Summary
Pour compter reproductible les numéros des ARNm dans les ovocytes, in situ en fluorescence seule molécule RNA hybridation (RNA-poisson) a été optimisée pour les cellules non adhérentes. Ovocytes ont été recueillis, hybridaient avec des sondes spécifiques de transcription et quantifiées à l’aide d’un logiciel de quantification d’image.
Abstract
Cours méthodes couramment utilisées pour quantifier les ARNm d’ovocytes et d’embryons incluent réaction en chaîne de polymérase de transcription inverse numérique (dPCR), RT-PCR quantitative, en temps réel (RT-qPCR) et le séquençage de RNA. Lorsque ces techniques sont effectuées à l’aide d’un seul ovocyte ou embryon, ARNm de faibles copies n’est pas détectées avec fiabilité. Pour surmonter ce problème, des ovocytes ou des embryons peuvent être regroupés ensemble pour l’analyse ; Toutefois, cela conduit souvent à la grande variabilité entre les échantillons. Dans ce protocole, nous décrivons l’utilisation de l’hybridation in situ fluorescence (FISH) à l’aide de chimie de l’ADN ramifié. Cette technique identifie la répartition spatiale des ARNm dans les cellules individuelles. Lorsque la technique est associée à la recherche de Spot et logiciels de suivi, l’abondance des ARNm dans les cellules peut également être quantifiée. En utilisant cette technique, il existe une variabilité réduite au sein d’un groupe expérimental et moins des ovocytes et des embryons sont nécessaires pour détecter des différences significatives entre les groupes expérimentaux. Disponible dans le commerce ramifiée ADN-SM-kits de poissons ont été optimisés pour détecter les ARNm de coupes de tissus ou cellules adhérentes sur des lames. Cependant, les ovocytes n’adhèrent pas efficacement aux diapositives et certains réactifs de la trousse ont été trop sévères, aboutissant à la lyse de l’ovocyte. Pour éviter cette lyse, plusieurs modifications ont été apportées au kit de poissons. Plus précisément, tampons conçus pour l’immunofluorescence des ovocytes et des embryons de la perméabilisation et lavage ovocyte remplacé les tampons exclusifs. La perméabilisation, lavages et incubations avec amplificateur et sondes ont été réalisées en plaques 6 puits et ovocytes ont été placés sur des lames à la fin du protocole à l’aide de supports de montage. Ces modifications ont été en mesure de surmonter les limitations de la trousse disponible dans le commerce, en particulier, la lyse de l’ovocyte. Pour avec précision et de façon reproductible, compter le nombre des ARNm dans les ovocytes, logiciels a été utilisé. Ensemble, ce protocole représente une alternative à la PCR et séquençage de comparer l’expression des transcriptions précises dans des cellules individuelles.
Introduction
La transcriptase inverse amplification génique (PCR) a été l’étalon-or pour le dosage de l’ARNm. Deux essais, digital PCR (dPCR)1 et quantitative, real time PCR (qPCR)2 sont actuellement utilisés. De ces deux techniques PCR, dPCR a une plus grande sensibilité que qPCR suggérant qu’il pourrait être utilisé pour mesurer l’abondance d’ARNm dans les cellules. Toutefois, dans nos mains, dPCR analyse des ARNm de faible abondance dans les piscines de 5 à 10 ovocytes par chaque échantillon expérimental a produit des données avec faible reproductibilité et de la forte variation3. C’est probablement à cause de l’erreur expérimentale, associé à l’extraction de l’ARN et l’efficacité de la transcriptase inverse. Séquençage de RNA a également effectué à l’aide d’une seule souris et les ovocytes humains4,5. Cette technique requiert des étapes d’amplification de cDNA requis pour la génération de la bibliothèque qui augmente probablement la variabilité au sein d’un groupe expérimental. En outre, les transcriptions de faible abondance ne peuvent pas être détectables. Bien que les prix de séquençage ont baissé ces dernières années, il peut encore être coût prohibitif en raison du coût élevé des analyses bioinformatiques. Enfin, localisation de l’ARNm est un processus dynamique avec des changements spatiaux contribuant à la fonction de protéine6. Par conséquent, nous partîmes à adopter une technique qui produirait des mesures quantitatives précises et reproductibles et localisation des différents mRNAs dans les ovocytes unique.
ADN ramifié couplé à l’hybridation in situ fluorescence amplifie le signal de fluorescence plutôt qu’amplification RNA/cDNA habilitante détection seul ARNm dans les cellules individuelles 7,8,9. L’analyse est réalisée à travers une série d’hybridation, amplification (en utilisant l’ADN ramifié) et fluorescence d’étiquetage afin d’amplifier le signal de fluorescence7étapes. La technique commence par liaison de paires de sonde oligonucléotide de 18 à 25 la base qui sont complémentaires à un8,3,d’ARNm spécifiques10. Quinze à vingt paires de sonde sont conçues pour chaque spécificité de veiller à ce que de transcription pour la transcription de la cible. L’hybridation de l’ARNm spécifique est suivie d’un préamplificateur et amplificateur des sondes qui forment une configuration ramifiée. Environ 400 étiquette fluorophores lier à chaque amplificateur, résultant en une 8000-fold augmentation de fluorescence permettant la détection des différents mRNAs (Figure 1)11.
Figure 1 : schéma du protocole SM-poisson. Séquentielle hybridation d’une sonde spécifique de transcription, ramifiée amplificateur ADN et fluorophore vers une cible apparaît à l’ARNm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Des études antérieures utilisant des molécules simples fluorescence in situ hybridation (SM-FISH) localisée β-actine ARNm dans différents neurones12 et virus du papillome humain ADN dans le cancer du col utérin cellule lignes7. Les logiciels Spot trouver et Tracking Program identifie chaque signal fluorescent ponctuée et a été utilisé avec succès pour quantifier le nombre des ARNm dans chaque cellule3,13.
Selon les résultats de détection de l’ARNm dans les neurones12, nous avons supposé que SM-poisson s’avérera un outil utile pour quantifier les niveaux de transcription en murines ovocytes et d’embryons, y compris les ARNm de faible abondance. Cependant, la technique est optimisée pour une utilisation avec les cellules adhérentes fixes et formaldéhyde fixé paraffine intégrée des sections de tissu (FFIP). Ovocytes ne peuvent adhérer à une diapositive, même lorsqu’ils sont revêtus de la Poly-L-lysine. En outre, ils sont plus fragiles que les cellules somatiques et des sections de tissu ce qui entraîne la lyse des cellules lorsqu’elles sont soumises à certains des tampons exclusifs dans les kits disponibles dans le commerce3. Pour surmonter ces défis, les ovocytes ont été fixe et transférées manuellement entre les gouttes des tampons. En outre, tampons perméabilisation et de lavage dans les kits ont été remplacés pour réduire la lyse cellulaire. Sondes prédéfinis sont achetées aux côtés de la trousse de poissons ou des relevés de notes spécifiques peuvent être demandés. Chaque propriétaire de sonde est disponible dans l’un des trois canaux de fluorescence (C1, C2 et C3) permettant de multiplexage. Dans l’expérience actuelle, murins ovocytes étaient chiffrés à l’aide d’une sonde de C2 Nanog et une sonde de C3 Pou5f1 et double marquage. Ces sondes ont été choisis sur l’expression signalée de Nanog et Pou5f1 d’ovocytes et d’embryons. À l’issue de la procédure d’hybridation, ovocytes ont été placés en gouttes de supports de montage de l’anti-fondu pour application à histologiques. Images confocales ont été utilisées pour quantifier le nombre de signaux fluorescents ponctuées, qui représentent différents mRNAs. En plus de la quantification de l’ARNm, imagerie a également montré la distribution spatiale de l’ARNm spécifique dans la cellule, quelles autres méthodes de quantification ARN sont incapables d’atteindre. Cette technique s’est avérée pour avoir faible variabilité au sein d’un groupe expérimental permettant l’utilisation de plus petits nombres d’ovocytes dans chaque groupe expérimental afin d’identifier des différences significatives entre les groupes expérimentaux3.
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Protocol
Procédures d’animaux ont été examinés et approuvés par le Comité de l’urbanisme à l’Université de Nebraska-Lincoln et d’institutionnels animalier et toutes les méthodes ont été effectuées conformément aux règlements et aux lignes directrices pertinentes. Pour cette étude, tel CD-1 souris avaient accès ad libitum à chow rongeur normaux et de l’eau ; Ils ont été maintenues dans un 12:12 sombres : light cycle.
1. préparation du média requis
- Pour les supports de base (OMM), ajouter 100 mM NaCl, KCl 5 mM, 0,5 mM KH2PO4et 1,7 mM CaCl2-2 H2O à 100 mL d’eau stérile.
NOTE : Support de l’OMM peut être stocké pendant environ 1 mois. - Pour les médias complètes (OMOPS), ajouter acide 3-morpholinopropane-1-sulfonique de 20 mM (MOPS), 1,2 mM MgSO4-7 H2O, glucose de 0,5 mM, 6 mM L-lactate, 1 mM ala-gln, taurine, 0,1 mM 1 x non essentiels des acides aminés (NEAA), (acide éthylènediaminetétraacétique) 0,01 mM EDTA), 10 µM acide alpha lipoïque, 10 gentamicine µg/mL dilué, 21 mM 1 M NaOH, 5 mM NaHCO3, 0,2 mM 0,5 mM le Citrate, le Pyruvate de 4 mg/mL FAF BSA pour un 01:10 dilution de l’OMM à l’eau stérile pour un volume total de 100 mL. Stériliser le milieu avec un filtre de 0,22 µM.
Remarque : Les OMOPS peuvent être stockés pendant 1 semaine. - Pour le support d’exploitation (HM) Ajoutez 5 % sérum de veau fœtal à OMOPS. Faire 2 mL HM par souris.
- Pour la solution de l’hyaluronidase ajouter 0,1 mg/mL d’hyaluronidase dérivé de testicules bovins, à 1 mL HM.
- Pour le tampon de fixation combiner paraformaldéhyde à 4 % dans 10 mL de solution de 1 PBS x 0,1 % embryon grade polyvinylpyrrolidone (PVP)14.
- 50 mL de tampon de lavage (WB), ajoutez surfactant non ionique de 0,1 % et 0,1 % PVP 1 x PBS14.
- Pour préparer 10 mL de tampon perméabilisation, ajouter 1 % non ioniques tensioactif de PBS 1 x14.
Remarque : Les tampons de lavage et perméabilisation décrits ci-dessus remplacent les tampons exclusifs dans les kits disponibles dans le commerce.
2. collecte des ovocytes ovulés des souris femelles
- Préparation :
- Stimuler les souris femelles à 5 à 8 semaines d’âge par une injection intrapéritonéale (IP) de 5 UI gonadotrophine chorionique équine (eCG) suivie de 5 UI gonadotrophine chorionique humaine (hCG) 44-48 h plus tard15,16.
- Garder 35 mm plats de pétri contenant 2 mL de HM sur une plaque chauffante de 37 ° C. Une pipette, déposer 100 µL de HM contenant dilué hyaluronidase suivie de trois gouttes de 50 µL de HM sans hyaluronidase dans un plat de pétri de 60 mm. Placer les plaques sur plaque de gouttes contenant sur le réchauffement de 37 ° C avant utilisation.
Remarque : Les gouttes de hyaluronidase il faudrait juste avant la dissection de chaque paire d’oviducte pour éviter l’évaporation et la concentration des composants du HM avec ou sans la hyaluronidase.
- Euthanasier souris, 16 h après l’injection Intrapéritonéale de l’hCG, à l’aide de surdosage isoflurane suivie de dislocation cervicale.
- Nettoyer la souris à l’aide d’éthanol à 70 %. Exposer la cavité abdominale et de visualiser l’appareil reproducteur féminin. Tenez l’ovaire avec une pince et enlever les ligaments utérins et l’excès de tissu adipeux d’autour de l’ovaire. Couper l’oviducte de l’utérus et placer la paire de l’ovaire-oviducte dans le HM chaud dans le plat de 35 mm.
- Enlever l’ovaire et n’importe quel tissu adipeux environnant. Déchirer l’ampoule gonflée de l’oviducte à l’aide d’une aiguille de calibre 27 ½ pouce. Pousser l’oviducte à l’endroit de la déchirure et les complexes de cellule-ovocyte cumulus (COC) seront expulsés. Transférez les ovocytes ovulés, qui sont censés être en métaphase II (MII) de la méiose, la baisse de 100 μL contenant des médias HM avec hyaluronidase à l’aide d’une pipette de bouche (Figure 2).
Figure 2 : Certaines parties de la pipette de bouche utilisé pour transférer des ovocytes. (A) bouche totale (B) 0,22, euh, 4 mm (C) aspirateur tube (D) 1000 μL pipette extrémité du filtre (E) 9" pipette Pasteur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
- Pipetter complexes cumulus-ovocytes cellule MII haut et en bas la hyaluronidase contenant HM avec la pipette de bouche pour déloger les cellules du cumulus. Transférer chaque ovocyte, une fois qu’ils sont dépourvus de cellules du cumulus à un lavage drop HM contenant uniquement à l’aide de la pipette de la bouche. Répétez cette opération pour chaque goutte de lavage. Ne transférez pas les ovocytes fragmenté ou transparent15.
Remarque : Il est important de transférer les ovocytes de chaque goutte dans le plat de 35 mm avec comme petite HM que possible. Cela est vrai pour chaque cession dans le protocole. Les ovocytes MII ne doivent pas rester dans l’hyaluronidase contenant le support HM pendant plus d’une minute.
3. poisson-SM la coloration des ovocytes
- Difficulté des ovocytes dans un puits individuel d’une plaque de 6 puits contenant 500 µL de tampon de Fixation. Plongez les 20 ovocytes ou moins dans le puits. Incuber pendant 20 min à température ambiante.
Remarque : Chaque étape de coloration SM-poisson se trouve dans un puits individuel dans une plaque 6 puits conique. S’assurer que les ovocytes sont complètement immergés dans des tampons et non flottante sur le dessus de la mémoire tampon. Chaque étape doit être effectuée avec 20 ovocytes ou moins dans chaque puits. - Transférez les ovocytes fixes à 500 μL de tampon de lavage (WB décrit à l’étape 1.6) pendant 10 min chaque. Répéter 2 fois plus.
- Incuber les ovocytes dans le tampon de la perméabilisation pendant 30 min à température ambiante.
NOTE : Le tampon de la perméabilisation décrit à l’étape 1.7 remplace le tampon de perméabilisation de bienséance.- Recueillir des ensembles de sonde et tourner rapidement vers le bas dans une micro-centrifugeuse. Réchauffer chaque sonde définie pendant 10 min dans un bain d’eau de 40 ° C ou de l’incubateur. Laisser refroidir à la température ambiante.
Remarque : Cette étape doit être effectuée au cours de l’incubation de la perméabilisation
- Recueillir des ensembles de sonde et tourner rapidement vers le bas dans une micro-centrifugeuse. Réchauffer chaque sonde définie pendant 10 min dans un bain d’eau de 40 ° C ou de l’incubateur. Laisser refroidir à la température ambiante.
- Laver les ovocytes dans 500 µL de WB pendant 10 min à température ambiante.
- Transférez les ovocytes dans 80 μL de protéase III tampon (disponible dans le kit), qui est dilué 1:8 à 1 X PBS, pendant 30 min à température ambiante.
Remarque : Le volume de 80 µL couvre adéquatement le fond d’un puits individuel dans une plaque 6 puits. - Laver les ovocytes dans 500 µL de WB pendant 10 min à température ambiante.
- Diluer les ensembles de sonde chauffée pour Nanog, Pou5f1 et DapB (un gène contrôle négatif), 01:50 dans le diluant de la sonde. Incuber les ovocytes dans 80 μL de la sonde de transcription spécifique pendant 2 heures à 40° C.
Remarque : Chaque jeu de sondes exclusives est disponible dans l’un des trois canaux de fluorescence (C1, C2 et C3). Les sondes Nanog et Pou5f1 ont été marqués avec C2 et C3, respectivement. - Réchauffer les propriétaires, 1 amplificateur (1 AMP), amplificateur 2 (AMP2), amplificateur 3 (AMP3) et amplificateur 4-fluorescence (AMP 4-FL) à température ambiante.
Remarque : Cette étape doit être effectuée au cours de l’incubation de la sonde de transcription spécifique de 2 heures. - Transférez les ovocytes dans 500 μL de WB et incuber pendant 10 min à température ambiante.
- Incuber les ovocytes séquentiellement dans des tampons de l’amplification.
- Incuber les ovocytes dans 80 µL d’AMP1 pendant 30 min à ovocytes transfert de 40° c à 500 µL de BM pendant 10 min à température ambiante.
- Incuber les ovocytes dans 80 µL de AMP2 pendant 15 min à 40 ° C. Transférez les ovocytes dans 500 µL de WB pendant 10 min à température ambiante.
- Incuber les ovocytes dans 80 µL de AMP3 pendant 30 min à 40 ° C. Transférez les ovocytes dans 500 µL de WB pendant 10 min à température ambiante.
NOTE : Le reste du protocole est effectué dans l’obscurité car AMP-FL contient le fluorophore. Lorsque vous travaillez sous le microscope à dissection, réduire autant que possible la lumière. - Ajouter des ovocytes à 80 μL de AMP4-FL pendant 15 min à 40° C.
Remarque : AMP4-FL est offert comme alternative tampon-A (Alt-A), Alt-B ou Alt-C. Sélectionnez le tampon AMP4-FL dépendant sur lequel les émissions de longueur d’onde est souhaitée.
- Laver les ovocytes dans 500 µL de WB pendant 10 min à température ambiante. Incuber les ovocytes dans 80 µL de DAPI pendant 20 min à température ambiante. Laver les ovocytes dans 500 µL de WB pendant 5 min à température ambiante.
- Distribuer 12 µL de supports de montage de l’anti-décoloration au centre d’une diapositive sans ajouter des bulles au réactif. Transférez les ovocytes avec comme petit WB que possible dans le milieu de montage et appliquez un lamelle couvre-objet.
- La lamelle à un angle d’inclinaison et délicatement placer au-dessus du liquide sur la diapositive. Évitez d’appuyer sur la lamelle couvre-objet trop dur pour empêcher toute déformation des ovocytes et introduction de bulles.
- Stocker les lames dans une boîte sombre sécher jusqu’au lendemain à la température ambiante. Enduisez les bords des lames en vernis à ongles transparent pour sceller la lamelle couvre-objet.
- Utiliser un microscope ordinaire pour rechercher les ovocytes sur la lame et le cercle avec un marqueur permanent.
Remarque : Cette étape n’est pas obligatoire mais améliore la localisation d’ovocytes sur la diapositive. Pour de meilleurs résultats, diapositives d’image dans les 1 à 5 jours comme le signal fluorescent commencera à s’estomper.
4. traitement de l’image
- Les ovocytes 3 dimensions, à l’aide de la microscopie confocale étape z de l’image.
Remarque : Pour analyser avec précision les images, chaque étape z serait de 1,0 µm/tranche. - Enregistrer les images confocales comme un nd2 compressé ou individuels. Fichiers TIFF pour chaque ovocyte. Les deux types d’images sont compatibles avec le programme de traitement d’image open source, Fidji.
- Téléchargez et installez le logiciel de Fidji de libre accès (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
- Faire glisser des fichiers de nd2 à Fidji et choisissez hyperstack. Si les images confocales étaient enregistrés sous. Fichiers TIFF passez à l’étape 4.4.
Remarque : Lorsque le fichier nd2 est tomb6e Fidji la liste déroulante hyperstack devrait apparaître automatiquement. - Cliquez sur l’onglet Image , sélectionnez la couleuret cliquez sur Canaux Split pour séparer les canaux fluorescents du fichier nd2.
- Générer des individuels. Fichiers TIFF pour chaque tranche de z de l’ovocyte dans chaque canal fluorescent. Cliquez sur l’onglet Image , sélectionner les pileset cliquez sur la pile d’Images. Cliquez sur l’onglet Image , sélectionner le Typeet cliquez sur Couleur RVB pour convertir chaque tranche z en image RVB couleur séparée.
Remarque : La couleur RVB est artificielle et peuvent être choisis comme désiré pour chaque longueur d’onde d’émission. - Enregistrez chaque image convertie comme. Fichier TIFF. Placer les images d’un seul ovocyte pour chaque canal fluorescente dans un nouveau dossier pour éviter la confusion au cours de couture (étape 4.3).
- Faire glisser des fichiers de nd2 à Fidji et choisissez hyperstack. Si les images confocales étaient enregistrés sous. Fichiers TIFF passez à l’étape 4.4.
- Normaliser les uns. Image TIFF pour Pou5f1 et Nanog en utilisant des images de contrôle négatif (DapB).
NOTE : Normalisation s’effectue à l’aide d’un programme de retouche photo. Veillez à retirer les mêmes niveaux de fluorescence de fond de chaque image de contrôle. - Ouvert chaque normalisé. Fichier TIFF à Fidji pour assembler tous les z-tranches pour chaque ovocyte dans chaque longueur d’onde.
- Cliquez sur l’onglet Plugins , sélectionnez Stitchinget cliquez sur Grille/Collection (Figure 3 a). Sélectionnez Séquence d’Images dans le menu déroulant et cliquez sur OK (Figure 3 b).
- Parcourir le répertoire et sélectionnez le dossier contenant toutes les images de z-tranche pour un ovocyte individuel à une longueur d’onde (voir étape 4.3.4). Cliquez sur OK.
- Déplacez le curseur en bas de l’image cousu sur le canal de la couleur appropriée pour la longueur d’onde utilisée et créer l’image finale de cousu RGB en cliquant sur Image, sélectionner le Type, puis cliquez sur Couleur RVB.
NOTE : Cette image sera utilisée pour le dosage de fluorescence décrit à l’étape 4.6 ci-dessous.
- Convertir l’image cousu en image projetée maximale de 32 bits. Cliquez sur l’Image, sélectionnez le Typeet cliquez sur 32 bits (Figure 3). Enregistrez cette image sous un nouveau. Fichier TIFF.
Figure 3 : Assembler des images confocal z-série d’ovocytes. (A) capture d’écran montrant l’outil grille/Collection de plug-in dans les îles Fidji qui a été utilisé pour produire des images composites de l’ovocyte. (B) Images séquentielles utilise la fluorescence chevauchement entre séquentiel. Fichiers TIFF pour générer une image composite. (C) l’image composite a été enregistré comme un 32 bits. Fichier TIFF. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
- Téléchargez et installez la tache de trouver et de Tracking Program13, qui est disponible sur le site de D.R. Larson, un chercheur à la National instituts de santé National Cancer Institute (https://ccr.cancer.gov/Laboratory-of-Receptor-Biology-and-Gene-Expression/daniel-r-larson). Téléchargez et installez la machine virtuelle de libre accès pour le système d’exploitation interactive data language (IDL) est requis pour exécuter la recherche de Spot et Tracking Program (http://www.spacewx.com/pdf/idlvm.pdf).
- Ouvrez l’image 32 bits, cousu, qui a été généré à l’étape 4.6 (Figure 4 a), dans le programme de suivi et de trouver de la place. Sélectionnez la liste déroulante Localize et cliquez Localize (Figure 4 b), qui calcule les taches numéros trouvés dans l’image.
Remarque : Chaque point compté représente un ARNm individuels. Bande pass et photon seuil réglages sont indiqués dans la capture d’écran (Figure 4 b). Pour ce protocole, a été utilisé par défaut pour chaque paramètre de seuil. Représentant positif et taches d’arrière-plan sont affichent (Figure 4).
Figure 4 : Quantification des ARNm par Spot Finder et suivi. (A) images de z-séries individuelles ont été cousues ensemble tel que décrit à la Figure 3 et enregistrés sous un maximum de 32 bits projeté. Fichier TIFF. (B) image Composite a été ouvert en Spot Finder et suivi. Localiser a été utilisé pour compter les taches fluorescentes (zone rouge). Seuil de passage et le photon bande sont indiqués par la boîte bleue. (C) la flèche bleue pointe vers un signal positif (seuil). La flèche blanche montre une fluorescence spot au-dessous du seuil et, par conséquent, pas pris en compte. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Representative Results
À la fin du protocole, le résultat sera des images individuelles de confocal z-series (Figure 4 a et Figure 5), images piquées (Figure 4), et l’ARNm comtes (Figure 4 b). Lorsque le multiplexage est effectuée, il y aura aussi des images fusionnées montrant l’étiquette pour deux différents ARNm (Figure 5). Les comtes d’ARNm sont générés à l’aide de cousu images générées par Fidji (Figure 3) et les taches de fluorescence ponctuée comptés en utilisant la recherche de Spot et Tracking Program (Figure 4 b).
Les comtes d’ARNm sont ensuite analysées à l’aide d’un outil d’analyse de données standard. Dans ce protocole, nous avons étiqueté n = 12 ovocytes avec Pou5f1 et Nanog. Les résultats de chaque ARNm sont en moyenne et l’écart-type de la moyenne calculée. Les données recueillies dans le présent protocole a montré 775 ± 26 SEM Pou5f1 transcriptions et 113 ± 5 SEM Nanog transcrits dans des ovocytes de MII (Figure 5). Un test de student t-déterminé qu'une différence statistiquement significative dans l’ARNm compte entre Pou5f1 et Nanog. Ce qui est important, il n’y a aucune taches détectés dans n = 5 ovocytes qui sont étiquetés avec sonde DapB (c.-à-d. contrôle négatif). Notez l’erreur-type petit à l’aide de seulement 12 ovocytes individuels. La sensibilité du test est également soulignée par une détection reproductible positive de Nanog(Figure 5). Des expériences antérieures de dPCR ne détecte pas de façon reproductible Nanog indiquant que le nombre des ARNm de Nanog dans un ovocyte individuels est inférieure à la détection de seuil par dPCR 3.
Dans des expériences pilotes, nous avons détecté fluorescence réduite s’il y a un retard entre la fixation des ovocytes et l’initiation du protocole SM-poisson. De même, si les mémoires tampons d’hybridation propriétaires ne sont pas utilisés, la sonde et l’amplification ADN ramifié n’entrent pas dans la cellule résultant en fluorescence anneaux autour de la membrane plasmique de l’ovocyte. Ceci est probablement dû à l’agrégation de l’ADN ramifié. Fluorescence aux anneaux autour de la membrane de l’ovocyte se traduira également s’il y a mauvaise perméabilisation de la membrane plasmique. Il faut également une dégradation optimale de protéine liée à l’ARNm. Le tampon de protéase fourni dans le kit de SM-poisson est à une concentration optimale pour le traitement des coupes de tissus et de cellules adhérentes. Toutefois, lorsque vous utilisez les cellules non adhérentes, il est important d’identifier empiriquement la meilleure dilution de protéase. Trop peu de mémoire tampon protéase peut entraîner de sous-dénombrement des ARNm en raison de la mauvaise accessibilité de la sonde à l’ARNm. De même, trop protéase peut entraîner une dégradation non seulement les protéines liées à l’ARNm mais aussi de déstabilisation de l’ARNm. Dans ce protocole, nous avons testé la détection de l’ARNm en utilisant une courbe de titrage de non dilué (1:1), 1:4, 1:8 et 01:12 mémoire tampon protéase dilué dans du PBS 1 x (n = 2 ou 3 ovocytes par dilution). La moyenne était de fluorescente expression de l’ARNm de Pou5f1 dans les ovocytes MII 169 ± 42 SEM (non dilué), 176 ± 36 SEM (1:4), 308 ± 18 SEM (1:8) et 445 ± 24 SEM (01:12) (Figure 6). Dilution de protéase utilisée dans le présent protocole a été de 1:8 telle qu’elle a montré la plus faible variation.
Figure 5 : Pou5f1 et Nanog ARNm ovocyte MII. (A). des images représentatives de l’image intermédiaire z-series sont indiqués sur la gauche. Pou5f1 est détecté dans le rouge (647 nm) longueur d’onde alors que Nanog est détecté dans le vert (488 nm) longueur d’onde. DAPI coloration des chromosomes alignés sur l’axe de métaphase II, caractéristique de l’ovocyte MII, apparaît en blanc. Il n’y avait aucune coloration pour DapB soit dans les 647 nm ou longueur d’onde de 488 nm d’émission. (B) le nombre des Pou5f1 et Nanog ARNm est montré comme moyenne SEM (n = 12 ovocytes) ; Il n’y avait aucune détection (N.D) de DapB. * indique P < 0,05, barre d’échelle est 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Titrage empirique du tampon de protéase afin d’optimiser le comptage précis des mRNAs. Images représentatives de SM-poissons de Pou5f1 dans des ovocytes de MII. La coloration DAPI montre chromosomes alignés sur l’axe du PPFI. Les ovocytes sont incubées avec non dilué (1:1), 1:4, 1:8 ou 01:12 les dilutions de tampon de protéase III. Le nombre des ARNm de Pou5f1 (n = 2-3 ovocytes) ont été dénombrés et la moyenne SEM est montré. Barre d’échelle est 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Transfert d’ovocytes MII par l’intermédiaire de tampons de fixation, la protéase et hybridation dans les puits d’une plaque de 6 puits. La forme de chaque puits est montrée. (A) les cellules flottent lorsque tout d’abord ajoutés aux tampons (B) l’immersion des ovocytes dans les tampons. (C) ovocytes se déposent au fond du puits au cours de la période d’incubation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Une série de mesures mineures pendant le protocole assurera succès fluorescence et comptages précis des ARNm. Tout d’abord, le protocole doit être effectué immédiatement après la collecte et la fixation des ovocytes. Notez que le PVP est ajoutée au tampon de fixation paraformaldéhyde à 4 % pour empêcher des ovocytes de coller les uns aux autres. Nous avons constaté qu’il est nécessaire réaliser l’expérience immédiatement après la collecte et la fixation des ovocytes. Tout retard entraîne un beaucoup plus faible signal de fluorescence qui se traduirait par la sous-estimation des transcriptions. Cela est dû en partie à la dégradation de l’ARN. Pas plus de 20 ovocytes doivent être transférés vers un puits de la plaque 6 puits en même temps et chacun bien ne doit être utilisé une fois. Temps d’incubation devraient également être fidèlement suivis sans raccourcissement ou allongement de chaque étape. L’exception est les pas de tampon de lavage ; ovocytes peuvent être laissés dans le tampon de lavage pendant une période prolongée sans altérer les résultats expérimentaux. Les sondes de SM-poissons sont disponibles dans les trois canaux de fluorescence C1, C2 et C3. Pour le multiplexage, ne mélangez pas les sondes qui ont la même étiquette de canal. Cela se traduira par les deux sondes réagissant à la même émission d’onde rendu analyse impossible car il n’y aura aucun moyen de distinguer entre les ensembles de sonde. Sondes de contrôle positif conçus contre gènes domestiques sont disponibles dans chacun des trois canaux. Sondes de contrôle négatif (par exemple, DapB) sont également disponibles en prémélangée ensembles qui contiennent une balise pour les trois canaux. L’expérience doit être menée dans la pénombre comme les ovocytes sont sensibles à la lumière après le retrait de l’oviducte17,18. Après l’ajout des fluorophores attachés à AMP4, les étapes devraient être effectuées avec que peu de lumière que possible pour empêcher la décoloration du fluorophore. Enfin, lors du montage d’ovocytes sur histologiques, poser délicatement la lamelle couvre-objet pour éviter des distorsions de l’ovocyte et la formation de bulles qui peuvent interférer avec l’imagerie. Si vous éprouvez des difficultés à éviter des distorsions de la cellule, entretoises de diapositive doivent servir afin de maintenir la forme sphérique de l’ovocyte.
Une modification essentielle du protocole est le remplacement de la perméabilisation et tampons de lavage fournis dans le kit disponible dans le commerce. Les tampons de protéase et hybridation propriétaires fournis sont difficiles pour les ovocytes mais sont requises pour le succès du protocole. Si non utilisé, les amplificateurs sont incapables de pénétrer dans la cellule qui est probablement dû à l’agrégation de l’ADN ramifié. Passer les ovocytes de ces milieux hostiles à la perméabilisation relativement bénigne et les tampons de lavage, conçus pour immunofluorescence14, s’est avérée suffisante pour assurer le succès du protocole et en même temps ont empêché la lyse des ovocytes. Parce que les ovocytes et embryons préimplantatoires n’adhèrent pas à une lame histologique, une autre modification essentielle plaçait les ovocytes dans les buffers dans une cupule d’une boîte de culture. Nous avons utilisé une plaque de culture embryonnaire de 6 puits. Chaque puits de la plaque a conique et côtés inclinées et un plat de 8 mm en bas (Figure 7), qui améliore le prélèvement d’ovocytes. Ceci est particulièrement important que les ovocytes perdent leurs propriétés réfractaires et deviennent presque transparentes dans les tampons de l’hybridation.
Lors du transfert d’ovocytes de puits à puits, il est important de s’assurer que les ovocytes soient entièrement immergés dans les solutions dans chaque puits comme cellules flottera quand tout d’abord transféré dans chaque puits (Figure 7 a). Une fois qu’ils sont mécaniquement immergés dans la mémoire tampon (Figure 7 b), ils descendront au fond du puits à la fin de l’incubation (Figure 7). L’exception est AMP 1 et 3 AMP ; Lorsque mécaniquement submergé les ovocytes ne pas complètement se déposer au fond du puits. Pour trouver ces ovocytes, vous devrez peut-être modifier le plan de mise au point. Pipetter soigneusement et compter le nombre de cellules transféré pour éviter toute perte.
Plusieurs techniques de poisson de molécule, qui amplifient le signal fluorescent plutôt que l’ADNc, y compris ramifiés chimies de l’ADN, ont été mis au point 9,19. Kits disponibles dans le commerce ont optimisé la méthode ADN SM-poisson ramifiés pour détection reproductible des ARNm individuels dans des coupes de tissus ou de cellules adhérentes sur une lame histologique. Le protocole décrit ici a été modifié pour être utilisé avec les cellules non adhérentes unique (p. ex., des ovocytes et des embryons préimplantatoires)3. Cela permet non seulement une quantification précise et reproductible, mais aussi la localisation d’un ARNm dans l’ovocyte. Alors qu’il s’agit d’un avantage de l’essai, il y a bien sûr des limitations. Par exemple, contrairement à la RNA-sequencing, il ne peut pas identifier l’ARNm roman. Une autre limite du protocole est la disponibilité de sondes spécifiques transcription. Sondes de propriétaires sont commercialement disponibles auprès des compagnies qui vendent des kits de SM-poisson. Il y a plusieurs sondes qui sont effectuées préalablement. D’autres peuvent être conçus par la société pour toute ARNm annoté à l’aide d’un algorithme objectif10. Toutefois, si un ARNm est séquencé mal il serait difficile de la conception des sondes avec une spécificité élevée. Quelques transcriptions, il peut être également difficile d’identifier suffisamment paires de sonde qui ne pas de réaction croisée avec les autres transcriptions réduisant la spécificité du test. De même, un plus petit nombre d’ensembles de sonde peut être insuffisant pour produire le signal de fluorescence au-dessus du seuil de détection positive dans le programme de suivi et de trouver de la place. Dans cette même veine, variantes de transcription ne peuvent être détectées avec cette méthode.
Malgré les limitations décrites ci-dessus, il existe plusieurs applications pour SM-poisson. Par exemple, des données de cellule unique RNA-sequencing pourraient être validées surtout quand le nombre de cellules est petites et difficiles à obtenir (par exemple, des ovocytes et des embryons). Amplification de l’ADNc pour tests de PCR présente une erreur expérimentale qui est généralement réduite par une étape de la normalisation à l’aide de données de gènes domestiques stablement exprimée. Toutefois, les changements temporels dans l’ovocyte par le biais de pré-implantatoire des embryons modifie également l’expression des gènes domestiques. Le protocole de SM-poissons amplifie fluorescence au lieu de cDNA. Il n’y a donc aucune exigence pour la normalisation des taux de mRNA de transcription spécifiques afin d’obtenir des résultats reproductibles avec une faible variabilité. En raison de la variabilité de l’efficacité d’amorces PCR, différences dans le nombre absolu de différentes espèces d’ARNm n’est pas exactement comparable au sein ou entre les types de cellules. SM-poisson localise et quantifie les ARNm. Par conséquent, il peut être utilisé pour identifier les cellules qui expriment ARNm dans une population de cellules mixtes. Par exemple, lorsque les ovocytes dans les follicules primaires ou secondaires sont en croissance, le follicule peut être isolé et cultivé dans l’alginate beads20 mais la séparation de l’ovocyte de cellules somatiques est difficile. Par conséquent, séquençage et études PCR ont été effectués à l’aide de populations de cellules mixtes. L’utilisation de poissons-SM peut déterminer si les ARNm est détectées dans les cellules somatiques ou de l’ovocyte du follicule. Enfin, SM-poisson a haute sensibilité et spécificité permettant la détection des transcriptions de faible abondance ; par exemple, la détection de Nanog dans des ovocytes de MII (Figure 5).
Stockage et la dégradation des ARNm sont d’importants mécanismes de régulation pour l’expression de la protéine. Régulation post-transcriptionnelle de traduction, le stockage et la dégradation sont médiés par des protéines qui se lient à l’ARNm21. Actuellement, ARN-protéine immunoprécipitation (RIP) peut être effectuée systématiquement lorsqu’un grand nombre de cellules est disponible22. En raison du grand nombre d’oeufs de Xenopus qui peuvent être prélevés sur un seul animal, RIP a été exécuté avec succès dans ce modèle animal. Toutefois, il est difficile d’obtenir assez mammifères ovocytes et des embryons de pré-implantatoire pour effectuer RIP. Couplage de SM-poissons et immunofluorescence (immunoFISH) 23 des sections de tissu détiennent le potentiel pour visualiser les protéines associées aux ARNm spécifiques y compris machines translationnelle24,25. Génomique mesure des variants génétiques (par exemple, polymorphismes de nucléotides petit, SNP) liés à la santé et la maladie26. Phenomics identifie les changements dans les réponses cellulaires à cause de pressions environnementales27,28. La recherche actuelle vise à trouver le mécanisme qui relie des changements dans le génome de phénotypes spécifiques. L’utilisation d’immunoFISH a la possibilité de lier des changements de SNP-dépendant dans l’expression de l’ARNm et l’expression des protéines qui contribuent aux phénotypes cellulaires. À mesure que la technologie évolue, il y a probablement d’autres applications de SM-poisson qui permettra d’identifier des mécanismes importants dans les systèmes biologiques multiples.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à déclarer
Acknowledgments
Nous remercions le Dr Daniel R. Larson pour son aide généreuse avec l’installation et l’utilisation de la recherche de Spot et de Tracking Program 13 et l’appui technique de l’Université du Nebraska Lincoln microscopie Core pour l’imagerie de la microscopie confocale. Cette étude représente une contribution de l’Université du Nebraska Agricultural Research Division, Lincoln, Nebraska et a été soutenue par des fonds de Hatch UNL (NEB-26-206/numéro d’ordre-232435 et NEB-26-231/numéro d’ordre-1013511).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (±)-α-Lipoic acid | Sigma-Aldrich | T1395 | Alpha Lipoic Acid |
| Albumin, Bovine Serum, Low Fatty Acid | MP Biomedicals, LLC | 199899 | FAF BSA |
| BD 10mL TB Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309659 | 10 mL syringe |
| BD PrecisionGlide Needle | Becton, Dickinson and Company | 305109 | 27 1/2 gauge needle |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | CaCl2-2H2O |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C2404 | Citrate |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | Glucose |
| Disodium phosphate | Na2HPO4 | ||
| Easy Grip Petri Dish | Falcon Corning | 351008 | 35 mm dish |
| Edetate Disodium | Avantor | 8994-01 | EDTA |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | Straight, Sharp/Sharp, non-serrated, 13mm cutting edge scissors |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta biologicals | S10250 | FBS |
| Gentamicin Reagent Solution | gibco | 15710-064 | Gentamicin |
| GlutaMAX-I (100X) | gibco | 35050-061 | Glutamax |
| Gold Seal Micro Slides | Gold Seal | 3039 | 25 x 75mm slides |
| Gonadotropin, From Pregnant Mares' Serum | Sigma | G4877 | eCG |
| hCG recombinant | NHPP | AFP8456A | hCG |
| Hyaluronidase, Type IV-S: From Bovine Testes | Sigma-Aldrich | H3884 | Hyaluronidase |
| Jewelers Style Forceps | Integra | 17-305X | Forceps 4-3/8", Style 5F, Straight, Micro Fine Jaw |
| L-(+)-Lactic Acid, free acid | MP Biomedicals, LLC | 190228 | L-Lactate |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M2773 | MgSO4-7H2O |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-Cl | NEAA |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-C | 25 x 25x 0.15 mm cover slips |
| Mm-Nanog-O2-C2 RNAscope Probe | Advanced Cell Diagnostics | 501891-C2 | Nanog Probe |
| Mm-Pou5f1-O1-C3 RNAscope Probe | Advanced Cell Diagnostics | 501611-C3 | Pou5f1 Probe |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Paraformaldehyde |
| PES 0.22 um Membrane -sterile | Millex-GP | SLGP033RS | 0.22 um filters |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P0930 | PVP |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 60128 | KCl |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 60218 | KH2PO4 |
| Prolong Gold antifade reagent | invitrogen | P36934 | Antifade reagent without DAPI |
| RNAscope DAPI | Advanced Cell Diagnostics | 320858 | DAPI |
| RNAscope FL AMP 1 | Advanced Cell Diagnostics | 320852 | Amplifier 1 |
| RNAscope FL AMP 2 | Advanced Cell Diagnostics | 320853 | Amplifier 2 |
| RNAscope FL AMP 3 | Advanced Cell Diagnostics | 320854 | Amplifier 3 |
| RNAscope FL AMP 4 ALT A | Advanced Cell Diagnostics | 320855 | Amplifier 4 ALT A |
| RNAscope FL AMP 4 ALT B | Advanced Cell Diagnostics | 320856 | Amplifier 4 ALT B |
| RNAscope FL AMP 4 ALT C | Advanced Cell Diagnostics | 320857 | Amplifier 4 ALT C |
| RNAscope Fluorescent Multiplex Detection Reagents Kit | Advanced Cell Diagnostics | 320851 | FISH Reagent Kit |
| RNAscope Probe 3-plex Negative Control Probe | Advanced Cell Diagnostics | 320871 | Negative Control |
| RNAscope Probe 3-plex Positive Control | Advanced Cell Diagnostics | 320881 | Positive Control |
| RNAscope Probe Diluent | Advanced Cell Diagnostics | 300041 | Probe Diluent |
| RNAscope Protease III | Advanced Cell Diagnositics | 322337 | Protease III |
| RNAscope Protease III & IV Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 322340 | FISH Protease Kit |
| RNAscope Protease IV | Advanced Cell Diagnostics | 322336 | Protease IV |
| S/S Needle with Luer Hub 30G | Component Supply Co. | NE-301PL-50 | blunt 30 gauge needle |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S6191 | NaCl |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 306576 | NaOH |
| Sodium pyruvate, >= 99% | Sigma-Aldrich | P5280 | Pyruvate |
| Solution 6 Well Dish | Agtechinc | D18 | 6 well dish |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | Taurine |
| Tissue Culture Dish | Falcon Corning | 353002 | 60 mm dish |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Triton X-100 |
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