Summary
Um die Zahl der mRNAs in einzelnen Eizellen, einzelnes Molekül RNA Fluoreszenz in-situ reproduzierbar zu zählen war Hybridisierung (RNA-Fisch) für nicht-anhaftende Zellen optimiert. Eizellen wurden gesammelt, mit der Abschrift spezifische Sonden hybridisiert und quantifiziert, mit einem Bild Quantifizierung Software.
Abstract
Aktuelle Methoden routinemäßig verwendet, um mRNA in Eizellen und Embryonen zu quantifizieren sind digitale Reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion (dPCR), quantitative, Real-Time RT-PCR (RT-qPCR) und RNA Sequenzierung. Wenn diese Techniken durchgeführt werden, mit einer einzigen Eizelle oder Embryo sind niedrig-Kopie mRNAs nicht zuverlässig erkannt. Um dieses Problem zu überwinden, können Eizellen oder Embryonen für die Analyse zusammengefasst werden; Allerdings führt dies oft zu hohe Variabilität unter den Proben. In diesem Protokoll beschreiben wir die Verwendung der Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH) mit verzweigten DNA-Chemie. Diese Technik identifiziert das räumliche Muster der mRNAs in einzelnen Zellen. Wenn die Technik mit dem Ort zu finden und Tracking-Computer-Software gekoppelt ist, kann die Fülle der mRNAs in der Zelle auch quantifiziert werden. Mit dieser Technik gibt es geringere Variabilität innerhalb einer experimentellen Gruppe und weniger Eizellen und Embryonen sind erforderlich, um signifikante Unterschiede zwischen den experimentellen Gruppen erkennen. Handelsübliche verzweigte DNA SM-Fisch-Kits zur Erkennung von mRNAs in geschnittenen Gewebe oder adhärente Zellen auf Folien optimiert worden. Jedoch Eizellen haften nicht effektiv auf Folien und einige Reagenzien im Kit waren zu hart, was zu Eizelle Lyse. Um diese Zerstörung zu verhindern, wurden einige Modifikationen an das Fisch-Kit vorgenommen. Insbesondere ersetzt Eizelle Permeabilisierung und waschen Puffer für die Immunfluoreszenz von Eizellen und Embryonen entwickelt die proprietäre Puffer. Die Permeabilisierung, Waschungen und Inkubationen mit Sonden und Verstärker wurden in 6-Well Platten durchgeführt und Eizellen wurden auf Folien am Ende des Protokolls mit Montage Media platziert. Diese Änderungen konnten die Einschränkungen des kommerziell erhältlichen Kit, insbesondere die Eizelle Lyse zu überwinden. Um präzise und reproduzierbar mRNAs in einzelnen Eizellen zählen, wurde Computer-Software verwendet. Dieses Protokoll ist zusammen, eine Alternative zur PCR und Sequenzierung den Ausdruck der spezifischen Transkripte in Einzelzellen zu vergleichen.
Introduction
Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde der Goldstandard für die mRNA Quantifizierung. Derzeit werden zwei Assays, digitale PCR (dPCR)1 und quantitative, real Time PCR (qPCR)2 verwendet. Die zwei PCR-Techniken hat dPCR höhere Empfindlichkeit als qPCR darauf hindeutet, dass es verwendet werden, könnte um mRNA Fülle in einzelnen Zellen zu messen. Aber in unseren Händen produziert dPCR Analyse der niedrigen Fülle mRNAs in Pools von 5 bis 10 Eizellen pro jede experimentelle Probe Daten mit geringen Reproduzierbarkeit und hohe Variation3. Dies ist wahrscheinlich auf die experimentellen Fehler in Verbindung mit RNA-Extraktion und reversen Transkription Effizienz. RNA-Sequenzierung wurde auch mit einem einzigen Mausklick und menschliche Eizellen4,5durchgeführt. Diese Technik erfordert cDNA Verstärkung für die Bibliothek-Generation, die wahrscheinlich erhöht die Variabilität innerhalb einer experimentellen Gruppe erforderlichen Schritte. Darüber hinaus können niedrige Fülle Protokolle nicht nachweisbar sein. Obwohl Sequenzierung Preise ab den letzten Jahren gestiegen sind, kann es noch unerschwinglich wegen der hohen Kosten der Bioinformatik Analysen sein. Zu guter Letzt ist mRNA Lokalisierung ein dynamischer Prozess mit räumlichen Veränderungen zur Protein-Funktion6. Daher setzen wir um eine Technik zu verabschieden, die genaue und reproduzierbare quantitative Maßnahmen und Lokalisierung der einzelnen mRNAs in einzelne Eizellen produzieren würde.
Verzweigte DNA gekoppelt mit Fluoreszenz in Situ Hybridisierung verstärkt Fluoreszenzsignal eher als verstärkendes RNA/DNA ermöglicht Nachweis von einzelnen mRNAs in einzelnen Zellen 7,8,9. Der Test erfolgt durch eine Reihe von Hybridisierung, Amplifikation (mit verzweigten DNA) und Fluoreszenz Kennzeichnung Schritte um die Fluoreszenz-Signal7verstärken. Das Verfahren beginnt mit der Bindung von 18 - 25 Base Oligonukleotid-Sonde-Paare, die einen spezifischen mRNA3,8,10ergänzen. Fünfzehn bis zwanzig Sonde Paare eignen sich für jedes Protokoll Gewährleistung Spezifität für das Ziel-Transkript. Die mRNA-spezifische Hybridisierung folgt Vorverstärker und Endstufe Sonden, die eine verzweigte Konfiguration bilden. Ungefähr binden 400 Label Fluorophore an jeden Verstärker, was zu einem 8000-fold Anstieg in Fluoreszenz ermöglicht die Erkennung von einzelnen mRNAs (Abbildung 1)11.
Abbildung 1: Schematische des SM-Fisch Protokolls. Sequenzieller Hybridisierung von Transkript Sonde, verzweigte DNA-Verstärker und Fluorophor, ein Ziel-mRNA gezeigt wird. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Frühere Studien mit Einzelmolekül-Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (SM-Fisch) lokalisiert β-Aktin mRNAs in einzelnen Neuronen12 und humanes Papillomavirus DNA bei Gebärmutterhalskrebs Zell-Linien7. Die Computersoftware, die Stelle zu finden und Tracking-Programm identifiziert einzelne punktförmige Fluoreszenzsignal und wurde erfolgreich verwendet, um die Anzahl der in jeder Zelle3,13mRNAs zu quantifizieren.
Basierend auf den Ergebnissen der mRNA-Erkennung in Neuronen12vermutet wir, dass SM-Fisch ein nützliches Instrument zur Abschrift Ebenen in murinen Eizellen und Embryonen einschließlich niedrige Fülle mRNAs quantitate beweisen würde. Aber die Technik ist optimiert für die Verwendung mit festen adhärente Zellen und Formaldehyd fixiert Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten (FFPE). Eizellen können nicht zu einer Folie haften, auch wenn sie mit Poly-L-Lysin beschichtet sind. Darüber hinaus sind sie empfindlicher als Körperzellen und Gewebeschnitte was in Zelle Lysis, wenn einige der proprietären Puffer in kommerziell erhältlichen Kits3ausgesetzt. Um diese Herausforderungen zu bewältigen, wurden Eizellen behoben und manuell zwischen Tropfen der Puffer übertragen. Darüber hinaus wurden Permeabilisierung und waschen Puffer in den Kits ersetzt, um die lyse der Zellen zu verringern. Vordefinierte Sonden sind neben dem Fisch-Kit gekauft oder bestimmte Protokolle angefordert werden können. Jedes proprietäre Sonde-Set ist erhältlich in einer der drei Fluoreszenz-Kanäle (C1, C2 und C3) multiplexing zu ermöglichen. Im aktuellen Experiment wurden murine Eizellen Dual-gebeizt und quantifizierte mit einer Sonde C2 Nanog und C3 Pou5f1 Sonde. Diese Sonden wurden anhand der gemeldeten Ausdruck von Nanog und Pou5f1 in Eizellen und Embryonen ausgewählt. Zum Abschluss der Hybridisierung Schritte wurden Eizellen in Tropfen von Anti-Fade Montage Medien für die Anwendung auf histologischen gelegt. Konfokale Bilder wurden verwendet, um die Anzahl der punctata fluoreszierende Signale zu quantifizieren, die einzelnen mRNAs darstellen. Neben der Quantifizierung der mRNAs Bildgebung zeigte auch die räumliche Verteilung der spezifischen mRNA in der Zelle sind die RNA-Quantifizierungsmethoden nicht in der Lage, zu erreichen. Dieses Verfahren erwies sich geringe Variabilität innerhalb einer experimentellen Gruppe erlaubt die Verwendung einer kleineren Anzahl von Eizellen in jeder experimentellen Gruppe signifikante Unterschiede zwischen experimentellen Gruppen3identifizieren.
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Protocol
Tierische Verfahren wurden geprüft und durch die institutionelle Animal Care and Use Committee an der University of Nebraska-Lincoln genehmigt und alle Methoden wurden im Einklang mit geltenden Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Für diese Studie CD-1 fremd-Mäuse hatten ad libitum Zugang zu normalen Nagetier Chow und Wasser; Sie waren in einem 12:12 dunkle gepflegt: Licht-Zyklus.
1. Vorbereitung der erforderlichen Medien
- Fügen Sie für base Medien (OMM) 100 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,5 mM KH2PO4und 1,7 mM CaCl2-2 H2O 100 mL sterilem Wasser hinzu.
Hinweis: OMM Medium kann bis zu 1 Monat aufbewahrt werden. - Fügen Sie für komplette Media (OMOPS) 20 mM 3-Morpholinopropane-1-Sulfo Säure (MOPS), 1,2 mM MgSO4-7 H2O, 0,5 mM Glukose, 6 mM L-Lactat, 1 mM Ala-Gln, Taurin, 0,1 mM 1 X nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA), Ethylenediaminetetraacetic Säure () 0,01 mM EDTA), 10 µM-alpha-Liponsäure, 10 µg/mL unverdünnt Gentamicin, 21 mM 1 M NaOH, 5 mM Nahco33, 0,2 mM Pyruvat, 0,5 mM Citrat, 4 mg/mL FAF BSA zu einem 01:10 Verdünnung der OMM in sterilem Wasser für ein Gesamtvolumen von 100 mL. Sterilisieren Sie das Medium mit einem 0,22 µM-Filter.
Hinweis: OMOPS können bis zu 1 Woche aufbewahrt werden. - Fügen Sie für das Betriebs-Medium (HM) 5 % fötalen Rinderserum zu OMOPS hinzu. 2 mL HM per Mausklick zu machen.
- Fügen Sie für Hyaluronidase Lösung 0,1 mg/mL von Hyaluronidase bovine Hoden zu 1 mL HM abgeleitet.
- Kombinieren Sie für die Fixierung Puffer 4 % Paraformaldehyd in 10 mL 1 X PBS zusammen mit 0,1 % Embryo Grade Polyvinylpyrrolidon (PVP)14.
- Um 50 mL Waschpuffer (WB) vorzubereiten, Hinzufügen von 0,1 % nicht-ionische Tenside und 0,1 % PVP bis 1 x PBS-14.
- Vorbereitung 10 mL Permeabilisierung Puffer fügen Sie 1 % nicht - ionische Tenside hinzu, 1 X PBS14.
Hinweis: Die oben beschriebenen Wasch- und Permeabilisierung Puffer ersetzen die proprietäre Puffer in den handelsüblichen Kits.
2. Sammlung von Eisprung Eizellen von weiblichen Mäusen
- Zubereitung:
- Weibliche Mäuse im Alter von 5-8 Wochen zu fördern, indem intraperitoneal (IP) Injektion von 5 IU equine Chorion-Gonadotropin (EKG) gefolgt von 5 IU humanes Choriongonadotropin (hCG) 44-48 h später15,16.
- 35 mm Petrischalen mit 2 mL HM auf einer Warmhalteplatte 37 ° C zu halten. Eine Pipette, 100 µL Tropfen HM mit verdünnt Hyaluronidase, gefolgt von drei 50 µL Tropfen HM ohne Hyaluronidase in einer Petrischale 60 mm. Legen Sie Platten mit Tropfen auf 37 ° C Erwärmung vor Gebrauch Platte.
Hinweis: Die Hyaluronidase-Tropfen sollte kurz vor der Dissektion jedes Eileiters Paares vorgenommen werden, um die Verdampfung und die Konzentration der Komponenten des HM mit oder ohne Hyaluronidase zu verhindern.
- Mäuse, 16 h nach der IP-Injektion von hCG einschläfern, mit Isofluran Überdosierung gefolgt von zervikale Dislokation.
- Reinigen Sie die Maus mit 70 % Ethanol. Setzen Sie die Bauchhöhle und visualisieren Sie der weiblichen Fortpflanzungsorgane. Halten Sie den Eierstock mit Zange und entfernen Sie die uterine Ligamente und überschüssiges Fettgewebe aus rund um die Eierstöcke zu. Schneiden Sie der Eileiter von der Gebärmutter und Eierstock Eileiter-paar in der warmen HM in der 35-mm-Schale.
- Entfernen Sie den Eierstock und alle umliegenden Fettgewebe. Reißen der geschwollenen Ampulle des Eileiters mit einem ½ Zoll-27-Gauge-Nadel. Drücken der Eileiter an der Stelle des Risses und der Cumulus-Zelle-Eizelle-komplexe (CoC) ausgewiesen werden. Übertragen der ovulated Eizellen, die in der Metaphase II (MII) der Meiose, bis zum 100 μL Tropfen mit HM-Medien mit Hyaluronidase mit einer Mund-Pipette (Abbildung 2) werden.
Abbildung 2 : Teile von der Mund-Pipette verwendet, um Eizellen zu übertragen. (A) Mund Stück (B) 0,22 äh, 4 mm (C) Sauger Schlauch (D) 1000 μL Pipettieren Filterspitze (E) 9" Pasteur pipettieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
- Pipette die MII Eizelle-Cumulus Zelle komplexe rauf und runter in die Hyaluronidase, HM mit der Mund-Pipette, Kumuluszellen zu verdrängen. Jede Eizelle übertragen, sobald sie frei von Kumuluszellen zu waschen sind fallen mit HM nur mit dem Mund-Pipette. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Wäsche-Tröpfchen. Übertragen Sie fragmentierte oder transparente Eizellen15nicht.
Hinweis: Es ist wichtig, die Eizellen aus jedem Tropfen in der 35-mm-Schale mit als wenig HM wie möglich zu übertragen. Dies gilt auch für jede Übertragung in das Protokoll. Die MII Eizellen dürfen nicht in die Hyaluronidase mit HM-Medium für mehr als eine Minute bleiben.
3. SM-Fisch Färbung der Eizellen
- Eizellen in einem einzelnen Brunnen einer 6-Well-Platte mit 500 µL Puffer Fixierung zu beheben. Tauchen 20 Eizellen oder weniger in den Brunnen. 20 min bei Raumtemperatur inkubieren.
Hinweis: Jeder SM-Fisch Färbung Schritt tritt innerhalb einer einzelnen Brunnen in einer konischen 6-Well Platte. Sicherstellen Sie, dass Eizellen vollständig untergetaucht im Puffer und nicht schwebend über den Puffer. Jeder Schritt sollte mit 20 Eizellen oder weniger in jedem gut sein. - Übertragen Sie feste Eizellen auf 500 μl Waschpuffer (WB im Schritt 1.6 beschrieben) für 10 Minuten. Wiederholen Sie 2 weitere Male.
- Inkubieren Sie Eizellen in Permeabilisierung Puffer für 30 min bei Raumtemperatur.
Hinweis: Die Permeabilisierung Puffer im Schritt 1.7 beschrieben ersetzt den Anstand Permeabilisierung Puffer.- Sammeln Sie Sonde-Sets zu und drehen Sie schnell nach unten, in einem Microcentrifuge. Jede Sonde set für 10 min in einer 40 ° C Wasserbad oder Inkubator zu wärmen. Auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
Hinweis: Dieser Schritt sollte während der Inkubation Permeabilisierung durchgeführt werden
- Sammeln Sie Sonde-Sets zu und drehen Sie schnell nach unten, in einem Microcentrifuge. Jede Sonde set für 10 min in einer 40 ° C Wasserbad oder Inkubator zu wärmen. Auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
- Waschen Sie Eizellen in 500 µL WB für 10 min bei Raumtemperatur.
- Übertragen Sie Eizellen auf 80 μl Protease III Puffer (aus dem Kit verfügbar), verdünnt 1:8 in 1 X PBS für 30 min bei Raumtemperatur.
Hinweis: Die 80 µL Volumen deckt ausreichend unten von einem einzelnen Brunnen in einem 6-Well-Platte. - Waschen Sie Eizellen in 500 µL WB für 10 min bei Raumtemperatur.
- Verdünnen Sie die erwärmten Sonde-Sets für Nanog, Pou5f1, und DapB (eine Negativkontrolle gen), 01:50 in Sonde Verdünnungsmittel. Inkubieren Sie Eizellen in 80 μL der Protokoll-spezifischen Sonde für 2 Stunden bei 40° c
Hinweis: Jeder proprietäre Sonde Satz steht in einem der drei Fluoreszenz-Kanäle (C1, C2 und C3). Nanog und Pou5f1 Sonden wurden mit C2 und C3, bzw. markiert. - Erwärmen Sie das proprietäre, 1 Verstärker (AMP 1), Verstärker 2 (AMP2) Verstärker 3 (AMP3) und Verstärker 4-Fluoreszenz (AMP 4-FL) bei Raumtemperatur.
Hinweis: Dieser Schritt sollte während der 2-stündigen Transkript-spezifische Sonde Inkubation durchgeführt werden. - Übertragen Sie die Eizellen auf 500 μL der WB und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Inkubieren Sie Eizellen sequenziell in Verstärkung Puffern.
- Inkubieren Sie Eizellen in 80 µL AMP1 für 30 min bei 40° c Übertragung Eizellen zu 500 µL von WB für 10 min bei Raumtemperatur.
- Inkubieren Sie Eizellen in 80 µL AMP2 für 15 min bei 40 ° c Übertragen Sie Eizellen auf 500 µL WB für 10 min bei Raumtemperatur.
- Inkubieren Sie die Eizellen in 80 µL AMP3 für 30 min bei 40 ° c Übertragen Sie Eizellen auf 500 µL WB für 10 min bei Raumtemperatur.
Hinweis: Der Rest des Protokolls wird im Dunkeln durchgeführt, weil AMP-FL der Fluorophor enthält. Beim Arbeiten unter dem sezierenden Mikroskop, reduzieren Sie das Licht so weit wie möglich. - Fügen Sie Eizellen zu 80 μL der AMP4-FL für 15 min bei 40° C.
Hinweis: AMP4-FL erfolgt als alternative Puffer-A (Alt-A), Alt-B oder Alt-C. Wählen Sie die AMP4-FL Puffer angewiesen auf die, den Emission Wellenlänge gewünscht wird.
- Waschen Sie Eizellen in 500 µL WB für 10 min bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie Eizellen in 80 µL DAPI für 20 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie Eizellen in 500 µL WB für 5 min bei Raumtemperatur.
- Pipette 12 µL Anti-Fading-Montage-Medien auf die Mitte einer Folie ohne Luftblasen das Reagenz hinzuzufügen. Eizellen mit als wenig WB wie möglich in den Montage-Medien übertragen und einem Deckgläschen gelten.
- Kippen Sie das Deckgläschen schräg und platzieren Sie langsam und sanft über der Flüssigkeit auf der Folie. Vermeiden Sie drücken das Deckglas zu hart, um die Eizellen und die Einführung von Luftblasen zu vermeiden.
- Speichern Sie die Folien in einer dunklen Box über Nacht trocknen bei Raumtemperatur. Bestreichen Sie die Ränder der Folien in klaren Nagellack, Deckglas zu versiegeln.
- Verwenden Sie ein standard Mikroskop Eizellen auf die Folie und Kreis mit einem permanent-Marker zu finden.
Hinweis: Dieser Schritt ist nicht erforderlich, aber verbessert die Ortung Eizellen auf der Folie. Für beste Ergebnisse Bildfolien innerhalb von 1-5 Tagen als das Fluoreszenzsignal beginnt zu verblassen.
(4) Bildverarbeitung
- Bild der 3-dimensionalen Eizellen, mit Z Schritt konfokalen Mikroskopie.
Hinweis: Um die Bilder genau zu analysieren, sollte jeder Schritt Z 1,0 µm/Stück. - Als eine komprimierte Sd2 oder individuelle speichern Sie konfokale Bilder. TIFF-Dateien für jede Eizelle. Beide Bildtypen sind kompatibel mit dem open-Source-Bildbearbeitungsprogramm, Fidschi.
- Downloaden Sie und installieren Sie die open-Access-Fidschi-Software (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
- Sd2-Dateien in Fidschi und wählen Sie Hyperstack. Wenn konfokale Bilder gespeichert wurden. TIFF-Dateien überspringen Sie Schritt 4.4.
Hinweis: Absinken die Sd2-Datei in Fidschi sollte der Hyperstack Dropdown-Liste automatisch angezeigt. - Klicken Sie auf die Registerkarte " Bild ", wählen Sie Farbe, und klicken Sie auf Kanäle teilen , um die fluoreszierenden Kanäle der Sd2 Datei zu trennen.
- Generieren Sie individuelle. TIFF-Dateien für jede Z-Scheibe von der Eizelle in jedem fluoreszierende Kanal. Klicken Sie auf die Registerkarte " Bild ", wählen Sie Stapel aus, und klicken Sie auf Stapel zu Bildern. Klicken Sie auf die Registerkarte " Bild ", wählen Sie Typ, und klicken Sie auf RGB-Farbe um jede Z-Scheibe in eine einzelne RGB-Farbbild zu konvertieren.
Hinweis: Die RGB-Farbe ist künstlich und kann werden gewählt für jedes Emissionswellenlänge. - Speichern Sie jede konvertierte Bild als. TIFF-Datei. Platzieren Sie Bilder aus einer einzigen Eizelle für jeden fluoreszierende Kanal in einem neuen Ordner um Verwechslungen beim Nähen (Schritt 4.3).
- Sd2-Dateien in Fidschi und wählen Sie Hyperstack. Wenn konfokale Bilder gespeichert wurden. TIFF-Dateien überspringen Sie Schritt 4.4.
- Jeweils zu normalisieren. TIFF-Bild für Pou5f1 und Nanog Negativkontrolle Bilder (DapB) verwenden.
Hinweis: Normalisierung erfolgt über ein Bildbearbeitungsprogramm. Stellen Sie sicher, das gleiche Maß an Hintergrundfluoreszenz aus jedem Steuerelement Bild zu entfernen. - Geöffnet jeweils normalisiert. TIFF-Datei in Fidschi an alle Z-Scheiben für jede Eizelle in jeder Wellenlänge zusammen zu nähen.
- Klicken Sie auf die Registerkarte " Plugins ", wählen Sie Naht, und klicken Sie auf Raster/Sammlung (Abb. 3A). Wählen Sie Aufeinander folgenden Bildern aus der Drop-Down-Menü und Klicken Sie auf "OK" (Abb. 3 b).
- Durchsuchen Sie das Verzeichnis und wählen Sie den Ordner mit allen Z-Schnittbilder für eine einzelne Eizelle bei einer Wellenlänge (siehe Schritt 4.3.4). Klicken Sie auf "OK".
- Bewegen Sie den Schieberegler am unteren Rand das gestickte Bild auf die entsprechende Farbe-Kanal für die verwendete Wellenlänge und erstellen Sie das Ergebnisbild RGB genähte durch Klick auf Bild, Auswahl- Typ, und klicken Sie auf RGB-Farbe.
Hinweis: Dieses Bild wird für Fluoreszenz-Quantifizierung in Schritt 4.6 unten beschrieben verwendet werden.
- 32-Bit max. projizierte Bild umwandeln Sie das gestickte Bild. Klicken Sie auf Bild, wählen Sie Typ, und klicken Sie auf 32-Bit (Abbildung 3). Speichern Sie dieses Bild als eine neue. TIFF-Datei.
Abbildung 3 : Zusammenfügen der konfokalen Z-Serie Bilder von Eizellen. (A) Screenshot zeigt das Plug-in-Grid/Datenerfassungs-Tool in Fidschi, die verwendet wurde, um zusammengesetzte Bilder der Eizelle zu produzieren. (B) aufeinander folgenden Bildern verwendet Fluoreszenz Überschneidungen zwischen sequentiellen. TIFF-Dateien um ein zusammengesetztes Bild zu erzeugen. (C) das zusammengesetzte Bild wurde als eine 32-Bit gespeichert. TIFF-Datei. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
- Downloaden Sie und installieren Sie die Stelle finden und Tracking-Programm13, die von der Website für d.r. Larson, ein Ermittler an den nationalen Instituten der Gesundheit National Cancer Institute (https://ccr.cancer.gov/Laboratory-of-Receptor-Biology-and-Gene-Expression/daniel-r-larson) zur Verfügung steht. Downloaden Sie und installieren Sie die open-Access-Virtual-Machine für die interaktive Daten Sprache (IDL) Betriebssystem, das erforderlich ist, um die Stelle zu finden und Tracking Program (http://www.spacewx.com/pdf/idlvm.pdf) laufen.
- Öffnen Sie das 32-Bit, genähte Bild, das in Schritt 4.6 (Abb. 4A), die Stelle zu finden und Tracking-Programm generiert wurde. Wählen Sie der Localize Dropdown-Liste aus , und klicken Sie auf Localize (Abbildung 4 b), die die Anzahl Plätze gefunden im Bild berechnet.
Hinweis: Jeder Punkt gezählt repräsentiert einen einzelnen mRNA. Band-Pass und Photon-Schwelle-Einstellungen entnehmen Sie bitte dem Screenshot (Abbildung 4 b). Dieses Protokoll wurde standardmäßig für jede Schwellenwerteinstellung verwendet. Vertreter positive und Hintergrund-Spots werden (Abbildung 4) angezeigt.
Abbildung 4 : Quantifizierung der mRNAs mit Spot Finder und Tracking. (A) einzelnen Z-Serie Bilder waren zusammengenäht, wie in Abbildung 3 beschrieben und als 32-Bit max. projiziert gespeichert. TIFF-Datei. (B) zusammengesetztes Bild wurde im Spot Finder und Tracking eröffnet. Lokalisiert wurde verwendet, um die fluoreszierenden Flecken (rote Markierung) zählen. Band-Pass und Photon Schwelle werden durch das blaue Kästchen gekennzeichnet. (C) der blaue Pfeil zeigt auf ein positives Signal (Schwellenwert). Der weiße Pfeil zeigt einen fluoreszierenden Punkt unterhalb des Schwellenwerts und daher nicht gezählt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Representative Results
Nach dem Abschluss des Protokolls, das Ergebnis wird Einzelbilder aus der konfokalen Z-Serie (Abbildung 4A und Abbildung 5), Zusammengeheftete Bilder (Abbildung 4), und mRNA zählt (Abbildung 4 b). Beim Multiplexen durchgeführt wird, wird auch sein zusammengeführten Bilder zeigen die Bezeichnung für zwei verschiedene mRNAs (Abbildung 5). Die mRNA-Grafen werden mit Zusammengeheftete Bilder von Fidschi (Abbildung 3) erzeugt und die punktförmige Fluoreszenz Flecken gezählt, mit dem Ort zu finden und Tracking Program (Abbildung 4 b)generiert.
Die mRNA-Grafen werden anschließend analysiert mit einem standard-Daten-Analyse-Tool. In diesem Protokoll wir beschriftet n = 12 Eizellen mit Pou5f1 und Nanog. Die Ergebnisse für jedes mRNA werden gemittelt und der Standardfehler des Mittelwerts berechnet. Die gesammelten Daten in diesem Protokoll zeigte 775 ± SEM Pou5f1 26 Transkripte und 113 ± 5 SEM Nanog Transkripte in MII Eizellen (Abbildung 5). Ein Student t-Test festgestellt, dass ein statistisch signifikanter Unterschied in mRNA zwischen Pou5f1 und Nanogzählt. Wichtig ist, gab es keine Flecken erkannt in n = 5 Eizellen, die mit DapB Sonde (d. h. Negativkontrolle) gekennzeichnet sind. Beachten Sie den kleinen Standardfehler mit nur 12 einzelnen Eizellen. Die Empfindlichkeit des Tests betont auch positive reproduzierbarer Nachweis von Nanog(Abbildung 5). Bisherigen dPCR Experimente erkennt nicht reproduzierbar Nanog darauf hinweist, dass die Anzahl der Nanog mRNAs in eine einzelne Eizelle unterhalb der Schwelle-Erkennung mit dPCR 3.
In Pilotversuchen erkannt wir reduzierten Fluoreszenz, wenn gab es eine Verzögerung zwischen Fixierung der Eizellen und Initiierung von SM-FISH-Protokoll. Ebenso, wenn die proprietäre Hybridisierung Puffer nicht verwendet werden, umringt die Sonde und Verstärkung, verzweigte DNA geben Sie nicht die Zelle durch Fluoreszenz, der Plasmamembran der Eizelle. Dies ist wahrscheinlich durch Aggregation der verzweigte DNA. Beringter Fluoreszenz um die Membran der Eizelle wird auch entstehen, wenn es schlechte Permeabilisierung der Plasmamembran gibt. Optimalen Abbau des Proteins mRNAs verpflichtet ist ebenfalls erforderlich. Die Protease-Puffer im SM-Fisch-Kit enthalten ist eine optimale Konzentration für die Behandlung von Gewebeschnitten und adhärente Zellen. Bei der Verwendung von nicht-anhaftende Zellen ist, es wichtig, die besten Protease-Verdünnung empirisch zu ermitteln. Zu wenig Protease Puffer könnte undercounting von mRNAs durch schlechte Erreichbarkeit der Sonde an die mRNA führen. Ebenso kann zuviel Protease Abbau nicht nur Proteine an die mRNA gebunden führen aber auch Destabilisierung der mRNAs. In diesem Protokoll getestet wir mRNA-Erkennung mithilfe einer Titration Kurve unverdünnt (1:1), 01:12, 1:4 und 1:8 verdünnt Protease Puffer mit 1 X PBS-Puffer (n = 2 bis 3 Eizellen pro Verdünnung). Der Durchschnitt war fluoreszierende Ausdruck Pou5f1 mRNA in MII Eizellen 169 ± 42 SEM (unverdünnt), 176 ± 36 SEM (1:4), 308 ± 18 SEM (1:8) und 445 ± 24 SEM (01:12) (Abbildung 6). In diesem Protokoll verwendeten Protease-Verdünnung wurde 1:8 als es zeigte die niedrigsten Variation.
Abbildung 5 : Pou5f1 und Nanog mRNA in MII Eizelle. (A). repräsentative Bilder des mittleren Z-Serie-Bildes auf der linken Seite angezeigt werden. Pou5f1 wird in den roten Zahlen erkannt (647 nm) Wellenlänge während Nanog im grünen erkannt wird (488 nm) Wellenlänge. DAPI Färbung der Chromosomen, ausgerichtet auf die Metaphase II Spindel, charakteristisch für die MII-Eizelle wird in weiß angezeigt. Gab es keine Färbung für DapB in entweder den 647 nm oder 488 nm Emissionswellenlänge. (B) die Anzahl der Pou5f1 und Nanog mRNAs werden gezeigt, da SEM bedeuten (n = 12 Eizellen); Es gab keine Erkennung (N.D) von DapB. * zeigt P < 0,05, Maßstabsleiste ist 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6 : Empirische Titration der Protease-Puffer zu optimieren, genaue Zählung der mRNAs. Repräsentative Bilder von SM-Fisch von Pou5f1 in MII Eizellen. DAPI-Färbung zeigt Chromosomen auf der MII-Spindel ausgerichtet. Eizellen wurden mit unverdünntem (1:1), 1:4, 1:8 oder 01:12 Verdünnungen der Protease III Puffer inkubiert. Die Anzahl der Pou5f1 mRNAs (n = 2-3 Eizellen) wurden gezählt und der Mittelwert SEM wird angezeigt. Maßstabsleiste ist 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7 : Übertragung von MII Eizellen durch Fixierung, Protease und Hybridisierung Puffer in Vertiefungen der 6-Well-Platte. Die Form von jedem Bohrloch wird angezeigt. (A) Zellen schweben wenn erstmalig Puffer (B) Eintauchen der Eizellen im Puffer hinzugefügt. (C) Eizellen absetzen auf den Boden des Brunnens während der Inkubationszeit. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Eine Reihe von kleinen Schritten während des Protokolls gewährleisten die erfolgreiche Fluoreszenz und genaue Grafen von mRNAs. Erstens muss das Protokoll unmittelbar nach Sammlung und Fixierung der Eizellen erfolgen. Beachten Sie, dass die 4 % Paraformaldehyd Fixierung Puffer zu verhindern, dass Eizellen aneinander kleben PVP hinzugefügt wird. Wir fanden, dass es unmittelbar nach der Sammlung und Fixierung der die Eizellen das Experiment durchführen muss. Jede Verzögerung führt zu einer viel niedrigeren Fluoreszenzsignal, die Transkripte undercounting führen würde. Dies ist zum Teil auf RNA-Abbau. Sollte nicht mehr als 20 Eizellen gleichzeitig zu einem Brunnen in der 6-Well-Platte übertragen werden und jeweils gut darf nur einmal verwendet werden. Inkubationszeiten sollten auch ohne Verkürzung oder Verlängerung der einzelnen Schritte genau befolgt werden. Die Ausnahme ist die Wäsche Puffer Schritte; Eizellen können in der Waschpuffer über einen längeren Zeitraum überlassen werden, unbeschadet der experimentellen Ergebnisse. Die SM-FISH-Sonden gibt es in drei Fluoreszenz-Kanäle C1, C2 und C3. Mischen Sie für multiplexing Sonden, die den gleichen Kanal-Tags nicht. Dies wird dazu führen, dass beide Sonden fluoreszieren bei der gleichen emittierende Wellenlänge Rendering Analyse unmöglich da es wird unterschieden zwischen der Sonde. Positivkontrolle Sonden entwickelt gegen Housekeeping-Gene sind in jeder der drei Kanäle zur Verfügung. Negativkontrolle Sonden (z. B. DapB) gibt es auch in vorgemischten Sets, die ein Tag für alle drei Kanäle enthalten. Das Experiment muss bei schlechten Lichtverhältnissen durchgeführt werden, wie Eizellen nach der Entnahme aus dem Eileiter17,18lichtempfindlich sind. Nach der Zugabe der Fluorophore AMP4 angebracht sollten die Schritte mit so wenig Licht wie möglich zu verhindern, Bleichen von der Fluorophor durchgeführt werden. Zu guter Letzt bei der Montage von Eizellen auf histologischen legen Sie vorsichtig das Deckglas zu verhindern Verzerrungen der Eizelle und Blasenbildung die Bildgebung stören können. Wenn Sie es schwierig finden, Zelle Verzerrungen zu vermeiden, sollten Folie Abstandhalter verwendet werden, um die Kugelform der Eizelle zu erhalten.
Eine wesentliche Änderung des Protokolls ist der Ersatz von Permeabilisierung und waschen Puffer in der kommerziell erhältlichen Kit zur Verfügung gestellt. Die proprietäre Protease und Hybridisierung Puffer zur Verfügung gestellt rauen Umgebungen für die Eizellen sind jedoch für den Erfolg des Protokolls erforderlich. Wenn nicht verwendet, sind die Verstärker nicht in der Lage, die Zelle eingeben, die wahrscheinlich durch Aggregation der verzweigte DNA. Verschieben die Eizellen von diesen rauen Umgebungen auf die relativ milden Permeabilisierung und waschen Puffer, Immunfluoreszenz14, erwies sich für den Erfolg des Protokolls und gleichzeitig ausreichend zur Lyse der Eizellen verhindert. Da Eizellen und Präimplantationsdiagnostik Embryonen nicht zu einer histologischen Folie halten, war eine weitere wesentliche Änderung die Eizellen in den Puffer in einen Brunnen von einer Kulturschale platzieren. Wir haben eine 6-Well Embryo-Kultur-Platte. Jedem Bohrloch in der Platte hat verjüngt und schrägen Seiten und einem 8 mm flach unten (Abbildung 7), die Eizelle Erholung verbessert. Dies ist besonders wichtig, da die Eizellen verlieren ihre feuerfesten Eigenschaften und werden in die Hybridisierung Puffer fast transparent.
Bei der Übertragung von Eizellen von Brunnen zu Brunnen ist es wichtig, sicherzustellen, dass die Eizellen in den Lösungen in jedem Bohrloch vollständig untergetaucht sind, wie Zellen schwimmt, wenn zuerst in jede Vertiefung (Abbildung 7A) übertragen. Sobald sie in den Puffer (Abb. 7 b) mechanisch eingetaucht sind, sinken sie auf den Grund des Brunnens bis zum Jahresende die Inkubation (Abbildung 7). Die Ausnahme ist AMP 1 und 3 AMP; Wenn mechanisch die Eizellen Do nicht vollständig eingetaucht an der Unterseite des Brunnens zu begleichen. Um diese Eizellen zu finden, müssen Sie die Fokusebene ändern. Pipette vorsichtig und die Anzahl der Zellen übertragen werden, um Datenverlust zu vermeiden.
Mehrere einzelne Molekül Fische Techniken, die das Fluoreszenzsignal zu verstärken, anstatt cDNA, verzweigte DNA Chemikalien einschließlich gewesen entwickelt 9,19. Kommerziell erhältlichen Kits haben die verzweigte DNA SM-FISH-Methode für reproduzierbare Erfassung der einzelnen mRNAs in Gewebeschnitten oder adhärente Zellen auf einer histologischen Folie optimiert. Das hier beschriebene Protokoll wurde für den Einsatz mit nicht-anhaftende Einzelzellen (z.B. Eizellen und Präimplantationsdiagnostik Embryonen)3geändert. Dies ermöglicht nicht nur spezifische und reproduzierbaren Quantifizierung, sondern auch Lokalisierung von mRNA in der Eizelle. Dies ist zwar ein Vorteil des Assays, gibt es natürlich Einschränkungen. Beispielsweise kann es im Gegensatz zu RNA-Sequenzierung, neuartige mRNAs nicht identifizieren. Eine weitere Einschränkung des Protokolls ist die Verfügbarkeit von Protokoll-spezifischen Sonden. Proprietäre Sonden sind im Handel erhältlich von den Firmen, die die SM-Fisch-Kits zu verkaufen. Es gibt mehrere Sonden, die vorgefertigte sind. Andere können von der Firma für alle kommentierten mRNA mit einer objektiven Algorithmus10entworfen. Jedoch wenn eine mRNA schlecht sequenziert ist es wäre schwierig, Design-Sonden mit hoher Spezifität. Für kurze Transkription kann es auch schwierig sein, genug Sonde Paare zu identifizieren, die nicht mit anderen Abschriften reduzieren die Spezifität des Assays Kreuzreaktion zu tun. Ebenso kann eine kleinere Anzahl von Sonde ausreichen um Fluoreszenzsignals über dem Schwellenwert für die Erkennung als positiv in den Ort zu finden und Tracking-Programm zu produzieren. In diesem Sinne können mit dieser Methode Transkript Varianten erkannt werden.
Trotz der oben beschriebenen Einschränkungen gibt es mehrere Anwendungen für SM-Fisch. Zum Beispiel Daten aus einzelnen Zelle RNA-Sequenzierung überprüft werden konnte, vor allem, wenn Zelle Zahlen kleine und schwer zu bekommen sind (z.B., Eizellen und Embryonen). Verstärkung der cDNA für PCR-Assays stellt einen experimentellen Fehler die in der Regel durch eine Normalisierung Schritt anhand der Daten aus stabil ausgedrückt Housekeeping-Gene reduziert ist. Zeitliche Änderungen in Eizelle durch vor der Implantation Embryonen ändert jedoch auch die Expression von Genen Hauswirtschaft. Das SM-FISH-Protokoll verstärkt Fluoreszenz statt cDNA. Daher ist keine Voraussetzung für die Normalisierung der Protokoll-spezifischen mRNA-Niveaus, reproduzierbare Ergebnisse mit geringer Variabilität zu erhalten. Aufgrund der Variabilität der PCR Primer Effizienz werden nicht Unterschiede in den absoluten Zahlen der verschiedenen mRNA-Spezies genau innerhalb oder zwischen verschiedenen Zelltypen verglichen. SM-Fisch lokalisiert und mRNA quantifiziert. Daher kann es zu identifizieren, welche Zellen in einer gemischten Zellpopulation mRNA Ausdrücken verwendet werden. Zum Beispiel wenn Eizellen innerhalb von primären oder sekundären Follikel wachsen, die Follikel kann isoliert und kultiviert Alginat Perlen20 aber die Trennung von der Eizelle aus Körperzellen ist schwierig. Daher, Sequenzierung und PCR-Studien wurden durchgeführt mit gemischten Zellpopulationen. Die Verwendung von SM-Fische kann bestimmen, ob mRNAs in somatischen Zellen oder der Eizelle des Follikels erkannt werden. Zu guter Letzt hat SM-Fische hohe Sensitivität und Spezifität zur Erkennung von niedrigen Fülle Protokolle erlauben; z. B. Nachweis von Nanog in MII Eizellen (Abbildung 5).
Lagerung und Abbau von mRNAs sind wichtige regulatorische Mechanismen für Protein-Expression. Posttranskriptionale Regulierung der Übersetzung, Speicherung und Abbau werden durch Proteine, die an mRNAs21binden vermittelt. Derzeit kann RNS-Protein Immunopräzipitation (RIP) routinemäßig durchgeführt werden, wenn eine große Anzahl von Zellen verfügbar22sind. Aufgrund der großen Anzahl von Xenopus Eiern, die von einem einzigen Tier gesammelt werden können, hat RIP in diesem Tiermodell erfolgreich durchgeführt. Es ist jedoch schwierig, genügend Säugetier-Eizellen und Embryonen vor der Implantation durchzuführen RIP zu erhalten. Kopplung von SM-Fisch und Immunfluoreszenz (ImmunoFISH) halten 23 von Gewebeschnitten das Potenzial um Proteine, die verbunden sind mit bestimmten mRNAs einschließlich translationale Maschinen24,25zu visualisieren. Genomik messen genetische Varianten (z. B. kleine-Nukleotid-Polymorphismen, SNPs) verbunden mit Gesundheit und Krankheit26. Phenomics identifiziert Veränderungen im zellulären Reaktionen aufgrund von Umweltbelastungen27,28. Aktuelle Forschung zielt darauf ab, den Mechanismus zu finden, der Veränderungen im Genom mit bestimmten Phänotypen verbindet. Die Verwendung von ImmunoFISH hat das Potenzial, SNP-abhängigen Veränderungen in mRNA Expression und die Expression von Proteinen, die dazu beitragen, zelluläre Phänotypen zu verknüpfen. Im Zuge der Weiterentwicklung die Technologie gibt es wahrscheinlich andere Anwendungen von SM-Fische, mit denen wichtige Mechanismen in verschiedenen biologischen Systemen identifiziert werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verzollen
Acknowledgments
Wir danken Dr. Daniel R. Larson für seine großzügige Unterstützung bei der Installation und Verwendung von Spot zu finden und Tracking-Programm 13 und die technische Unterstützung von der University of Nebraska Lincoln Mikroskopie Kern für die konfokale Mikroskopie-Bildgebung. Diese Studie ist ein Beitrag von der University of Nebraska Agricultural Research Division, Lincoln, Nebraska und wurde unterstützt von UNL Luke Mittel (NEB-26-206/Accession Number-232435 und NEB-26-231/Zbl-Nummer-1013511).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (±)-α-Lipoic acid | Sigma-Aldrich | T1395 | Alpha Lipoic Acid |
| Albumin, Bovine Serum, Low Fatty Acid | MP Biomedicals, LLC | 199899 | FAF BSA |
| BD 10mL TB Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309659 | 10 mL syringe |
| BD PrecisionGlide Needle | Becton, Dickinson and Company | 305109 | 27 1/2 gauge needle |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | CaCl2-2H2O |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C2404 | Citrate |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | Glucose |
| Disodium phosphate | Na2HPO4 | ||
| Easy Grip Petri Dish | Falcon Corning | 351008 | 35 mm dish |
| Edetate Disodium | Avantor | 8994-01 | EDTA |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | Straight, Sharp/Sharp, non-serrated, 13mm cutting edge scissors |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta biologicals | S10250 | FBS |
| Gentamicin Reagent Solution | gibco | 15710-064 | Gentamicin |
| GlutaMAX-I (100X) | gibco | 35050-061 | Glutamax |
| Gold Seal Micro Slides | Gold Seal | 3039 | 25 x 75mm slides |
| Gonadotropin, From Pregnant Mares' Serum | Sigma | G4877 | eCG |
| hCG recombinant | NHPP | AFP8456A | hCG |
| Hyaluronidase, Type IV-S: From Bovine Testes | Sigma-Aldrich | H3884 | Hyaluronidase |
| Jewelers Style Forceps | Integra | 17-305X | Forceps 4-3/8", Style 5F, Straight, Micro Fine Jaw |
| L-(+)-Lactic Acid, free acid | MP Biomedicals, LLC | 190228 | L-Lactate |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M2773 | MgSO4-7H2O |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-Cl | NEAA |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-C | 25 x 25x 0.15 mm cover slips |
| Mm-Nanog-O2-C2 RNAscope Probe | Advanced Cell Diagnostics | 501891-C2 | Nanog Probe |
| Mm-Pou5f1-O1-C3 RNAscope Probe | Advanced Cell Diagnostics | 501611-C3 | Pou5f1 Probe |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Paraformaldehyde |
| PES 0.22 um Membrane -sterile | Millex-GP | SLGP033RS | 0.22 um filters |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P0930 | PVP |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 60128 | KCl |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 60218 | KH2PO4 |
| Prolong Gold antifade reagent | invitrogen | P36934 | Antifade reagent without DAPI |
| RNAscope DAPI | Advanced Cell Diagnostics | 320858 | DAPI |
| RNAscope FL AMP 1 | Advanced Cell Diagnostics | 320852 | Amplifier 1 |
| RNAscope FL AMP 2 | Advanced Cell Diagnostics | 320853 | Amplifier 2 |
| RNAscope FL AMP 3 | Advanced Cell Diagnostics | 320854 | Amplifier 3 |
| RNAscope FL AMP 4 ALT A | Advanced Cell Diagnostics | 320855 | Amplifier 4 ALT A |
| RNAscope FL AMP 4 ALT B | Advanced Cell Diagnostics | 320856 | Amplifier 4 ALT B |
| RNAscope FL AMP 4 ALT C | Advanced Cell Diagnostics | 320857 | Amplifier 4 ALT C |
| RNAscope Fluorescent Multiplex Detection Reagents Kit | Advanced Cell Diagnostics | 320851 | FISH Reagent Kit |
| RNAscope Probe 3-plex Negative Control Probe | Advanced Cell Diagnostics | 320871 | Negative Control |
| RNAscope Probe 3-plex Positive Control | Advanced Cell Diagnostics | 320881 | Positive Control |
| RNAscope Probe Diluent | Advanced Cell Diagnostics | 300041 | Probe Diluent |
| RNAscope Protease III | Advanced Cell Diagnositics | 322337 | Protease III |
| RNAscope Protease III & IV Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 322340 | FISH Protease Kit |
| RNAscope Protease IV | Advanced Cell Diagnostics | 322336 | Protease IV |
| S/S Needle with Luer Hub 30G | Component Supply Co. | NE-301PL-50 | blunt 30 gauge needle |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S6191 | NaCl |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 306576 | NaOH |
| Sodium pyruvate, >= 99% | Sigma-Aldrich | P5280 | Pyruvate |
| Solution 6 Well Dish | Agtechinc | D18 | 6 well dish |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | Taurine |
| Tissue Culture Dish | Falcon Corning | 353002 | 60 mm dish |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Triton X-100 |
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