Denne protokollen beskriver bruk av høy-spesifisitet ion-exchange kromatografi med multi-Angle lysspredning for en nøyaktig molar masse bestemmelse av proteiner, protein komplekser og peptider i en heterogen prøve. Denne metoden er nyttig for kvalitetsvurdering, så vel som for karakterisering av innfødte oligomers, gratis varianter og blandet-protein prøver.
Ion-exchange kromatografi med multi-Angle lysspredning (IEX-MALS) er en kraftig metode for proteiner og karakteristikk. Kombinasjonen av høy-spesifisitet separasjon teknikken IEX med nøyaktig molar masse analyse av MALS lar karakterisering av heterogene protein blodprøver, inkludert blandinger av oligomeric skjemaer eller protein befolkninger, selv med svært lignende molar massene. Derfor IEX-MALS gir et ekstra nivå av protein karakterisering og er utfyllende til den standard størrelse-utestenging kromatografi med multi-Angle lysspredning (SEC-MALS) teknikk.
Her beskriver vi en protokoll for en grunnleggende IEX-MALS eksperimentere og demonstrerer denne metoden på storfe serum albumin (BSA). IEX skiller BSA oligomeric former slik at en molar masse analyse av MALS av hvert enkelt skjema. Optimalisering av et IEX-MALS eksperiment er også presentert og vist på BSA, oppnå gode skille mellom BSA monomerer og større oligomers. IEX-MALS er en verdifull teknikk for protein kvalitetsvurdering siden det gir både fine separasjon og molar masse fastsettelse av flere protein som finnes i et utvalg.
Kvantitativ karakteristikk av protein produkter er stadig mer avgjørende for kvalitetskontroll (QC), både for reguleringer i biofarmasøytisk industri og garantere pålitelighet og integritet av livet vitenskap forskning1 , 2. som beskrevet på hjemmesidene til protein nettverk Protein produksjon og rensing samarbeid i Europa (P4EU) og foreningen av ressurser for Biofysiske forskning i Europa og molekylære biofysikk i Europa (ARBRE-MOBIEU) (https://p4eu.org/protein-quality-standard-pqs og https://arbre-mobieu.eu/guidelines-on-protein-quality-control, henholdsvis), protein QC må karakterisere ikke bare renheten av det endelige produktet, men også sin oligomeric tilstand, homogenitet, identitet, konformasjon, struktur, posttranslational modifikasjoner og andre egenskaper3,4.
En av de vanligste QC karakterisering metodene er sek-MALS. I denne metoden er en analytisk SEC kolonne kombinert MALS og Spektrofotometri og refractometric detektorer, slik at presise målinger av protein molar massen hver topp5. SEC-MALS bestemmer molar masse eluted toppene lydstyrken elueringsrør, og overvinner unøyaktighet i analytisk SEC bruke kolonnen kalibrering. Tillegg av en dynamisk lys-spredning (DLS) modul legger størrelse måling evne slik at etter radius besluttsomhet. I akademisk forskning, SEC-MALS brukes vanligvis til å fastslå oligomeric tilstanden til et protein, sin konformasjon, nivået av renhet, aggregering, og endret proteiner, som glykoproteiner eller lipid-solubilized membran proteiner (fastsette den molar masse protein og bøy komponentene individuelt)6,7,8.
I mange tilfeller det siste proteinet av en renselsesprosess er ikke en godt definert molekylær arter men heller består av noen heterogenitet. Proteinene i slike en blanding kan varieres i struktur (for eksempel ulike oligomeric former), konformasjonen eller protein isoformene. Protein heterogenitet kan også være et resultat av mindre kjemisk forskjeller forårsaket av C-terminalen lysin behandling eller asparagine/glutamin deamination, fører til belaste variant9,10. Forskjeller i posttranslational modifikasjoner som glykosylering kan også føre til heterogene prøver med gratis variasjoner9. Disse typer heterogenitet gjenspeiles i protein’s Biofysiske egenskaper og kan påvirke stabiliteten og biologisk aktivitet målet protein11.
Pålitelig kvalitetskontroll analyser av slike heterogene prøver krever en svært resolutive analytisk separasjon teknikk. Det er tilfeller hvor god separasjon kan utfordres til å oppnå med analytiske SEC kolonner, på grunn av sin begrensede oppløsning og separasjon evner12, som resulterer i feil SEC-MALS analyse. Kombinerer en høy spesifisitet separasjon teknikk som IEX med MALS kan overvinne begrensning av SEC-MALS i heterogene prøver og komplementære metode for protein karakterisering (tabell 1 i Amartely et al.12). I motsetning til SEC, som skiller makromolekyler av deres etter størrelse13, skiller IEX makromolekyler av deres overflate kostnad14. Anion exchange (AIEX) og cation exchange (CIEX) matriser bind ladet negativt og positivt varianter, henholdsvis. Med et fint skille mellom protein populasjoner som deler en relativt tett masse eller figur, fastsettes IEX-MALS molar masse hver individuelle protein stat i en blanding eksempel12.
Her presenterer vi en standardprotokoll for å kjøre et IEX-MALS eksperiment for separasjon og analyse av BSA oligomeric former som finnes i samme utvalget. Valget av en IEX-kolonne for et bestemt protein er viktig og diskutert, samt de pH og ledningsevne forholdene i buffrene. Analyse av IEX-MALS eksperimentelle data er også beskrevet trinn for trinn. Selv om separasjon av BSA oligomers er gode og tilstrekkelig i SEC-MALS, er BSA et godt eksempel viser IEX-MALS mulighetene og demonstrere optimalisering av et eksperiment. Eksempler på dårlig separasjon av SEC-MALS og riktig separasjon og analyse aktivert av IEX-MALS er omtalt i en tidligere studie12.
IEX-MALS er en kraftig metode for proteiner og karakterisering som lar nøyaktig molar masse fastsettelse av ren proteiner også fra heterogene prøver, karakteriserer innfødte oligomers, finne aggregat, Kovalente og noncovalent komplekser, og conjugated proteiner. Et program som består av en lineær forløpning eller en rekke saltkonsentrasjon trinn kan oppnå en god separasjon av protein befolkningen og la riktig analyse av hver individuelle peak av MALS. Ytterligere optimalisering av varierende ulike parametere, for eksempel gradering skråningen (se trinn 3.4 protokollen), kan utføres hvis en bedre oppløsning. IEX-MALS kan være en verdifull protein kvalitetskontroll analysen siden det gir et ekstra, kritisk nivå av protein karakterisering, utfyllende til andre metoder som SEC-MALS.
SEC-MALS er en standard og felles teknikk for protein molar masse besluttsomhet, kan analytiske SEC standardspalter relativt lav oppløsning begrense nøyaktig molar masse målinger av MALS12. Noen av begrensningene for SEC-MALS eksempler som inneholder påfølgende oligomers, høye nivåer av aggregering som ikke er fullstendig atskilt fra monomer peak og heterogene populasjoner med lignende molar massene, som endret proteiner.
IEX er en mer kompleks kromatografi metode for å utforme og gjennomføre enn SEC, men informasjonen fra et IEX-MALS eksperiment kan utfylle og være enda mer informative enn SEC-MALS analyse. IEX-MALS har med hell preget antistoff varianter som deler de samme molar masse, oligomers som ikke er fullstendig skilt på SEC og kort peptider som er vanskelige å analysere av SEC12,24. Macromolecular samlinger som er for stor til å være atskilt av SEC, som full (inneholder virus-DNA) og tom partikler av adeno-assosiert virus (AAV), kan også løses ved IEX25 før MALS analyse. Sammenlignet med SEC, IEX tilbyr mer variert separasjon evner14 og har fleksibilitet til å justere flere parametere for å øke topp oppløsning, for eksempel buffer pH, salt, typer og lengden av kolonnen, og andre. I motsetning til SEC, det er ingen volumbegrensning for eksempel injeksjon i IEX, og et molekyl kan analyseres uavhengig av størrelsen (se tabell 1 i Amartely et al.12). Dette er en stor fordel av IEX-MALS, hovedsakelig for prøver med en lav LS intensitet, som svært små proteiner eller utvannet proteiner med en tendens til samling på konsentrasjon. Siden analytisk IEX kolonner er mer stabil og slipp færre partikler enn SEC kolonner, IEX-MALS krever svært kort balanse tid og LS signaler er stabilisert veldig fort. Dette gjør at driften av individuelle eksperimenter som beskrevet i denne protokollen og stopp av Kjør som nødvendig.
I motsetning til SEC, som vanligvis gir gode resultater med bare én eksperimentet (med en kolonne med høyre fraksjoneres området), IEX kan kreve flere eksperimenter for å oppnå optimal oppløsning ved å justere metodeparameterne. IEX-MALS eksperimenter som utføres med salt gradering, buffer ledningsevne, og derfor RI endre dramatisk under kjøringen, med påfølgende endringer RI signalet. Dette krever en ekstra tom kjøre for hvert IEX-MALS eksperiment og en analyse med planlagte subtraksjon (som beskrevet i trinn 5.2 protokollen) med mindre konsentrasjon analysen er begrenset til UV gjenkjenning (krever en priori kunnskap om utryddelse koeffisientene for hver topp). Analysen med planlagte subtraksjon er robust lineære forløpninger selv om videre utvikling av metoden er fortsatt nødvendig for vellykket planlagte subtraksjon av salt gradvis programmer. Dn/dc verdiene for hver topp bør justeres i henhold til tjenestespesifikke bufferen ledningsevne på eluted toppen (beregninger kan bli funnet i litteraturen12). Hvis et protein elut på en NaCl konsentrasjon lavere enn 200 mM (som i eksemplet BSA), denne justeringen er ubetydelig.
Den relativt store mengden protein brukes i IEX-MALS (som beskrevet i trinn 2.3 protokollen) sammenlignet med SEC-MALS er viktig å overvinne den dramatiske endringen av RI forårsaket av salt graderingen og RI svingninger på grunn av imperfektum blanding av den gradient buffere. Hvis bare UV klippsøking for masse måling, kan mindre mengder brukes. Mengden av protein for å injisere avhenger av molar masse protein, homogenitet, renhet og UV utryddelse koeffisient. Nødvendig injisert massen bør være høyere for mindre proteiner og lavere for større proteiner (~ 1 mg for en 20 kDa protein og ~0.2 mg for en 150 kDa protein). Heterogen prøver kreve injeksjon av flere prøven siden antallet deles mellom flere populasjoner. Analytiske Væskekromatografi (HPLC) kan kreve mindre materiale enn et FPLC system.
Nylig, innebygd analyse bruker MALS under rensing prosedyrer har blitt rapportert. Så sanntid analyse er svært effektiv for å oppdage samling produkter som oppstår under rensing og kan eliminere behovet for noen videre analyse av proteinet etter rensing26. IEX kromatografi brukes ofte som en mellomliggende rensing trinn; Dermed kan kombinasjonen av skytevåpen IEX kolonner med MALS være nyttig ikke bare som en analytisk karakterisering metode men også som en analyse i sanntid av storskala rensing prosedyrer. Nonanalytical IEX-kolonner er også stabilt, med en lav grad av partikkel slippe, og derfor kan brukes med MALS. Andre separasjon teknikker, for eksempel affinitet kromatografi eller hydrofobe exchange Ture, kan også kombineres med MALS når de utsettes for ren prøver (for å unngå forurensning av de MALS og RI detektorer). Dette krever tilpasning og optimalisering av metoden ikke bare god peak separasjon men også tilstrekkelig ren LS og RI signaler for en vellykket MALS analyse.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Dr. Tsafi Danieli (Wolfson senter for anvendt strukturell biologi, hebraiske universitetet) for hennes råd og samarbeid. Forfatterne takker også Danyel Biotech Ltd (Rehovot, Israel) for hjelp og etablering av analytisk FPLC-MALS systemet benyttes i denne studien.
ÄKTA pure | GE Healthcare | 29-0182-26 | FPLC |
0.02 µm Anotop Whatman Filter 10 mm | GE Healthcare | 6809-1002 | Sample Filter |
0.1 µm Anotop Whatman Filter 10 mm | GE Healthcare | 6809-1012 | Sample Filter |
0.1 µm Anotop Whatman Filter 25 mm | GE Healthcare | 6809-2012 | Mobile phase filter |
BSA (purity >97%) | Sigma | A1900 | Bovine serum albumin |
miniDAWN TREOS | Wyatt Technology | WTREOS | MALS |
mono Q HR 5/50 GL | GE Healthcare | 17-5166-01 | Anion exchange analytical column |
Optilab T-rEX | Wyatt Technology | WTREX | Refractometer |
0.1 mm PES 1000 mL Stericup | Millipore | SCVPU11RE | Mobile phase filter |
Sodium chloride | Sigma | 71382 | HPLC grade NaCl |
TRISMA base | Sigma | T-1503 | TRIS buffer |