Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Ионообменной хроматографии (IEX) в сочетании с мульти-угол рассеяния света (MALS) для разделения белков и характеристика

Published: April 5, 2019 doi: 10.3791/59408
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Wolfson Centre for Applied Structural Biology, The Alexander Silberman Institute of Life Science, The Hebrew University of Jerusalem, 2Wyatt Technology Corporation, 3Danyel Biotech Ltd

Summary

Этот протокол описывает использование высокой специфичности ионообменная хроматография с мульти-угол рассеяния света для точного определения молярной массы белков, белковых комплексов и пептидов в гетерогенной пробе. Этот метод является ценным для оценки качества, а также как характеристика родной олигомеров, заряд вариантов и образцы смешанные протеина.

Abstract

Ионообменная хроматография с мульти-угол рассеяния света (IEX-МЭЛС) является мощный метод для разделения белков и характеристика. Сочетание высокой специфика разделения методики, которую IEX с точной молярной массы анализа, достигается MALS позволяет характеристика гетерогенных белков образцов, включая смеси олигомерных форм или белка населения, даже с очень Подобные молярной массы. Таким образом IEX-МЭЛС обеспечивает дополнительный уровень белка характеристика и дополняет стандартный размер-гель-проникающей хроматографии с мульти-угол рассеяния света (SEC-МЭЛС) техники.

Здесь мы описываем протокол для основных IEX-МЭЛС экспериментировать и продемонстрировать этот метод на бычьим сывороточным альбумином (БСА). IEX отделяет BSA его олигомерных форм, позволяя молярной массы анализ MALS каждой формы. Оптимизации эксперимента IEX-МЭЛС также представил и продемонстрировал на ЗБТ, достижения отличное разделение между BSA мономеров и больших олигомеров. IEX-МЭЛС является полезен для оценки качества белка, так как он обеспечивает тонкой сепарации и молярной массы определение нескольких видов белков, которые существуют в образце.

Introduction

Количественная характеристика белковых продуктов все более важное значение как средство контроля качества (КК), и для целей регулирования в биофармацевтической промышленности и гарантировать надежность и целостность жизни науки исследования1 , 2. как описано на веб-сайтах белка сетей производства белка и очистки партнерство в Европе (P4EU) и объединения ресурсов для биофизических исследований в Европе и молекулярной биофизики в Европе (ARBRE-MOBIEU) (https://p4eu.org/protein-quality-standard-pqs и https://arbre-mobieu.eu/guidelines-on-protein-quality-control, соответственно), белок КК должны характеризоваться не только чистота конечного продукта, но также его олигомерных государства, однородность, личность, конформации, структура, Посттрансляционная изменения и другие свойства3,4.

Одним из наиболее распространенных методов КК характеристика — SEC-МЭЛС. В этом методе столбец аналитической SEC сочетается МЭЛС и спектрофотометрические и рефрактометрический детекторы, включение точных измерений молярной массы белка каждого пика5. SEC-МЭЛС определяет Молярная масса eluted пиков независимо от громкости элюции и преодолевает неточность аналитических сек, с помощью столбца калибровки. Добавление динамического рассеяния света (DLS) модуля добавляет возможность измерения размера, позволяя определение гидродинамических радиус. В научных исследованиях, SEC-МЭЛС обычно используется для определения состояния олигомерных белок, ее конформации, уровень чистоты, уровень агрегирования и изменение белков, таких как гликопротеины или липидов солюбилизирован мембранных белков (определить Молярная масса белка и сопряженные компоненты отдельно)6,,78.

Во многих случаях окончательный белок процесс очистки не является хорошо ворит молекулярных видов, но скорее включает некоторые неоднородности. Белков в такой смеси могут быть разнообразны с точки зрения структуры (например, различные олигомерных формы), конформации или изоформ белка. Гетерогенность белка также может быть результатом незначительных химических различий, вызванных C-терминала лизин обработки или аспарагин/глютамина дезаминирование, ведущих к взимать вариация9,10. Различия в Посттрансляционная модификации, такие как гликозилирования может также привести к гетерогенных образцы с заряд вариации9. Эти различные типы гетерогенности отражаются в биофизические характеристики белков и может повлиять на стабильность и биологическая активность целевого белка11.

Надежный контроль качества анализов образцов таких разнородных требуют весьма резолютивной аналитическое разделение техника. Бывают случаи, когда хорошее разделение может быть оспорено достичь с Аналитические колонки SEC, ввиду их ограниченной резолюции и разделения способности12, привело недостатки SEC-МЭЛС анализа. Сочетание высокой специфика разделения техника например IEX с MALS может преодолеть ограничение SEC-МЭЛС в гетерогенных образцов и обеспечивают дополнительный метод для белка характеристика (таблица 1 в Amartely et al.12). В отличие от SEC, который отделяет макромолекул, их гидродинамические размер13, IEX отделяет макромолекул, их поверхности бесплатно14. Анион обмен (AIEX) и катионного обмена (CIEX) матриц bind негативно и позитивно взимается варианты, соответственно. С тонкой разделения между населением белков, которые имеют относительно близко массы или форму IEX-МЭЛС успешно определяет Молярная масса каждого государства индивидуальных белков в смеси образца12.

Здесь мы представляем стандартный протокол для запуска эксперимента IEX-МЭЛС для разделения и анализа BSA олигомерных форм, которые существуют в той же пробы. Выбор IEX колонку для определенного белка является важным и обсуждены, а также pH и проводимости условия буферов. Анализ экспериментальных данных IEX-МЭЛС также описаны шаг за шагом. Хотя разделение BSA олигомеров, хороший и достаточно в SEC-МЭЛС, BSA является хорошим примером показать возможности IEX-МЭЛС и продемонстрировать оптимизацию эксперимента. В предыдущем исследовании12рассматриваются примеры достигнутых SEC-МЭЛС и надлежащего разделения и анализа, активизируемые IEX-МЭЛС бедных разделения.

Protocol

1. Подготовка системы

  1. Установить систему жидкостной хроматографии (ПСОК) быстро белка и MALS/Рефракционная индекс (RI) детекторы (см. Таблицу материалы) вместе с их соответствующих программных пакетов для управления, сбора данных и анализа на производителей инструкции.
  2. Соедините MALS ри детекторы и ниже по течению ПСОК УФ и проводимости детекторов. Обход детектор pH, если это абсолютно необходимо для рН градиенты, чтобы свести к минимуму объем interdetector между детекторы УФ и МЭЛС. Используйте капиллярную трубку 0,25 – 0,5 мм внутренний диаметр (и.д.) между столбцом и детекторы и 0,75 мм i.d. капиллярной трубки на выходе детектора ри сборщику отходов или дроби.
  3. Убедитесь, что были созданы необходимые сигнала соединения между ПСОК и детекторы, включая аналоговый выход УФ от ПСОК детектора к входу Aux МЭЛС и цифровой выход из ПСОК в МЭЛС Autoinject, через поле ввода-вывода.

2. Подготовка образца и буфера

  1. Фильтр все реагенты, включая стиральные и элюции буферов, с 0,1 мкм фильтром. Фильтрации первые 50 – 100 мл буфера в бутылку отходов с целью ликвидации частиц от сухой фильтров и держать на оставшуюся часть буфера в чистой, стерильные бутылки, тщательно промывают отфильтрованной водой и ограничен для предотвращения проникновения пыли.
  2. Настроить образец BSA рН и ионной силы (например, рН = 8, 50 мм NaCl) привязки к столбцу IEX, которые позволяют во время разрежения, ультрафильтрация или буфер обмена процедур.
    Примечание: Рекомендуется префильтра образец протеина в наименьший размер поры, что не удалить материал интерес (0,02 — 0,1 мкм). Кроме того образец можно центрифугируется на высокой скорости (13 000-16 000 x g) за 10 мин, с тем чтобы осаждения крупных частиц.
  3. Подготовить по крайней мере 0,3 – 0,5 мг BSA (см. Таблицу материалы) для вставки в столбец 1 мл (5/50 мм) для достижения хорошего качества MALS анализ. Обратите внимание, что объем впрыска не ограничено.

3. Выбор и разработка метода IEX для белок

  1. Вычислите Изоэлектрическая точка (pI) белка на основе первичной последовательности, для которых серверов, таких как Protparam средство на ExPASy веб-сайт может быть используется15. Обратите внимание, что pI BSA-5.8.
  2. Выберите параметры столбца тип и буфера.
    1. Используйте различные буферы для AIEX и CIEX, в зависимости от pK буфера и ионный характер буфера. Использование катионных буферов при выполнении AIEX столбец и анионными буферов при выполнении CIEX столбец с небольшой counterions. В этом примере используется 20 мм трис-HCl буфере, pH 8, для анализа BSA на столбец AIEX.
    2. Для белка с pI, ниже чем 7, такие как BSA используйте AIEX столбца и буфер с рН выше чем Пи по крайней мере двух единиц. Для протеина с pI, выше, чем 7 Используйте CIEX столбца и буфер с рН ниже, чем белок Пи по крайней мере двух единиц.
    3. Оптимизируйте буфер рН по прочности привязки между белком и столбца матрицы. Если белок не связывать также столбец, используйте pH дальше от Пи. Убедитесь, что белок является стабильным на уровне используемых pH.
    4. Использование низкой концентрации соли в привязке и мыть буферы, чтобы разрешить связывание белка в матрице, поскольку связывания белков зависит от ионной силы загруженного образца. Белки, как правило, требуют некоторые соли для их устойчивости; Таким образом используйте NaCl 50 мм (или альтернативного соли) во время белка загрузки и столбец промывание шаги.
    5. Элюирующий буфер используется максимум 0.5 М NaCl для отсоединения белка из столбца.
      Примечание: Выше концентрация соли не рекомендуется при работе с стандарт модель ри рефрактометр из-за ограничения диапазона инструмента. Однако модель высокой концентрации может использоваться и будет вместить 2 М NaCl.
  3. Выполните исходный метод следующим образом.
    1. Загрузить 1 мг BSA (170 мкл 6 мг/мл) в мл ~0.5 загрузки буфера буфера 20 мм трис-HCl, рН 8, содержащая 50 мм NaCl. Промойте колонку с тот же буфер для тома столбец 10 – 15 (CV) разрешить полный элюции несвязанных молекул и частиц из системы до рассеяния света (LS), УФ, и Ри сигналы полностью стабилизировалась.
    2. Выполните короткий, линейной соли градиент 20 – 30 CV, используя Элюирующий буфер 20 мм трис-HCl, рН 8, содержащий 0,5 М NaCl для отсоединения белка из столбца. Выполните градиент 0%-100% (или альтернативного широко градиент) Элюирующий буфер или разделить его на два градиенты: 0 – 50% Элюирующий буфер следуют дополнительные градиент из 50 – 100% Элюирующий буфер, каждый градиент для CV 10 – 20. Для BSA, использовать градиент широко 15% – 70% для 30 CV для первоначального метода.
      Примечание: В некоторых случаях первоначальный метод может обеспечить разделение для надежного анализа MALS, и нет необходимости в дополнительных бежит. Во многих случаях первоначальный метод предоставляет только руководством для дальнейшей оптимизации метода.
  4. Оптимизация метода IEX увеличить разрешение и улучшить разделение пик путем изменения различных параметров.
    1. Измените градиент наклона и длины. Короткие градиенты с высоких склонах обеспечивают интенсивные пики с менее разделения, а длинные градиенты с мягким склонам обеспечивают более низких пиков с лучшего разделения. Найти баланс между пика интенсивности резолюции и сигнал для оптимального MALS анализа.
      Примечание: Загрузка выше количество белка может увеличить LS, УФ, и Ри сигналы, но не так за счет резолюции.
    2. Используйте профиль ступенчатой концентрации соли для элюции. Помните, что часто используется сочетание действия и линейный градиент.
    3. Уменьшение расхода для улучшения разделения пик.
      Примечание: Для матриц с очень малых частиц, это не очень значительным.
    4. Измените pH буфера для увеличения заряда различия между населением белка в образце и улучшить разделение между этими вариантами. Обратите внимание, что белки, которые должным образом не разделены на один рН могут быть разделены на разные рН.
    5. Используйте pH градиента, линейные или поэтапно, чтобы отделить белки от IEX столбца. Использование элюции градиенты, которые сочетают pH и концентрации соли вариации при необходимости.
    6. Для увеличения чувствительности и резолюции16используйте сильнее солей, например MgCl2или более слабой соли, например, натрия ацетат.
    7. Используйте больше IEX столбцы или другой столбец матрицы с меньших частиц для улучшения разделения способностей.
    8. Измените тип столбца (AIEX/CIEX) для предоставления другой шаблон разделения. Обратите внимание, что матрицы с лигандами сильные, слабые или комбинированной (смешанной) также доступны и могут улучшить разрешение некоторых образцов.
    9. Используйте столбец от разных поставщиков с же лиганд, который прилагается к другой матрице смолы. Смола, независимо от лиганд, можно по-разному взаимодействуют с белками и влияют на разделение профиля.
    10. Включайте добавки (молекул, которые стабилизировать белка в растворе) в буферах улучшить стабильность белков и избежать белок агрегации, чтобы улучшить IEX эксперимент.
      Примечание: Примеры таких добавок являются сахара, спирты, мочевина, неионогенные или цвиттерионными моющих средств, и chaotropic и kosmotropic солей17,18.

4. IEX-МЭЛС эксперимент

  1. Открыть New\Experiment из метода в МЭЛС программного обеспечения и выберите метод онлайн из системной папки методами Рассеяния света . Если модуль DLS доступен и DLS данные должны быть приобретены, выберите метод онлайн из подпапки Свет Scattering\With QELS .
  2. Задайте параметры запуска в разделе конфигурации .
    1. Установите скорость потока выполнения в разделе Общий насос скорость потока, используемые в ПСОК (1,5 мл/мин) и введите или проверить параметры буфера в разделе растворителя .
    2. Введите имя белка (BSA), показатель преломления приращения (dn/dc; стандарт для белков значение 0.185 мл/г), коэффициент вымирания УФ на длине волны 280 Нм (0,66 г/Л-1·cm-1) и концентрация белка образца (6 мг/мл) в Пример вкладки в разделе инжектор . Вставьте объем образца для инъекций (170 мкл), а также в том же разделе.
    3. На вкладке Основные коллекции в разделе процедуры , установите флажок триггер на Autoinject и установите продолжительность выполнения так, что будет продолжен сбор данных по крайней мере 5 минут после того, как градиент достиг своей конечное значение.
  3. Установите параметры эксперимент в программном обеспечении ПСОК.
    1. Создайте новый эксперимент в вкладке Редактора метода . Начальный эксперимент будет линейный градиент соли или рН (см. шаг 3.3). Для оптимизированного метода, создать более конкретные градиент или поэтапная программа по итогам элюции во время первоначального метода (см. шаг 3.4 и рис. 1). Включите в метод, который будет инициировать сбор данных в программном обеспечении MALS импульсный сигнал.
    2. Вымойте столбца и клапаны с соответствующих буферов: 20 мм трис-HCl, рН 8, с 50 мм NaCl Отмывающий буфер (клапан) и тот же буфер с 500 мм NaCl для Элюирующий буфер (B клапан). Убедитесь, что последний столбец мыть использует буфер привязки, с низкой концентрацией соли, чтобы включить привязку белка к матрице столбца. Для массивных вымыть сильно привязанных примесей используйте 0.5 M NaOH до мытья с соответствующим буферы, после чего буфера мытья нейтрализации.
    3. Поместите образец протеина в цикле с помощью шприца. Если загружена более чем 10 мл образца, используйте superloop или клапан насоса ПСОК инструмента минуя фильтр насоса и микшер ПСОК.
  4. Сначала запустите эксперимент в МЭЛС программного обеспечения, нажав на кнопку запуска , а затем в программном обеспечении ПСОК. Данные будут собираться после получения сигнала импульса от ПСОК инструмент через детектор МЭЛС.
  5. Примените те же параметры запуска и инструкциям, описанным в шагах 4.1-4.4 Если IEX-МЭЛС производится вручную в режиме непрерывного потока вместо отдельного метода.
  6. После того, как последний метод проверен и запустить, выполните точно тот же метод с использованием пустой инъекции (загрузки буфера вместо образца). Важно, что время между autoinject пульс и градиент пустой выполнения идентична запуска образца.

5. анализ экспериментальных данных IEX-МЭЛС

  1. Выполните анализ шаг за шагом в разделе процедуры в МЭЛС программного обеспечения. В Основной коллекции отображаются сбора первичных данных эксперимента.
    1. Используйте вкладку Despiking гладкой хроматограм, если они проявляют много шума. Как правило используете нормальный уровень.
    2. Определение базовой линии для всех сигналов (все LS, УФ и Ри детекторы) в представлении базовой линии .
    3. Пики для анализа определите в представлении пиков . Проверьте правильные значения dn/dc и коэффициент вымирания УФ для белков под каждого пика.
      Примечание: Для белков, он является общим для использовать стандартное значение приращения ри 0.185 мл/г, но для других макромолекул, различные dn/dc значения должны использоваться, в зависимости от характера молекулы. Средняя dn/dc полинуклеотидов (ДНК/РНК) составляет 0,17 мл/г19, хотя углеводов, таких как сахароза, имеют значение средняя dn/dc 0,145 мл/г20 и значения dn/dc липидов и моющих средств в диапазоне между 0,1 – 0,16 g21.
    4. Анализируйте Молярная масса и радиус, используя параметры установки и функции корреляции под видом Молярная масса и радиус от LS и Rh от QELS .
  2. РИ сигнал изменения значительно во время IEX-МЭЛС выполняются за счет увеличения концентрации соли. Таким образом вычтите базовый сигнал от пустой инъекции для массовых вычислений, которые требуют ри данных.
    1. Откройте как белок, так и пустой IEX-МЭЛС экспериментов. Щелкните правой кнопкой мыши на имя эксперимент белка, выберите Применить методи выберите папку Вычитание из диалогового окна файла. Выберите правильный тип метода (например, Интернет) для стандартных молярной массы анализа. Обратите внимание, что параметры и настройки, определенные для белка эксперимента будут сохранены на нового открытого метода.
    2. Согласно мнению Вычитание щелкните Импорт пустой импортировать сигналы пустой выполнения. Под инструментами (рядом с кнопкой Импорт пустой ) Проверьте все детекторы для вычитания.
    3. В представлении пиков отрегулируйте значения dn/dc (при необходимости) благодаря проводимости раствора на площадь пика белка, так как ри решения изменяется во время выполнения12.
  3. Калибровки системы IEX-МЭЛС с BSA мономера.
    Примечание: Как правило, система IEX-МЭЛС периодически откалиброван для пик выравнивание, расширение диапазона и нормализации угловой детекторы детектор 90°, использование монодисперсных белка с радиусом инерции (Rg) < 10 Нм, Например, BSA мономера. В этом примере BSA служит как молекулы калибровки и сам предмет молярной массы анализа.
    1. Выравнивание вершины, в соответствии с процедурами > Просмотр конфигурации .
    2. Выполняют нормализацию в представлении нормализации , ввод 3.0 Нм как значение Rg .
    3. В разделе Расширение группы в той же вкладке Конфигурация выберите пик и матч УФ и LS сигналы на ри сигнал, с помощью кнопки Выполнить Fit .
  4. График результатов отображаются в представлении Результаты установки . Изменение шкалы оси и другие параметры диаграммы, щелкните правой кнопкой мыши на диаграмме, выбрав изменитьи затем нажав на кнопку Дополнительно . Фигура графа с больше вариантов отображения также доступен на вкладке EASI графа : выберите Молярная масса отображения раскрывающегося меню в верхней части окна.
  5. Обратите внимание, что все результаты, включая Молярная масса, радиуса, уровень чистоты и другие, доступны в представлении отчета (резюме и подробный) в разделе результаты . Используйте кнопку Конструктор отчетов для добавить больше результатов или параметров, а также цифры, в отчет.

Representative Results

BSA является общий белок, который используется для калибровки экспериментальной системы22 в хроматографии и отлично подходит для практикующих IEX-МЭЛС, а также SEC-МЭЛС. Это главным образом мономерных массой теоретической мономера 66,7 кДа и обычно включает в себя небольшое количество димеры и выше олигомеров23.

BSA была проанализирована на IEX-МЭЛС, используя столбец аналитический обмен анион (см. Таблицу материалы). Широкий линейного градиента, состоящий из 30 CV от 75 мм до 350 мм NaCl отделены BSA мономеров из высших олигомеров. Вниз по течению MALS анализ привел в вычисляемых мономера Молярная масса 66,8 ± 0,7 кДа и вычисляемые димер Молярная масса 130 ± 5 кДа (рис. 1А).

Основываясь на буфер проводимости на вершины eluted, градиент был изменен на другой программы: длинный шаг 175 мм NaCl следуют линейный градиент от 175 мм до 500 мм NaCl. Новый градиент значительно улучшилась резолюции и отличное разделение BSA мономера (с вычисляемого Молярная масса 66.1 ± 0,7 кДа) и его высших олигомерных видов (с расчетная средняя масса 132 ± 2 кДа) (рис. 1Б). Чтобы также сосредоточить внимание на высокой олигомерных видов и расчет молярной массы каждой олигомерных формы БСА, поэтапная программа 200 мм и 250 мм NaCl был применен. Этот эксперимент результате отличное разделение между мономера (с расчетная масса 62,4 ± 0,4 кДа) BSA, димер (с расчетная масса 130 ± 10 кДа) и тример (с расчетная масса 170 ± 10 кДа) (рис. 1C). Все IEX-МЭЛС эксперименты показывают, что BSA elutes главным образом в качестве мономера с чистотой 80%, по согласованию с SEC-МЭЛС результаты, где BSA мономеров элюировать с чистотой 85%12.

Figure 1
Рисунок 1 : Оптимизация IEX-МЭЛС эксперимента для BSA. (A) IEX-МЭЛС эксперимент БСА с помощью градиента программы 75 – 350 мм NaCl. (B) IEX-МЭЛС эксперимент БСА с программой 175 мм NaCl шаг последовал линейного градиента программа 175 – 500 мм NaCl. (C) IEX-МЭЛС эксперимент БСА с программой шагом 200 мм и 250 мм NaCl. Хроматограммы отображения UV на 280 Нм (синий), свет, рассеяние на угол 90° (красный) и преломления (розовый) и проводимости (серый) кривых вместе с Молярная масса каждого пика, вычисляемая МЭЛС (черный). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

IEX-МЭЛС-это мощный метод для разделения белков и характеристика, которая позволяет точное молярной массы определение чистого белков, а также гетерогенных образцы, характеризующие родной олигомеров, неродном агрегатов, ковалентных и нековалентных комплексы и сложные белки. Программа, состоящая из линейного градиента или серию шагов, концентрация соли может обеспечить хорошее разделение белков населения и позволяют надлежащего анализа каждого индивидуального пика МЭЛС. Дальнейшая оптимизация путем изменения различных параметров, таких как градиент склона (см. шаг 3.4 протокола), может быть выполнена, если лучшее разрешение не требуется. IEX-МЭЛС может быть пробирного контроля качества полноценного белка, так как он обеспечивает дополнительные, критический уровень характеристика белков, дополняет другие методы, такие как SEC-МЭЛС.

Хотя SEC-МЭЛС стандартные и традиционные техники для молярной массы определения белка, относительно низкое разрешение стандартного аналитического SEC столбцов может ограничить Точная Молярная измерений массы, достигнутый MALS12. Некоторые примеры ограничений SEC-МЭЛС решения, которые содержат последовательных олигомеров, высокий уровень агрегирования, которые полностью не отделены от мономера пик и разнородных популяций с аналогичные молярной массы, такие как изменение белки.

IEX-это более сложный метод хроматографии для проектирования и выполнения чем сек, однако информация, полученная из эксперимента IEX-МЭЛС может дополнять и иногда быть еще более информативным, чем анализ SEC-МЭЛС. IEX-МЭЛС успешно характеризуется варианты антитела, которые разделяют же молярной массы, олигомеры, которые не разделяются полностью на SEC и короткие пептиды, которые трудно анализировать SEC12,24. Кроме того макромолекулярных сборки, которые слишком велики, чтобы быть разделены SEC, таких как полный (содержащий вирусной ДНК) и пустой частицы аденоассоциированный вирус (AAV), может быть решена IEX25 до MALS анализа. По сравнению с SEC, IEX предлагает более разнообразные возможности разделения14 , и она имеет гибкость корректировки нескольких параметров, чтобы увеличить разрешение пик, например буфер рН, типы соли, типы и длины столбца, и др. В отличие от SEC, существует ограничение громкости для образца инъекций в IEX, и любой молекулы могут быть проанализированы независимо от его размера (см. таблицу 1 в Amartely et al.12). Это большое преимущество IEX-МЭЛС, главным образом для образцов с низкой интенсивностью LS, например очень маленькие белки или разбавленных белки с тенденцией для агрегирования по концентрации. Так как аналитические колонки IEX являются более стабильными и выпустить меньше частиц, чем SEC колонны, как правило, IEX-МЭЛС требует уравновешивания очень короткое время, и LS сигналы стабилизируются очень быстро. Это позволяет запуск отдельных экспериментов, как описано в настоящем Протоколе и остановка выполнения при необходимости.

В отличие от SEC, которая обычно обеспечивает прекрасные результаты с только один эксперимент (с помощью столбца с правой фракционирование диапазон), IEX может потребовать несколько экспериментов для достижения оптимального разрешения путем настройки параметров метода. В экспериментах IEX-МЭЛС выполняются с градиентом соли, буфер проводимость и, следовательно, Ри резко изменить во время выполнения, с последующими изменениями на ри сигнал. Это требует дополнительное пустое, запускать для каждого IEX-МЭЛС эксперимента и анализ с вычитание (как описано в шаге 5.2 протокола), если анализ концентрации ограничивается УФ обнаружения (требует априорного знания вымирания коэффициенты для каждого пика). Анализ с вычитание надежными для линейных градиентов, несмотря на то, что дальнейшее развитие метода все еще требуется для успешного вычитание соли ступенчатой программ. Dn/dc значения каждого пика должны корректироваться согласно конкретных буфера проводимости на eluted пик (вычисления можно найти в литературе12). Если белок этого eluted при концентрации NaCl, ниже, чем 200 мм (как в примере BSA), эта корректировка является незначительным.

Относительно большое количество белка, используемых в IEX-МЭЛС (как описано в шаге 2.3 протокола), по сравнению с SEC-МЭЛС важно преодолеть драматические изменения сигнала ри, вызванные соль градиента и Ри колебания из-за несовершенной смешивания градиент буферов. Если УФ обнаружения используется для измерения массы, только меньшие суммы может быть использован. Количество белка для вставки зависит от Молярная масса белка, однородности, чистоты и коэффициент вымирания УФ. Необходимости вводят масса должна быть выше для более малые протеины и ниже для более крупных белков (~ 1 мг за 20 кДа белками и ~0.2 мг для 150 kDa белок). Гетерогенных образцы требуют введения более образца, так как количество делится между несколькими населения. Аналитические высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) может потребоваться меньше материала, чем система ПСОК.

Недавно было сообщено в линии анализ с использованием MALS во время процедуры очистки. Такой анализ в реальном времени является очень эффективным для обнаружения статистической продукции, которые возникают во время очистки и может устранить необходимость для любого дальнейшего анализа белка после очистки26. IEX хроматографии часто используется в качестве промежуточного очистки шага; Таким образом сочетание препаративные IEX столбцов с MALS может быть полезным не только как метод аналитических характеристик, но и как в реальном времени анализ крупномасштабных очистительных процедур. Nonanalytical IEX столбцы также являются стабильными, с низкой степенью выпускать частиц и, таким образом, может быть использован с МЭЛС. Другие методы разделения, например аффинной хроматографии или гидрофобные обмен хроматографии, могут также сочетаться с MALS подвергано к относительно чистой пробы (чтобы избежать загрязнения МЭЛС и Ри детекторов). Это потребует адаптации и оптимизации метода для получения не только хороший пик разделения, но также достаточно чистой LS и Ри сигналы для успешного анализа МЭЛС.

Disclosures

D.S. является сотрудником корпорации Уайат технологии, продукты которых используются в настоящем Протоколе. А.т. является сотрудником Danyel Biotech, дистрибьютор Уайатт и ÄKTA документов.

Acknowledgments

Авторы благодарят доктор Tsafi Danieli (Wolfson центр применяется структурной биологии, Еврейский университет) за ее советы и сотрудничество. Авторы также поблагодарить Danyel Biotech Ltd. (Реховот, Израиль) за помощь и создание аналитической системы ПСОК-МЭЛС, используемые в данном исследовании.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ÄKTA pure GE Healthcare 29-0182-26 FPLC 
0.02 µm Anotop Whatman Filter 10 mm GE Healthcare 6809-1002 Sample Filter
0.1 µm Anotop Whatman Filter 10 mm GE Healthcare 6809-1012 Sample Filter
0.1 µm Anotop Whatman Filter 25 mm GE Healthcare 6809-2012 Mobile phase filter
BSA (purity >97%) Sigma  A1900 Bovine serum albumin
miniDAWN TREOS  Wyatt Technology WTREOS MALS
mono Q HR 5/50 GL GE Healthcare 17-5166-01 Anion exchange analytical column
Optilab T-rEX Wyatt Technology WTREX Refractometer
0.1 mm PES 1000 mL Stericup Millipore SCVPU11RE Mobile phase filter
Sodium chloride Sigma  71382 HPLC grade NaCl
TRISMA base Sigma  T-1503 TRIS buffer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lebendiker, M., Danieli, T., de Marco, A. The Trip Adviser guide to the protein science world: a proposal to improve the awareness concerning the quality of recombinant proteins. BMC Research Notes. 7, 585 (2014).
  2. Raynal, B., Lenormand, P., Baron, B., Hoos, S., England, P. Quality assessment and optimization of purified protein samples: why and how. Microbial Cell Factories. 13, 180 (2014).
  3. Oliveira, C., Domingues, L. Guidelines to reach high-quality purified recombinant proteins. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (1), 81-92 (2018).
  4. Manta, B., Obal, G., Ricciardi, A., Pritsch, O., Denicola, A. Tools to evaluate the conformation of protein products. Biotechnology Journal. 6 (6), 731-741 (2011).
  5. Minton, A. P. Recent applications of light scattering measurement in the biological and biopharmaceutical sciences. Analytical Biochemistry. 501, 4-22 (2016).
  6. Sahin, E., Roberts, C. J. Size-Exclusion Chromatography with Multi-angle Light Scattering for Elucidating Protein Aggregation Mechanisms. Methods in Molecular Biology. 899, 403-423 (2012).
  7. Ogawa, T., Hirokawa, N. Multiple analyses of protein dynamics in solution. Biophysical Reviews. 10 (2), 299-306 (2018).
  8. Rebolj, K., Pahovnik, D., Žagar, E. Characterization of a Protein Conjugate Using an Asymmetrical-Flow Field-Flow Fractionation and a Size-Exclusion Chromatography with Multi-Detection System. Analytical Chemistry. 84 (17), 7374-7383 (2012).
  9. Liu, H., Gaza-Bulseco, G., Faldu, D., Chumsae, C., Sun, J. Heterogeneity of Monoclonal Antibodies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (7), 2426-2447 (2008).
  10. Hintersteiner, B., et al. Charge heterogeneity: Basic antibody charge variants with increased binding to Fc receptors. mAbs. 8 (8), 1548-1560 (2016).
  11. Wei, B., Berning, K., Quan, C., Zhang, Y. T. Glycation of antibodies: Modification, methods and potential effects on biological functions. mAbs. 9 (4), 586-594 (2017).
  12. Amartely, H., Avraham, O., Friedler, A., Livnah, O., Lebendiker, M. Coupling Multi Angle Light Scattering to Ion Exchange chromatography (IEX-MALS) for protein characterization. Scientific Reports. 8 (1), 6907 (2018).
  13. Goyon, A., et al. Evaluation of size exclusion chromatography columns packed with sub-3μm particles for the analysis of biopharmaceutical proteins. Journal of Chromatography A. 1498, 80-89 (2016).
  14. Fekete, S., Beck, A., Veuthey, J. -L., Guillarme, D. Ion-exchange chromatography for the characterization of biopharmaceuticals. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 113, 43-55 (2015).
  15. Gasteiger, E., et al. ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3784-3788 (2003).
  16. Kopaciewicz, W., Regnier, F. E. Mobile phase selection for the high-performance ion-exchange chromatography of proteins. Analytical Biochemistry. 133 (1), 251-259 (1983).
  17. Lebendiker, M., Danieli, T. Production of prone-to-aggregate proteins. FEBS Letters. 588 (2), 236-246 (2014).
  18. Lebendiker, M., Maes, M., Friedler, A. A screening methodology for purifying proteins with aggregation problems. Methods in Molecular Biology. 1258, 261-281 (2015).
  19. Fu, D., et al. Ultraviolet refractometry using field-based light scattering spectroscopy. Optics Express. 17 (21), 18878-18886 (2009).
  20. Scafati, A. R., Stornaiuolo, M. R., Novaro, P. Physicochemical and Light Scattering Studies on Ribosome Particles. Biophysical Journal. 11 (4), 370-384 (1971).
  21. Berthaud, A., Manzi, J., Pérez, J., Mangenot, S. Modeling Detergent Organization around Aquaporin-0 Using Small-Angle X-ray Scattering. Journal of the American Chemical Society. 134 (24), 10080-10088 (2012).
  22. Umrethia, M., Kett, V. L., Andrews, G. P., Malcolm, R. K., Woolfson, A. D. Selection of an analytical method for evaluating bovine serum albumin concentrations in pharmaceutical polymeric formulations. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 51 (5), 1175-1179 (2010).
  23. Hirano, A., Arakawa, T., Kameda, T. Effects of arginine on multimodal anion exchange chromatography. Protein Expression and Purification. 116, 105-112 (2015).
  24. Avraham, O., Bayer, E. A., Livnah, O. Crystal structure of afifavidin reveals common features of molecular assemblage in the bacterial dimeric avidins. The FEBS Journal. , (2018).
  25. Lock, M., Alvira, M. R., Wilson, J. M. Analysis of Particle Content of Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 8 Vectors by Ion-Exchange Chromatography. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 56-64 (2012).
  26. Patel, B. A., et al. Multi-angle light scattering as a process analytical technology measuring real-time molecular weight for downstream process control. mAbs. 10 (7), 945-950 (2018).

Tags

Биохимия выпуск 146 ионного обмена (IEX) мульти-угол рассеяния света (MALS) хроматография разделение белков молекулярный вес бычьим сывороточным альбумином (БСА) олигомеров контроль качества
Ионообменной хроматографии (IEX) в сочетании с мульти-угол рассеяния света (MALS) для разделения белков и характеристика
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Amartely, H., Some, D., Tsadok, A.,… More

Amartely, H., Some, D., Tsadok, A., Lebendiker, M. Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization. J. Vis. Exp. (146), e59408, doi:10.3791/59408 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter