Det här protokollet beskriver användningen av hög-specificitet-jonbyteskromatografi som med flera vinklar ljusspridning för en noggrann molära massan bestämning av proteiner, proteinkomplex och peptider i ett heterogent urval. Denna metod är värdefullt för kvalitetsbedömning, såväl som för karakterisering av infödda oligomerer, kostnad varianter och blandat-protein prover.
Jonbyteskromatografi med flera vinklar ljusspridning (IEX-MALS) är en kraftfull metod för protein separation och karakterisering. Kombinationen av hög-specificitet separation tekniken IEX med korrekt molära massan analysen uppnås genom MALS tillåter karakterisering av heterogena protein prover, inbegripet blandningar av Oligomera former eller protein populationer, även med mycket liknande molar massorna. Därför IEX-MALS ger en extra nivå av protein karakterisering och är ett komplement till standard storlek-utslagning kromatografi med flera vinklar ljusspridning (SEC-MALS) teknik.
Här beskriver vi ett protokoll för en grundläggande IEX-MALS experimentera och Visa denna metod på bovint serumalbumin (BSA). IEX skiljer BSA att dess Oligomera former som tillåter en molär massa analys av MALS av varje enskilt formulär. Optimering av ett IEX-MALS experiment presenteras också och visade på BSA, att uppnå utmärkt separation mellan BSA monomerer och större oligomerer. IEX-MALS är en värdefull teknik för protein kvalitetsbedömning eftersom det ger både fin separation och molar massa Bestämning av flera protein arter som finns i ett urval.
Kvantitativa karaktärisering av proteinprodukter är allt viktigt som ett medel för kvalitetskontroll (QC), både för tillsynen inom den biofarmaceutiska industrin och att garantera tillförlitlighet och integritet life science forskning1 , 2. enligt beskrivningen på webbplatserna för protein nätverk proteinproduktion och rening partnerskap i Europa (P4EU) och föreningen av resurser för biofysiska forskning i Europa och molekylär biofysik i Europa (ARBRE-MOBIEU) (https://p4eu.org/protein-quality-standard-pqs och https://arbre-mobieu.eu/guidelines-on-protein-quality-control, respektive), protein QC måste prägla inte bara renheten av den slutliga produkten, men också dess Oligomera tillstånd, homogenitet, identitet, konformation, struktur, posttranslationell ändringar och andra egenskaper3,4.
En av de vanligaste metoderna för QC-karakterisering är SEC-MALS. I denna metod, är en Analyskolonn SEC kopplat till MALS och spektrofotometrisk och Fruktköttets detektorer, möjliggör noggranna mätningar av protein molära massan av varje topp5. SEC-MALS bestämmer molära massan av de eluerade topparna oberoende av elutionsvolymen och övervinner Felaktigheten av analytiska SEC använder kolumnen kalibrering. Tillägg av en dynamisk ljus-spridning (DLS) modul lägger storlek mätning kapacitet vilket gör att hydrodynamiska radien bestämning. Akademisk forskning, SEC-MALS vanligtvis används för att avgöra Oligomera tillstånd för ett protein, dess konformation, graden av renhet, nivå av aggregation och modifierade proteiner, såsom glykoproteiner eller lipid-solubilized membranproteiner (avgöra den Molmassa för protein och konjugat komponenter individuellt)6,7,8.
I många fall slutliga proteinet av en reningsprocess är inte en väl-definierade molekylstorleken utan består snarare av vissa heterogenitet. Proteinerna i sådan blandning kan varieras i form av struktur (till exempel olika Oligomera former), konformationer eller protein isoformer. Protein heterogenitet kan också vara en följd av mindre kemiska skillnader orsakas av C-terminal lysin bearbetning eller asparagin/glutamin Deaminering, leder till debitera variation9,10. Skillnader i posttranslationell ändringar, till exempel glycosylation kan också leda till heterogena prover med kostnad variationer9. Dessa olika typer av heterogenitet återspeglas i proteinets biofysiska egenskaper och kan påverka stabilitet och biologiska aktivitet mål protein11.
Pålitlig kvalitetskontroll analyser av dessa heterogena prover kräver en mycket hävningsklausulerna analytiska separation teknik. Det finns fall där god separation kan utmanas att uppnå med analytiska SEC kolumner, på grund av deras begränsade upplösning och separation förmågor12, vilket resulterar i bristfällig SEC-MALS analys. Att kombinera en hög-specificitet separation teknik såsom IEX med MALS kan övervinna begränsning av SEC-MALS i heterogena prover och ge en kompletterande metod för protein karakterisering (tabell 1 i Amartely et al.12). Till skillnad från SEC, som separerar makromolekyler av deras hydrodynamiska storlek13, separerar IEX makromolekyler av deras ytladdning14. Anjon exchange (AIEX) och katjon exchange (CIEX) matriser binder laddade negativt och positivt varianter, respektive. Med en fin separation mellan protein populationer som delar en förhållandevis nära massa eller form, bestämmer IEX-MALS framgångsrikt molära massan av varje enskild protein stat i en blandning prov12.
Här presenterar vi ett standardprotokoll för att köra ett IEX-MALS experiment för separation och analys av BSA Oligomera formulär som finns i samma prov. Valet av en IEX kolumnen för ett visst protein är viktigt och diskuteras, liksom pH och konduktivitet villkoren av buffertar. Analysen av IEX-MALS experimentella data är också beskrivs steg för steg. Även om separation av BSA oligomerer är bra och tillräcklig i SEC-MALS, är BSA ett bra exempel att Visa IEX-MALS funktionerna och demonstrera optimering av ett experiment. Exempel på dålig separation uppnås genom SEK-MALS och ordentlig separation och analys aktiverat av IEX-MALS diskuteras i en tidigare studie12.
IEX-MALS är en kraftfull metod för protein separation och karakterisering som tillåter korrekt molära massan bestämning av rena proteiner samt per heterogena prover, karaktärisera infödda oligomerer, nonnative aggregat, kovalent och noncovalent komplex och konjugerad proteiner. Ett program bestående av en linjär övertoning eller en serie saltkoncentrationen steg kan uppnå en god separation av protein befolkningarna och möjliggöra korrekt analys av varje enskild topp av MALS. Ytterligare optimering genom att variera olika parametrar, såsom lutning lutning (se steg 3,4 i protokollet), kan utföras om en bättre upplösning krävs. IEX-MALS kan vara en värdefull protein kvalitet kontrollanalysen eftersom det ger en ytterligare, kritisk nivå av protein karakterisering, komplement till andra metoder såsom SEC-MALS.
SEC-MALS är en standard och gemensam teknik för protein molära massan beslutsamhet, begränsa den relativt låga matchningen av analytiska SEC standardkolumner noggranna molar massa mätningar genom MALS12. Några exempel på begränsningar av SEC-MALS lösningar som innehåller sammanhängande oligomerer, höga nivåer av aggregation som inte är helt separerade från monomer peak och heterogena populationer med liknande molära massan, såsom modifierade proteiner.
IEX är en mer komplex kromatografi metoden att utforma och genomföra än SEK, men den information som erhålls från ett IEX-MALS experiment kan komplettera och ibland vara ännu mer informativ än SEC-MALS analys. IEX-MALS har framgångsrikt präglat antikropp varianter som delar de samma molära massan, oligomerer som inte är helt separerade på SEC och kort peptider som är svåra att analysera av SEC12,24. Makromolekylära sammansättningar som är för stor för att vara avgränsade med SEC, såsom full (innehållande virus-DNA) och Tom partiklar av adeno-associerade virus (AAV), kan också lösas genom IEX25 före MALS analys. IEX jämfört med SEK, och erbjuder mer varierande separation kapacitet14 och det har flexibiliteten att kunna justera flera parametrar för att öka maximal upplösning, t ex buffert pH, typer av salt, typer och längd av kolumnen, m.fl. Till skillnad från SEC, det finns ingen volymbegränsning för prov injektion i IEX, och någon molekyl kan analyseras oberoende av dess storlek (se tabell 1 i Amartely et al.12). Detta är en stor fördel med IEX-MALS, främst för prover med en lågintensiv LS, såsom mycket små proteiner eller utspädda proteiner med en tendens för aggregering vid koncentrationen. Eftersom analytisk IEX kolumner är stabilare och tenderar att släppa färre partiklar än SEC kolumner, IEX-MALS kräver mycket kort Jämviktstiden tid och LS signaler är stabiliserad mycket snabbt. Detta gör att driften av enskilda experiment som beskrivs i detta protokoll och stoppa av kör som krävs.
Till skillnad från SEC, som vanligtvis ger fina resultat med en enda experiment (med en kolumn med rätt fraktionering utbud), IEX kan kräva flera experiment att uppnå optimal upplösning genom att trimma Metodparametrarna. I IEX-MALS experiment som utförs med en salt lutning, buffert ledningsförmåga och, därmed, RI förändras dramatiskt under körningen, med åtföljande förändringar av RI signalen. Detta kräver en extra Tom köra för varje IEX-MALS experiment och en analys med baslinjen subtraktion (enligt beskrivningen i steg 5.2 i protokollet) om koncentration analysen begränsas till UV-detektion (som kräver en priori kunskap om utrotning koefficienter för varje topp). Analysen med baslinjen subtraktion är robust för linjära övertoningar, även om ytterligare utveckling av metoden krävs fortfarande för den framgångsrika baslinjen subtraktionen av salt stegvis program. Dn/dc värdena för varje topp bör anpassas efter specifika buffert ledningsförmåga på eluerade toppen (beräkningar kan hittas i litteraturen12). Om ett protein elueras vid en koncentration av NaCl som är lägre än 200 mM (som i exemplet med BSA), denna justering är försumbar.
Den relativt stora mängden protein som används i IEX-MALS (enligt beskrivning i steg 2,3 i protokollet) jämfört med SEK-MALS är viktigt att övervinna dramatiska förändringen av RI signalen orsakas av salt toningen och RI svängningar på grund av ofullständig blandning av den Gradient buffertar. Om bara UV-detektion används för massa mätning, får mindre belopp användas. Mängden protein att injicera beror på molära massan av proteinet, homogenitet, renhet och den UV extinktionskoefficient. Den nödvändiga injicerade massan bör vara högre för mindre proteiner och lägre för större proteiner (~ 1 mg för en 20 kDa-protein och ~0.2 mg för en 150 kDa-protein). Heterogena prover kräver injektion av fler prov eftersom kvantiteten delas mellan flera populationer. Analytiska högpresterande vätskekromatografi (HPLC) kan kräva mindre material än ett FPLC system.
Nyligen, i-line analys med MALS under rening förfaranden har rapporterats. Sådan en realtidsanalys är mycket effektiv för att upptäcka aggregering produkter som uppstå vid rening och kan eliminera behovet av vidare analys av protein efter rening26. IEX kromatografi används ofta som en mellanliggande reningssteg; kombinationen av preparativ IEX kolumner med MALS kan således användbar inte bara som en analytisk karakterisering metod men också som en realtidsanalys av storskalig rening förfaranden. Nonanalytical IEX kolumner är också stabil, med en låg grad av partikel släppa och, därför, kan användas med MALS. Andra separation tekniker, såsom affinitetskromatografi eller hydrofoba exchange kromatografi, kan också kombineras med MALS när de utsätts för relativt ren prover (för att undvika kontaminering av de MALS och RI detektorerna). Detta kommer att kräva anpassning och optimering av metoden att få inte bara bra peak separation men också tillräckligt rena LS och RI signaler för en framgångsrik MALS analys.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Dr Tsafi Danieli (Wolfson centrum för tillämpad strukturbiologi, Hebrew University) för hennes råd och samarbeten. Författarna också tacka Danyel Biotech Ltd (Rehovot, Israel) för bistånd och inrättandet av FPLC-MALS analyssystemet utnyttjas i denna studie.
ÄKTA pure | GE Healthcare | 29-0182-26 | FPLC |
0.02 µm Anotop Whatman Filter 10 mm | GE Healthcare | 6809-1002 | Sample Filter |
0.1 µm Anotop Whatman Filter 10 mm | GE Healthcare | 6809-1012 | Sample Filter |
0.1 µm Anotop Whatman Filter 25 mm | GE Healthcare | 6809-2012 | Mobile phase filter |
BSA (purity >97%) | Sigma | A1900 | Bovine serum albumin |
miniDAWN TREOS | Wyatt Technology | WTREOS | MALS |
mono Q HR 5/50 GL | GE Healthcare | 17-5166-01 | Anion exchange analytical column |
Optilab T-rEX | Wyatt Technology | WTREX | Refractometer |
0.1 mm PES 1000 mL Stericup | Millipore | SCVPU11RE | Mobile phase filter |
Sodium chloride | Sigma | 71382 | HPLC grade NaCl |
TRISMA base | Sigma | T-1503 | TRIS buffer |