פרוטוקול זה מתאר השימוש כרומטוגרפיה גבוהה-ירידה לפרטים-יונים עם פיזור אור רב זווית נחישות המוני טוחנת מדויק של חלבונים, חלבונים מתחמי פפטידים במדגם הטרוגנית. שיטה זו היא ערך להערכת איכות, כמו גם באשר אפיון oligomers מקורית, מטען גרסאות ודוגמאות מעורב-חלבון.
כרומטוגרפיה יונים עם פיזור אור רב זווית (IEX-MALS) היא שיטה חזקה בשביל חלבון הפרדה ואפיון. השילוב של הטכניקה הפרדה גבוהה-ירידה לפרטים IEX בניתוח מדויק טוחנת המוני מושגת על-ידי MALS מאפשרת אפיון דגימות חלבון הטרוגנית, כולל תערובות של טפסים oligomeric או חלבון אוכלוסיות, בכלל עם מאוד ההמונים טוחנת דומה. לכן, IEX-MALS מספק רמה נוספת של חלבון אפיון, משלים כרומטוגרפיה הוצאת בגודל סטנדרטי עם טכניקת פיזור אור רב זווית (שניה-MALS).
כאן נתאר פרוטוקול IEX-MALS הבסיסית הניסוי, להדגים בשיטה זו על שור אלבומין (BSA). IEX מפריד BSA כדי צורותיה oligomeric המאפשר ניתוח המוני טוחנת מאת MALS של כל טופס בודדים. אופטימיזציה של ניסוי IEX-MALS הוא גם הציג, הפגינו על BSA, להשגת הפרדה מצוינת בין מונומרים BSA oligomers גדול יותר. IEX-MALS היא טכניקה חשוב להערכת איכות חלבון מאז שהיא מספקת ההפרדה בסדר והן טוחנת המוני קביעה של מספר מינים חלבון קיים במדגם.
אפיון כמותי של מוצרי חלבון חיוני יותר ויותר כאמצעי בקרת איכות (QC), שניהם למטרות רגולציה בענף ביולוגיות וכדי להבטיח את אמינות ויושרה של מדעי החיים מחקר1 , 2. כפי שמתואר על האתרים של חלבונים רשתות ייצור החלבון ושותפות טיהור ב אירופה (P4EU), איגוד של משאבים עבור מחקר Biophysical באירופה, ביופיסיקה מולקולרית באירופה (ארברה-MOBIEU) (https://p4eu.org/protein-quality-standard-pqs ו- https://arbre-mobieu.eu/guidelines-on-protein-quality-control, בהתאמה), חלבון QC יש לאפיין לא רק את הטוהר של המוצר הסופי, אבל מצבו oligomeric גם, הומוגניות, זהות. קונפורמציה, מבנה, שינויים posttranslational ואחרים מאפיינים3,4.
אחת השיטות הנפוצות ביותר של אפיון QC היא שניה-MALS. בשיטה זו, טור שניה אנליטי רתומה MALS, גלאי spectrophotometric, refractometric, המאפשרים מדידות מדויקות של המסה טוחנת חלבון של כל שיא5 שניה-MALS קובע את המסה טוחנת פסגות eluted ללא תלות • תנאי האחסון, מתגבר על אי-הדיוק של ה-SEC אנליטי באמצעות כיול עמודה. התוספת של מודול דינאמי (DLS) אור-פיזור מוסיף יכולת המדידה בגודל המאפשר קביעת הרדיוס hydrodynamic. במחקר אקדמי, שניה-MALS משמש בדרך כלל כדי לקבוע את מצב oligomeric של חלבון, קונפורמציה שלה, הרמה של טוהר, ברמה של צבירת, וחלבונים שונה, כגון glycoproteins או solubilized-השומנים קרום חלבונים (לקבוע המסה טוחנת של חלבון ו נזווג את הרכיבים בנפרד)6,7,8.
במקרים רבים, החלבון הסופי של תהליך טיהור אינו זן מולקולרית טוב-defined אך מעדיף כוללת כמה הטרוגניות. החלבונים בתערובת כאלה יכולים להיות מגוונים מבחינת מבנה (לדוגמה, oligomeric בצורות שונות), הייצורים החיים, או חלבון איזופורמים. החלבון הזה יכול להיות גם תוצאה של הבדלים משניים כימי הנגרם על ידי עיבוד ליזין C-מסוף או דיאמינציה אספרגין/גלוטמין, מובילים להאשים וריאציה9,10. הבדלים posttranslational שינויים כגון גליקוזילציה יכול גם להוביל דגימות הטרוגנית עם תשלום וריאציות9. אלה סוגים שונים של הטרוגניות משתקפים מאפיינים ביופיזיקלי של החלבון, יכולים להשפיע על יציבות, פעילות ביולוגית של חלבון המטרה11.
בקרת איכות אמינים מבחני דוגמאות כאלה הטרוגנית דורשים טכניקה מאוד resolutive ההפרדה האנליטית. ישנם מקרים שבהם ניתן לערער הפרדה טובה להשיג עם עמודות שניה אנליטית, עקב שלהם מוגבל רזולוציה והפרדה היכולות12, וכתוצאה מכך ניתוח שניה-MALS פגום. שילוב של טכניקה הפרדה גבוהה-ירידה לפרטים כגון IEX עם MALS ניתן להתגבר על המגבלה של שניה-MALS בדגימות הטרוגנית, מספקות שיטה משלימה איפיון חלבונים (טבלה 1 Amartely et al.12). בניגוד שניה, המפריד בין מקרומולקולות מאת שלהם גודל hydrodynamic13, IEX מפריד מקרומולקולות מאת שלהם תשלום משטח14. Exchange אניון (AIEX) ו- bind מטריצות קטיון (CIEX) באופן שלילי ולא חיובי טעונה גרסאות, בהתאמה. עם הפרדה בסדר בין אוכלוסיות חלבון המשתפים מסה יחסית קרוב או צורה, IEX-MALS בהצלחה קובע את המסה טוחנת של כל מדינה חלבונים בודדים גם עם תערובת מדגם12.
כאן אנו מציגים פרוטוקול תקני לביצוע ניסוי IEX-MALS ההפרדה וניתוח של צורות oligomeric BSA הקיימים במדגם זהה. הבחירה של עמודת IEX על חלבון ספציפי היא חשובה ולא נדונה, כמו גם התנאים pH, מוליכות של מאגרי. הניתוח של נתוני הניסוי IEX-MALS גם מתואר צעד אחר צעד. למרות ההפרדה של BSA oligomers טובה ומספקת ב- SEC-MALS, BSA היא דוגמה טובה כדי להראות את היכולות IEX-MALS וכדי להדגים אופטימיזציה של ניסוי. דוגמאות המסכן ההפרדה מושגת על ידי שניה-MALS, הפרדה נכונה וניתוח מופעל על-ידי IEX-MALS הם דנו גם עם המחקר הקודם12.
IEX-MALS היא שיטת רב עוצמה חלבון הפרדה ואפיון המאפשרת קביעת המוני טוחנת מדויק טהור חלבונים כמו גם החל מדגמים הטרוגנית, אפיון oligomers מקורית, אגרגטים לא מקוריים, קוולנטיות, noncovalent מתחמי ולאחר conjugated חלבונים. תוכנית בהיקף של מעבר צבע ליניארי או סדרה של צעדים ריכוז המלחים ניתן להשיג הפרדה טובה של אוכלוסיות חלבון ולאפשר ניתוח נכון של כל שיא בודדים על-ידי MALS. נוספים מיטוב על ידי שינוי פרמטרים שונים, כגון שיפוע המדרון (ראה שלב 3.4 לפרוטוקול), יכול להתבצע אם נדרשת רזולוציה טובה יותר. IEX-MALS יכול להיות assay בקרת איכות חלבון בעל ערך מאז שהיא מספקת רמה נוספים, קריטי של חלבון אפיון, משלים בשיטות אחרות כגון שניה-MALS.
בעוד שניה-MALS היא טכניקה סטנדרטי, נפוץ לקביעת מסה טוחנת חלבון, ברזולוציה נמוכה יחסית של הטורים התקניים שניה אנליטי עלולה להגביל מדידות מדויקות טוחנת המוני מושגת על ידי MALS12. כמה דוגמאות של המגבלות של שניה-MALS כוללים פתרונות המכילים oligomers רצופים, רמות גבוהות של צבירת שאינם מופרדים לחלוטין מתוך מונומר שיא ולאחר אוכלוסיות הטרוגניות עם ההמונים טוחנת דומים, כגון חלבונים ששונה.
IEX היא שיטת כרומטוגרפיה מורכבים יותר לעצב ולבצע יותר שניה, אבל המידע המתקבל ניסוי IEX-MALS יכול להשלים, לפעמים להיות אינפורמטיבי אפילו יותר מאשר ניתוח שניה-MALS. IEX-MALS בהצלחה אפיינו את גרסאות נוגדן המשתפים oligomers אותה מסה, טוחנת שהרווח לא לגמרי שניה ולאחר פפטידים קצרים קשה לנתח שניה12,24. כמו כן, הרכבות macromolecular גדולים מדי כדי להיות מופרדים על-ידי שניה, מלא (המכיל DNA נגיפי) ו ריק חלקיקי וירוס adeno-הקשורים (AAV), יכולים להיפתר על ידי IEX25 לפני ניתוח MALS. בהשוואה ל- SEC, IEX מציע הפרדה יותר מגוונת יכולות14 ויש לו את הגמישות של התאמת מספר פרמטרים כדי להגדיל את הרזולוציה שיא, כגון מאגר pH, סוגי מלח, סוגי ואת האורך של העמודה, ואחרים. בניגוד שניה, יש ללא מגבלה נפח להזרקה מדגם ב IEX, בכל מולקולה ניתן לנתח באופן עצמאי את גודלו (Amartely et al.12, ראה טבלה 1). זהו יתרון גדול של IEX-MALS, בעיקר עבור דגימות בעוצמה נמוכה LS, כגון חלבונים קטנים מאוד או חלבונים מדולל עם נטייה לצורך צבירת על ריכוז. מאז עמודות IEX אנליטי יציבים יותר, נוטים לשחרר חלקיקים פחות מאשר שניה טורים, IEX-MALS דורש זמן קצר מאוד equilibration, האם אותות התייצבו מהר מאוד. דבר זה מאפשר הפעלה של ניסויים בודדים כפי שמתואר פרוטוקול זה, לעצור את המרוץ כנדרש.
בניגוד שניה, אשר בדרך כלל מספק תוצאות בסדר עם היחידה להתנסות (באמצעות עמודה עם הטווח fractionation נכון), IEX עשויים לדרוש מספר ניסויים כדי להשיג רזולוציה מיטבית על-ידי כיוונון הפרמטרים בשיטה. בניסויים IEX-MALS המבוצעים במילוי הדרגתי מלח, מוליכות מאגר ושנה, לפיכך, המהלכים הנכונים באופן דרמטי במהלך הריצה, עם שינויים הסוגר האות רי. פעולה זו דורשת של ריק נוספים להפעיל עבור ניסוי IEX-MALS וניתוח עם חיסור בסיסית (כפי שמתואר בשלב 5.2 לפרוטוקול), אלא אם כן הניתוח ריכוז מוגבלת לזיהוי UV (הדורשים ידע א-פריורי של הכחדה המקדמים עבור כל שיא). הניתוח עם חיסור בסיסית היא חזקה למעברי צבע קוויים, אף-על-פי בהמשך פיתוח של שיטת נדרש עדיין עבור חיסור בסיסית מוצלחת של תוכניות stepwise מלח. הערכים dn/dc של כל שיא צריך להיות מותאם על פי מוליכות מאגר ספציפי על פסגת eluted (חישובים ניתן למצוא ספרות12). אם חלבון eluted-NaCl ריכוז נמוך מ-200 מ מ (כמו בדוגמה של BSA), התאמה זו הוא זניח.
כמות יחסית גדולה של חלבון בשימוש IEX-MALS (כמו שלב ושלב ב 2.3 לפרוטוקול) בהשוואה ל- SEC-MALS חשוב להתגבר על השינוי הדרמטי של האות רי הנגרמת על ידי מעבר הצבע המלח ותנודות רי עקב ערבוב לא מושלם של מאגרי הדרגתיות. אם רק לזיהוי UV משמש למדידה המוני, עשוי לשמש כמויות קטנות יותר. כמות חלבון כדי להזריק תלוי המסה טוחנת של החלבון, הומוגניות, טוהר, המקדם הכחדה UV. המסה מוזרק הכרחי צריך להיות גבוה יותר עבור חלבונים קטנים יותר נמוך יותר עבור חלבונים גדולים יותר (~ 1 מ”ג עבור 20 kDa חלבונים ו ~0.2 מ”ג ל חלבון 150 kDa). דוגמאות הטרוגנית דורשות הזרקה מדגם יותר מאז הכמות מחולק בין מספר אוכלוסיות. ביצועים גבוהים אנליטי כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) עשוי לדרוש פחות חומר מאשר מערכת FPLC.
לאחרונה, דווח בשורה ניתוח באמצעות MALS במהלך הליכי טיהור. ניתוח כזה בזמן אמת יעיל מאוד לזיהוי מוצרים צבירת להתרחש במהלך טיהור יכול לבטל את הצורך עבור כל ניתוח נוסף של החלבון לאחר טיהור26. כרומטוגרפיה IEX משמש לעתים קרובות כשלב ביניים טיהור; לפיכך, השילוב של עמודות IEX מפוח עם MALS יכול להיות שימושי לא רק כמו שיטת אפיון האנליטית אלא גם כמו ניתוח בזמן אמת של תהליכי טיהור בקנה מידה גדול. עמודות IEX nonanalytical גם הם יציבים, עם רמה נמוכה של חלקיקים שחרור, לכן, ניתן להשתמש עם MALS. שיטות ההפרדה אחרים, כגון כרומטוגרפיית זיקה או כרומטוגרפיה הידרופובית, יכול גם להיות משולב עם MALS כאשר נתון דגימות יחסית טהורה (כדי למנוע זיהום של גלאי MALS ואת RI). זה ידרוש ההסתגלות, אופטימיזציה של השיטה כדי להשיג לא רק הפרדה שיא טוב אבל האם גם מספיק נקי ואת RI אותות עבור ניתוח מוצלח MALS.
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים ד ר צאפי דניאלי (מרכז וולפסון עבור להחיל ביולוגיה מבנית, האוניברסיטה העברית) על לה עצות ושיתופי פעולה. המחברים מודים גם דניאל ביוטק בע מ (רחובות) על סיוע והקמת מערכת FPLC-MALS אנליטית מנוצל במחקר זה.
ÄKTA pure | GE Healthcare | 29-0182-26 | FPLC |
0.02 µm Anotop Whatman Filter 10 mm | GE Healthcare | 6809-1002 | Sample Filter |
0.1 µm Anotop Whatman Filter 10 mm | GE Healthcare | 6809-1012 | Sample Filter |
0.1 µm Anotop Whatman Filter 25 mm | GE Healthcare | 6809-2012 | Mobile phase filter |
BSA (purity >97%) | Sigma | A1900 | Bovine serum albumin |
miniDAWN TREOS | Wyatt Technology | WTREOS | MALS |
mono Q HR 5/50 GL | GE Healthcare | 17-5166-01 | Anion exchange analytical column |
Optilab T-rEX | Wyatt Technology | WTREX | Refractometer |
0.1 mm PES 1000 mL Stericup | Millipore | SCVPU11RE | Mobile phase filter |
Sodium chloride | Sigma | 71382 | HPLC grade NaCl |
TRISMA base | Sigma | T-1503 | TRIS buffer |