Summary
Questo articolo presenta un protocollo modulare per la lipidomica e la trascrittomica tissutale e la lipidomica plasmatica in modelli murini di malattie neurologiche che mirano ai lipidi sottostanti l'infiammazione e l'attività neuronale, i lipidi di membrana, i messaggeri a valle e gli enzimi / recettori che codificano per l'mRNA alla base della funzione lipidica. Vengono delineate le procedure di campionamento, elaborazione dei campioni, estrazione e quantificazione.
Abstract
I lipidi fungono da interfaccia primaria per insulti cerebrali o stimoli favorevoli alle malattie neurologiche e sono un serbatoio per la sintesi dei lipidi con varie funzioni di segnalazione o ligando che possono sottolineare l'insorgenza e la progressione delle malattie. Spesso cambiando a livello presintomatico, i lipidi sono una fonte emergente di bersagli farmacologici e biomarcatori. Molte malattie neurologiche presentano neuroinfiammazione, neurodegenerazione ed eccitabilità neuronale come segni distintivi comuni, in parte modulati da specifici sistemi di segnalazione lipidica. L'interdipendenza e l'interrelazione della sintesi di vari lipidi richiede un'analisi multilipidica, multienzimatica e multirecettore al fine di ricavare i punti in comune e le specificità dei contesti neurologici e di accelerare il dipanarsi degli aspetti meccanicistici dell'insorgenza e della progressione della malattia. L'attribuzione di ruoli lipidici a regioni cerebrali distinte fa progredire la determinazione del fenotipo molecolare lipidico e della morfologia associata a una malattia neurologica.
Qui viene presentato un protocollo modulare adatto per l'analisi dei lipidi di membrana e dei segnali lipidici a valle insieme all'mRNA di enzimi e mediatori alla base della loro funzionalità, estratti da regioni cerebrali discrete che sono rilevanti per una particolare malattia e / o condizione neurologica. Per garantire un'accurata profilazione lipidomica comparativa, i flussi di lavoro e i criteri operativi sono stati ottimizzati e standardizzati per: i) campionamento cerebrale e dissezione delle regioni di interesse, ii) co-estrazione di più segnali lipidici e lipidi di membrana, iii) doppia estrazione lipidico/mRNA, iv) quantificazione mediante cromatografia liquida monitoraggio a reazioni multiple (LC/MRM) e v) profilazione standard dell'mRNA. Questo flusso di lavoro è suscettibile per le basse quantità di tessuto ottenute dal campionamento delle sottoregioni cerebrali funzionalmente discrete (cioè mediante punzonatura cerebrale), prevenendo così pregiudizi nell'analisi multimolecolare dovuti all'eterogeneità tissutale e / o alla variabilità animale. Per rivelare le conseguenze periferiche delle malattie neurologiche e stabilire letture molecolari traslazionali degli stati di malattia neurologica, il campionamento degli organi periferici, l'elaborazione e la loro successiva analisi lipidomica, nonché la lipidomica plasmatica, sono anche perseguiti e descritti. Il protocollo è dimostrato su un modello murino di epilessia acuta.
Introduction
I recenti progressi nella funzione dei lipidi e il loro ruolo nell'insorgenza e nella progressione delle malattie neurologiche aprono nuove sedi di ricerca e sviluppo di nuovi bersagli terapeutici e delucidazione del meccanismo della malattia1. Le differenze documentate nella composizione lipidica in diverse regioni del cervello, enfatizzate dalle moderne tecniche di imaging molecolare come l'imaging con spettrometria di massa e la profilazione avanzata della spettrometria di massa, spostano il paradigma dell'indagine lipidica dall'intero cervello verso regioni cerebrali funzionalmente distinte e discrete. Il fatto che la composizione lipidica vari nelle diverse regioni del cervello induce a una nuova concettualizzazione sia della sensibilità lipidica di membrana che della segnalazione lipidica a valle in risposta a un insulto o stimoli cerebrali attraverso le regioni cerebrali funzionalmente distinte. Pertanto, i protocolli lipidici richiedono nuovi sviluppi per affrontare la sfida di basse quantità di tessuto per il rilevamento e la quantificazione di una risoluzione spaziale più elevata e, contemporaneamente, l'analisi di più componenti lipidici delle membrane cellulari e delle vie di segnalazione. Inoltre, la determinazione di enzimi, ligandi lipidici e recettori coinvolti nella regolazione dei loro livelli e della loro funzione è fondamentale per chiarire le vie di segnalazione colpite in una malattia neurologica e guidare nuove indagini meccanicistiche in un contesto fisiopatologico.
Oltre all'aumento della risoluzione spaziale del cervello, ci sono due grandi difficoltà che sfidano lo sviluppo di nuovi approcci neurolipidomici. In primo luogo, le molecole di segnalazione lipidica sono tipicamente di abbondanza molto bassa rispetto ai lipidi costitutivi di membrana. In secondo luogo, il lipidoma presenta un'elevata eterogeneità strutturale, difficile da sezionare utilizzando un unico approccio analitico. Quindi, i metodi di estrazione e analisi sono adattati a diverse categorie lipidiche e comunemente eseguiti in campioni di tessuto distinti2. Metodi lipidomici shotgun3 sono strumenti eccellenti per rivelare rapidamente un ampio profilo dei lipidi di membrana, mentre l'aumento della sensibilità e della selettività offerte dalla scoperta mirata e dalla quantificazione dei metodi spettrometrici di massa sono capitalizzati per lo studio di lipidi di segnalazione a bassa abbondanza tra cui: i) lipidi infiammatori e ii) lipidi coinvolti nella modulazione dell'attività neuronale, come endocannabinoidi (eCB), lipidi legati agli amminoacidi, and so on.4,5. Per comprendere i cambiamenti lipidici sia a livello di membrana cellulare che di segnalazione che si verificano nelle regioni cerebrali dei modelli di malattie neurologiche, in genere l'estrazione e l'analisi dei lipidi vengono eseguite in campioni di tessuto distinti, ottenuti da lotti animali distinti o da emisferi diversi, o sezionando una regione tissutale più ampia in più pezzi. Quando anche i livelli di mRNA dei recettori enzimatici sono di interesse, la loro indagine richiede in genere l'approvvigionamento di un campione di tessuto distinto. Ad esempio, lo studio dei lipidi di membrana, dei cannabinoidi endogeni e dell'mRNA richiederebbe tre diversi campioni di tessuto (ad esempio, due campioni per i due metodi di estrazione dei lipidi - lipidi di membrana e lipidi di segnalazione - e successivi due metodi di analisi dei lipidi - e un campione per l'analisi dell'mRNA). Lo studio dei lipidi infiammatori e dei cannabinoidi endogeni richiede due distinti campioni di tessuto, metodi di estrazione e metodi di analisi, rispettivamente. Un altro esempio è lo studio dell'mRNA e di qualsiasi categoria lipidica in un campione di punch cerebrale o di microdissezione laser che di conseguenza richiede due animali distinti per procurarsi due campioni per (sotto)regione del cervello. In questi casi si verifica frequentemente una notevole variabilità e/o scarsa riproducibilità dei risultati, derivante dalla variabilità biologica e/o dall'eterogeneità tissutale. Guidato da queste limitazioni pratiche dell'analisi multimolecolare, che si verificano in particolare ad alta risoluzione spaziale nel cervello, è stato progettato un protocollo di neurolipidomica a tre moduli che comprende: 1) coestrazione e co-analisi da parte di LC / MRM di lipidi infiammatori (ad esempio, eicosanoidi (eiCs)) e lipidi coinvolti nella modulazione dell'attività neuronale, come gli eCB2; 2) co-estrazione di fosfolipidi (PL) ed eCB con successiva analisi multiscan LC/MRM e precursor/neutral loss scan2; e 3) doppia estrazione di lipidi di membrana (fosfo)lipidi ed eCB nonché di mRNA, con successiva analisi di sequenziamento LC/MRM e qPCR o RNA6. A seconda della questione biologica da affrontare in una malattia neurologica e della regione cerebrale di interesse, una combinazione del primo e del secondo protocollo, o del primo e del terzo protocollo, può essere applicata sullo stesso campione di tessuto per tessuti di peso di circa 4 mg. Il primo e il terzo protocollo possono essere applicati in modo indipendente per i tessuti intorno ai 2 mg. Il secondo protocollo può essere applicato per tessuti di peso minimo di 0,5 mg. Indipendentemente dal modulo di protocollo neurolipidomico selezionato, il campionamento dei tessuti e l'elaborazione pre-analitica, l'isolamento cerebrale e la dissezione della regione, nonché la procedura per sacrificare il modello animale sono standardizzati e identici per tutti e tre i moduli del protocollo. Nella nostra indagine sulle malattie neurologiche, gli organi periferici che sono rilevanti per le conseguenze patologiche della malattia vengono sempre raccolti e analizzati utilizzando questi protocolli modulari. Inoltre, il sangue viene regolarmente campionato per la lipidomica plasmatica per servire come strumento di lettura delle malattie neurologiche in vista di potenziali applicazioni traslazionali. Il protocollo lipidomico modulare qui presentato è molto versatile: scalabile a quantità di tessuto più grandi e facilmente applicabile praticamente a qualsiasi tipo di tessuto e malattia. Per l'applicazione del protocollo modulare (Figura 1) nelle malattie neurologiche, qualsiasi modello standardizzato di roditori di insorgenza e progressione di disturbi neurologici, come lesioni cerebrali traumatiche, morbo di Parkinson, morbo di Alzheimer o epilessia sono suscettibili.
Questi protocolli sono stati ampiamente applicati per studiare i cambiamenti nel lipidoma tissutale e/o nel trascrittoma nella fase acuta dell'epilessia nel modello murino di epilessia indotto dall'acido kainico (KA)2,7, un modello ampiamente utilizzato negli studi preclinici a causa della somiglianza con l'epilessia del lobo temporale umano (TLE)8,9,10,11. Utilizzando questi protocolli, il potenziale terapeutico di farmaci come palmitoiletanolamide (PEA)12,13 è stato valutato nello stesso modello murino di epilessia. Lo studio ha identificato cambiamenti lipidici e mRNA ad alta e bassa risoluzione spaziale nel cervello e nella periferia, nel punto temporale delle intensità massime di convulsioni acute (a 60 minuti di induzione post-epilettica) e dopo il trattamento subcronico e acuto con PEA in quattro diversi punti temporali (20, 60, 120 e 180 min) dopo l'induzione della crisi ka, una finestra temporale che copre la fase acuta dell'epilessia. Plasma, cervello e organi periferici di topi iniettati con KA non trattati, topi acuti e subcronicamente trattati con PEA, così come topi di controllo veicolo e PEA-veicolo, sono stati raccolti in ogni punto temporale12,13 e studiati con questa analisi molecolare. I dati molecolari sono stati correlati con fenotipi comportamentali ottenuti dal seizure scoring, nonché con dati derivati dall'immunoistochimica sui processi neurodegenerativi, al fine di svelare la progressione della fase di epilessia acuta e il potenziale della PEA per alleviarla.
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Protocol
Tutte le procedure sperimentali qui descritte sono conformi alla direttiva del Consiglio della Comunità europea del 22 settembre 2010 (2010/63UE) e sono state approvate dal comitato locale per gli animali dello stato Renania-Palatinato, Germania (riferimento file: 23 177-07/G16-1-075).
1. Modello animale di epilessia acuta e profilatticamente trattata con KA
- Eseguire l'induzione delle convulsioni, il trattamento e il punteggio comportamentale.
- Separare i topi (minimo n = 6 topi per gruppo) in gabbie singole.
- Preparare la soluzione per iniezione di induzione del sequestro e il veicolo corrispondente (vedere Tabella 1), nonché la soluzione di iniezione del trattamento e il veicolo corrispondente (vedere Tabella 2).
- Iniettare topi per via intraperitoneale (i.p.) (10 ml/kg di massa corporea del topo) senza anestesia in base alla loro identità di gruppo: malattia, trattata o trattata con veicolo (cioè KA, KA trattata con PEA e i due gruppi di veicoli). Vedere figura 2, tabella 1 e tabella 2.
- Monitorare e valutare il comportamento secondo la seguente scala standardizzata di intensità delle convulsioni: 0 = nessuna risposta; 1 = immobilità e fissare; 2 = estensione dell'arto anteriore e/o della coda, postura rigida; 3 = movimenti ripetitivi, oscillazione della testa; 4 = allevamento e caduta; 5 = allevamento e caduta continui; 6 = gravi convulsioni clonico-toniche; 7 = morte14,15 (Figura 3).
- Eseguire la procedura di sacrificio per l'analisi lipidomica e trascrittomica.
- In quattro timepoint (cioè 20, 60, 120 e 180 min dopo KA- o iniezione del veicolo rispettivamente), sacrificare sei topi di ciascuno dei seguenti gruppi: PEA trattato, PEA-non trattato veicolo epilettico 1 e veicolo 2, seguendo protocolli approvati IACUC.
- Dieci secondi dopo aver raggiunto ogni punto temporale, anestetizzare i topi usando un tessuto imbevuto di isoflurano in una camera di vetro. Confermare l'anestesia dalla perdita del riflesso di raddrizzamento, indicata dall'incapacità di muoversi mentre si ribalta lentamente la camera di vetro. Decapitare i topi usando forbici chirurgiche e raccogliere plasma, cervello e organi periferici (vedere i passaggi 2.2.2-2.2.4).
ATTENZIONE: le norme etiche per le procedure di sacrificio variano tra i comitati animali locali. Assicurati di controllare e seguire le normative emesse dal comitato locale per gli animali.
- Seguire la procedura di sacrificio per l'analisi immunoistochimica.
- Per la colorazione immunoistochimica13, assegnare un punteggio comportamentale a tre topi di ciascuno dei seguenti gruppi: PEA trattata, epilessia non trattata con PEA e gruppi di veicoli, durante l'intero corso del tempo (180 min).
- Sacrifica e perfondi i topi 5 giorni dopo. Anestetizzare profondamente i topi (vedere il punto 1.3.1 per i gruppi murini) mediante iniezione i.p. di pentobarbital (100 mg/kg) e buprenorfina (0,1 mg/kg) come stupefacenti. Confermare l'anestesia profonda con la perdita di riflesso tra le dita dei piedi.
- Fissare il mouse su una piastra di polistirolo e aprire immediatamente il torace usando forbici sottili e pinze standard. Metti la farfalla nel ventricolo del cuore sinistro e taglia l'atrio destro usando forbici fini.
- Regolare la velocità e la pressione della pompa a un flusso peristaltico costante con una velocità di 2-3 ml / min. Perfondere con soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato (PBS) per ~ 5 min. Se necessario, sostituire la farfalla.
NOTA: Con una corretta perfusione, gli organi interni (ad eccezione della milza) iniziano a sbiancare entro 1-2 minuti. - Passare la perfusione alla soluzione ghiacciata di paraformaldeide al 4% (PFA) per ~ 5 min. Isolare cervelli interi come descritto nel passaggio 2.2.2 e fissare per 24 ore in soluzione di PFA al 4% a 4 °C.
- Incubare i cervelli in soluzione di saccarosio al 30% per 48 ore a 4 °C. Rimuovere il saccarosio avanzato con una carta velina asciutta e congelare il cervello su una piastra metallica (-80 °C). Conservare il cervello a -80 °C per le procedure di colorazione13.
2. Procedure di campionamento per analisi lipidomiche/trascrittomiche
- Prepararsi per il campionamento.
- Tubi EDTA preraffreddati per il campionamento al plasma a 4 °C. Preraffreddare l'apparato centrifugo e vortice a 4 °C. Preraffreddare la piastra metallica ricoperta di foglio di alluminio (per far scattare il cervello congelato e/o altri tessuti di interesse) su ghiaccio secco (-80 °C). Preraffreddare i tubi marcati da 2 mL e 5 mL su ghiaccio secco (-80 °C) rispettivamente per aliquote plasmatiche, tessuto congelato e raccolta del cervello. Utilizzare tubi ambra per proteggere le molecole sensibili alla luce, come gli eIC.
- Pulire l'apparecchiatura per il campionamento e l'isolamento dei tessuti (forbici chirurgiche, forbici sottili dritte e affilate, pinze standard dritte e lisce, pinze fini con finitura a specchio, pinze curve e spatola, piastra in polistirene espanso e aghi per la fissazione) con un disinfettante (ad esempio, etanolo al 70%).
- Protocolli di campionamento
- Determinare l'ordine di campionamento.
- Raccogliere il sangue immediatamente dopo la decapitazione in tubi EDTA preraffreddati da 1 mL (vedere punto 2.2.3).
- Rimuovere l'intero cervello e congelare immediatamente dopo la rimozione. Questo passaggio richiederà 1-2 minuti. Conservare i cervelli congelati a -80 °C per un'ulteriore elaborazione (vedere il passaggio 2.2.2).
- Rimuovere gli organi periferici di interesse (ad esempio, polmone, cuore, fegato), entro 5 minuti dopo la rimozione del cervello, e congelare e conservare a -80 °C per un'ulteriore elaborazione (vedere il passaggio 2.2.4).
- Rimuovere il cervello per le procedure di dissezione o punzonatura. Questa procedura richiede 1-2 min / cervello.
- Dopo la decapitazione (vedi passo 1.2), inizia a fare un'incisione della linea mediana nella pelle usando forbici fini. Libera il cranio capovolgendo la pelle sopra gli occhi. Raggiungi la parte superiore del cranio e fai una piccola incisione caudale a partire dal livello dell'osso intraparietale. Evitare di tagliare attraverso il cervello.
- Tagliare saldamente attraverso la parte più anteriore del cranio tra gli occhi per facilitare la rimozione del cervello. Inclina un lato dell'osso parietale usando una pinza curva a modello stretto e stacca. Ripeti l'ultimo passaggio per l'altro lato.
- Rimuovere le meningi cerebrali. Far scorrere una spatola sotto la parte anteriore del cervello (cioè il bulbo olfattivo) e inclinare delicatamente il cervello verso l'alto. Far scorrere la spatola più in basso per rompere l'ottica e altri nervi cranici.
- Sollevare il cervello dal cranio e congelare immediatamente l'intero cervello su una piastra metallica preraffreddata (-80 ° C) con il lato ventrale rivolto verso la piastra metallica (dorsale verso l'alto).
- Lasciare che il cervello si congeli completamente e si trasferisca in tubi preraffreddati da 5 ml e conservare a -80 °C fino alla dissezione delle regioni cerebrali o alla procedura di punzonatura (vedere i passaggi 3.1. e 3.2).
- Eseguire il campionamento del plasma.
- Tubi EDTA preraffreddati Spike con 10 μL di indometacina-diluizione appena preparata fino a una concentrazione target di 10 μM.
- Raccogliere il sangue del tronco immediatamente dopo la decapitazione mediante una delicata spremitura del corpo in tubi EDTA preraffreddati fino a un volume massimo di sangue di 1 ml.
NOTA: In caso di corretta pressione sanguigna, non è richiesta la spremitura. Se il volume del sangue è inferiore a 1 ml, ridurre il tempo di incubazione dell'isoflurano per consentire un corretto flusso sanguigno. - Centrifugare immediatamente le provette del sangue a 2.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
- Rimuovere la fase plasmatica superiore risultante e, ai fini dell'analisi multilipidica, i volumi di plasma definiti aliquota nei tubi preraffreddati da 2 mL come segue: 50 μL per l'analisi eCB/eiCs, 30 μL per l'analisi DEI PL e il volume di plasma rimanente come campione di riserva o per altri tipi di analisi.
- Conservare i campioni di plasma a -80 °C per un'ulteriore estrazione (vedere i passaggi 4.1.2 e 4.1.4).
- Eseguire il campionamento degli organi periferici.
NOTA: Utilizzare i riferimenti di anatomia del topo16 e la documentazione fornita per i corsi obbligatori (FELASA) frequentati da sperimentatori di animali per identificare i singoli organi, i loro tessuti connettivi e / o vasi sanguigni.- Immobilizzare il busto del topo per facilitare la rimozione degli organi usando gli aghi. Fai un'incisione ventrale della linea mediana usando una forbice dritta affilata all'altezza del pube. Utilizzare una pinza standard smussata per fissare la parete addominale durante il taglio per aprire la cavità addominale.
- Immobilizzare la pelle per consentire la rimozione degli organi addominali utilizzando pinze smussate. Per la rimozione del cuore o del polmone, continuare il taglio mediale nella direzione della grotta del seno. Rimuovere il polmone e / o il cuore usando una pinza fine.
- Aprire attentamente la cavità mammaria per evitare sanguinamento. Tagliare i tessuti connettivi e i vasi sanguigni ancorando il rispettivo organo senza tagliare l'organo.
- Trasferire immediatamente i pezzi di tessuto su piastre metalliche preraffreddate (-80 °C) e lasciare congelare completamente. Trasferire i pezzi di tessuto in tubi preraffreddati e conservare a -80 °C per un'ulteriore lavorazione (vedere punto 4.1).
- Determinare l'ordine di campionamento.
3. Lavorazione biologica dei materiali
NOTA: Per la co-estrazione di eCB/eIC utilizzare tubi ambrati da 2 ml come tubi di estrazione e aggiungere in ogni tubo sette sfere di acciaio preraffreddate. Per la co-estrazione di PL/eCB e per la doppia co-estrazione lipidica e RNA, utilizzare 2 mL di tubi di estrazione privi di RNAsi con chiodati con perline ceramiche (Table of Materials).
- Eseguire la dissezione cerebrale e l'elaborazione degli organi periferici.
NOTA: utilizzare lampade di ingrandimento per aumentare la visibilità del cervello per la dissezione.- Pulire gli strumenti chirurgici, comprese le pinze con punte super sottili, 2x con il 70% di etanolo.
- Trasferire il cervello congelato da -80 °C a una capsula di Petri contenente tampone fisiologico preraffreddato (pH 5,5) Assicurarsi che la capsula di Petri sia a 4 °C. Consenti al cervello di sbloccarsi completamente per consentire la dissezione. Testare attentamente usando una pinza.
ATTENZIONE: Non tenere il cervello a 4 °C più a lungo di quanto richiesto per lo scongelamento. - Preraffreddare una piastra metallica su ghiaccio (4 °C) e coprirla con tessuti bagnati imbevuti di tampone fisiologico ghiacciato (pH 5,5) e trasferire accuratamente il cervello con il lato ventrale su una piastra metallica preraffreddata (4 °C) su ghiaccio. Coprirlo con tessuti bagnati imbevuti di tampone fisiologico ghiacciato (pH 5,5).
- Seziona le regioni del cervello entro un massimo di 5 minuti usando una pinza a punta super fine. Inizia con l'ipotalamo (HYP) e gira il lato dorsale verso l'alto per procedere con il lato destro. Isolare l'ippocampo (HCr), la corteccia prefrontale (PFCr), lo striato (STRr) e la corteccia cerebrale (cCTXr). Quindi seziona il lato sinistro. Isolare l'ippocampo (HCl), la corteccia prefrontale (PFCl), lo striato (STRl) e la corteccia cerebrale (cCTXl). Sezionare il cervelletto e la regione talamica. Utilizzare riferimenti anatomici pubblicati16,17 per l'identificazione della regione del cervello.
- Trasferire ogni pezzo sezionato direttamente su una piastra metallica preraffreddata rivestita di foglio di alluminio (-80 °C). Consentire il congelamento e trasferire le regioni cerebrali isolate nei tubi preraffreddati da 2 ml etichettati.
- Polverizzare i pezzi di tessuto utilizzando un polverizzatore di tessuto (a -80 °C), evitando lo scongelamento del tessuto. Nella cella frigorifera, polvere di tessuto aliquota in tubi di estrazione preraffreddati etichettati contenenti perline di ceramica o sfere di acciaio. Per la doppia analisi lipidomica/trascrittomica, pesare le aliquote di polvere tissutale nella cella frigorifera. Per l'analisi solo lipidomica, scegliere tra la normalizzazione al peso del tessuto o al contenuto proteico. Per quest'ultimo, procedere ulteriormente senza pesare i tessuti.
- Tagliare i tessuti periferici dell'organo in pezzi con un peso massimo di 20 mg. Procedere con la polverizzazione dei tessuti come al punto 3.1.6.
- Procedere con l'estrazione di campioni di tessuto (vedere i passaggi 4.1.1, 4.1.3 o 4.1.5) o conservare i tubi a -80 °C per un'estrazione successiva.
NOTA: La matrice cerebrale può anche essere utilizzata se il progetto di studio lo consente. Tuttavia, il metodo è più adatto per un numero discreto e limitato di regioni del cervello, e non è pratico sezionare e isolare tutte le regioni cerebrali sopra menzionate entro il periodo di tempo stabilito.
- Esegui la punzonatura cerebrale.
- Montare l'intero cervello congelato sul sistema di montaggio (Tabella dei materiali) nel criostato. Impostare lo spessore su 50 μm e affettare in modalità trim vicino alla regione di interesse.
- Macchiare la fetta di cervello (18-20 μm) usando il blu di toluidina (0,1% -1%) come riferimento per localizzare la sottoregione di interesse. Ispezionare le fette macchiate utilizzando un microscopio per identificare le regioni di interesse da punzonare. Utilizzare un atlante del topo come riferimento per trovare le regioni anatomiche cerebrali appropriate16. Prelevare punzoni con un diametro di 0,8-1,0 mm utilizzando corer campione in tubi preraffreddati.
- Pesare i punzoni congelati nella cella frigorifera in tubi di estrazione da 2 mL etichettati e preraffreddati contenenti perline di ceramica o sfere di acciaio. Utilizzare tubi ambra per la co-estrazione di eCB ed eIC.
- Avviare l'estrazione (vedere i passaggi 4.1.1, 4.1.3 o 4.1.5) o conservare i tubi a -80 °C per un'ulteriore estrazione.
- Eseguire l'elaborazione al plasma.
- Posizionare i campioni di plasma congelato sul ghiaccio (4 °C) e lasciarli scongelare (~20 min).
- Assicurarsi che il plasma sia completamente scongelato prima di iniziare l'estrazione.
- Procedere con la procedura di estrazione del plasma (vedere i passaggi 4.1.2 o 4.1.4).
NOTA: i campioni di plasma devono rimanere a -80 °C fino all'estrazione. Evitare cicli di scongelamento e ricongelamento.
4. Procedure di estrazione
- Eseguire protocolli di co-estrazione lipidica Liquid-Liquid (LLE).
- Eseguire la co-estrazione di eCB ed eIC da pezzi cerebrali, pugni o campioni di polvere di tessuto.
NOTA: durante tutta la procedura è necessario un pipettaggio accurato.- Posizionare i tubi di estrazione contenenti i campioni di tessuto e sette sfere di acciaio sul ghiaccio (4 °C). Aggiungere 600 μL di MTBE ghiacciato e 50 μL di ACN/H2O (1:1; v/v) contenenti gli standard interni. La concentrazione target delle norme interne nel volume finale per l'analisi (50 μL) è la seguente: 1 ng/mL AEA-d4, 125 ng/mL 2-AG-d5, 3.000 ng/mL AA-d8, 2 ng/mL OEA-d4; PEA-d4, 12,5 ng/mL 1-AG-d5, 2,5 ng/mL PGF2α-d4 e 5 ng/mL per PGD2-d4; PGE2-d9; 5(S)-HETE-d8; 12(S)-HETE-d8; 20-HETE-d6 e TXB2-d4, rispettivamente.
- Aggiungere 400 μL di acido formico 0,1 M e omogeneizzare con un liser tissutale (30 s-1 min). Centrifugare l'omogeneizzato per 15 min a 5.000 x g a 4 °C. Consentire il congelamento della fase inferiore acquosa per 10 minuti a -80 °C per facilitare il trasferimento della fase organica superiore.
- Trasferire la fase organica in nuovi tubi. Evaporare sotto un flusso delicato di N2 a 37 °C e ricostituire in 50 μL di ACN/H2O (1:1; v/v) per ulteriori analisi.
- Conservare la fase acquosa a -20 °C o -80 °C per un'ulteriore analisi del contenuto proteico.
- Eseguire la co-estrazione di eCB ed eIC da campioni di plasma.
- Aliquote plasmatiche di scongelamento a 4 °C. Aggiungere 800 μL di MTBE e 50 μL di ACN/H2O (1:1; v/v) contenenti le norme interne (analoghe a quelle utilizzate per l'analisi dei tessuti, cfr. punto 5.1.1). Ottimizzare la concentrazione standard interna per lo spiking utilizzando campioni di plasma di riferimento.
- Aggiungere 600 μL di 0,1 M di acido formico e campioni di vortice a 4 °C per 2 minuti. Centrifugare i campioni a 4.000 x g per 15 min a 4 °C.
- Trasferire la fase organica in nuovi tubi, evaporare sotto un flusso delicato di N2 a 37 °C e ricostituire in 50 μL di ACN/H2O (1:1; v/v) per l'analisi LC/MRM.
NOTA: Se possibile, evitare lo stoccaggio di estratti secchi di eIC e procedere immediatamente all'analisi LC/MRM. Se la conservazione non può essere evitata, ricorrere alla conservazione a breve termine per soli 2-3 giorni a 4 ° C con campioni in solvente per iniezione LC.
- Eseguire la co-estrazione di PL ed eCB da regioni del cervello, punzoni o altri campioni di polvere tissutale.
- Posizionare i tubi di estrazione contenenti i campioni di tessuto e le perle di ceramica sul ghiaccio (4 °C). Aggiungere 800 μL di MTBE/MeOH (10:3; v/v) e 10 μL di MeOH contenenti gli standard interni. La concentrazione target delle norme interne nel volume finale per l'analisi (100 μL) è la seguente: 150 ng/mL per PC 17:0/14:1, PE 17:0/14:1, PA 17:0/14:1, 100 ng/mL PG 17:0/14:1; PS 17:0/14:1; PI 17:0/14:1; LPC 17:0; LPA 17:0; SM d18:1/12: 0,1 ng/mL AEA-d4, 60 ng/mL 2-AG-d5, 4.000 ng/mL AA-d8, 2 ng/mL OEA-d2 e 3 ng/mL PEA- d4 rispettivamente.
- Aggiungere 200 μL di acido formico allo 0,1% contenente 25 μM di tetraidrolipstatina/URB597 e 50 μg/mL di BHT. Omogeneizzare con l'omogeneizzatore tissutale (Tavolo dei Materiali) e centrifugare a 5.000 x g e 4 °C per 15 min.
- Recuperare la fase organica superiore in nuovi tubi ed evaporare sotto un flusso delicato di N2 a 37 °C. Ricostituire in 90 μL di MeOH e conservare a -20 °C o -80 °C o procedere con il passaggio successivo.
- Aggiungere il 10% di H2O ad un'aliquota di estratto lipidico (4.1.3.3) e iniettare 10 μL nella LC/MS per l'analisi dei PL. Per ulteriori analisi eCB procedere con il passaggio 4.3.5.
- Prelevare un'aliquota dell'estratto (4.1.3.3), evaporare a secco e ricostituire in ACN/H2O (1:1; v/v). Utilizzare 20 μL per l'iniezione di LC/MS per l'analisi eCB.
- Eseguire la co-estrazione di PL ed eCB da campioni di plasma.
- Scongelare le aliquote plasmatiche a 4 °C, aggiungere 1.000 μL di MTBE/metanolo (10:3; v/v) e 10 μL Di MeOH contenenti standard interni (analogo al punto 4.1.3) e vortice a 4 °C per 1 min.
- Aggiungere 250 μL di H2O e vortice per 45 min a 4 °C. Centrifugare i campioni per 15 min a 5.000 x g e 4 °C. Recuperare la fase organica superiore, evaporare sotto un flusso delicato di N2 a 37 °C e ricostituire in 90 μL di metanolo per ulteriori analisi LC/MS. Conservare a -20 °C o -80 °C o procedere al passaggio successivo.
- Per l'analisi dei PL, aggiungere il 10% di acqua a un'aliquota di estratto lipidico (4.1.2.2).
- Per l'analisi eCB, aggiungere il 10% di acqua a un'aliquota dell'estratto lipidico (vedere 4.1.4.3), evaporare a secco e ricostituire in 50% ACN/H2O (1:1; v/v).
- Eseguire la doppia estrazione di RNA e lipidi (co-estrazione di PL ed eCB) da campioni di tessuto.
ATTENZIONE: Assicurarsi di lavorare in condizioni prive di RNA per evitare la degradazione dell'RNA.- Scongelare aliquote di polvere tissutale o grappoli cerebrali (a 4 °C) e aggiungere 600 μL di tampone RLT contenente 5 μM THL/URB597, 10 μg/mL BHT e 1% β-mercaptoetanolo (per le percentuali del volume finale del tampone di omogeneizzazione, vedere punto 4.1) insieme a 200 μL di cloroformio in tubi di estrazione contenenti pugni cerebrali congelati e perline ceramiche.
- Spike di campioni con 10 μL di miscela standard interna per la co-estrazione di PL ed eCB (vedi punto 4.1.3) e omogeneizzazione tramite omogeneizzatore tissutale (alta velocità, 20 s).
- Trasferire lisati in nuovi tubi centrifuga e centrifuga per 5 minuti a piena velocità e 4 °C per consentire la separazione di fase.
- Recuperare e utilizzare la fase superiore per l'estrazione dell'RNA utilizzando kit di procedure di estrazione dell'RNA standard (Tabella dei materiali). Elutare l'RNA in un volume totale di 50 μL di acqua priva di RNasi e conservare a -80 °C.
NOTA: Il campione al passo 4.1.5.4 è suscettibile sia per il sequenziamento dell'RNA che per la qPCR utilizzando i metodi e la strumentazione appropriati. - Utilizzare la fase inferiore contenente cloroformio per l'estrazione dei lipidi. Aggiungere 800 μL di MTBE/metanolo (10:3; v/v) e 200 μL di acido formico allo 0,1% e vortice per 45 minuti a 4 °C. Recuperare la fase organica superiore ed evaporare sotto un leggero flusso di N2 a 37 °C.
- Ricostituire in 90 μL di metanolo per ulteriori analisi LC/MS. Conservare a -20 °C o -80 °C o procedere al passaggio 5.
- Aggiungere il 10% di H2O a un'aliquota di estratto lipidico (vedere sopra il punto 4.1.5.6) e iniettare 10 μL nella LC/MS per l'analisi dei PL. Per ulteriori analisi eCB procedere con il passaggio 5.7.
- Prendere un'aliquota dell'estratto (vedi sopra il punto 4.1.5.6) evaporare a secco e ricostituirsi in ACN/H2O (1:1; v/v). Utilizzare 20 μL per l'iniezione di LC/MS per l'analisi eCB (analogamente al passaggio 4.3.5).
- Eseguire la co-estrazione di eCB ed eIC da pezzi cerebrali, pugni o campioni di polvere di tessuto.
5. Profilazione qualitativa e quantitativa LC/MRM
- Preparare sistemi di solventi LC, soluzioni di calibrazione e campioni di controllo qualità.
- Per i PL, preparare la fase mobile A: metanolo/acqua (1:1; v/v) contenente 7,5 mM di formiato di ammonio e 0,1% di TEA. Preparare la fase mobile B: metanolo/isopropanolo (2:8; v/v) contenente 7,5 mM di formiato di ammonio e 0,1% di TEA. Conservare i solventi in flaconi LC.
- Per la separazione eCB ed eiC, preparare i seguenti solventi LC: 0,1% di acido formico come fase mobile A e 100% ACN contenente lo 0,1% di acido formico come fase mobile B. Conservare i solventi in flaconi LC.
- Preparare i controlli di qualità utilizzando gli standard di taratura e gli standard interni (Tabella 3) in una concentrazione equimolare o definita dall'utente.
- Preparare curve di calibrazione con sette punti di concentrazione. Utilizzare lo stesso batch standard interno per aumentare la soluzione della curva di calibrazione e nei campioni da analizzare.
- Utilizzare il metodo LC-MRM per la profilazione lipidica qualitativa e quantitativa.
- Aprire la scheda Build Acquisition Method nel software commerciale (ad esempio, Analyst) e selezionare la modalità LC/MRM con commutazione di polarità. Impostare nel metodo le transizioni ioniche (come indicato nella Tabella 3) per la profilazione quantitativa. Impostare il tempo di assestamento a 50 ms.
- Per la profilatura dei PL, impostare i seguenti parametri della sorgente di ioni: gas di cortina = 40 psi; temperatura del riscaldatore della sorgente = 550 °C; tensione di spruzzatura ionica = -4.500 V in modalità ione negativo e = + 5.200 V in modalità ioni positivi.
- Per la co-analisi di eCB ed eIC, impostare i seguenti parametri: gas di cortina = 40 psi; temperatura del riscaldatore della sorgente = 550 °C; tensione di spruzzatura ionica = -4.500 V in modalità ioni negativi e = +4.500 V in modalità ioni positivi.
- Per l'analisi PL, impostare il riscaldamento della colonna a 45 °C e la portata a 200 μL/min e impostare il seguente gradiente: min 0 = 40% B; min 3 = 40% B; min 42 = 90% B; min 43 = 99% B; min 50 = 99% B e min 52 = 40% B. Impostare il volume di iniezione a 10 μL.
- Per l'analisi di eCB ed eIC, impostare la temperatura della colonna a temperatura ambiente e impostare il seguente gradiente: min 0 = 20% B; min 1 = 20% B; min 5 = 50% B, min 12 = 50% B; min 13 = 90% B, min 17 = 90% B; min 17,5 = 20% B; min 20 = 20% B. Impostare il volume di iniezione a 20 μL.
NOTA: le condizioni MRM possono variare tra le piattaforme strumentali, quindi la frammentazione e le condizioni MRM devono essere dedotte sperimentalmente e i parametri di ionizzazione devono essere testati e regolati se necessario per ottenere la massima sensibilità e selettività.
- Eseguire analisi batch.
- Aprire il batch build acquisition e inserire i parametri richiesti per la descrizione del campione, la posizione nel rack campione dell'autocampionatore e il metodo di acquisizione (impostato come passaggio 5.2).
- Includere sempre i controlli di qualità all'inizio e alla fine dell'analisi e all'interno del lotto. Dopo ogni 25-30 campioni, includere almeno tre curve di calibrazione all'interno del lotto e includere una fase di lavaggio con un solvente di scelta dopo ogni campione di controllo qualità, curva di calibrazione e alla fine del lotto di campione.
- Trasferire i campioni ottenuti al punto 4 in flaconcini LC/MS. Posizionare i campioni nelle scaffalature di carico dell'autocampionatore LC in base alla posizione definita nel lotto e caricare il rack campione nell'autocampionatore LC.
- Invia batch e avvia l'analisi della coda.
- Quantificazione lipidica
- Utilizzare il software commerciale (ad esempio, Analyst) e il modulo di quantificazione incorporato per la quantificazione di eCB ed eIC e il software commerciale (ad esempio, Multiquant) per la quantificazione dei PL.
NOTA: Il secondo software può essere utilizzato anche per eCB ed eIC, in particolare quando viene utilizzato uno standard interno per la quantificazione di più analiti. - Aprire build quantification Method e compilare i parametri per gli analiti, gli standard interni, le transizioni MRM e attribuire gli standard interni agli analiti da quantificare (Tabella 3). Impostare l'altezza minima di picco su 500 cps.
- Utilizzare i seguenti criteri o combinazioni di essi per l'assegnazione dell'identità lipidica e la successiva quantificazione6: corrispondenza del tempo di ritenzione degli analiti lipidici endogeni con gli standard di calibrazione e/o gli standard interni deuterati, se disponibili; corrispondenza dello ione del frammento mediante frammentazione in modalità ionica positiva e negativa per un dato m/z di analiti lipidici per i quali non sono previste norme; comportamento di eluizione dedotto dalla letteratura dei lipidi in condizioni LC impiegate in modo simile per sezionare strutture isomeriche e/o isobariche; e, ove disponibile, analisi LC/MS e MS/MS con spettrometria di massa ad alta risoluzione, utilizzando condizioni LC simili a quelle dell'analisi mirata (utilizzando LC/MRM), per identificare con precisione l'identità e il comportamento di eluizione dei lipidi endogeni di interesse18,19.
- Per la convalida dell'analisi dei lotti, utilizzare i seguenti criteri: accuratezza della quantificazione ≤ ±20%; coefficiente di regressione ≥0,97 (idealmente ≥0,99).
NOTA: Seguire le linee guida per lo sviluppo e la convalida del metodo bioanalitico per garantire un'analisi affidabile e riproducibile delle molecole bersaglio.
- Utilizzare il software commerciale (ad esempio, Analyst) e il modulo di quantificazione incorporato per la quantificazione di eCB ed eIC e il software commerciale (ad esempio, Multiquant) per la quantificazione dei PL.
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Representative Results
L'insieme dei protocolli descritti può essere combinato su diversi livelli in modo specifico per scopo, come la scelta del modello animale, la via di campionamento, il metodo di estrazione e la profilazione (Figura 1).
Al fine di determinare i cambiamenti del livello lipidico nel cervello e nella periferia nel corso di un decorso acuto di crisi epilettica e per svelare il potenziale effetto antiepilettico13 della PEA e il suo impatto sui cambiamenti lipidome nel cervello e nella periferia, tre gruppi di animali sperimentali sono stati trattati con veicolo, KA per indurre l'epilessia acuta e PEA come candidato farmaco antiepilettico. La PEA è stata somministrata tramite i.p. prima dell'iniezione di KA (ad esempio, con una singola iniezione di PEA per il trattamento acuto e due iniezioni di PEA per il trattamento subcronico). Ai fini dell'analisi molecolare multipla e/o della colorazione immunoistochimica a 5 giorni dal trattamento, gli esperimenti sugli animali sono stati ripetuti secondo necessità (Figura 2).
L'induzione di KA delle crisi epilettiche acute porta ad un'intensità massima delle crisi 1 ora dopo l'iniezione15 (Figura 3). Per svelare i cambiamenti del livello lipidico cerebrale e periferico allo stato di massima intensità convulsiva, i topi sono stati sacrificati a 1 ora dopo l'iniezione di KA, seguiti dal campionamento di plasma, cervello e organi periferici. I cervelli congelati sono stati sezionati in sei regioni del cervello (vedi passo 3.1). Le regioni cerebrali e i tessuti degli organi periferici (cuore e polmone) sono stati polverizzati per ottenere campioni di tessuto omogenei e successivamente aliquotati per i due profili lipidomici di eCB ed eIC (Figura 4A e fase 4.1.1) e PL ed eCB (Figura 4B e fase 4.1.3).
Il protocollo di doppia estrazione (vedi fase 4.1.5) è stato applicato per eseguire PL/eCB e RNA a una risoluzione spaziale più elevata tramite profilazione da pugni cerebrali in diverse regioni: l'ipotalamo (HYP), l'amigdala basolaterale (BLA) e l'ippocampo ventrale (vHC) e dorsale (dHC) (Figura 5). I pugni sono stati campionati (vedere fase 3.2) da topi epilettici indotti da KA e topi di controllo allo stato di crisi massimale a 1 ora dopo l'iniezione di KA (Figura 2).
Per valutare l'estensione della neurodegenerazione e attribuire i cambiamenti lipidici all'estensione della neurodegenerazione con l'epilessia e dopo un nuovo trattamento dell'epilessia con PEA, è stata eseguita una doppia colorazione immunoistochimica su sezioni cerebrali (vedere fase 1.3) campionate 5 giorni dopo le crisi epilettiche indotte da KA (Figura 2) in topi senza trattamento subcronico con PEA (al centro), con trattamento subcronico con PEA (a destra) e in topi iniettati con soluzione salina (a sinistra) (Figura 6 ). Lo stato epilettico indotto da KA (SE) ha causato una massiccia perdita del segnale NeuN, prevalentemente nella regione CA1, CA3 e hilus dell'ippocampo, accompagnata da eventi apoptotici indicati dal segnale caspasi-3 (CASP3) (Figura 6, immagine centrale) rispetto al controllo (Figura 6, immagine a sinistra). Il trattamento subcronico con PEA (immagine a destra) ha conservato in particolare il segnale della proteina dei nuclei neuronali (NeuN), mentre il segnale (CASP3) è a malapena rilevabile.
| Soluzione iniettabile KA- e SAL . |
| Soluzione iniettabile ka (8 mL volume finale): |
| 1. Pesare 24 mg di KA in tubo da 15 ml (attenzione: indossare glosi e maschera) |
| 2. Aggiungere 8 ml di soluzione salina e vortice per 10 minuti |
| 3. Conservare a 4°C per la conservazione indeterminata |
| 4. Ricondizionamento a temperatura ambiente e vortice prima dell'iniezione |
| Soluzione di iniezione del veicolo 1 (volume finale di 8 ml): |
| Salta il passaggio 1 e procedi con i passaggi da 2 a 4 |
Tabella 1: Preparazione del farmaco che induce convulsioni e applicazione del veicolo 1. Fasi per preparare la soluzione iniettabile di acido kainico (KA) per 24 iniezioni intraperitoneali (10 ml/kg) in una concentrazione finale di 30 mg/kg e la corrispondente soluzione di iniezione del veicolo (veicolo 1)1.
| PEA- e SAL/DMSO/Cremophor (18:2:1, (v/v/v)) soluzione iniettabile. |
| Soluzione per iniezione di PEA (8 mL volume finale): |
| 1. Pesare 32 mg di PEA in tubo da 15 ml |
| 2. Aggiungi 0,4 mL DMSO e vortice per 10 minuti |
| 3. Aggiungere 3,4 ml di SAL e vortice per 5 minuti |
| 4. Miscela sonicata per 5 min a 36°C |
| 5. Aggiungi 0,4 ml di Cremophor e vortice per 5 minuti |
| 6. Sonicare per 1 minuto a 36°C e aggiungere 3,4 ml di SAL |
| 7. Vortice per 30 sec e sonicate per 3 min a 36°C |
| 8. Mantenere la soluzione a 36°C a bassa velocità in shaker e vortice prima dell'iniezione |
| Soluzione per iniezione del veicolo 2 (volume finale di 8 ml): |
| Salta il passaggio 1 e procedi con i passaggi da 2 a 8 |
Tabella 2: Preparazione del farmaco antiepilettico e applicazione del veicolo 2. Fasi esemplificate per preparare la soluzione iniettabile di palmitoiletanolamide (PEA) per 24 iniezioni intraperitoneali (10 ml/kg) in una concentrazione finale di 40 mg/kg e la corrispondente soluzione di iniezione del veicolo (veicolo 2)1.
| Modalità ioni positivi | ||||||
| Standard di calibrazione selezionati PL | Standard interni corrispondenti | |||||
| Analita | Ione precursore | Ione prodotto m/z | Analita | Ione precursore | Ione prodotto m/z | |
| nome | m/z | nome | m/z | |||
| AEA · | 348.3 | 62.1 | AEA-d4 | 352.3 | 66.1 | |
| 2-AG | 379.1 | 287.2 | 2-AG-d5 | 384.2 | 287.2 | |
| OEA | 326.2 | 62.1 | OEA-d2 | 328.2 | 62.1 | |
| PISELLO | 300.2 | 62.1 | PEA-d4 · | 304.2 | 62.1 | |
| PC 16:0/18:1 | 760.59 | 184.07 | PC 17:0/14:1 | 718.54 | 184.07 | |
| PC 18:2_20:4 | 806.57 | 184.07 | ||||
| PC 18:0_20:4 | 810.6 | 184.07 | ||||
| LPC 18:0 | 524.37 | 184.07 | LPC 17:0 | 510.36 | 184.07 | |
| LPC 20:4 | 544.34 | 184.07 | ||||
| SM d18:1/18:0 | 731.61 | 184.07 | SM d18:1/12:0 | 647.51 | 184.07 | |
| Modalità ioni negativi | ||||||
| Standard di calibrazione selezionati PL | Standard interni corrispondenti | |||||
| Analita | Precursore ione m/z | Ione prodotto m/z | Analita | Ione precursore | Ione prodotto m/z | |
| nome | nome | m/z | ||||
| AA | 303.05 | 259.1 | AA-d8 · | 311.04 | 267 | |
| 5(S)-HETE | 319.48 | 115 | 5(S)-HETE-d8 | 327.48 | 116 | |
| 8(S)-HETE | 319.48 | 155 | 12(S)-HETE-d8 | 327.48 | 184 | |
| 12(S)-HETE | 319.48 | 179 | ||||
| 15(S)-HETE | 319.48 | 219 | ||||
| 19(S)-HETE | 319.48 | 231 | ||||
| 20-HETE | 319.48 | 289 | 20-HETE-d6 | 325.48 | 295 | |
| LxA4 · | 351.5 | 115.2 | LxA4-d5 | 356.5 | 115 | |
| PGF2 α | 353.48 | 309.2 | PGF2 α-d4 | 357.5 | 313.3 | |
| TxB2 · | 369 | 169 | TxB2-d4 | 373 | 173 | |
| PGE2 · | 351.47 | 315.3 | PGE2-d9 · | 360.25 | 324.3 | |
| PGD2 · | 351.47 | 315.3 | PGD2-d4 | 355.25 | 319.3 | |
| 11β-PGF2 α | 353.24 | 193 | ||||
| RvD1 · | 375.22 | 215.1 | RvD1-d5 | 380.22 | 180.2 | |
| PE 16:0/18:1 | 716.52 | 281.25 | PE 17:0/14:1 | 674.48 | 225.19 | |
| PE 38:4 | 766.54 | 303.23 | ||||
| PE 40:6 | 790.54 | 303.23 | ||||
| PE 40:4 | 794.57 | 303.23 | ||||
| PA 16:0/18:1 | 673.48 | 255.23 | PA 17:0/14:1 | 631.43 | 269.25 | |
| LPA 16:0 | 409.24 | 153 | LPA 17:0 | 423.25 | 153 | |
| LPA 20:4 | 457.24 | 153 | ||||
| LPI 20:4 | 619.29 | 303.23 | ||||
| PG 16:0/18:1 | 747.52 | 281.25 | PG 17:0/14:1 | 705.47 | 225.19 | |
| PG 16:1_20:4 | 767.49 | 303.23 | ||||
| PG 18:1_20:4 | 795.52 | 303.23 | ||||
| PI 16:0/18:1 | 835.53 | 281.25 | PI 17:0/14:1 | 793.49 | 269.25 | |
| PS 16:0/18:1 | 760.51 | 255.23 | PS 17:0/14:1 | 718.47 | 269.25 | |
| PS 36:4 | 782.49 | 303.23 | ||||
| PS 38:4 | 810.53 | 303.23 | ||||
| PI 16:0/18:1 | 835.53 | 281.25 | PI 17:0/14:1 | 793.49 | 269.25 | |
| PI 36:4 | 857.52 | 303.23 | ||||
| PI 38:4 | 885.55 | 303.23 | ||||
| C1P d18:1/16:0 | 616.47 | 78.9 | C1P d18:1/12:0 | 560.41 | 78.9 | |
| S1P d18:1 | 378.24 | 78.9 | S1P d17:1 | 364.23 | 78.9 | |
Tabella 3: Standard lipidici e transizioni MRM per l'analisi lipidomica mirata. Il contenuto della tabella è stato originariamente pubblicato in Lerner et al.2
Figura 1: Panoramica dei moduli del flusso di lavoro. A seconda dell'obiettivo dello studio e delle diverse vie di campionamento, estrazione e profilazione possono essere combinate per consentire un risultato significativo per lo studio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Progettazione sperimentale di un modello di crisi epilettica indotta da acido kainico acuto (KA) nei topi. I topi sono trattati con 1) soluzione salina (10 ml / kg i.p.); 2) KA (30 mg/kg i.p.); e/o 3) (sub) cronicamente pretrattati (1−2x 40 mg/kg i.p.) con il potenziale composto antiepilettico Palmitoiletanolamide (PEA). Ventiquattro topi per gruppo sono stati trattati come sopra e il comportamento è stato valutato per valutare le intensità delle convulsioni. Sei topi per gruppo sono stati sacrificati in ciascuno dei quattro diversi timepoint (T1-T4) per determinare i cambiamenti del livello lipidico in un corso temporale di stato di crisi epilettica acuta nel cervello, negli organi periferici e nel plasma. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Punteggio comportamentale in un arco di tempo di epilessia acuta indotta da acido kainico (KA) rispetto ai controlli. Valutazione delle intensità convulsive in un arco di tempo di 180 minuti dopo l'induzione ka-crisi (n = 24) o l'iniezione salina (n = 24) data come punteggi comportamentali medi. Non sono state riscontrate differenze tra i gruppi iniettati del veicolo 1 e del veicolo 2. Barre di errore = SEM. La misurazione ripetuta ANOVA ha prodotto interazioni significative tra i punti temporali delle misurazioni e i gruppi di test, indicando effetti significativi del trattamento KA sui punteggi comportamentali. Le intensità convulsive dei topi trattati con KA sono state originariamente pubblicate su Post et al.13Per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Livelli lipidici del cervello e del tessuto periferico allo stato di crisi epilettica acuta. Le variazioni del livello lipidico presentate come valore medio ± SEM alla massima intensità convulsiva (ad esempio, 1 ora di iniezione post-KA) in sei regioni del cervello (n = 9): corteccia cerebrale (cCTX), striato (STR), regione talamica (THL), ippocampo (HC), ipotalamo (HYP), cervelletto (CER), nonché tessuto cardiaco e polmonare nei topi epilettici indotti da KA (valore superiore) e controlli (valore inferiore). I livelli lipidici basali nei tessuti sono rappresentati in grigio. I valori di PL, 2-AG e AA sono indicati rispettivamente in nmol/g. e i valori per NAE, eiCs e AEA in pmol/g. Tutti i livelli lipidici sono normalizzati al peso del tessuto. Per evidenziare i cambiamenti molecolari specifici, i livelli lipidici dei topi trattati con KA sono rappresentati come percentuale del soluzione salina iniettata (KA / sal) in una mappa termica che mostra valori diminuiti a intensità di crisi acuta rispetto al controllo sono rappresentati in azzurro e i livelli aumentati rispetto al controllo in rosso, rispettivamente. Sono considerati significativi a un valore p <0,05. Questi dati sono stati originariamente pubblicati in Lerner et al.2Per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Doppia estrazione di eCB/PL e RNA per la profilazione quantitativa dai pugni cerebrali dei topi. (A) Distribuzione quantitativa di PL ed eCB selezionati attraverso: 1) una sottoregione dell'ipotalamo (HYP); 2) l'amigdala basolaterale (BLA); e 3) le sottoregioni ventrale (vHC) e dorsale (dHC) dell'ippocampo, dai topi con crisi epilettica indotta da KA (valore superiore) rispetto ai controlli (valore inferiore) (n = 10). I livelli sono normalizzati al peso del tessuto (i pugni corrispondono a circa 0,5-1,5 mg) ed espressi in nmol/g. Solo l'AEA è espresso in pmol/g. I livelli lipidici sono presentati come valore medio ± SEM. La variazione media per regione cerebrale perforata (SEM come percentuale della media, media su tutti i lipidi) è: HYP = 7,83%; BLA = 7,80%; vHC = 6,28%; e dHC = 7,90%, rispettivamente. (B) Livelli di espressione relativa di enzimi e recettori endogeni coinvolti nella segnalazione lipidica, nonché marcatori per l'attività cerebrale studiati a livello di mRNA in diverse regioni/sottoregioni cerebrali da topi sottoposti a crisi epilettica indotta da KA (rosso) e controlli (grigio chiaro). Le analisi statistiche della differenza tra i mezzi di gruppo sono state effettuate utilizzando il t-test dello studente spaiato a due code e considerate significative a un valore p <0,05 (n = 10). Questi dati sono stati originariamente pubblicati in Lerner et al.7Per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Doppia macchia immunoistochimica NeuN e CASP3. L'immunoistochimica post-iniezione di KA di cinque giorni è stata eseguita su sezioni cerebrali di topi iniettati con soluzione salina non trattati (a sinistra), topi pretrattati subchronicallymente PEA (al centro) e topi epilettici senza pretrattamento (a destra). Il pretrattamento di PEA mostra effetti neuroprotettivi rispetto ai topi epilettici non trattati (n = 3). Questi dati sono stati originariamente pubblicati su Post et. al.13Per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La metodologia neurolipidomica e trascrittomica qui descritta è un mezzo praticabile per studiare qualsiasi malattia o sviluppo sano ad alta e bassa risoluzione spaziale nel cervello e negli organi periferici. Grazie alle procedure ottimizzate di campionamento e manipolazione del plasma, l'analisi lipidomica plasmatica può essere effettuata anche dagli stessi animali sacrificati per la lipidomica e la trascrittomica tissutale, migliorando così l'affidabilità dei correlati molecolari del sangue tissutale e la scoperta di biomarcatori. La fornitura di un ampio insieme di dati mediante l'applicazione di uno dei tre protocolli o combinazioni di essi, è utile per indagare non solo una malattia neurologica all'interno di un contesto (esperimento di modello animale), ma anche attraverso e tra contesti di modello sperimentale. Inoltre, un alto livello di standardizzazione del campionamento, dell'elaborazione e dell'analisi molecolare facilita un'elevata riproducibilità dei dati molecolari, quindi fa riferimento in modo affidabile ai cambiamenti molecolari tra e all'interno di studi e laboratori.
Tuttavia, per raggiungere questo obiettivo, la configurazione di un progetto sperimentale che offra il massimo potenziale di lettura per l'obiettivo di studio definito è fondamentale. Per ottenere un confronto affidabile dei cambiamenti molecolari tra i gruppi sperimentali, si raccomanda di utilizzare un minimo di dieci animali per compensare la variabilità animale e la gamma biologica dei livelli lipidici. Quando l'approvvigionamento di animali e/o la logistica della manipolazione degli animali sono restrittivi, l'uso di un minimo di sei animali per gruppo è indispensabile per consentire un'analisi statistica sicura. I calcoli delle dimensioni del gruppo devono compensare i tassi di mortalità correlati al modello (cioè, un minimo di sei, idealmente dieci, animali per gruppo sono necessari per lo studio nonostante il possibile tasso di mortalità del modello). Un requisito fondamentale è quello di garantire animali di pari età, sesso e ceppo per gruppo sperimentale. Per la fase di scoperta, è essenziale utilizzare lo stesso fornitore per gli animali da esperimento per tutti gli studi e lo stesso lotto animale, se possibile, al fine di evitare distorsioni dei risultati dovute a possibili differenze di fenotipo comportamentale e molecolare tra i lotti animali. Per garantire l'affidabilità e la riproducibilità del fenotipo molecolare e comportamentale determinato negli studi, è fondamentale effettuare un'analisi di replicazione biologica quando possibile.
Un altro passo cruciale è quello di impostare un lavoro sperimentale standardizzato e programmato con gruppi di animali. È imperativo trattare gli animali entro la stessa finestra temporale del giorno per aggirare la variabilità molecolare circadiana. L'ora del giorno deve essere impostata in base all'impatto noto del ritmo circadiano sulla sintesi e la degradazione delle molecole bersaglio o mantenuta coerente per tutti i gruppi sperimentali quando non sono disponibili informazioni sugli effetti del ritmo circadiano. Allo stesso modo, le condizioni di stabulazione e di alimentazione prima del sacrificio animale devono essere mantenute coerenti e rigorosamente controllate attraverso modelli sperimentali. Ciò è particolarmente rilevante per il profilo lipidomico a causa dell'influenza della nutrizione sul plasma lipidico e sul metabolismo dei tessuti. La somministrazione di farmaci terapeutici o che inducono malattie deve essere invariabilmente effettuata parallelamente alla somministrazione del veicolo in gruppi di controllo, per cui il veicolo deve essere lo stesso utilizzato per la somministrazione del farmaco. Al fine di scegliere il ceppo e/o i sottostrati di roditore più adatti ai fini dello studio, le strategie di trattamento farmacologiche devono essere eseguite in base alla specificità del farmaco in termini di tempo e frequenza di somministrazione, dosi e via di somministrazione e suscettibilità specifiche a farmaci di ceppi diversi dedotti dalla letteratura e/o dall'esperienza precedente. Un'indagine a tempo di una malattia e una risposta alla terapia che coinvolge grandi gruppi di coorte o più gruppi di animali è impossibile da eseguire in un giorno in termini di trattamento, sacrificio e campionamento. In tali casi, la lavorazione di gruppi animali deve essere programmata ed effettuata in giorni consecutivi, ma mantenendo le stesse condizioni in termini di ora del giorno, progettazione sperimentale, tempo di lavorazione, ricercatori, ecc. La preparazione delle iniezioni chimiche è un altro passo critico. I composti che inducono farmaci o malattie devono essere preparati di recente prima della somministrazione e secondo le specifiche del farmaco. L'uso dello stesso lotto di produzione del farmaco è raccomandato per tutte le coorti da confrontare. Ciò è particolarmente importante nel caso di formulazioni composte naturali come l'acido kainico (KA) utilizzato in questo studio per l'induzione dell'epilessia.
Per consentire una profilazione lipidomica e/o trascrittomica affidabile, la procedura di sacrificio degli animali deve essere eseguita in modo coerente tra i gruppi di animali entro un periodo di tempo di 5 minuti. Se il sangue viene raccolto dopo la decapitazione, è importante mantenere una quantità costante di isoflurano nella camera di vetro. A tale scopo, immergere frequentemente (dopo cinque usi) con isoflurano e non superare i 10 s per la durata dell'anestesia con isoflurano, al fine di evitare l'insorgenza di aritmia e palpitazioni e garantire una corretta pressione sanguigna per il campionamento plasmatico.
Le condizioni per il campionamento e la manipolazione dei materiali biologici (ad esempio, la finestra temporale e l'ordine di campionamento e manipolazione dei materiali biologici) devono essere rigorosamente seguite e mantenute identiche per tutti i gruppi. Per evitare gradi variabili di scongelamento dei tessuti e quindi cambiamenti tissutali ex vivo incoerenti dei livelli lipidici e/o di mRNA, è essenziale mantenere condizioni di tempo e temperatura rigorosamente controllate per il post-campionamento
immagazzinamento. dissezione o punzonatura dei tessuti e successiva elaborazione e analisi del campione (vedere paragrafi 3 e 4). I cervelli interi appena campionati possono essere immediatamente sezionati su una piastra metallica preraffreddata (4 °C) senza previo congelamento a scatto, se le dimensioni dei gruppi di animali sperimentali consentono il sacrificio, la rimozione e la dissezione degli animali senza alterare il periodo di tempo indicato qui per ciascuna di queste procedure. Se la dimensione dei gruppi sperimentali non è pratica per queste procedure, si raccomanda il congelamento a scatto del cervello e la successiva dissezione per consentire un tempo comparabile e controllato per l'elaborazione. Seguendo rigorosamente i protocolli e le linee guida temporali qui indicate, non sono state osservate discrepanze tra i livelli molecolari ottenuti dall'estrazione di regioni cerebrali appena sezionate e regioni cerebrali sezionate da cervelli congelati.
Un aspetto critico per ottenere una variabilità riproducibile e minima dei livelli lipidici all'interno e tra i gruppi, oltre alla lavorazione del campione in condizioni di temperatura strettamente controllate, è la fornitura di antiossidanti (vedere paragrafi 2 e 3). Evitare qualsiasi fattore di stress (ad esempio, l'odore del sangue) degli animali prima del sacrificio è di fondamentale importanza, dal momento che molti lipidi coinvolti nell'attività neuronale come gli eCB possono cambiare rapidamente in risposta allo stress.
Per l'estrazione e l'analisi dei lipidi, è essenziale preparare al momento gli standard interni, le soluzioni di calibrazione e i solventi di estrazione il giorno dell'estrazione. La stessa fonte di standard interni deve essere utilizzata sia per la preparazione della curva di taratura che per le estrazioni di campioni. Inoltre, seguire condizioni di temperatura rigorosamente controllate per l'estrazione, la conservazione e l'analisi del campione è fondamentale per ridurre al minimo e controllare le alterazioni enzimatiche o chimiche ex vivo delle molecole. Per l'analisi LC/MRM, l'insieme dei lipidi mirati può essere adattato all'obiettivo dello studio aggiungendo o rimuovendo bersagli e corrispondenti standard interni e calibranti, a condizione che la separazione, il rilevamento e le transizioni MRM per un nuovo set di lipidi siano ottimizzati. I protocolli di estrazione presentati consentono la fornitura di due repliche LC/MRM per eCB ed eIC, che è strumentale per i casi di guasto tecnico o quando l'analisi della replica è significativa per lo studio. I protocolli di estrazione PL rendono le quantità di campioni/estratti adatte per almeno 10 analisi per estratto (ad esempio esperimenti di scansione multipli basati rispettivamente sulla scansione dello ione precursore e della perdita neutra2; ulteriori analisi LC/MRM; o repliche LC/MRM per compensare il guasto tecnico durante una corsa). L'analisi lipidica non è limitata a LC/MRM; infatti gli estratti lipidici ottenuti con uno qualsiasi di questi protocolli sono suscettibili di analisi di spettrometria di massa non colorate e di fascia alta. Fatta eccezione per i pugni cerebrali o la minima quantità di tessuti ottenuti da regioni discrete (meno di 3 mg), i tessuti polverizzati congelati di regioni superiori a 2−3 mg possono essere aliquotati e utilizzati per più moduli di estrazione come descritto qui per l'analisi di replica e / o per altre indagini suscettibili di polvere tissutale.
Un vantaggio generale dei protocolli qui descritti rispetto a quelli comunemente usati è l'aumento dell'efficacia complessiva in termini di tempo e sensibilità per l'estrazione e l'analisi multicomposizione con un minore dispendio di risorse animali, materiali di consumo e costi di analisi. È importante sottolineare che il protocollo di estrazione dual lipid/mRNA offre anche una maggiore efficienza di estrazione dell'mRNA20,21 e l'integrità dell'mRNA rispetto ai corrispondenti protocolli standard disponibili e contemporaneamente una maggiore efficienza dell'estrazione lipidica7. Ciò è probabilmente dovuto anche alla diminuzione dell'effetto della matrice per ciascuna delle frazioni lipidiche e mRNA quando estratte due volte. A causa di ciò, il metodo è facilmente applicabile per la profilazione ad alta risoluzione spaziale come nei pugni cerebrali.
Tuttavia, una limitazione attuale del protocollo è che i lipidi infiammatori non sono suscettibili di analisi e quantificazione utilizzando la doppia estrazione lipidico / mRNA. Pertanto, il protocollo è soggetto a ulteriori perfezionamenti. A tal fine, i lipidi infiammatori tissutali e plasmatici e gli endocannabinoidi possono essere co-estratti e co-analizzati, che è uno strumento ottimizzato per studiare contemporaneamente i processi neuroinfiammatori e l'attività neuronale modulata dagli endocannabinoidi (vedi coestrazione di eIC ed eCB). L'inclusione dei fosfolipidi in quest'ultimo test dovrebbe essere fattibile.
In considerazione di approcci prospettici multi-omici per le malattie neurologiche, l'analisi proteomica delle frazioni proteiche ottenute dopo il protocollo di estrazione lipidica (cioè la co-estrazione di eCB ed eIC, nonché la co-estrazione di PL ed eCB) dovrebbe essere fattibile. Tuttavia, questo non è ancora possibile quando si utilizza il protocollo dual lipid/ mRNA. Per quest'ultimo, l'ambiente chimico dell'estrazione preclude anche la determinazione della quantità proteica utilizzando saggi proteici standard come il saggio dell'acido bicinchoninico (BCA). Sono previsti ulteriori sviluppi per superare questa limitazione e accelerare l'inclusione della profilazione proteomica in questi protocolli.
Utilizzando il protocollo modulare qui descritto, è stato possibile ottenere una mappa regionale cerebrale di eIC, eCB e PL in un modello animale di crisi epilettiche acute (Figura 4). Il protocollo ha mostrato la modulazione ippocampale dei processi infiammatori da parte delle eIC e della modulazione dell'attività neuronale da parte degli eCB in topi trattati e non trattati con crisi acute indotte da KA13. È stata osservata anche la localizzazione subregionale del cervello di fosfolipidi, endocannabinoidi e cambiamenti dell'mRNA negli stati di crisi epilettica acuta, rispettivamente (Figura 5). Questi risultati evidenziano il valore e l'applicabilità dei metodi qui descritti nell'avanzamento delle conoscenze su un ampio spettro di lipidi coinvolti nella modulazione di malattie neurologiche complesse come l'epilessia nelle regioni e sottoregioni del cervello. Questi protocolli sono di applicabilità generale nell'indagine sulle malattie neurologiche e oltre, mentre continua l'ulteriore sviluppo dei protocolli e delle applicazioni per le popolazioni cellulari.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Dedichiamo questo articolo alla Dott.ssa Ermelinda Lomazzo. Durante la finalizzazione di questo manoscritto, la dottoressa Ermelinda Lomazzo è deceduta. È l'incarnazione della passione per la scienza e dell'impegno disinteressato nel lavoro di squadra per soddisfare uno scopo di ricerca significativo. Ha sempre sognato di contribuire in modo significativo al maggiore benessere degli esseri umani. La sua natura di buon cuore non è mai stata compromessa dalle faticose strade della scienza e della vita. Rimarrà inestimabile, e per sempre, nei nostri cuori.
Julia M. Post è stata finanziata dal Focus Program for Translational Neuroscience (FTN) presso l'University Medical Center dell'Università Johannes Gutenberg di Magonza ed è attualmente finanziata dal progetto SPP-2225 EXIT a LB. Raissa Lerner è stata parzialmente finanziata dal progetto DZHK 81X2600250 a LB e Lipidomics Core Facility. Il finanziamento parziale per questi studi è stato fornito dalla Lipidomics Core Facility, dall'Institute of Physiological Chemistry e dai fondi intramurali (a LB) del Centro medico universitario dell'Università Johannes Gutenberg di Magonza.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12(S)-HETE | Biomol | Cay10007248-25 | Lipid Std |
| 12(S)-HETE-d8 | Biomol | Cay334570-25 | Lipid Std |
| 1200 series LC System | Agilent | Instrumentation/LCMS | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | Instrumentation/qPCR | |
| 5(S)-HETE-d8 | Biomol | Cay 334230 | Lipid Std |
| ABI 7300 Real-Time PCR cycler | Applied Biosystems | Instrumentation/qPCR | |
| Acetonitrile LC-MS Chroma Solv | Honeywell | 9814920 | Solvent/LCMS |
| amber eppendorf tubes | Eppendorf | Sample Prep. | |
| Analyst 1.6.2 Software | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | Instrumentation/Sample prep. | |
| Arachidonic Acid-d8 MS Standard | Biomol | Cay-10007277 | Lipid Std |
| Bessmann Tissue Pulverizer | Spectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands) | Instrumentation/Sample prep. | |
| Bino | Zeiss | Microscopy | |
| cleaved Caspase 3 antibody | Cellsignaling | 9661S | Microscopy |
| Cryostat, Leica CM3050 S | Leica Biosystems | Instrumentation/Sample prep. | |
| CTC HTC PAL autosampler | CTC Analytics AG | Instrumentation/LCMS | |
| Dumont Curved Forceps Dumoxel #7 | FST | 11271-30 | Surgical Tools |
| Dumont Forceps Super fine tip #5SF (x2) | FST | 11252-00 | Surgical Tools |
| EDTA 1000 A Röhrchen | Kabe Labortechnik | 078001 | Sample Prep. |
| EP-1 EconoPump | BioRAD | 700BR07757 | Instrumentation/Sample prep. |
| Fine Forceps Mirror Finish | FST | 11412-11 | Surgical Tools |
| Fine Iris Scissors straight sharp | FST | 14094-11 | Surgical Tools |
| Fine Scissor Tungsten Carbide straight | FST | 14568-09 | Surgical Tools |
| Iris Spatulae | FST | 10094-13 | Surgical Tools |
| Kainic acid | Abcam | ab120100 | Epileptic drug |
| Lipid View software | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| LPC 17:0 | Avanis Polaris | 855676P | Lipid Std |
| LPC 18:0 | Avanis Polaris | 855775P | Lipid Std |
| Luna 2,5µm C18(2)- HAST 100A LC column | Phenomenex | 00D-4446-B0 | Instrumentation/LCMS |
| Magnifying lamp | Maul GmbH | Instrumentation/Sample prep. | |
| Methanol LC-MS Chroma Solv 99.9% | Honeywell | 9814920 | Solvent/LCMS |
| Motic Camara | Motic | Microscopy | |
| MTBE | Honeywell | 34875-1L | Solvent/LCMS |
| MultiQuant 3.0 quantitation software package | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| NanoDrop 2000c Spectrophotometer | Thermo Scientific | Instrumentation/qPCR | |
| PA 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 840857P | Lipid Std |
| PA 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1404 | Lipid Std |
| Palmitoyl Ethanolamide | Biomol | Cay90350-100 | Lipid Std |
| Palmitoyl Ethanolamide-d5 | Biomol | Cay9000573-5 | Lipid Std |
| PC 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850457P | Lipid Std |
| PC 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850457P | Lipid Std |
| PC 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1004 | Lipid Std |
| PE 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850757P | Lipid Std |
| PE 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1104 | Lipid Std |
| PG 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 840457P | Lipid Std |
| PG 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1204 | Lipid Std |
| PI 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1504 | Lipid Std |
| Precelleys 24 | Peqlab | Instrumentation/Sample prep. | |
| Precellys Keramik-Kügelchen | Peqlab | 91-pcs-ck14p | Sample Prep. |
| Precellys Stahlkugeln 2,8mm | Peqlab | 91-PCS-MK28P | Sample Prep. |
| Precellys-keramik-kit 1,4 mm | VWR | 91-PCS-CK14 | Sample Prep. |
| Prostaglandin D2 | Biomol | Cay 12010 | Lipid Std |
| Prostaglandin D2-d4 | Biomol | Cay 312010 | Lipid Std |
| Prostaglandin E2 | Biomol | Cay10007211-1 | Lipid Std |
| Prostaglandin E2-d9 | Biomol | Cay10581-50 | Lipid Std |
| PS 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1304 | Lipid Std |
| Q Trap 5500 triple-quadrupole linear ion trap MS | AB SCIEX | AU111609004 | Instrumentation/LCMS |
| Real Time PCR System | Appliert Biosystem | Instrumentation/qPCR | |
| Resolvin D1 | Biomol | Cay10012554-11 | Lipid Std |
| Rneasy Mini Kit - RNAase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | Sample Prep. |
| Security Guard precolumn | Phenomenex | Instrumentation/LCMS | |
| Shandon coverplates | Thermo Fisher | 72110017 | Microscopy |
| Shandon slide rack and lid | Thermo Fisher | 73310017 | Microscopy |
| SM 18:0 | Avanis Polaris | 860586P | Lipid Std |
| SM d18:1/12:0 | Avanis Polaris | LM-2312 | Lipid Std |
| Standard Forceps straight Smooth | FST | 11016-17 | Surgical Tools |
| Surgical Scissor ToughCut Standard Pattern | FST | 14130-17 | Surgical Tools |
| T3000 Thermocycler | Biometra | Instrumentation/qPCR | |
| Thromboxane B2 | Biomol | Cay19030-5 | Lipid Std |
| Thromboxane B2-d4 | Biomol | Cay319030-25 | Lipid Std |
| Tissue Lyser II | Qiagen/ Retsch | 12120240804 | Instrumentation/Sample prep. |
| Tissue Tek | Sakura Finetek | 4583 | Microscopy |
| Toluidinblau | Roth | 0300.2 | Microscopy |
| Vapotherm | Barkey | 4004734 | Instrumentation/Sample prep. |
| Wasser LC-MS Chroma Solv | VWR | 9814920 | Solvent/LCMS |
References
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