requieren inyección de muestra más ya que la cantidad se divide entre varias poblaciones. Analítica alta cromatografía líquida (HPLC) puede requerir menos material que un sistema FPLC.
Recientemente, se ha divulgado en línea análisis con MALS durante procedimientos de purificación. Un análisis en tiempo real es muy eficiente para detectar productos de agregación que se producen durante la depuración y pueden eliminar la necesidad de cualquier análisis adicional de la proteína después de purificación26. Cromatografía de IEX se utiliza con frecuencia como un paso intermedio de purificación; así, la combinación de columnas IEX preparativas con MALS puede ser útil no sólo como un método de caracterización analítica sino también como un análisis en tiempo real de procesos de purificación a gran escala. Nonanalytical IEX columnas también son estables, con un bajo grado de liberación de partículas y, por tanto, pueden utilizarse con MALS. Otras técnicas de separación como la cromatografía de afinidad o la cromatografía de intercambio hidrofóbico, pueden combinarse también con MALS cuando se somete a muestras relativamente puras (para evitar la contaminación de los detectores de MALS y RI). Esto requerirá la adaptación y optimización del método para obtener no sólo separación de buen pico pero LS también suficientemente limpios y RI señales para un acertado análisis MALS.
Disclosures
D.S. es un empleado de Wyatt Technology Corporation, cuyos productos son utilizados en el presente Protocolo. A.T. es un empleado de Danyel Biotech, un distribuidor de instrumentos de Wyatt y ÄKTA.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Dr. Tsafi Danieli (Wolfson centro de biología estructural aplicada, Universidad Hebrea) por sus consejos y colaboraciones. Los autores también agradecen a Danyel Biotech Ltd. (Rehovot, Israel) para la asistencia y establecimiento del sistema FPLC-MALS analítico utilizado en este estudio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ÄKTA pure | GE Healthcare | 29-0182-26 | FPLC |
| 0.02 µm Anotop Whatman Filter 10 mm | GE Healthcare | 6809-1002 | Sample Filter |
| 0.1 µm Anotop Whatman Filter 10 mm | GE Healthcare | 6809-1012 | Sample Filter |
| 0.1 µm Anotop Whatman Filter 25 mm | GE Healthcare | 6809-2012 | Mobile phase filter |
| BSA (purity >97%) | Sigma | A1900 | Bovine serum albumin |
| miniDAWN TREOS | Wyatt Technology | WTREOS | MALS |
| mono Q HR 5/50 GL | GE Healthcare | 17-5166-01 | Anion exchange analytical column |
| Optilab T-rEX | Wyatt Technology | WTREX | Refractometer |
| 0.1 mm PES 1000 mL Stericup | Millipore | SCVPU11RE | Mobile phase filter |
| Sodium chloride | Sigma | 71382 | HPLC grade NaCl |
| TRISMA base | Sigma | T-1503 | TRIS buffer |
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