Summary

Uso de uma única molécula fluorescente hibridação In Situ (FISH-SM) para Quantify e Localize os mRNAs em oócitos murino

Published: April 24, 2019
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Summary

Para reproducibly contar os números dos mRNAs em oócitos individuais, fluorescência única molécula de RNA in situ hibridação (RNA-FISH) foi otimizada para células não-aderentes. Oócitos foram coletados, hibridizados com sondas específicas transcrição e quantificados usando um software de quantificação de imagem.

Abstract

Métodos atuais rotineiramente usados para quantificar o mRNA de oócitos e embriões incluem digital polimerase transcrição reversa reação em cadeia (dPCR), quantitativo, real-time RT-PCR (RT-qPCR) e sequenciação do ARN. Quando estas técnicas são realizadas usando um único oócito ou embrião, baixo-cópia mRNAs confiável não são detectados. Para superar este problema, oócitos ou embriões podem ser agrupados para análise; no entanto, isso muitas vezes leva a alta variabilidade entre as amostras. Neste protocolo, descrevemos o uso da fluorescência hibridação in situ (FISH) usando química de DNA ramificada. Esta técnica identifica o padrão espacial dos mRNAs em células individuais. Quando a técnica está associada a encontrar o local e software de computador de rastreamento, a abundância de mRNAs na célula também pode ser quantificada. Usando esta técnica, há reduzida variabilidade dentro de um grupo experimental e menos oócitos e embriões são necessários para detectar diferenças significativas entre os grupos experimentais. Comercialmente disponível DNA ramificado SM-kits de peixes foram otimizados para detectar mRNAs em secionado tecidos ou células aderentes em slides. No entanto, oócitos efetivamente não adere aos slides e alguns reagentes do kit foram muito duras, resultando em lise do oócito. Para evitar este Lise, várias modificações foram feitas para o kit de peixe. Especificamente, buffers de permeabilização e lavagem de oócito projetados para a imunofluorescência de oócitos e embriões substituiu os buffers de proprietários. A permeabilização, lavagens e incubação com sondas e amplificador foram realizadas em placas de 6-poços e oócitos foram colocados em slides no final do protocolo utilizando meios de montagem. Essas modificações foram capazes de superar as limitações do kit comercialmente disponível, em particular, a lise do oócito. Para precisão e reproducibly contar o número dos mRNAs em oócitos individuais, utilizou-se o software de computador. Juntos, este protocolo representa uma alternativa para PCR e sequenciamento para comparar a expressão de transcritos específicos em células únicas.

Introduction

Transcriptase reversa cadeia da polimerase (PCR) tem sido o padrão-ouro para quantificação de mRNA. Dois ensaios, digital PCR (dPCR)1 e quantitativo, real time PCR (qPCR)2 são utilizados atualmente. Das duas técnicas de PCR, dPCR tem maior sensibilidade do que qPCR, sugerindo que poderia ser usado para medir a abundância de mRNA em células únicas. No entanto, em nossas mãos, dPCR análise de mRNAs baixa abundância nas piscinas de ovócitos de 5 a 10 por cada amostra experimental produziu dados com baixa reprodutibilidade e alta variação3. Isto é provavelmente devido ao erro experimental associado a extração do RNA e transcrição reversa eficiência. A sequenciação do ARN também foi executada usando um único rato e oócitos humanos4,5. Esta técnica requer etapas de amplificação do cDNA necessárias para a geração de biblioteca que provavelmente aumenta a variabilidade dentro de um grupo experimental. Além disso, transcrições de baixa abundância podem não ser detectáveis. Embora os preços de sequenciamento caíram nos últimos anos, ainda pode ser custo proibitivo devido ao alto custo das análises de Bioinformática. Finalmente, a localização de mRNA é um processo dinâmico, com alterações espaciais, contribuindo para a proteína função6. Portanto, decidimos para adotar uma técnica que produziria medidas quantitativas precisas e reprodutíveis e localização dos mRNAs individuais em oócitos único.

DNA em cadeia ramificada acoplado a fluorescência hibridação in situ amplifica o sinal de fluorescência em vez de amplificação do RNA/cDNA permita deteção dos mRNAs único em células individuais 7,8,9. O ensaio é realizado através de uma série de hibridização e amplificação (usando DNA em cadeia ramificada) fluorescência rotulagem passos a fim de amplificar o sinal de fluorescência7. A técnica começa com ligação de pares de sonda de 18 a 25-base do oligonucleotide que são complementares a uma específica do mRNA3,8,10. Quinze a vinte pares de sonda são projetados para cada especificidade de transcrição garantindo para a transcrição do alvo. A hibridação de mRNA específico é seguida por sondas pré-amplificador e amplificador que formam uma configuração ramificada. Aproximadamente, 400 rótulo fluorophores bind para cada amplificador, resultando em um 8000-fold aumento na fluorescência permitindo a deteção de mRNAs individuais (Figura 1)11.

Figure 1
Figura 1: esquemático do protocolo SM-peixes. Sequencial hibridização da sonda específica de transcrição, ramificado DNA amplificador e fluoróforo para um destino de mRNA é mostrado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Estudos anteriores usando fluorescência única molécula em situ da hibridação (SM-peixe) localizada β-actina mRNAs em neurônios individuais12 e DNA de papilomavírus humano em câncer de colo uterino de células linhas7. O software de computador, encontrar o local e o programa de rastreamento identifica o sinal fluorescente punctate individual e tem sido usada com sucesso para quantificar o número de mRNAs em cada célula3,13.

Baseado nos resultados da deteção do mRNA em neurônios12, formulamos a hipótese que SM-peixe provaria uma ferramenta útil para dosar os níveis de transcrição de murino oócitos e embriões, incluindo baixa abundância mRNAs. No entanto, a técnica é otimizada para uso com pilhas fixos aderentes e formaldeído fixada parafina incorporado cortes de tecido (FFPE). Oócitos não podem aderir a um slide, mesmo quando eles são revestidos com poli-L-lisina. Além disso, eles são mais frágeis do que as células somáticas e cortes de tecido, resultando em lise celular quando submetido a alguns dos buffers de proprietários em kits comercialmente disponíveis3. Para superar estes desafios, oócitos foram fixo e manualmente transferidos entre gotas dos buffers. Além disso, os buffers de permeabilização e lavagem nos kits foram substituídos para reduzir o lysis da pilha. Sondas preconcebidas são compradas juntamente com o kit de peixe ou transcrições específicas podem ser solicitadas. Cada conjunto de sonda proprietário está disponível em um dos três canais de fluorescência (C1, C2 e C3) para permitir a multiplexação. Na experiência atual, murino oócitos foram manchadas de dual e quantificados usando uma sonda de C2 Nanog e uma sonda de C3 Pou5f1 . Estas sondas foram selecionadas com base em expressão relatado de Nanog e Pou5f1 de oócitos e embriões. Na conclusão das etapas da hibridação, oócitos foram colocados em gotas de mídia anti-desvaneça-se montagem para aplicação de lâminas histológicas. Confocal imagens foram usadas para quantificar o número de sinais fluorescentes punctate que representam os mRNAs individuais. Além de quantificar os mRNAs, imagem também mostrou a distribuição espacial do mRNA específico na célula, quais outros métodos de quantificação de RNA são incapazes de alcançar. Esta técnica provou ter baixa variabilidade dentro de um grupo experimental, permitindo o uso de um menor número de oócitos em cada grupo experimental para identificar diferenças significativas entre os grupos experimentais3.

Protocol

Animais procedimentos foram revisados e aprovados pelo Comitê de uso da Universidade de Nebraska-Lincoln e institucional Cuidado Animal e todos os métodos foram realizados em conformidade com os regulamentos e orientações pertinentes. Para este estudo, CD-1 consanguíneo ratos tem acesso ad libitum chow roedor normal e água; Eles foram mantidos em um 12:12 escuros: ciclo de luz. 1. preparação dos meios de comunicação necessários Para a mídia de base (OMM), adicione 100 mM …

Representative Results

Após a conclusão do protocolo, o resultado será imagens individuais de confocal z-series (Figura 4A e Figura 5), imagens costuradas (Figura 4), e contagens de mRNA (Figura 4B). Quando é executada a multiplexação, haverá também mescladas imagens mostrando o rótulo para dois diferentes mRNAs (<strong class…

Discussion

Uma série de pequenas etapas durante o protocolo irá garantir sucesso fluorescência e contagens exatas dos mRNAs. Em primeiro lugar, o protocolo deve ser realizado imediatamente após a coleta e fixação de oócitos. Observe que o PVP é adicionado para o buffer de fixação paraformaldeído 4% para evitar oócitos grudem uns aos outros. Nós achamos que é necessário realizar o experimento imediatamente após a coleta e fixação de oócitos. Qualquer atraso resulta em um muito menor sinal de fluorescência que res…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos o Dr. Daniel R. Larson por sua generosa ajuda com a instalação e utilização do local encontrando e programa de rastreamento 13 e o apoio técnico da Universidade de Nebraska Lincoln microscopia núcleo para a imagem de microscopia confocal. Este estudo representa uma contribuição da Universidade da divisão de pesquisa agrícola de Nebraska, Lincoln, Nebraska e foi apoiado por fundos de hachura UNL (NEB-26-206/adesão número-232435 e NEB-26-231/adesão número-1013511).

Materials

(±)-α-Lipoic acid Sigma-Aldrich T1395 Alpha Lipoic Acid
Albumin, Bovine Serum, Low Fatty Acid MP Biomedicals, LLC 199899 FAF BSA
BD 10mL TB Syringe Becton, Dickinson and Company 309659 10 mL syringe
BD PrecisionGlide Needle Becton, Dickinson and Company 305109 27 1/2 gauge needle
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C7902 CaCl2-2H2O
Citric acid Sigma-Aldrich C2404 Citrate
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G6152 Glucose
Disodium phosphate Na2HPO4
Easy Grip Petri Dish Falcon Corning 351008 35 mm dish
Edetate Disodium Avantor 8994-01 EDTA
Extra Fine Bonn Scissors Fine Science Tools 14084-08 Straight, Sharp/Sharp, non-serrated, 13mm cutting edge scissors
Fetal Bovine Serum Atlanta biologicals S10250 FBS
Gentamicin Reagent Solution gibco 15710-064 Gentamicin
GlutaMAX-I (100X) gibco 35050-061 Glutamax
Gold Seal Micro Slides Gold Seal 3039 25 x 75mm slides
Gonadotropin, From Pregnant Mares' Serum Sigma G4877 eCG
hCG recombinant NHPP AFP8456A hCG
Hyaluronidase, Type IV-S: From Bovine Testes Sigma-Aldrich H3884 Hyaluronidase
Jewelers Style Forceps Integra 17-305X Forceps 4-3/8", Style 5F, Straight, Micro Fine Jaw
L-(+)-Lactic Acid, free acid  MP Biomedicals, LLC 190228 L-Lactate
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich M2773 MgSO4-7H2O
MEM Nonessential Amino Acids Corning  25-025-Cl NEAA
Microscope Cover Glass Fisher Scientific 12-542-C 25 x 25x 0.15 mm cover slips
Mm-Nanog-O2-C2 RNAscope Probe Advanced Cell Diagnostics 501891-C2 Nanog Probe
Mm-Pou5f1-O1-C3 RNAscope Probe Advanced Cell Diagnostics 501611-C3 Pou5f1 Probe
MOPS Sigma-Aldrich M3183
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Paraformaldehyde
PES 0.22 um Membrane -sterile Millex-GP SLGP033RS 0.22 um filters
Polyvinylpyrrolidone Sigma-Aldrich P0930 PVP
Potassium chloride Sigma-Aldrich 60128 KCl
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 60218 KH2PO4
Prolong Gold antifade reagent invitrogen P36934 Antifade reagent without DAPI
RNAscope DAPI Advanced Cell Diagnostics 320858 DAPI
RNAscope FL AMP 1 Advanced Cell Diagnostics 320852 Amplifier 1
RNAscope FL AMP 2 Advanced Cell Diagnostics 320853 Amplifier 2
RNAscope FL AMP 3 Advanced Cell Diagnostics 320854 Amplifier 3
RNAscope FL AMP 4 ALT A Advanced Cell Diagnostics 320855 Amplifier 4 ALT A
RNAscope FL AMP 4 ALT B Advanced Cell Diagnostics 320856 Amplifier 4 ALT B
RNAscope FL AMP 4 ALT C Advanced Cell Diagnostics 320857 Amplifier 4 ALT C
RNAscope Fluorescent Multiplex Detection Reagents Kit Advanced Cell Diagnostics 320851 FISH Reagent Kit
RNAscope Probe 3-plex Negative Control Probe Advanced Cell Diagnostics 320871 Negative Control
RNAscope Probe 3-plex Positive Control Advanced Cell Diagnostics 320881 Positive Control
RNAscope Probe Diluent Advanced Cell Diagnostics 300041 Probe Diluent
RNAscope Protease III Advanced Cell Diagnositics 322337 Protease III
RNAscope Protease III & IV Reagent Kit Advanced Cell Diagnostics 322340 FISH Protease Kit
RNAscope Protease IV Advanced Cell Diagnostics 322336 Protease IV
S/S Needle with Luer Hub 30G Component Supply Co. NE-301PL-50 blunt 30 gauge needle
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6297 NaHCO3
Sodium chloride Sigma-Aldrich S6191 NaCl
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 306576 NaOH
Sodium pyruvate, >= 99% Sigma-Aldrich P5280 Pyruvate
Solution 6 Well Dish Agtechinc D18 6 well dish
Taurine Sigma-Aldrich T8691 Taurine
Tissue Culture Dish Falcon Corning 353002 60 mm dish
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 Triton X-100

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Cite This Article
Timme, K. R., Wood, J. R. Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes. J. Vis. Exp. (146), e59414, doi:10.3791/59414 (2019).

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