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Neuroscience

न्यूरोलॉजिकल रोगों में लिपिडोमिक्स और ट्रांसक्रिप्टोमिक्स

Published: March 18, 2022 doi: 10.3791/59423
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Physiological Chemistry, University Medical Center of the Johannes Gutenberg University Mainz

Summary

यह लेख ऊतक लिपिडोमिक्स और ट्रांसक्रिप्टोमिक्स के लिए एक मॉड्यूलर प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, और न्यूरोलॉजिकल रोग माउस मॉडल में प्लाज्मा लिपिडोमिक्स अंतर्निहित सूजन और न्यूरोनल गतिविधि, झिल्ली लिपिड, डाउनस्ट्रीम मैसेंजर, और एमआरएनए-एन्कोडिंग एंजाइम / रिसेप्टर्स अंतर्निहित लिपिड फ़ंक्शन को लक्षित करता है। नमूनाकरण, नमूना प्रसंस्करण, निष्कर्षण, और परिमाणीकरण प्रक्रियाओं को रेखांकित किया गया है।

Abstract

लिपिड मस्तिष्क के अपमान या न्यूरोलॉजिकल बीमारियों के लिए अनुकूल उत्तेजनाओं के लिए प्राथमिक इंटरफ़ेस के रूप में कार्य करते हैं और विभिन्न सिग्नलिंग या लिगैंड फ़ंक्शन के साथ लिपिड के संश्लेषण के लिए एक जलाशय हैं जो बीमारियों की शुरुआत और प्रगति को रेखांकित कर सकते हैं। अक्सर presymptomatic स्तर पर बदलते हुए, लिपिड दवा लक्ष्य और biomarkers का एक उभरता स्रोत हैं। कई न्यूरोलॉजिकल रोग न्यूरोइन्फ्लेमेशन, न्यूरोडीजेनेरेशन और न्यूरोनल उत्तेजना को आम हॉलमार्क के रूप में प्रदर्शित करते हैं, आंशिक रूप से विशिष्ट लिपिड सिग्नलिंग सिस्टम द्वारा संशोधित होते हैं। विभिन्न लिपिड के संश्लेषण की परस्पर निर्भरता और परस्पर संबंध एक बहुलिपिड, मल्टीएंजाइम और मल्टीरिसेप्टर विश्लेषण को संकेत देता है ताकि न्यूरोलॉजिकल संदर्भों की समानताएं और विशिष्टताओं को प्राप्त किया जा सके और रोग की शुरुआत और प्रगति के यांत्रिक पहलुओं को उजागर करने में तेजी लाई जा सके। अलग-अलग मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए लिपिड भूमिकाओं की सदस्यता एक न्यूरोलॉजिकल बीमारी से जुड़े लिपिड आणविक फेनोटाइप और आकृति विज्ञान के निर्धारण को आगे बढ़ाती है।

यहां प्रस्तुत एक मॉड्यूलर प्रोटोकॉल है जो झिल्ली लिपिड और डाउनस्ट्रीम लिपिड संकेतों के विश्लेषण के लिए उपयुक्त है, साथ ही एंजाइमों और मध्यस्थों के एमआरएनए के साथ उनकी कार्यक्षमता अंतर्निहित है, जो असतत मस्तिष्क क्षेत्रों से निकाला गया है जो किसी विशेष न्यूरोलॉजिकल बीमारी और / या स्थिति के लिए प्रासंगिक हैं। सटीक तुलनात्मक लिपिडोमिक प्रोफाइलिंग सुनिश्चित करने के लिए, वर्कफ़्लो और ऑपरेटिंग मानदंडों को अनुकूलित और मानकीकृत किया गया था: i) मस्तिष्क का नमूना करण और ब्याज के क्षेत्रों का विच्छेदन, ii) कई लिपिड संकेतों और झिल्ली लिपिड का सह-निष्कर्षण, iii) दोहरी लिपिड / एमआरएनए निष्कर्षण, iv) तरल क्रोमैटोग्राफी मल्टीपल रिएक्शन मॉनिटरिंग (एलसी / एमआरएम) द्वारा परिमाणीकरण, और वी) मानक एमआरएनए प्रोफाइलिंग। यह वर्कफ़्लो कार्यात्मक रूप से असतत मस्तिष्क उप-क्षेत्रों (यानी मस्तिष्क छिद्रण द्वारा) के नमूने द्वारा प्राप्त कम ऊतक मात्रा के लिए उपयुक्त है, इस प्रकार ऊतक विषमता और / या पशु परिवर्तनशीलता के कारण बहु-आणविक विश्लेषण में पूर्वाग्रह को रोकता है। न्यूरोलॉजिकल बीमारियों के परिधीय परिणामों को प्रकट करने और न्यूरोलॉजिकल रोग राज्यों के ट्रांसलेशनल आणविक रीडआउट स्थापित करने के लिए, परिधीय अंग नमूनाकरण, प्रसंस्करण, और उनके बाद के लिपिडोमिक विश्लेषण, साथ ही प्लाज्मा लिपिडोमिक्स, का भी पीछा किया जाता है और वर्णित किया जाता है। प्रोटोकॉल एक तीव्र मिर्गी माउस मॉडल पर प्रदर्शित किया जाता है।

Introduction

लिपिड के कार्य में हाल की प्रगति और न्यूरोलॉजिकल बीमारियों की शुरुआत और प्रगति में उनकी भूमिका नए चिकित्सीय लक्ष्यों और रोग तंत्र स्पष्टीकरण 1 के नए अनुसंधान और विकास स्थलों को खोलती है। विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों में लिपिड संरचना में प्रलेखित अंतर, आधुनिक आणविक इमेजिंग तकनीकों जैसे कि मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग और उन्नत मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोफाइलिंग द्वारा जोर दिया गया है, पूरे मस्तिष्क से लिपिड जांच के प्रतिमान को कार्यात्मक रूप से अलग और असतत मस्तिष्क क्षेत्रों की ओर स्थानांतरित करता है। तथ्य यह है कि लिपिड संरचना विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों में भिन्न होती है, कार्यात्मक रूप से अलग-अलग मस्तिष्क क्षेत्रों में मस्तिष्क अपमान या उत्तेजनाओं के जवाब में झिल्ली लिपिड संवेदनशीलता और डाउनस्ट्रीम लिपिड सिग्नलिंग दोनों की नई अवधारणा को प्रेरित करती है। इसलिए, लिपिड प्रोटोकॉल को उच्च स्थानिक रिज़ॉल्यूशन का पता लगाने और परिमाणीकरण के लिए कम ऊतक मात्रा की चुनौती को संबोधित करने के लिए नए विकास की आवश्यकता होती है, और समवर्ती रूप से, सेल झिल्ली और सिग्नलिंग मार्गों के कई लिपिड घटकों का विश्लेषण। इसके अलावा, एंजाइमों, लिपिड लिगेंड, और रिसेप्टर्स का निर्धारण उनके स्तरों और कार्य के विनियमन में शामिल है, एक न्यूरोलॉजिकल बीमारी में प्रभावित सिग्नलिंग मार्गों को स्पष्ट करने और एक pathophysiological संदर्भ में नई यांत्रिक जांच का मार्गदर्शन करने के लिए सर्वोपरि है।

बढ़े हुए मस्तिष्क स्थानिक संकल्प के अलावा, नए न्यूरोलिपिडोमिक दृष्टिकोणों के विकास को चुनौती देने वाली दो प्रमुख कठिनाइयां हैं। सबसे पहले, लिपिड सिग्नलिंग अणु आमतौर पर झिल्ली घटक लिपिड की तुलना में बहुत कम बहुतायत के होते हैं। दूसरा, लिपिडोम एक उच्च संरचनात्मक विषमता प्रदर्शित करता है, जो एक एकल विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण का उपयोग करके विच्छेदन करना मुश्किल है। इसलिए, निष्कर्षण और विश्लेषणात्मक विधियों को विभिन्न लिपिड श्रेणियों के अनुरूप बनाया जाता है और आमतौर पर अलग-अलग ऊतक नमूनों में किया जाता है।2. शॉटगन लिपिडोमिक तरीके3 झिल्ली लिपिड की एक व्यापक प्रोफ़ाइल को तेजी से प्रकट करने के लिए उत्कृष्ट उपकरण हैं, जबकि लक्षित खोज और परिमाणीकरण द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्रिक विधियों द्वारा प्रदान की गई संवेदनशीलता और चयनात्मकता में वृद्धि हुई है, जिसमें कम प्रचुर मात्रा में सिग्नलिंग लिपिड की जांच के लिए पूंजीकरण किया जाता है: i) भड़काऊ लिपिड और ii) न्यूरोनल गतिविधि के मॉड्यूलेशन में शामिल लिपिड, जैसे एंडोकैनाबिनोइड्स (ईसीबी), अमीनो एसिड से जुड़े लिपिड, आदि।4,5. न्यूरोलॉजिकल रोग मॉडल के मस्तिष्क क्षेत्रों में होने वाले सेल झिल्ली और सिग्नलिंग स्तर दोनों पर लिपिड परिवर्तनों को शामिल करने के लिए, आमतौर पर लिपिड निष्कर्षण और विश्लेषण अलग-अलग ऊतक नमूनों में किया जाता है, जो अलग-अलग जानवरों के बैचों से या विभिन्न गोलार्धों से प्राप्त होता है, या एक बड़े ऊतक क्षेत्र को कई टुकड़ों में विच्छेदन करके। जब एंजाइम रिसेप्टर्स के एमआरएनए स्तर भी रुचि के होते हैं, तो उनकी जांच में आमतौर पर एक अलग ऊतक नमूने की खरीद की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, झिल्ली लिपिड, अंतर्जात कैनबिनोइड्स और एमआरएनए की जांच के लिए तीन अलग-अलग ऊतक नमूनों की आवश्यकता होगी, (उदाहरण के लिए, दो लिपिड निष्कर्षण विधियों-झिल्ली लिपिड और सिग्नलिंग लिपिड के लिए दो नमूने- और बाद के दो लिपिड विश्लेषण विधियों- और एमआरएनए विश्लेषण के लिए एक नमूना)। भड़काऊ लिपिड और अंतर्जात कैनबिनोइड्स की जांच के लिए क्रमशः दो अलग-अलग ऊतक नमूनों, निष्कर्षण विधियों और विश्लेषण विधियों की आवश्यकता होती है। एक अन्य उदाहरण एमआरएनए की जांच है और मस्तिष्क पंच या लेजर माइक्रोडिसेक्शन नमूने में किसी भी लिपिड श्रेणी की जांच है जिसके परिणामस्वरूप प्रति मस्तिष्क (उप) क्षेत्र में दो नमूनों को प्राप्त करने के लिए दो अलग-अलग जानवरों की आवश्यकता होती है। परिवर्तनशीलता और / या परिणामों की खराब पुनरुत्पादकता की एक पर्याप्त सीमा अक्सर ऐसे मामलों में होती है, जो जैविक परिवर्तनशीलता और / या ऊतक विषमता से उत्पन्न होती है। बहु-आणविक विश्लेषण की इन व्यावहारिक सीमाओं द्वारा निर्देशित, विशेष रूप से मस्तिष्क में उच्च स्थानिक संकल्प पर होने वाली, एक तीन-मॉड्यूल न्यूरोलिपिडोमिक्स प्रोटोकॉल को शामिल करते हुए डिज़ाइन किया गया था: 1) भड़काऊ लिपिड के एलसी / एमआरएम द्वारा सह-विश्लेषण (उदाहरण के लिए, इकोसानोइड्स (ईआईसी)) और न्यूरोनल गतिविधि के मॉड्यूलेशन में शामिल लिपिड, जैसे कि ईसीबी2; 2) बाद के मल्टीस्कैन एलसी / एमआरएम और अग्रदूत / तटस्थ हानि स्कैन विश्लेषण के साथ फॉस्फोलिपिड्स (पीएल) और ईसीबी का सह-निष्कर्षण2; और 3) झिल्ली (फॉस्फो) लिपिड और eCBs के साथ-साथ mRNA का दोहरा निष्कर्षण, बाद में LC / MRM और qPCR या आरएनए अनुक्रमण विश्लेषण के साथ6. एक न्यूरोलॉजिकल बीमारी और ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्र में संबोधित किए जाने वाले जैविक प्रश्न के आधार पर, पहले और दूसरे प्रोटोकॉल, या पहले और तीसरे प्रोटोकॉल का एक संयोजन, लगभग 4 मिलीग्राम वजन वाले ऊतकों के लिए एक ही ऊतक के नमूने पर लागू किया जा सकता है। पहले और तीसरे प्रोटोकॉल को स्वतंत्र रूप से 2 मिलीग्राम के आसपास के ऊतकों के लिए लागू किया जा सकता है। दूसरा प्रोटोकॉल 0.5 मिलीग्राम के रूप में कम वजन वाले ऊतकों के लिए लागू किया जा सकता है। चयनित न्यूरोलिपिडोमिक प्रोटोकॉल मॉड्यूल के बावजूद, ऊतक नमूनाकरण और पूर्व-विश्लेषणात्मक प्रसंस्करण, मस्तिष्क अलगाव और क्षेत्र विच्छेदन, साथ ही पशु मॉडल का त्याग करने की प्रक्रिया प्रोटोकॉल के सभी तीन मॉड्यूल के लिए मानकीकृत और समान है। न्यूरोलॉजिकल बीमारियों की हमारी जांच में, परिधीय अंग जो रोग के रोग संबंधी परिणामों के लिए प्रासंगिक हैं, उन्हें हमेशा इन मॉड्यूलर प्रोटोकॉल का उपयोग करके एकत्र और विश्लेषण किया जाता है। इसके अतिरिक्त, संभावित ट्रांसलेशनल अनुप्रयोगों पर एक दृश्य के साथ न्यूरोलॉजिकल बीमारियों के रीडआउट टूल के रूप में सेवा करने के लिए प्लाज्मा लिपिडोमिक्स के लिए रक्त का नियमित रूप से नमूना लिया जाता है। यहां प्रस्तुत मॉड्यूलर लिपिडोमिक्स प्रोटोकॉल बहुत बहुमुखी है: बड़ी ऊतक मात्रा में स्केल करने योग्य और लगभग किसी भी ऊतक प्रकार और बीमारी के लिए आसानी से लागू होता है। मॉड्यूलर प्रोटोकॉल के आवेदन के लिए (चित्र 1) न्यूरोलॉजिकल बीमारियों में, न्यूरोलॉजिकल विकारों की शुरुआत और प्रगति का कोई भी मानकीकृत कृंतक मॉडल, जैसे कि दर्दनाक मस्तिष्क की चोट, पार्किंसंस रोग, अल्जाइमर रोग, या मिर्गी सक्षम हैं।

इन प्रोटोकॉल को बड़े पैमाने पर कैनिक एसिड (केए) में मिर्गी के तीव्र चरण में ऊतक लिपिडोम और / या ट्रांसक्रिप्टोम में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए लागू किया गया है- मिर्गी के प्रेरित माउस मॉडल 2,7, एक मॉडल जो मानव टेम्पोरल लोब मिर्गी (टीएलई) 8,9,10,11 की समानता के कारण प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। इन प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, मिर्गी के एक ही माउस मॉडल में पाल्मिटोइलेथनोलामाइड (पीईए) 12,13 जैसी दवाओं की चिकित्सीय क्षमता का आकलन किया गया था। अध्ययन ने मस्तिष्क और परिधि में उच्च और निम्न स्थानिक संकल्प पर लिपिड और एमआरएनए परिवर्तनों की पहचान की, अधिकतम तीव्र जब्ती तीव्रता के समय (60 मिनट के पोस्टसीजर प्रेरण पर), और पीईए के साथ उप-कालिक और तीव्र उपचार पर चार अलग-अलग टाइमपॉइंट्स (20, 60, 120, और 180 मिनट) पर केए-जब्ती प्रेरण के बाद, मिर्गी के तीव्र चरण को कवर करने वाली एक समय-खिड़की। प्लाज्मा, दिमाग, और अनुपचारित केए-इंजेक्टेड चूहों के परिधीय अंगों, तीव्र और उप-विडंबना पीईए-उपचारित चूहों, साथ ही साथ वाहन और पीईए-वाहन नियंत्रण चूहों को प्रत्येक समय बिंदु 12,13 पर एकत्र किया गया था, और इस आणविक विश्लेषण के साथ जांच की गई थी। आणविक डेटा जब्ती स्कोरिंग द्वारा प्राप्त व्यवहारफेनोटाइप के साथ-साथ न्यूरोडीजेनेरेटिव प्रक्रियाओं पर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री-व्युत्पन्न डेटा के साथ सहसंबद्ध थे, ताकि तीव्र मिर्गी चरण की प्रगति और पीईए की क्षमता को कम किया जा सके।

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Protocol

यहां वर्णित सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाएं 22 सितंबर 2010 (2010/63EU) के यूरोपीय समुदाय के परिषद निर्देश के अनुसार हैं और राज्य की स्थानीय पशु समिति द्वारा अनुमोदित की गई थीं राइनलैंड-पैलेटिनेट, जर्मनी (फ़ाइल संदर्भ: 23 177-07 / G16-1-075)।

1. तीव्र और रोगनिरोधी रूप से इलाज केए-प्रेरित मिर्गी के पशु मॉडल

  1. जब्ती प्रेरण, उपचार, और व्यवहार स्कोरिंग प्रदर्शन करें।
    1. एकल पिंजरों में अलग-अलग चूहों (न्यूनतम एन = 6 चूहों प्रति समूह) ।
    2. जब्ती-प्रेरण इंजेक्शन समाधान और संबंधित वाहन तैयार करें ( तालिका 1 देखें), साथ ही साथ उपचार इंजेक्शन समाधान और संबंधित वाहन ( तालिका 2 देखें)।
    3. अपने समूह की पहचान के अनुसार संज्ञाहरण के बिना चूहों को इंट्रापेरिटोनियल रूप से इंजेक्ट करें (आईपी) (10 एमएल / किग्रा माउस बॉडी मास) : बीमारी, इलाज, या वाहन का इलाज किया गया (यानी, केए, पीईए-उपचारित केए, और दो वाहन समूह)। चित्र 2, तालिका 1, और तालिका 2 देखें।
    4. मॉनिटर और निम्नलिखित मानकीकृत जब्ती तीव्रता पैमाने के अनुसार व्यवहार स्कोर: 0 = कोई प्रतिक्रिया नहीं; 1 = गतिहीनता और घूरना; 2 = forelimb और / या पूंछ विस्तार, कठोर मुद्रा; 3 = दोहराए जाने वाले आंदोलनों, सिर bobbing; 4 = पालन और गिरना; 5 = निरंतर पालन और गिरना; 6 = गंभीर क्लोनिक-टॉनिक दौरे; 7 = मृत्यु14,15 (चित्र 3)।
  2. लिपिडोमिक और ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण के लिए बलिदान प्रक्रिया करें।
    1. चार टाइमपॉइंट्स (यानी, क्रमशः 20, 60, 120, और 180 मिनट पोस्ट केए- या वाहन इंजेक्शन) पर, निम्नलिखित समूहों में से प्रत्येक से छह चूहों का बलिदान करें: पीईए का इलाज किया गया, पीईए-अनुपचारित मिर्गी वाहन 1, और वाहन 2, आईएसीयूसी अनुमोदित प्रोटोकॉल का पालन करते हुए।
    2. प्रत्येक समय बिंदु तक पहुंचने के दस सेकंड बाद, एक ग्लास चैंबर में एक आइसोफ्लुरेन-भिगोए गए ऊतक का उपयोग करके चूहों को बेहोश करें। राइटिंग रिफ्लेक्स के नुकसान से संज्ञाहरण की पुष्टि करें, जो धीरे-धीरे ग्लास चैंबर को पलटते हुए स्थानांतरित करने में असमर्थता से संकेत मिलता है। सर्जिकल कैंची का उपयोग करके चूहों को डिकैपिटेट करें और प्लाज्मा, मस्तिष्क और परिधीय अंगों को इकट्ठा करें (चरण 2.2.2-2.2.4 देखें)।
      सावधानी: बलिदान प्रक्रियाओं के लिए नैतिक नियम स्थानीय पशु समितियों के बीच भिन्न होते हैं। स्थानीय पशु समिति द्वारा जारी किए गए नियमों की जांच और पालन करना सुनिश्चित करें।
  3. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री विश्लेषण के लिए बलिदान प्रक्रिया का पालन करें।
    1. इम्यूनोहिस्टोकेमिकल स्टेनिंग 13 के लिए, निम्नलिखित समूहों में से प्रत्येक से व्यवहारिक रूप से तीन चूहों को स्कोर करें: पीईए का इलाज किया गया, पीईए-अनुपचारित मिर्गी, और वाहन समूह, पूरे समय के पाठ्यक्रम (180 मिनट) पर।
    2. बलिदान और perfuse चूहों 5 दिन बाद. गहराई से anesthetize चूहों (माउस समूहों के लिए चरण 1.3.1 देखें) पेंटोबार्बिटल (100 मिलीग्राम / किग्रा) और buprenorphine (0.1 मिलीग्राम / किग्रा) के आईपी इंजेक्शन द्वारा नशीली दवाओं के रूप में। पैर की उंगलियों के बीच पलटा के नुकसान से गहरी संज्ञाहरण की पुष्टि करें।
    3. एक polystyrene प्लेट पर माउस को ठीक करें और तुरंत ठीक कैंची और मानक संदंश का उपयोग करके वक्ष को खोलें। तितली को बाएं दिल के वेंट्रिकल में सेट करें और ठीक कैंची का उपयोग करके दाएं आलिंद को काट लें।
    4. पंप की गति और दबाव को 2−3 mL/min की दर के साथ एक स्थिर पेरिस्टाल्टिक प्रवाह में समायोजित करें। ~ 5 मिनट के लिए बर्फ-ठंडे फॉस्फेट बफ़र्ड खारा (पीबीएस) के साथ perfuse। यदि आवश्यक हो, तो तितली को बदलें।
      नोट: उचित परफ्यूजन के साथ, आंतरिक अंग (प्लीहा को छोड़कर) 1-2 मिनट के भीतर ब्लीच करना शुरू कर देते हैं।
    5. ~ 5 मिनट के लिए बर्फ-ठंडा 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) समाधान के लिए परफ्यूजन स्विच करें। चरण 2.2.2 में वर्णित पूरे दिमाग को अलग करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% पीएफए समाधान में 24 घंटे के लिए ठीक करें।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए 30% सुक्रोज समाधान में दिमाग को इनक्यूबेट करें। एक सूखे टिशू पेपर के साथ बचे हुए सुक्रोज को हटा दें और एक धातु की प्लेट (-80 डिग्री सेल्सियस) पर दिमाग को फ्रीज करें। धुंधला प्रक्रियाओं 13 के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर दिमाग को स्टोर करें।

2. लिपिडोमिक / ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण के लिए नमूना प्रक्रियाओं

  1. सैंपलिंग के लिए तैयारी करें।
    1. 4 डिग्री सेल्सियस करने के लिए प्लाज्मा नमूना लेने के लिए प्रीकूल ईडीटीए-ट्यूब। 4 डिग्री सेल्सियस करने के लिए सेंट्रीफ्यूज और भंवर उपकरण precool. एल्यूमीनियम पन्नी (जमे हुए मस्तिष्क और / या ब्याज के अन्य ऊतकों को स्नैप करने के लिए) सूखी बर्फ (-80 डिग्री सेल्सियस) पर के साथ कवर धातु की प्लेट को प्रीकूल करें। प्लाज्मा एलीकोट, जमे हुए ऊतक, और मस्तिष्क संग्रह के लिए सूखी बर्फ (-80 डिग्री सेल्सियस) पर लेबल किए गए 2 एमएल और 5 एमएल ट्यूबों को प्रीकूल करें। प्रकाश संवेदनशील अणुओं की रक्षा के लिए एम्बर ट्यूबों का उपयोग करें, जैसे कि ईआईसी।
    2. ऊतक नमूनाकरण और अलगाव उपकरण (सर्जिकल कैंची, सीधे तेज ठीक कैंची, सीधे चिकनी मानक संदंश, दर्पण खत्म के साथ ठीक संदंश, घुमावदार संदंश और स्पैटुला, पॉलीस्टीरीन फोम प्लेट, और निर्धारण के लिए सुई) को एक कीटाणुनाशक (जैसे, 70% इथेनॉल) के साथ साफ करें।
  2. नमूना प्रोटोकॉल
    1. नमूने का क्रम निर्धारित करें।
      1. Precooled 1 mL EDTA ट्यूबों में decapitation के तुरंत बाद रक्त इकट्ठा करें (चरण 2.2.3 देखें)।
      2. पूरे मस्तिष्क को हटा दें और हटाने के तुरंत बाद फ्रीज को स्नैप करें। इस चरण में 1-2 मिनट का समय लगेगा। आगे के प्रसंस्करण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए दिमाग को स्टोर करें (चरण 2.2.2 देखें)।
      3. मस्तिष्क हटाने के बाद 5 मिनट के भीतर ब्याज के परिधीय अंगों (जैसे, फेफड़े, हृदय, जिगर) को हटा दें, और आगे के प्रसंस्करण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज और स्टोर करें (चरण 2.2.4 देखें)।
    2. विच्छेदन या छिद्रण प्रक्रियाओं के लिए मस्तिष्क निकालें। इस प्रक्रिया में 1−2 मिनट / मस्तिष्क लगता है।
      1. विच्छेदन के बाद (चरण 1.2 देखें), ठीक कैंची का उपयोग करके त्वचा में एक मिडलाइन चीरा बनाना शुरू करें। आंखों पर त्वचा flipping द्वारा खोपड़ी मुक्त. खोपड़ी के शीर्ष तक पहुंचें और इंट्रापेरिएटल हड्डी के स्तर पर शुरू होने वाला एक छोटा सा पुच्छल चीरा बनाएं। मस्तिष्क के माध्यम से काटने से बचें।
      2. मस्तिष्क को हटाने को आसान बनाने के लिए आंखों के बीच खोपड़ी के सबसे पूर्वकाल भाग के माध्यम से दृढ़ता से काटें। घुमावदार संकीर्ण पैटर्न संदंश का उपयोग करके पार्श्विका हड्डी के एक तरफ झुकाएं और तोड़ दें। दूसरी तरफ के लिए अंतिम चरण को दोहराएं।
      3. मस्तिष्क meninges निकालें. मस्तिष्क के पूर्वकाल भाग (यानी, घ्राण बल्ब) के नीचे एक स्पैटुला स्लाइड करें और मस्तिष्क को धीरे से ऊपर की ओर झुकाएं। ऑप्टिक और अन्य कपाल तंत्रिकाओं को तोड़ने के लिए स्पैटुला को और नीचे स्लाइड करें।
      4. खोपड़ी से मस्तिष्क को बाहर निकालें और पूरे मस्तिष्क को तुरंत एक प्रीकूल्ड (-80 डिग्री सेल्सियस) धातु प्लेट पर फ्रीज करें, जिसमें धातु की प्लेट (पृष्ठीय ऊपर) का सामना करने वाले वेंट्रल पक्ष के साथ।
      5. मस्तिष्क को पूरी तरह से फ्रीज करने और प्रीकूल्ड 5 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करने की अनुमति दें और मस्तिष्क क्षेत्रों के विच्छेदन या छिद्रण प्रक्रिया तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें (चरण 3.1 और 3.2 देखें)।
    3. प्लाज्मा नमूनाकरण निष्पादित करें।
      1. स्पाइक precooled EDTA-ट्यूबों के साथ 10 μL ताजा तैयार indomethacin-कमजोर पड़ने के 10 μM के एक लक्ष्य एकाग्रता के लिए.
      2. 1 एमएल की अधिकतम रक्त मात्रा के लिए precooled EDTA ट्यूबों में शरीर के कोमल निचोड़ द्वारा शरीर के कोमल निचोड़ने के तुरंत बाद ट्रंक रक्त इकट्ठा करें।
        नोट: उचित रक्तचाप के मामले में, निचोड़ने की आवश्यकता नहीं है। यदि रक्त की मात्रा 1 मिलीलीटर से कम है, तो उचित रक्त प्रवाह को सक्षम करने के लिए समय इनक्यूबेशन आइसोफ्लुरेन को कम करें।
      3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 2,000 x g पर तुरंत सेंट्रीफ्यूज रक्त ट्यूब।
      4. परिणामी ऊपरी प्लाज्मा चरण को हटा दें और मल्टीलिपिड विश्लेषण के उद्देश्य के लिए एलीकोट ने प्रीकूल्ड 2 एमएल ट्यूबों में प्लाज्मा वॉल्यूम को निम्नानुसार परिभाषित किया: eCBs / eiCs विश्लेषण के लिए 50 μL, PLs विश्लेषण के लिए 30 μL, और बैकअप नमूने के रूप में या अन्य प्रकार के विश्लेषण के लिए शेष प्लाज्मा मात्रा।
      5. आगे निष्कर्षण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर प्लाज्मा नमूनों को संग्रहीत करें (चरण 4.1.2 और 4.1.4 देखें)।
    4. परिधीय अंग नमूनाकरण करें।
      नोट: माउस एनाटॉमी संदर्भ16 का उपयोग करें और व्यक्तिगत अंगों, उनके संयोजी ऊतकों और / या रक्त वाहिकाओं की पहचान करने के लिए पशु जांचकर्ताओं द्वारा भाग लेने वाले अनिवार्य पाठ्यक्रमों (FELASA) के लिए प्रदान किए गए प्रलेखन का उपयोग करें।
      1. सुइयों का उपयोग करके अंग हटाने को आसान बनाने के लिए माउस धड़ को स्थिर करें। प्यूबिस की ऊंचाई पर एक सीधी तेज कैंची का उपयोग करके एक वेंट्रल मिडलाइन चीरा बनाएं। उदर गुहा को खोलने के लिए काटने के दौरान पेट की दीवार को ठीक करने के लिए कुंद मानक संदंश का उपयोग करें।
      2. कुंद संदंश का उपयोग करके पेट के अंग को हटाने की अनुमति देने के लिए त्वचा को स्थिर करें। दिल या फेफड़ों को हटाने के लिए, स्तन गुफा की दिशा में औसत दर्जे का कटौती जारी रखें। ठीक संदंश का उपयोग करके फेफड़ों और / या हृदय को हटा दें।
      3. रक्तस्राव से बचने के लिए स्तन गुहा को ध्यान से खोलें। संयोजी ऊतकों और रक्त वाहिकाओं अंग के माध्यम से काटने के बिना संबंधित अंग लंगर काटें।
      4. प्रीकूल्ड धातु प्लेटों (-80 डिग्री सेल्सियस) पर तुरंत ऊतक के टुकड़े स्थानांतरित करें और पूरी तरह से फ्रीज करने की अनुमति दें। ऊतक के टुकड़ों को प्रीकूल्ड ट्यूबों में स्थानांतरित करें और आगे के प्रसंस्करण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें (चरण 4.1 देखें)।

3. जैविक सामग्री प्रसंस्करण

नोट: eCBs / eiCs के सह-निष्कर्षण के लिए निष्कर्षण ट्यूबों के रूप में 2 mL एम्बर ट्यूबों का उपयोग करें और प्रत्येक ट्यूब में सात precooled स्टील गेंदों को जोड़ें। PLs / eCBs के सह-निष्कर्षण के लिए और दोहरे लिपिड और आरएनए सह-निष्कर्षण के लिए, सिरेमिक मोतियों (सामग्री की तालिका) के साथ स्पाइक किए गए आरएनएएस-मुक्त निष्कर्षण ट्यूबों के 2 एमएल का उपयोग करें।

  1. मस्तिष्क विच्छेदन और परिधीय अंग प्रसंस्करण प्रदर्शन.
    नोट: विच्छेदन के लिए मस्तिष्क की दृश्यता बढ़ाने के लिए आवर्धक लैंप का उपयोग करें।
    1. सर्जिकल उपकरण, सुपर ठीक सुझावों के साथ संदंश सहित, 70% इथेनॉल के साथ 2x साफ करें।
    2. जमे हुए दिमाग को -80 डिग्री सेल्सियस से एक पेट्री डिश में स्थानांतरित करें जिसमें प्रीकूल्ड शारीरिक बफर (पीएच 5.5) शामिल है, सुनिश्चित करें कि पेट्री डिश 4 डिग्री सेल्सियस पर है। विच्छेदन की अनुमति देने के लिए दिमाग को पूरी तरह से अनफ्रीज करने की अनुमति दें। संदंश का उपयोग करके सावधानीपूर्वक परीक्षण करें।
      सावधानी: पिघलने के लिए आवश्यक से अधिक समय तक दिमाग को 4 डिग्री सेल्सियस पर न रखें।
    3. बर्फ (4 डिग्री सेल्सियस) पर एक धातु की प्लेट को प्रीकूल करें और इसे बर्फ-ठंडे शारीरिक बफर (पीएच 5.5) में भिगोए गए गीले ऊतकों के साथ कवर करें और बर्फ पर एक प्रीकूल्ड (4 डिग्री सेल्सियस) धातु प्लेट पर ध्यान से वेंट्रल पक्ष के साथ मस्तिष्क को स्थानांतरित करें। इसे बर्फ-ठंडे शारीरिक बफर (पीएच 5.5) में भिगोए गए गीले ऊतकों के साथ कवर करें।
    4. सुपर ठीक टिप संदंश का उपयोग करके अधिकतम 5 मिनट के भीतर मस्तिष्क क्षेत्रों को विच्छेदित करें। हाइपोथैलेमस (HYP) के साथ शुरू करें और दाईं ओर के साथ आगे बढ़ने के लिए पृष्ठीय पक्ष को ऊपर की ओर घुमाएं। हिप्पोकैम्पस (HCr), प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स (PFCr), striatum (STRr), और सेरेब्रल कॉर्टेक्स (cCTXr) को अलग करें। फिर बाईं ओर विच्छेदन करें। हिप्पोकैम्पस (HCl), प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स (PFCl), striatum (STRl), और सेरेब्रल कॉर्टेक्स (cCTXl) को अलग करें। सेरिबैलम और थैलेमिक क्षेत्र को विच्छेदित करें। मस्तिष्क क्षेत्र की पहचान के लिए प्रकाशित शारीरिक संदर्भ16,17 का उपयोग करें।
    5. एक एल्यूमीनियम पन्नी कवर, precooled धातु प्लेट (-80 डिग्री सेल्सियस) पर प्रत्येक विच्छेदित टुकड़ा सीधे स्थानांतरण। ठंड और लेबल precooled 2 एमएल ट्यूबों में अलग मस्तिष्क क्षेत्रों को स्थानांतरित करने की अनुमति दें।
    6. एक ऊतक pulverizer (-80 डिग्री सेल्सियस पर) का उपयोग कर ऊतक टुकड़ों pulverize, ऊतक के thawing से बचने. ठंडे कमरे में, लेबल में एलीकोट ऊतक पाउडर, सिरेमिक मोती या स्टील गेंदों युक्त precooled निष्कर्षण ट्यूबों. दोहरी लिपिडोमिक्स / ट्रांसक्रिप्टोमिक्स विश्लेषण के लिए, ठंडे कमरे में ऊतक पाउडर एलीकोट का वजन करें। लिपिडोमिक्स-केवल विश्लेषण के लिए, ऊतक वजन या प्रोटीन सामग्री के लिए सामान्यीकरण के बीच चुनें। उत्तरार्द्ध के लिए, ऊतक वजन के बिना आगे बढ़ें।
    7. परिधीय अंग ऊतकों को 20 मिलीग्राम के अधिकतम वजन के साथ टुकड़ों में काटें। चरण 3.1.6 के रूप में ऊतक pulverization के साथ आगे बढ़ें।
    8. ऊतक के नमूनों के निष्कर्षण के साथ आगे बढ़ें (चरण 4.1.1, 4.1.3, या 4.1.5 देखें) या बाद में निष्कर्षण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब स्टोर करें।
      नोट: मस्तिष्क मैट्रिक्स का उपयोग भी किया जा सकता है यदि अध्ययन डिजाइन अनुमति देता है। हालांकि, यह विधि मस्तिष्क क्षेत्रों की एक असतत और सीमित संख्या के लिए अधिक उपयुक्त है, और निर्धारित समय-सीमा के भीतर उपरोक्त सभी मस्तिष्क क्षेत्रों को विच्छेदित और अलग करना व्यावहारिक नहीं है।
  2. मस्तिष्क छिद्रण करें।
    1. क्रायोस्टेट में बढ़ते सिस्टम (सामग्री की तालिका) पर पूरे, जमे हुए दिमाग को माउंट करें। मोटाई को 50 μm पर सेट करें और ब्याज के क्षेत्र के करीब ट्रिम-मोड में स्लाइस करें।
    2. स्टेन मस्तिष्क स्लाइस (18-20 μm) टोल्यूइडिन नीले (0.1% -1%) का उपयोग करके ब्याज के उप-क्षेत्र को स्थानीयकृत करने के लिए एक संदर्भ के रूप में। ब्याज के क्षेत्रों की पहचान करने के लिए एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करके दाग स्लाइस का निरीक्षण करने के लिए छिद्रित किया जा करने के लिए। उपयुक्त मस्तिष्क शारीरिक क्षेत्रों को खोजने के लिए संदर्भ के रूप में एक माउस एटलस का उपयोग करें16. प्रीकूल्ड ट्यूबों में नमूना कोरर्स का उपयोग करके 0.8−1.0 मिमी व्यास के साथ घूंसे लें।
    3. लेबल में ठंडे कमरे में जमे हुए घूंसे का वजन करें, चीनी मिट्टी के मोतियों या स्टील की गेंदों वाले प्रीकूल्ड 2 एमएल निष्कर्षण ट्यूब। eCBs और eiCs सह-निष्कर्षण के लिए एम्बर ट्यूबों का उपयोग करें।
    4. निष्कर्षण प्रारंभ करें (चरण 4.1.1, 4.1.3, या 4.1.5 देखें) या आगे निष्कर्षण के लिए -80 °C पर ट्यूब स्टोर करें।
  3. प्लाज्मा प्रसंस्करण निष्पादित करें।
    1. बर्फ (4 डिग्री सेल्सियस) पर जमे हुए प्लाज्मा नमूनों को रखें और उन्हें पिघलने दें (~ 20 मिनट)।
    2. सुनिश्चित करें कि निष्कर्षण शुरू करने से पहले प्लाज्मा पूरी तरह से unfrozen है।
    3. प्लाज्मा निष्कर्षण प्रक्रिया के साथ आगे बढ़ें (चरण 4.1.2 या 4.1.4 देखें)।
      नोट: प्लाज्मा नमूने निष्कर्षण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर रहना चाहिए। thawing और refreezing के चक्र से बचें।

4. निष्कर्षण प्रक्रियाओं

  1. तरल-तरल (एलएलई) लिपिड सह-निष्कर्षण प्रोटोकॉल करें।
    1. मस्तिष्क के टुकड़ों, घूंसे, या ऊतक पाउडर नमूनों से eCBs और eiCs के सह-निष्कर्षण प्रदर्शन।
      नोट:: सटीक pipetting प्रक्रिया के दौरान आवश्यक है।
      1. बर्फ (4 डिग्री सेल्सियस) पर ऊतक के नमूने और सात स्टील गेंदों युक्त निष्कर्षण ट्यूबों जगह। बर्फ-ठंडे एमटीबीई के 600 μL और आंतरिक मानकों वाले ACN / H2O (1: 1; v / v) के 50 μL जोड़ें। विश्लेषण (50 μL) के लिए अंतिम मात्रा में आंतरिक मानकों की लक्ष्य एकाग्रता इस प्रकार है: 1 ng/mL AEA-d4, 125 ng/mL 2-AG-d5, 3,000 ng/mL AA-d8, 2 ng/mL OEA-d4; पीईए-डी 4, 12.5 एनजी / एमएल 1-एजी-डी 5, 2.5 एनजी / एमएल पीजीएफ 2α-डी 4 और पीजीडी 2-डी 4 के लिए 5 एनजी / एमएल; PGE2-d9; 5 (एस) -HETE-d8; 12 (एस) -HETE-d8; 20-HETE-d6, और TXB2-d4, क्रमशः।
      2. 0.1 एम फॉर्मिक एसिड के 400 μL जोड़ें और एक ऊतक लाइसर (30 s-1 मिनट) के साथ homogenize। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5,000 x g पर 15 मिनट के लिए होमोजेनेट को सेंट्रीफ्यूज करें। ऊपरी कार्बनिक चरण के हस्तांतरण को कम करने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए जलीय निचले चरण को ठंडा करने की अनुमति दें।
      3. नई ट्यूबों में कार्बनिक चरण स्थानांतरित करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर N2 की एक कोमल धारा के तहत वाष्पित करें और आगे के विश्लेषण के लिए ACN / H2O (1: 1; v / v) के 50 μL में पुनर्गठित करें।
      4. आगे प्रोटीन सामग्री विश्लेषण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस पर जलीय चरण को स्टोर करें।
    2. प्लाज्मा नमूनों से eCBs और eiCs के सह निष्कर्षण प्रदर्शन.
      1. 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लाज्मा एलीकोट पिघलाहुआ। MTBE के 800 μL और ACN/H2O (1:1; v/v) के 50 μL जोड़ें, जिसमें आंतरिक मानक (ऊतक विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले लोगों के अनुरूप, चरण 5.1.1 देखें)। संदर्भ प्लाज्मा नमूनों का उपयोग करके स्पाइकिंग के लिए आंतरिक मानक एकाग्रता का अनुकूलन करें।
      2. 2 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.1 एम फॉर्मिक एसिड और भंवर के नमूनों के 600 μL जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 4,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज नमूने।
      3. कार्बनिक चरण को नई ट्यूबों में स्थानांतरित करें, 37 डिग्री सेल्सियस पर एन 2 की एक कोमल धारा के तहत वाष्पित हो जाएं, और एलसी / एमआरएम विश्लेषण के लिए एसीएन / एच 2 ओ (1: 1; वी / वी) के 50 μL में पुनर्गठित करें।
        नोट: यदि संभव हो, तो ईआईसी के सूखे अर्क के भंडारण से बचें और तुरंत एलसी / एमआरएम विश्लेषण पर आगे बढ़ें। यदि भंडारण से बचा नहीं जा सकता है, तो एलसी इंजेक्शन विलायक में नमूनों के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर केवल 2-3 दिनों के लिए अल्पकालिक भंडारण का सहारा लें।
    3. मस्तिष्क क्षेत्रों, घूंसे, या अन्य ऊतक पाउडर के नमूनों से PLs और eCBs के सह-निष्कर्षण प्रदर्शन।
      1. बर्फ (4 डिग्री सेल्सियस) पर ऊतक के नमूने और सिरेमिक मोतियों वाले निष्कर्षण ट्यूबों को रखें। MTBE / MeOH (10: 3; v / v) के 800 μL और आंतरिक मानकों वाले MeOH के 10 μL जोड़ें। विश्लेषण (100 μL) के लिए अंतिम मात्रा में आंतरिक मानकों की लक्ष्य एकाग्रता इस प्रकार है: पीसी 17: 0 / 14: 1, पीई 17: 0 / 14: 1, पीए 17: 0 / 14: 1, पीए 17: 0 / 14: 1, 100 एनजी / एमएल पीजी 17: 0 / 14: 1 के लिए 150 एनजी / एमएल; PS 17:0/14:1; पीआई 17:0/14:1; LPC 17:0; LPA 17:0; SM d18:1/12: 0,1 ng/mL AEA-d4, 60 ng/mL 2-AG-d5, 4,000 ng/mL AA-d8, 2 ng/mL OEA-d2 और 3 ng/mL PEA-d4 क्रमशः।
      2. 25 μM tetrahydrolipstatin / URB597 और 50 μg / mL BHT युक्त 0.1% फॉर्मिक एसिड का 200 μL जोड़ें। ऊतक homogenizer (सामग्री की तालिका) और 5,000 x जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज के साथ homogenize 15 मिनट के लिए.
      3. नई ट्यूबों में ऊपरी कार्बनिक चरण को पुनर्प्राप्त करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर N2 की एक कोमल धारा के तहत वाष्पित करें। MeOH के 90 μL में पुनर्गठित करें और या तो -20 °C या -80 °C पर स्टोर करें या अगले चरण के साथ आगे बढ़ें।
      4. लिपिड निकालने (4.1.3.3) के एक एलीकोट में 10% H2O जोड़ें और PLs विश्लेषण के लिए LC / MS में 10 μL इंजेक्ट करें। आगे के लिए eCB विश्लेषण चरण 4.3.5 के साथ आगे बढ़ें।
      5. निकालने (4.1.3.3) का एक एलीकोट लें, सूखापन के लिए वाष्पित करें और एसीएन / एच 2 ओ (1: 1; वी / वी) में पुनर्गठित करें। ईसीबी विश्लेषण के लिए एलसी / एमएस इंजेक्शन के लिए 20 μL का उपयोग करें।
    4. प्लाज्मा नमूनों से PLs और eCBs के सह निष्कर्षण प्रदर्शन.
      1. 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लाज्मा एलीकोट को पिघलाएं, एमटीबीई / मेथनॉल (10: 3; वी / वी) और 10 μL MeOH के 1,000 μL जोड़ें जिसमें आंतरिक मानक (चरण 4.1.3 के अनुरूप) और 1 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंवर शामिल हैं।
      2. 4 °C पर 45 मिनट के लिए H2O और भंवर के 250 μL जोड़ें। 5,000 x g और 4 °C पर 15 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज नमूने। ऊपरी कार्बनिक चरण को पुनर्प्राप्त करें, 37 डिग्री सेल्सियस पर एन 2 की एक कोमल धारा के तहत वाष्पित हो जाएं, और आगे के एलसी / एमएस विश्लेषण के लिए मेथनॉल के 90 μL में पुनर्गठित करें। -20 °C या -80 °C पर स्टोर करें या अगले चरण पर आगे बढ़ें।
      3. पीएल विश्लेषण के लिए, लिपिड निकालने (4.1.2.2) के एक एलीकोट में 10% पानी जोड़ें।
      4. ईसीबी विश्लेषण के लिए, लिपिड निकालने के एक एलीकोट में 10% पानी जोड़ें (4.1.4.3 देखें), सूखापन के लिए वाष्पित हो जाएं, और 50% एसीएन / एच 2 ओ (1: 1; वी / वी) में पुनर्गठित करें।
    5. ऊतक के नमूनों से आरएनए और लिपिड (पीएल और ईसीबी का सह-निष्कर्षण) का दोहरा निष्कर्षण करें।
      सावधानी: आरएनए गिरावट से बचने के लिए आरएनए-मुक्त स्थितियों के तहत काम करना सुनिश्चित करें।
      1. पिघलना ऊतक पाउडर एलीकोट या मस्तिष्क के गुच्छे (4 डिग्री सेल्सियस पर) और 5 μM THL / URB597, 10 μg / mL BHT, और 1% β-mercaptoethanol (homogenization बफर की अंतिम मात्रा के प्रतिशत के लिए, चरण 4.1 देखें) के साथ 200 μL क्लोरोफॉर्म के 200 μL के साथ जमे हुए मस्तिष्क घूंसे और सिरेमिक मोतियों वाले निष्कर्षण ट्यूबों के लिए जोड़ें।
      2. PLs और eCB सह-निष्कर्षण के लिए आंतरिक मानक मिश्रण के 10 μL के साथ स्पाइक नमूने (चरण 4.1.3 देखें) और ऊतक homogenizer (उच्च गति, 20 s) के माध्यम से homogenize।
      3. चरण पृथक्करण को सक्षम करने के लिए पूर्ण गति और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए नए सेंट्रीफ्यूज ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज में लिसेट को स्थानांतरित करें।
      4. पुनर्प्राप्त करें और मानक आरएनए निष्कर्षण प्रक्रिया किट (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके आरएनए निष्कर्षण के लिए ऊपरी चरण का उपयोग करें। RNase मुक्त पानी के 50 μL की कुल मात्रा में Elute RNA और -80 °C पर स्टोर।
        नोट:: चरण 4.1.5.4 पर नमूना उपयुक्त विधियों और इंस्ट्रूमेंटेशन का उपयोग कर RNA अनुक्रमण और qPCR दोनों के लिए amenable है।
      5. लिपिड निष्कर्षण के लिए निचले क्लोरोफॉर्म युक्त चरण का उपयोग करें। MTBE / मेथनॉल (10: 3; v / v) के 800 μL और 0.1% फॉर्मिक एसिड के 200 μL और 4 °C पर 45 मिनट के लिए भंवर जोड़ें। ऊपरी कार्बनिक चरण को पुनर्प्राप्त करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर N2 की एक कोमल धारा के तहत वाष्पित करें।
      6. आगे एलसी / एमएस विश्लेषण के लिए मेथनॉल के 90 μL में पुनर्गठित। -20 °C या -80 °C पर स्टोर करें या चरण 5 पर आगे बढ़ें।
      7. लिपिड निकालने के एक एलीकोट में 10% H2O जोड़ें (ऊपर चरण 4.1.5.6 देखें) और PLs विश्लेषण के लिए LC / MS में 10 μL इंजेक्ट करें। आगे के लिए eCB विश्लेषण चरण 5.7 के साथ आगे बढ़ें।
      8. निकालने का एक एलीकोट लें (ऊपर दिए गए चरण 4.1.5.6 देखें) एसीएन / एच 2 ओ (1: 1; वी / वी) में सूखापन और पुनर्गठन के लिए वाष्पित करें। eCB विश्लेषण के लिए LC/MS इंजेक्शन के लिए 20 μL का उपयोग करें (चरण 4.3.5 के अनुरूप)।

5. एलसी / एमआरएम गुणात्मक और मात्रात्मक प्रोफाइलिंग

  1. एलसी विलायक सिस्टम, अंशांकन समाधान, और गुणवत्ता नियंत्रण नमूने तैयार करें।
    1. PLs के लिए, मोबाइल चरण A तैयार करें: मेथनॉल / पानी (1: 1; v / v) जिसमें 7.5 mM अमोनियम फॉर्मेट और 0.1% TEA होता है। मोबाइल चरण बी तैयार करें: मेथनॉल / आइसोप्रोपेनॉल (2: 8; वी / वी) जिसमें 7.5 एमएम अमोनियम फॉर्मेट और 0.1% टीईए होता है। एलसी बोतलों में सॉल्वैंट्स स्टोर करें।
    2. ईसीबी और ईआईसी पृथक्करण के लिए, निम्नलिखित एलसी-सॉल्वैंट्स तैयार करें: मोबाइल चरण ए के रूप में 0.1% फॉर्मिक एसिड, और 100% एसीएन जिसमें मोबाइल चरण बी के रूप में 0.1% फॉर्मिक एसिड होता है।
    3. अंशांकन मानकों और आंतरिक मानकों (तालिका 3) का उपयोग करके गुणवत्ता नियंत्रण एक equimolar या उपयोगकर्ता-परिभाषित एकाग्रता में तैयार करें।
    4. सात एकाग्रता बिंदुओं के साथ अंशांकन घटता तैयार करें। अंशांकन वक्र समाधान में स्पाइक करने के लिए और विश्लेषण किए जाने वाले नमूनों में एक ही आंतरिक मानक बैच का उपयोग करें।
  2. गुणात्मक और मात्रात्मक लिपिड प्रोफाइलिंग के लिए एलसी-एमआरएम विधि का उपयोग करें।
    1. वाणिज्यिक सॉफ़्टवेयर (जैसे, विश्लेषक) में बिल्ड अधिग्रहण विधि टैब खोलें और ध्रुवीयता स्विचिंग के साथ LC/MRM मोड का चयन करें. विधि में सेट करें आयन संक्रमण (जैसा कि तालिका 3 में दिया गया है) मात्रात्मक प्रोफाइलिंग के लिए। 50 ms करने के लिए निपटान समय सेट करें।
    2. PLs प्रोफाइलिंग के लिए, निम्नलिखित आयन स्रोत पैरामीटर सेट करें: पर्दा गैस = 40 साई; स्रोत हीटर तापमान = 550 डिग्री सेल्सियस; आयन स्प्रे वोल्टेज = -4,500 V नकारात्मक आयन मोड में और = +5,200 V सकारात्मक आयन मोड में।
    3. eCBs और eiCs के सह-विश्लेषण के लिए, निम्नलिखित पैरामीटर सेट करें: पर्दा गैस = 40 साई; स्रोत हीटर तापमान = 550 डिग्री सेल्सियस; आयन स्प्रे वोल्टेज = -4,500 V नकारात्मक आयन मोड में और = +4,500 V धनात्मक आयन मोड में।
    4. PL विश्लेषण के लिए, स्तंभ हीटिंग को 45 °C और प्रवाह दर को 200 μL/min पर सेट करें और निम्न ग्रेडिएंट सेट करें: min 0 = 40% B; न्यूनतम 3 = 40% B; न्यूनतम 42 = 90% B; न्यूनतम 43 = 99% B; min 50 = 99% B, और min 52 = 40% B. इंजेक्शन की मात्रा को 10 μL पर सेट करें।
    5. eCBs और eiCs विश्लेषण के लिए, कमरे के तापमान पर स्तंभ तापमान सेट करें और निम्नलिखित ग्रेडिएंट सेट करें: न्यूनतम 0 = 20% B; न्यूनतम 1 = 20% B; min 5 = 50% B, min 12 = 50% B; न्यूनतम 13 = 90% B, न्यूनतम 17 = 90% B; न्यूनतम 17.5 = 20% B; न्यूनतम 20 = 20% B. इंजेक्शन की मात्रा को 20 μL पर सेट करें।
      नोट: MRM की स्थिति वाद्य प्लेटफार्मों के बीच भिन्न हो सकती है, इसलिए विखंडन और MRM स्थितियों को प्रयोगात्मक रूप से अनुमान लगाया जाना चाहिए और अधिकतम संवेदनशीलता और चयनात्मकता प्राप्त करने के लिए आवश्यक होने पर आयनीकरण पैरामीटर का परीक्षण और समायोजित किया जाना चाहिए।
  3. बैच विश्लेषण निष्पादित करें.
    1. बिल्ड अधिग्रहण बैच खोलें और नमूना विवरण के लिए आवश्यक पैरामीटर भरें, ऑटोसैम्पलर के नमूना रैक में स्थान, और अधिग्रहण विधि (चरण 5.2 के रूप में सेट करें)।
    2. हमेशा विश्लेषण की शुरुआत और अंत में और बैच के भीतर गुणवत्ता नियंत्रण शामिल करें। प्रत्येक 25-30 नमूनों के बाद, बैच के भीतर कम से कम तीन अंशांकन वक्र शामिल करें और प्रत्येक गुणवत्ता नियंत्रण नमूने, अंशांकन वक्र और नमूना बैच के अंत में पसंद के विलायक के साथ एक धोने का कदम शामिल करें।
    3. एलसी / एमएस शीशियों में चरण 4 पर प्राप्त किए गए स्थानांतरण नमूने। बैच में परिभाषित स्थिति के अनुसार एलसी autosampler के लोडिंग रैक में नमूनों को रखें और एलसी autosampler में नमूना रैक लोड करें।
    4. बैच सबमिट करें और कतार विश्लेषण प्रारंभ करें.
  4. लिपिड परिमाणीकरण
    1. वाणिज्यिक सॉफ़्टवेयर (उदाहरण के लिए, विश्लेषक) और eCBs और eiCs परिमाणीकरण और वाणिज्यिक सॉफ़्टवेयर (जैसे, Multiquant) के लिए PLs परिमाणीकरण के लिए एम्बेडेड परिमाणीकरण मॉड्यूल का उपयोग करें।
      नोट: दूसरे सॉफ़्टवेयर का उपयोग eCBs और eiCs के लिए भी किया जा सकता है, खासकर जब एक आंतरिक मानक का उपयोग कई analytes के परिमाणीकरण के लिए किया जाता है।
    2. खोलें निर्माण परिमाणीकरण विधि और analytes, आंतरिक मानकों, MRM संक्रमण के लिए मापदंडों में भरें, और analytes के लिए आंतरिक मानकों को निर्धारित करने के लिए मात्रा (तालिका 3). न्यूनतम चोटी की ऊंचाई को 500 सीपीएस पर सेट करें।
    3. लिपिड पहचान असाइनमेंट और बाद के परिमाणीकरण के लिए निम्नलिखित मानदंडों या संयोजन का उपयोग करें6: अंशांकन मानकों के साथ लिपिड अंतर्जात analytes के प्रतिधारण समय मिलान, और / या deuterated आंतरिक मानकों, जहां उपलब्ध हो; लिपिड एनालिट्स के दिए गए एम / जेड के लिए सकारात्मक और नकारात्मक आयन मोड विखंडन द्वारा मिलान करने वाला टुकड़ा आयन जिसके लिए कोई मानक प्रदान नहीं किए जाते हैं; आइसोमेरिक और / या आइसोबेरिक संरचनाओं को विच्छेदित करने के लिए इसी तरह से नियोजित एलसी शर्तों के तहत लिपिड के साहित्य-अनुमानित क्षालन व्यवहार; और, जहां उपलब्ध हो, उच्च रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ एलसी / एमएस और एमएस / एमएस विश्लेषण, लक्षित विश्लेषण (एलसी / एमआरएम का उपयोग करके) के लिए समान एलसी स्थितियों का उपयोग करके, ब्याज के अंतर्जात लिपिड की पहचान और क्षालन व्यवहार की सटीक पहचान करने के लिए 18,19।
    4. बैच विश्लेषण के सत्यापन के लिए, निम्नलिखित मानदंडों का उपयोग करें: परिमाणीकरण की सटीकता ≤ ±20%; प्रतिगमन गुणांक ≥0.97 (आदर्श रूप से ≥0.99)।
      नोट: लक्ष्य अणुओं के एक विश्वसनीय, पुन: प्रस्तुत करने योग्य विश्लेषण सुनिश्चित करने के लिए bioanalytical विधि के विकास और सत्यापन के लिए दिशानिर्देशों का पालन करें।

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Representative Results

वर्णित प्रोटोकॉल के सेट को एक उद्देश्य-विशिष्ट फैशन में विभिन्न स्तरों पर जोड़ा जा सकता है, जैसे कि पशु मॉडल की पसंद, नमूनाकरण का मार्ग, निष्कर्षण और प्रोफाइलिंग की विधि (चित्रा 1)।

एक तीव्र मिर्गी जब्ती राज्य के एक समय के दौरान मस्तिष्क और परिधि में लिपिड स्तर के परिवर्तनों को निर्धारित करने के लिए और पीईए के संभावित एंटीएपिलेप्टिक प्रभाव 13 और मस्तिष्क और परिधि में लिपिडोम परिवर्तनों पर इसके प्रभाव को उजागर करने के लिए, तीन प्रयोगात्मक पशु समूहों को वाहन के साथ इलाज किया गया था, केए तीव्र मिर्गी को प्रेरित करने के लिए, और पीईए एक एंटीएपिलेप्टिक दवा उम्मीदवार के रूप में। पीईए को केए-इंजेक्शन से पहले आई.पी. के माध्यम से प्रशासित किया गया था (उदाहरण के लिए, तीव्र उपचार के लिए एक एकल पीईए इंजेक्शन और सबक्रोनिक उपचार के लिए दो पीईए इंजेक्शन के साथ)। उपचार के बाद 5 दिनों में कई आणविक विश्लेषण और / या इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री स्टेनिंग के उद्देश्य से, जानवरों के प्रयोगों को आवश्यकतानुसार दोहराया गया था (चित्रा 2)।

तीव्र मिर्गी के दौरे के केए-प्रेरण से अधिकतम जब्ती तीव्रता 1 एच पोस्ट-इंजेक्शन 15 (चित्रा 3) होती है। अधिकतम जब्ती तीव्रता की स्थिति में मस्तिष्क और परिधीय लिपिड स्तर के परिवर्तनों को उजागर करने के लिए, चूहों को केए-इंजेक्शन के बाद 1 घंटे में बलिदान किया गया था, इसके बाद प्लाज्मा, मस्तिष्क और परिधीय अंग नमूने। जमे हुए दिमाग को छह मस्तिष्क क्षेत्रों में विच्छेदित किया गया था (चरण 3.1 देखें)। मस्तिष्क क्षेत्रों और परिधीय अंग (हृदय और फेफड़े) ऊतकों को समरूप ऊतक के नमूने प्राप्त करने के लिए pulverized किया गया था और बाद में eCBs और eiCs (चित्रा 4A और चरण 4.1.1) और PLs और eCBs (चित्रा 4B और चरण 4.1.3) के दो लिपिडोमिक प्रोफाइलिंग के लिए एलीकोट किया गया था।

दोहरी निष्कर्षण प्रोटोकॉल (चरण 4.1.5 देखें) को विभिन्न क्षेत्रों में मस्तिष्क के घूंसे से प्रोफाइलिंग के माध्यम से एक उच्च स्थानिक रिज़ॉल्यूशन पर PLs / eCBs और RNA करने के लिए लागू किया गया था: हाइपोथैलेमस (HYP), basolateral amygdala (BLA) और वेंट्रल (vHC) और पृष्ठीय (dHC) हिप्पोकैम्पस (चित्रा 5)। घूंसे का नमूना लिया गया था (चरण 3.2 देखें) केए-प्रेरित मिर्गी के चूहों से और 1 ज पोस्ट-केए इंजेक्शन (चित्रा 2) पर अधिकतम जब्ती राज्य में चूहों को नियंत्रित करता है।

न्यूरोडीजेनेरेशन सीमा का आकलन करने के लिए और मिर्गी के साथ न्यूरोडीजेनेरेशन सीमा तक लिपिड परिवर्तनों का वर्णन करने के लिए और पीईए के साथ नए मिर्गी-उपचार पर, इम्यूनोहिस्टोकेमिकल डबल स्टेनिंग मस्तिष्क वर्गों पर किया गया था (चरण 1.3 देखें) 5 दिनों के बाद केए-प्रेरित मिर्गी के दौरे (चित्रा 2) के बिना चूहों में सबक्रोनिक पीईए उपचार (मध्य), सबक्रोनिक पीईए उपचार (दाएं) के साथ, और खारा-इंजेक्टेड चूहों (बाएं) में (चित्रा 6) ). केए-प्रेरित स्थिति मिर्गी (एसई) ने न्यूएन सिग्नल के बड़े पैमाने पर नुकसान का कारण बना, मुख्य रूप से हिप्पोकैम्पस के सीए 1, सीए 3 और हिलस क्षेत्र में, नियंत्रण की तुलना में एपोप्टोटिक घटनाओं के साथ-साथ -3 (CASP3) सिग्नल (चित्रा 6, मध्य छवि) द्वारा इंगित एपोप्टोटिक घटनाओं के साथ (चित्रा 6, बाईं छवि)। Subchronic PEA-उपचार (सही छवि) विशेष रूप से संरक्षित न्यूरोनल नाभिक प्रोटीन (NeuN) संकेत, जबकि (CASP3) संकेत मुश्किल से पता लगाने योग्य है।

KA- और SAL इंजेक्शन समाधान।
KA इंजेक्शन समाधान (8 मिलीलीटर अंतिम मात्रा):
1. 15 mL ट्यूब में 24 मिलीग्राम KA वजन (सावधानी: glothes और मुखौटा पहनें)
2. 10 मिनट के लिए 8 एमएल खारा और भंवर जोड़ें
3. intermdediate भंडारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें
4. कमरे के तापमान और इंजेक्शन से पहले भंवर के लिए शर्त
वाहन 1 इंजेक्शन समाधान (8 मिलीलीटर अंतिम मात्रा):
चरण 1 छोड़ें और चरण 2-4 के साथ आगे बढ़ें

तालिका 1: जब्ती-उत्प्रेरण दवा और वाहन 1 आवेदन की तैयारी। 30 मिलीग्राम / किग्रा की अंतिम एकाग्रता में 24 इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन (10 एमएल / किलोग्राम) के लिए कैनिक एसिड (केए) इंजेक्शन समाधान तैयार करने के लिए कदम और संबंधित वाहन इंजेक्शन समाधान (वाहन 1)1।

पीईए- और एसएएल / डीएमएसओ / क्रेमोफोर (18: 2: 1, (वी / वी / वी)) इंजेक्शन समाधान।
पीईए इंजेक्शन समाधान (8 एमएल अंतिम मात्रा):
1. 15 mL ट्यूब में 32 मिलीग्राम PEA वजन
2. 10 मिनट के लिए 0.4 mL DMSO और भंवर जोड़ें
3. 5 मिनट के लिए 3.4 mL SAL और भंवर जोड़ें
4. 36 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए Sonicate मिश्रण
5. 5 मिनट के लिए 0.4 mL क्रेमोफोर और भंवर जोड़ें
6. 36 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए Sonicate और 3.4 mL SAL जोड़ें
7. 30 सेकंड के लिए भंवर और 36 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए sonicate
8. इंजेक्शन से पहले शेकर और भंवर में कम गति पर 36 डिग्री सेल्सियस पर समाधान रखें
वाहन 2 इंजेक्शन समाधान (8 मिलीलीटर अंतिम मात्रा):
चरण 1 छोड़ें और चरण 2-8 के साथ आगे बढ़ें

तालिका 2: एंटीएपिलेप्टिक दवा और वाहन 2 आवेदन की तैयारी। 40 मिलीग्राम / किग्रा की अंतिम एकाग्रता में 24 इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन (10 एमएल / किग्रा) के लिए पाल्मिटोइलेथेनोलामाइड (पीईए) इंजेक्शन समाधान तैयार करने के लिए उदाहरण दिए गए कदम और संबंधित वाहन इंजेक्शन समाधान (वाहन 2)1।

धनात्मक आयन मोड
चयनित अंशांकन मानक PLs इसी आंतरिक मानक
विश्लेषक अग्रदूत आयन उत्पाद आयन m/z विश्लेषक अग्रदूत आयन उत्पाद आयन m/z
नाम m/z नाम m/z
AEA 348.3 62.1 AEA-d4 352.3 66.1
2-AG 379.1 287.2 2-AG-d5 384.2 287.2
OEA 326.2 62.1 OEA-d2 328.2 62.1
मटर 300.2 62.1 PEA-d4 304.2 62.1
पीसी 16:0/18:1 760.59 184.07 पीसी 17:0/14:1 718.54 184.07
पीसी 18:2_20:4 806.57 184.07
पीसी 18:0_20:4 810.6 184.07
LPC 18:0 524.37 184.07 LPC 17:0 510.36 184.07
LPC 20:4 544.34 184.07
SM d18:1/18:0 731.61 184.07 SM d18:1/12:0 647.51 184.07
ऋणात्मक आयन विधा
चयनित अंशांकन मानक PLs इसी आंतरिक मानक
विश्लेषक अग्रदूत आयन m/z उत्पाद आयन m/z विश्लेषक अग्रदूत आयन उत्पाद आयन m/z
नाम नाम m/z
AA 303.05 259.1 AA-d8 311.04 267
5(S)-HETE 319.48 115 5(S)-HETE-d8 327.48 116
8(S)-HETE 319.48 155 12(S)-HETE-d8 327.48 184
12(S)-HETE 319.48 179
15(S)-HETE 319.48 219
19(S)-HETE 319.48 231
20-HETE 319.48 289 20-HETE-d6 325.48 295
LxA4 351.5 115.2 LxA4-d5 356.5 115
PGF2 α 353.48 309.2 PGF2 α-d4 357.5 313.3
TxB2 369 169 TxB2-d4 373 173
PGE2 351.47 315.3 PGE2-d9 360.25 324.3
PGD2 351.47 315.3 PGD2-d4 355.25 319.3
11π-PGF2 α 353.24 193
RvD1 375.22 215.1 RvD1-d5 380.22 180.2
पीई 16:0/18:1 716.52 281.25 पीई 17:0/14:1 674.48 225.19
PE 38:4 766.54 303.23
पीई 40:6 790.54 303.23
PE 40:4 794.57 303.23
PA 16:0/18:1 673.48 255.23 PA 17:0/14:1 631.43 269.25
LPA 16:0 409.24 153 LPA 17:0 423.25 153
LPA 20:4 457.24 153
LPI 20:4 619.29 303.23
पीजी 16:0/18:1 747.52 281.25 PG 17:0/14:1 705.47 225.19
PG 16:1_20:4 767.49 303.23
PG 18:1_20:4 795.52 303.23
PI 16:0/18:1 835.53 281.25 PI 17:0/14:1 793.49 269.25
PS 16:0/18:1 760.51 255.23 PS 17:0/14:1 718.47 269.25
PS 36:4 782.49 303.23
PS 38:4 810.53 303.23
PI 16:0/18:1 835.53 281.25 PI 17:0/14:1 793.49 269.25
PI 36:4 857.52 303.23
PI 38:4 885.55 303.23
C1P d18:1/16:0 616.47 78.9 C1P d18:1/12:0 560.41 78.9
S1P d18:1 378.24 78.9 S1P d17:1 364.23 78.9

तालिका 3: लक्षित लिपिडोमिक्स विश्लेषण के लिए लिपिड मानक और एमआरएम संक्रमण। तालिका सामग्री मूल रूप से लर्नर एट अल.2 में प्रकाशित की गई थी

Figure 1
चित्र 1: वर्कफ़्लो मॉड्यूल का ओवरव्यू। अध्ययन के उद्देश्य और नमूने के विभिन्न मार्गों के आधार पर, निष्कर्षण और प्रोफाइलिंग को अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण परिणाम को सक्षम करने के लिए जोड़ा जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: चूहों में तीव्र कैनिक एसिड (केए) -प्रेरित मिर्गी जब्ती मॉडल का प्रयोगात्मक डिजाइन। चूहों को या तो 1) खारा (10 एमएल / किग्रा आईपी) के साथ इलाज किया जाता है; 2) KA (30 मिलीग्राम / किग्रा आई.पी.); और / या 3) (उप) संभावित एंटीएपिलेप्टिक यौगिक Palmitoylethanolamide (PEA) के साथ क्रोनिक रूप से pretreated (1−2x 40 मिलीग्राम / किग्रा i.p.) है। प्रति समूह चौबीस चूहों को ऊपर के रूप में माना जाता था और जब्ती तीव्रता का मूल्यांकन करने के लिए व्यवहार को स्कोर किया गया था। मस्तिष्क, परिधीय अंगों और प्लाज्मा में तीव्र मिर्गी के दौरे की स्थिति के एक समय के दौरान लिपिड स्तर में परिवर्तन को निर्धारित करने के लिए प्रति समूह छह चूहों को चार अलग-अलग टाइमपॉइंट्स (T1-T4) में से प्रत्येक पर बलिदान किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: तीव्र कैनिक एसिड (केए) के एक समय के पाठ्यक्रम पर व्यवहार स्कोरिंग-प्रेरित मिर्गी बनाम नियंत्रण। केए-जब्ती प्रेरण (एन = 24) या खारा इंजेक्शन (एन = 24) के बाद 180 मिनट के समय के दौरान जब्ती तीव्रता का आकलन औसत व्यवहार स्कोर के रूप में दिया गया है। वाहन 1 और वाहन 2 इंजेक्ट किए गए समूहों के बीच कोई अंतर नहीं पाया गया। त्रुटि सलाखों = SEM. एनोवा दोहराया माप माप के समय बिंदुओं और परीक्षण समूहों के बीच महत्वपूर्ण बातचीत उत्पन्न, व्यवहार स्कोर पर KA उपचार के महत्वपूर्ण प्रभाव ों का संकेत. KA-उपचारित चूहों की जब्ती तीव्रता मूल रूप से पोस्ट एट अल.13 में प्रकाशित की गई थीकृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: तीव्र मिर्गी जब्ती राज्य में मस्तिष्क और परिधीय ऊतक लिपिड का स्तर। लिपिड स्तर परिवर्तन छह मस्तिष्क क्षेत्रों (एन = 9) में अधिकतम जब्ती तीव्रता (जैसे, 1 ज पोस्ट-केए इंजेक्शन) पर एसईएम ± के औसत मूल्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है: सेरेब्रल कॉर्टेक्स (सीसीटीएक्स), स्ट्रिएटम (एसटीआर), थैलेमिक क्षेत्र (टीएचएल), हिप्पोकैम्पस (एचसी), हाइपोथैलेमस (हाइप), सेरिबैलम (सीईआर), साथ ही केए-प्रेरित मिर्गी चूहों (ऊपरी मूल्य) और नियंत्रण (कम मूल्य) में हृदय और फेफड़ों के ऊतक। ऊतकों में बेसल लिपिड के स्तर को ग्रे में दर्शाया गया है। PLs, 2-AG, और AA के मान nmol/g में दिए गए हैं और PMOL/g में NAEs, eiCs और AEA के लिए मान क्रमशः दिए गए हैं। सभी लिपिड स्तर ऊतक वजन के लिए सामान्यीकृत कर रहे हैं। विशिष्ट आणविक परिवर्तनों को उजागर करने के लिए, केए-उपचारित चूहों के लिपिड स्तरों को एक गर्मी मानचित्र में खारा-इंजेक्टेड (केए / साल) के प्रतिशत के रूप में दर्शाया जाता है, जो नियंत्रण की तुलना में तीव्र जब्ती तीव्रता पर कम मूल्यों को प्रदर्शित करता है, क्रमशः हल्के नीले रंग में दर्शाया गया है और लाल रंग में नियंत्रण की तुलना में बढ़े हुए स्तरों को दर्शाया गया है। उन्हें पी मान <0.05 पर महत्वपूर्ण माना जाता है। ये डेटा मूल रूप से लर्नर एट अल.2प्लेज़ में प्रकाशित किए गए थे, इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: माउस मस्तिष्क घूंसे से मात्रात्मक प्रोफाइलिंग के लिए eCBs / PLs और RNA का दोहरा निष्कर्षण। (ए) चयनित पीएल और ईसीबी का मात्रात्मक वितरण: 1) हाइपोथैलेमस (HYP) का एक उप-क्षेत्र; 2) basolateral अमिगडाला (बीएलए); और 3) हिप्पोकैम्पस के वेंट्रल (वीएचसी) और पृष्ठीय (डीएचसी) उप-क्षेत्रों, केए-प्रेरित मिर्गी के दौरे के चूहों (ऊपरी मूल्य) बनाम नियंत्रण (कम मूल्य) (एन = 10) से। स्तरों को ऊतक वजन के लिए सामान्यीकृत किया जाता है (घूंसे लगभग 0.5-1.5 मिलीग्राम के अनुरूप होते हैं) और एनएमओएल / जी में व्यक्त किए जाते हैं। केवल एईए को पीएमओएल / जी में व्यक्त किया जाता है। लिपिड स्तरों को SEM के माध्य मान ± रूप में प्रस्तुत किया जाता है। प्रति छिद्रित मस्तिष्क क्षेत्र (माध्य के प्रतिशत के रूप में SEM, सभी लिपिड पर औसत के रूप में SEM) माध्य भिन्नता है: HYP = 7.83%; BLA = 7.80%; vHC = 6.28%; और dHC = 7.90%, क्रमशः। (बी) लिपिड सिग्नलिंग में शामिल अंतर्जात एंजाइमों और रिसेप्टर्स के सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर, साथ ही साथ केए-प्रेरित मिर्गी जब्ती (लाल) और नियंत्रण (हल्के भूरे) के अधीन चूहों से विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों / उपक्षेत्रों में एमआरएनए स्तर पर जांच की गई मस्तिष्क गतिविधि के लिए मार्कर। समूह के साधनों के बीच अंतर के सांख्यिकीय विश्लेषण दो-पूंछ वाले अनपेयर्ड छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके किए गए थे और पी मान <0.05 (एन = 10) पर महत्वपूर्ण माना जाता था। ये डेटा मूल रूप से लर्नर एट अल.7 में प्रकाशित किए गए थेकृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: Immunohistochemical NeuN और CASP3 डबल दाग। पांच दिन बाद केए इंजेक्शन immunohistochemistry अनुपचारित खारा इंजेक्शन चूहों (बाएं) से मस्तिष्क वर्गों पर प्रदर्शन किया गया था, subchronically पीईए pretreated चूहों (मध्य), और pretreatment (दाएं) के बिना मिर्गी चूहों. पीईए pretreatment अनुपचारित मिर्गी चूहों (एन = 3) की तुलना में neuroprotective प्रभाव से पता चलता है। इन आंकड़ों को मूल रूप से पोस्ट एट में प्रकाशित किया गया था। al.13कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहां वर्णित न्यूरोलिपिडोमिक और ट्रांसक्रिप्टोमिक पद्धति मस्तिष्क और परिधीय अंगों में उच्च और निम्न स्थानिक संकल्प पर किसी भी बीमारी या स्वस्थ विकास की जांच करने का एक व्यवहार्य साधन है। अनुकूलित प्लाज्मा नमूनाकरण और हैंडलिंग प्रक्रियाओं के कारण, प्लाज्मा लिपिडोमिक विश्लेषण भी ऊतक लिपिडोमिक्स और ट्रांसक्रिप्टोमिक्स के लिए बलिदान किए गए एक ही जानवरों से किया जा सकता है, इस प्रकार ऊतक रक्त आणविक सहसंबंध और बायोमार्कर खोज की विश्वसनीयता में सुधार होता है। तीन प्रोटोकॉल या उसके संयोजनों में से किसी एक के आवेदन द्वारा डेटा के एक व्यापक सेट का प्रावधान, न केवल एक संदर्भ (पशु मॉडल प्रयोग) के भीतर एक न्यूरोलॉजिकल बीमारी की जांच करने के लिए मूल्य का है, बल्कि प्रयोगात्मक मॉडल संदर्भों के बीच भी है। इसके अलावा, नमूनाकरण, प्रसंस्करण और आणविक विश्लेषण के मानकीकरण का एक उच्च स्तर आणविक डेटा की उच्च पुनरुत्पादकता की सुविधा प्रदान करता है, इसलिए अध्ययन और प्रयोगशालाओं के बीच और भीतर आणविक परिवर्तनों को मज़बूती से संदर्भित करता है।

हालांकि, इसे प्राप्त करने के लिए, एक प्रयोगात्मक डिजाइन का सेटअप जो परिभाषित अध्ययन उद्देश्य के लिए अधिकतम रीडआउट क्षमता प्रदान करता है, महत्वपूर्ण है। प्रयोगात्मक समूहों के बीच आणविक परिवर्तनों की विश्वसनीय तुलना प्राप्त करने के लिए, पशु परिवर्तनशीलता और लिपिड स्तरों की जैविक सीमा की भरपाई के लिए कम से कम दस जानवरों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। जब जानवरों की खरीद और / या पशु हैंडलिंग के रसद प्रतिबंधात्मक होते हैं, तो प्रति समूह कम से कम छह जानवरों का उपयोग आत्मविश्वास सांख्यिकीय विश्लेषण का खर्च उठाने के लिए अनिवार्य है। समूह के आकार की गणना को मॉडल से संबंधित मृत्यु दर के लिए क्षतिपूर्ति करने की आवश्यकता होती है (यानी, मॉडल की संभावित मृत्यु दर के बावजूद अध्ययन के लिए कम से कम छह, आदर्श रूप से दस, प्रति समूह जानवरों की आवश्यकता होती है)। एक महत्वपूर्ण आवश्यकता यह सुनिश्चित करना है कि प्रयोगात्मक समूह के प्रति आयु, लिंग-, और तनाव-मिलान वाले जानवरों को सुनिश्चित किया जाए। खोज चरण के लिए, सभी अध्ययनों के लिए प्रयोगात्मक जानवरों के लिए एक ही प्रदाता का उपयोग करना आवश्यक है और यदि संभव हो तो एक ही पशु बैच, पशु बैचों के बीच संभावित व्यवहार और आणविक फेनोटाइप मतभेदों के कारण निष्कर्षों के पूर्वाग्रह से बचने के लिए। अध्ययनों में निर्धारित आणविक और व्यवहारिक फेनोटाइप की विश्वसनीयता और पुनरुत्पादन सुनिश्चित करने के लिए, जब भी संभव हो जैविक प्रतिकृति विश्लेषण करना महत्वपूर्ण है।

एक और महत्वपूर्ण कदम पशु समूहों के साथ एक मानकीकृत, अनुसूचित प्रयोगात्मक कार्य स्थापित करना है। सर्कैडियन आणविक परिवर्तनशीलता को दरकिनार करने के लिए दिन के एक ही समय-खिड़की के भीतर जानवरों का इलाज करना आवश्यक है। दिन का समय संश्लेषण और लक्ष्य अणुओं के क्षरण पर सर्कैडियन लय के ज्ञात प्रभाव के अनुसार निर्धारित किया जाना चाहिए या सभी प्रयोगात्मक समूहों के लिए सुसंगत रखा जाना चाहिए जब सर्कैडियन लय प्रभावों के बारे में कोई जानकारी उपलब्ध नहीं होती है। इसी तरह, पशु बलि से पहले आवास और खिलाने की स्थिति को प्रयोगात्मक मॉडल में सुसंगत और सख्ती से नियंत्रित किया जाना चाहिए। यह लिपिड प्लाज्मा और ऊतक चयापचय पर पोषण के प्रभाव के कारण लिपिडोमिक प्रोफाइलिंग के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक है। चिकित्सीय या रोग-उत्प्रेरण दवाओं के प्रशासन को हमेशा नियंत्रण समूहों में वाहन प्रशासन के समानांतर किया जाना चाहिए, जिससे वाहन दवा प्रशासन के लिए उपयोग किए जाने वाले वाहन के समान होना चाहिए। अध्ययन के उद्देश्य के लिए सबसे उपयुक्त कृंतक तनाव और / या उप-उपभेदों को चुनने के लिए, दवा-आधारित उपचार रणनीतियों को समय और प्रशासन की आवृत्ति, खुराक और प्रशासन के मार्ग के संदर्भ में दवा की विशिष्टता के अनुसार किया जाना चाहिए, और साहित्य और / या पूर्व अनुभव से अनुमानित विभिन्न उपभेदों की दवाओं के लिए विशिष्ट संवेदनशीलता। एक बीमारी की एक समय पाठ्यक्रम की जांच और बड़े समूह समूहों या कई पशु समूहों को शामिल करने वाली चिकित्सा की प्रतिक्रिया उपचार, बलिदान और नमूने के संदर्भ में एक दिन में करना असंभव है। ऐसे मामलों में, पशु समूह प्रसंस्करण को लगातार दिनों में निर्धारित और किया जाना चाहिए, लेकिन दिन के समय, प्रयोगात्मक डिजाइन, प्रसंस्करण समय, शोधकर्ताओं आदि के संदर्भ में समान स्थितियों को बनाए रखना चाहिए। रासायनिक इंजेक्शन की तैयारी एक और महत्वपूर्ण कदम है। दवा- या रोग-उत्प्रेरण यौगिकों को प्रशासन से पहले और दवा विनिर्देशों के अनुसार ताजा तैयार किया जाना चाहिए। दवा के एक ही उत्पादन बैच के उपयोग की सिफारिश की जाती है ताकि सभी साथियों की तुलना की जा सके। मिर्गी प्रेरण के लिए इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले कैनिक एसिड (केए) जैसे प्राकृतिक यौगिक योगों के मामले में यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है।

विश्वसनीय लिपिडोमिक और या ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रोफाइलिंग को सक्षम करने के लिए, पशु बलिदान प्रक्रिया को 5 मिनट की समय सीमा के भीतर पशु समूहों में लगातार किया जाना चाहिए। यदि रक्त विच्छेदन के बाद एकत्र किया जाता है, तो कांच के कक्ष में आइसोफ्लुरेन की निरंतर मात्रा को बनाए रखना महत्वपूर्ण है। इस उद्देश्य के लिए, आइसोफ्लुरेन के साथ अक्सर (पांच उपयोगों के बाद) भिगोएं और आइसोफ्लुरेन का उपयोग करके संज्ञाहरण की अवधि के लिए 10 सेकंड से अधिक न हों, ताकि अतालता और धड़कन की शुरुआत से बचा जा सके और प्लाज्मा नमूने के लिए उचित रक्तचाप सुनिश्चित किया जा सके।

जैविक सामग्री के नमूने और हैंडलिंग के लिए शर्तों (उदाहरण के लिए, समय खिड़की और जैविक सामग्री के नमूने और हैंडलिंग के क्रम) का सख्ती से पालन किया जाना चाहिए और सभी समूहों के लिए समान बनाए रखा जाना चाहिए। ऊतक thawing के चर डिग्री से बचने के लिए और इसलिए लिपिड और / या mRNA स्तरों के असंगत पूर्व विवो ऊतक परिवर्तन, यह सख्ती से नियंत्रित समय और पोस्ट-नमूनाकरण के लिए तापमान की स्थिति को बनाए रखने के लिए आवश्यक है
गोदाम। ऊतक विच्छेदन या छिद्रण, और बाद में नमूना प्रसंस्करण और विश्लेषण (अनुभाग 3 और 4 देखें)। ताजा नमूना पूरे दिमाग को पहले स्नैपफ्रीजिंग के बिना एक प्रीकूल्ड धातु प्लेट (4 डिग्री सेल्सियस) पर तुरंत विच्छेदित किया जा सकता है, यदि प्रयोगात्मक पशु समूहों का आकार इन प्रक्रियाओं में से प्रत्येक के लिए यहां इंगित समय सीमा को बदलने के बिना पशु बलिदान, हटाने और विच्छेदन की अनुमति देता है। यदि प्रयोगात्मक समूहों का आकार इन प्रक्रियाओं के लिए व्यावहारिक नहीं है, तो प्रसंस्करण के लिए तुलनीय और नियंत्रित समय की अनुमति देने के लिए मस्तिष्क के स्नैप-फ्रीजिंग और बाद के विच्छेदन की सिफारिश की जाती है। यहां इंगित प्रोटोकॉल और टाइमलाइन दिशानिर्देशों का सख्ती से पालन करते समय, ताजा विच्छेदित मस्तिष्क क्षेत्रों और जमे हुए दिमाग से विच्छेदित मस्तिष्क क्षेत्रों के निष्कर्षण द्वारा प्राप्त आणविक स्तरों के बीच कोई विसंगति नहीं देखी गई थी।

सख्ती से नियंत्रित तापमान स्थितियों के तहत नमूना प्रसंस्करण के अलावा समूहों के भीतर और उनके बीच लिपिड स्तरों की पुनरुत्पादक और न्यूनतम परिवर्तनशीलता प्राप्त करने के लिए एक महत्वपूर्ण पहलू एंटीऑक्सिडेंट का प्रावधान है (अनुभाग 2 और 3 देखें)। बलिदान करने से पहले जानवरों के किसी भी तनाव कारकों (जैसे, रक्त की गंध) से बचना सर्वोपरि महत्व का है, क्योंकि न्यूरोनल गतिविधि में शामिल कई लिपिड जैसे कि ईसीबी तनाव के जवाब में तेजी से बदल सकते हैं।

लिपिड निष्कर्षण और विश्लेषण के लिए, निष्कर्षण के दिन आंतरिक मानकों, अंशांकन समाधानों और निष्कर्षण सॉल्वैंट्स को ताजा तैयार करना आवश्यक है। आंतरिक मानकों के एक ही स्रोत का उपयोग अंशांकन वक्र तैयारी और नमूना निष्कर्षण दोनों के लिए किया जाना चाहिए। इसके अलावा, नमूना निष्कर्षण, भंडारण और विश्लेषण के लिए सख्ती से नियंत्रित तापमान की स्थिति का पालन करना अणुओं के पूर्व विवो एंजाइमेटिक या रासायनिक परिवर्तनों को कम करने और नियंत्रित करने के लिए सर्वोपरि है। एलसी / एमआरएम विश्लेषण के लिए, लक्षित लिपिड के सेट को लक्ष्यों और तदनुसार आंतरिक मानकों और कैलिब्रंट्स को जोड़कर या हटाकर अध्ययन के उद्देश्य के अनुरूप बनाया जा सकता है, बशर्ते कि लिपिड के एक नए सेट के लिए अलगाव, पता लगाने और एमआरएम संक्रमण को अनुकूलित किया जाए। प्रस्तुत निष्कर्षण प्रोटोकॉल ईसीबी और ईआईसी के लिए दो एलसी / एमआरएम प्रतिकृतियों के प्रावधान की अनुमति देते हैं, जो तकनीकी विफलता के मामलों के लिए महत्वपूर्ण है या जब विश्लेषण को दोहराने का अध्ययन के लिए महत्व है। पीएल निष्कर्षण प्रोटोकॉल प्रति अर्क कम से कम 10 विश्लेषणों के लिए उपयुक्त नमूना / अर्क मात्रा प्रदान करते हैं (उदाहरण के लिए क्रमशः अग्रदूत आयन और तटस्थ हानि स्कैनिंग 2 के आधार पर कई स्कैन प्रयोग; अतिरिक्त एलसी / एमआरएम विश्लेषण; या एलसी / एमआरएम एक रन के दौरान तकनीकी विफलता की भरपाई करने के लिए प्रतिकृति)। लिपिड विश्लेषण एलसी / एमआरएम तक सीमित नहीं है; वास्तव में इन प्रोटोकॉल में से किसी के साथ प्राप्त लिपिड अर्क untargteted, उच्च अंत मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए amenable हैं। मस्तिष्क के घूंसे या असतत क्षेत्रों (3 मिलीग्राम से कम) से प्राप्त ऊतकों की मिनट की मात्रा को छोड़कर, 2-3 मिलीग्राम से बड़े क्षेत्रों के जमे हुए पल्वरीकृत ऊतकों को एलीकोट किया जा सकता है और कई निष्कर्षण मॉड्यूल के लिए उपयोग किया जा सकता है जैसा कि यहां वर्णित विश्लेषण को दोहराने के लिए और / या ऊतक पाउडर में सक्षम अन्य जांचों के लिए किया गया है।

आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले लोगों की तुलना में यहां वर्णित प्रोटोकॉल का एक सामान्य लाभ पशु संसाधनों, उपभोग्य वस्तुओं और विश्लेषण लागतों के कम खर्च पर बहु-जटिल निष्कर्षण और विश्लेषण के लिए समग्र समय-प्रभावशीलता और संवेदनशीलता में वृद्धि हुई है। महत्वपूर्ण रूप से, दोहरी लिपिड / एमआरएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल भी संबंधित उपलब्ध मानक प्रोटोकॉल की तुलना में एमआरएनए निष्कर्षण 20,21 और एमआरएनए की अखंडता की उच्च दक्षता प्रदान करता है, और साथ ही साथ लिपिड निष्कर्षण 7 की दक्षता में वृद्धि करता है। यह संभवतः लिपिड और एमआरएनए अंशों में से प्रत्येक के लिए मैट्रिक्स प्रभाव में कमी के कारण भी है जब दोहरी रूप से निकाला जाता है। इस वजह से, विधि आसानी से उच्च स्थानिक संकल्प प्रोफाइलिंग के लिए लागू होती है जैसे कि मस्तिष्क के घूंसे में।

हालांकि, प्रोटोकॉल की एक वर्तमान सीमा यह है कि भड़काऊ लिपिड दोहरे लिपिड / एमआरएनए निष्कर्षण का उपयोग करके विश्लेषण और परिमाणीकरण के लिए उपयुक्त नहीं हैं। इस प्रकार, प्रोटोकॉल आगे के शोधन के लिए विषय है। इस अंत तक, ऊतक और प्लाज्मा भड़काऊ लिपिड और एंडोकैनाबिनोइड्स को सह-निकाला और सह-विश्लेषण किया जा सकता है, जो न्यूरोइंफ्लेमेटरी प्रक्रियाओं और एंडोकैनाबिनोइड्स-मॉडुलित न्यूरोनल गतिविधि की समवर्ती रूप से जांच करने के लिए एक अनुकूलित उपकरण है (ईआईसी और ईसीबी का सह-निष्कर्षण देखें)। इस बाद के परख में फॉस्फोलिपिड्स को शामिल करना संभव होने की उम्मीद है।

न्यूरोलॉजिकल बीमारियों के लिए संभावित बहु-ओमिक दृष्टिकोणों को ध्यान में रखते हुए, लिपिड निष्कर्षण प्रोटोकॉल (यानी, ईसीबी और ईआईसी के सह-निष्कर्षण, साथ ही साथ पीएल और ईसीबी के सह-निष्कर्षण) के बाद प्राप्त प्रोटीन अंशों का प्रोटिओमिक विश्लेषण संभव होने की उम्मीद है। हालांकि, दोहरी लिपिड / एमआरएनए प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय यह अभी तक संभव नहीं है। उत्तरार्द्ध के लिए, निष्कर्षण के रासायनिक वातावरण भी इस तरह के bicinchoninic एसिड परख (बीसीए) के रूप में मानक प्रोटीन assays का उपयोग कर प्रोटीन राशि निर्धारण को रोकता है। इस सीमा को दूर करने और इन प्रोटोकॉल में प्रोटिओमिक प्रोफाइलिंग को शामिल करने में तेजी लाने के लिए आगे के विकास की योजना बनाई गई है।

यहां वर्णित मॉड्यूलर प्रोटोकॉल का उपयोग करके, तीव्र मिर्गी के दौरे (चित्रा 4) के एक पशु मॉडल में ईआईसी, ईसीसी और पीएल के मस्तिष्क क्षेत्रीय मानचित्र को प्राप्त करना संभव था। प्रोटोकॉल ने ईआईसी द्वारा भड़काऊ प्रक्रियाओं के हिप्पोकैम्पल मॉड्यूलेशन और केए-प्रेरित तीव्र दौरे के साथ इलाज किए गए और अनुपचारित चूहों में ईसीबी द्वारा न्यूरोनल गतिविधि मॉडुलन को दिखाया। फॉस्फोलिपिड, एंडोकैनाबिनोइड और एमआरएनए परिवर्तनों के उप-क्षेत्रीय मस्तिष्क स्थानीयकरण, क्रमशः तीव्र मिर्गी के दौरे के राज्यों में, भी देखे गए थे (चित्रा 5)। ये परिणाम मस्तिष्क क्षेत्रों और उप-क्षेत्रों में मिर्गी जैसे जटिल न्यूरोलॉजिकल रोगों के मॉडुलन में शामिल लिपिड के एक व्यापक स्पेक्ट्रम पर ज्ञान को आगे बढ़ाने में यहां वर्णित तरीकों के मूल्य और प्रयोज्यता को उजागर करते हैं। ये प्रोटोकॉल न्यूरोलॉजिकल रोग की जांच में सामान्य प्रयोज्यता के हैं और इससे परे हैं, जबकि सेल आबादी के लिए प्रोटोकॉल और अनुप्रयोगों का आगे का विकास जारी है।

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Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हम इस लेख को डॉ. एर्मेलिंडा लोमाज़ो को समर्पित करते हैं। इस पांडुलिपि को अंतिम रूप देने के दौरान, डॉ. एर्मेलिंडा लोमाज़ो का निधन हो गया। वह एक सार्थक अनुसंधान उद्देश्य को पूरा करने के लिए टीम के काम में विज्ञान और निस्वार्थ सगाई के लिए जुनून का अवतार है। वह हमेशा मनुष्यों की अधिक से अधिक भलाई के लिए सार्थक योगदान देने का सपना देखती थी। उसकी नेकदिल प्रकृति को विज्ञान और जीवन की ज़ोरदार सड़कों से कभी समझौता नहीं किया गया था। वह अमूल्य बनी रहेगी, और हमेशा के लिए, हमारे दिलों में।

जूलिया एम पोस्ट को जोहान्स गुटेनबर्ग विश्वविद्यालय मेन्ज़ के यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर में ट्रांसलेशनल न्यूरोसाइंस (एफटीएन) के लिए फोकस प्रोग्राम द्वारा वित्त पोषित किया गया था और वर्तमान में एसपीपी -2225 एग्जिट प्रोजेक्ट द्वारा एलबी के लिए वित्त पोषित किया गया था रायसा लर्नर को आंशिक रूप से DZHK परियोजना 81X2600250 द्वारा एलबी और लिपिडोमिक्स कोर फैसिलिटी के लिए वित्त पोषित किया गया था। इन अध्ययनों के लिए आंशिक धन लिपिडोमिक्स कोर फैसिलिटी, इंस्टीट्यूट ऑफ फिजियोलॉजिकल केमिस्ट्री और इंट्राम्यूरल फंड (एलबी के लिए) द्वारा जोहान्स गुटेनबर्ग यूनिवर्सिटी मेन्ज़ के यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर से प्रदान किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12(S)-HETE Biomol Cay10007248-25 Lipid Std
12(S)-HETE-d8 Biomol Cay334570-25 Lipid Std
1200 series LC System Agilent Instrumentation/LCMS
2100 Bioanalyzer Agilent Instrumentation/qPCR
5(S)-HETE-d8 Biomol Cay 334230 Lipid Std
ABI 7300 Real-Time PCR cycler Applied Biosystems Instrumentation/qPCR
Acetonitrile LC-MS Chroma Solv Honeywell 9814920 Solvent/LCMS
amber eppendorf tubes Eppendorf Sample Prep.
Analyst 1.6.2 Software AB SCIEX, Darmstadt Software
Analytical balance Mettler Toledo Instrumentation/Sample prep.
Arachidonic Acid-d8 MS Standard Biomol Cay-10007277 Lipid Std
Bessmann Tissue Pulverizer Spectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands) Instrumentation/Sample prep.
Bino Zeiss Microscopy
cleaved Caspase 3 antibody Cellsignaling 9661S Microscopy
Cryostat, Leica CM3050 S Leica Biosystems Instrumentation/Sample prep.
CTC HTC PAL autosampler CTC Analytics AG Instrumentation/LCMS
Dumont Curved Forceps Dumoxel #7 FST 11271-30 Surgical Tools
Dumont Forceps Super fine tip #5SF (x2) FST 11252-00 Surgical Tools
EDTA 1000 A Röhrchen Kabe Labortechnik 078001 Sample Prep.
EP-1 EconoPump BioRAD 700BR07757 Instrumentation/Sample prep.
Fine Forceps Mirror Finish FST 11412-11 Surgical Tools
Fine Iris Scissors straight sharp FST 14094-11 Surgical Tools
Fine Scissor Tungsten Carbide straight FST 14568-09 Surgical Tools
Iris Spatulae FST 10094-13 Surgical Tools
Kainic acid Abcam ab120100 Epileptic drug
Lipid View software AB SCIEX, Darmstadt Software
LPC 17:0 Avanis Polaris 855676P Lipid Std
LPC 18:0 Avanis Polaris 855775P Lipid Std
Luna 2,5µm C18(2)- HAST 100A LC column Phenomenex 00D-4446-B0 Instrumentation/LCMS
Magnifying lamp Maul GmbH Instrumentation/Sample prep.
Methanol LC-MS Chroma Solv 99.9% Honeywell 9814920 Solvent/LCMS
Motic Camara Motic Microscopy
MTBE Honeywell 34875-1L Solvent/LCMS
MultiQuant 3.0 quantitation software package AB SCIEX, Darmstadt Software
NanoDrop 2000c Spectrophotometer Thermo Scientific Instrumentation/qPCR
PA 16:0-18:1 Avanis Polaris 840857P Lipid Std
PA 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1404 Lipid Std
Palmitoyl Ethanolamide Biomol Cay90350-100 Lipid Std
Palmitoyl Ethanolamide-d5 Biomol Cay9000573-5 Lipid Std
PC 16:0-18:1 Avanis Polaris 850457P Lipid Std
PC 16:0-18:1 Avanis Polaris 850457P Lipid Std
PC 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1004 Lipid Std
PE 16:0-18:1 Avanis Polaris 850757P Lipid Std
PE 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1104 Lipid Std
PG 16:0-18:1 Avanis Polaris 840457P Lipid Std
PG 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1204 Lipid Std
PI 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1504 Lipid Std
Precelleys 24 Peqlab Instrumentation/Sample prep.
Precellys Keramik-Kügelchen Peqlab 91-pcs-ck14p Sample Prep.
Precellys Stahlkugeln 2,8mm Peqlab 91-PCS-MK28P Sample Prep.
Precellys-keramik-kit 1,4 mm VWR 91-PCS-CK14 Sample Prep.
Prostaglandin D2 Biomol Cay 12010 Lipid Std
Prostaglandin D2-d4 Biomol Cay 312010 Lipid Std
Prostaglandin E2 Biomol Cay10007211-1 Lipid Std
Prostaglandin E2-d9 Biomol Cay10581-50 Lipid Std
PS 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1304 Lipid Std
Q Trap 5500 triple-quadrupole linear ion trap MS AB SCIEX AU111609004 Instrumentation/LCMS
Real Time PCR System Appliert Biosystem Instrumentation/qPCR
Resolvin D1 Biomol Cay10012554-11 Lipid Std
Rneasy Mini Kit - RNAase-Free DNase Set (50) Qiagen 79254 Sample Prep.
Security Guard precolumn Phenomenex Instrumentation/LCMS
Shandon coverplates Thermo Fisher 72110017 Microscopy
Shandon slide rack and lid Thermo Fisher 73310017 Microscopy
SM 18:0 Avanis Polaris 860586P Lipid Std
SM d18:1/12:0 Avanis Polaris LM-2312 Lipid Std
Standard Forceps straight Smooth FST 11016-17 Surgical Tools
Surgical Scissor ToughCut Standard Pattern FST 14130-17 Surgical Tools
T3000 Thermocycler Biometra Instrumentation/qPCR
Thromboxane B2 Biomol Cay19030-5 Lipid Std
Thromboxane B2-d4 Biomol Cay319030-25 Lipid Std
Tissue Lyser II Qiagen/ Retsch 12120240804 Instrumentation/Sample prep.
Tissue Tek Sakura Finetek 4583 Microscopy
Toluidinblau Roth 0300.2 Microscopy
Vapotherm Barkey 4004734 Instrumentation/Sample prep.
Wasser LC-MS Chroma Solv VWR 9814920 Solvent/LCMS

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References

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Post, J. M., Lerner, R., Schwitter, C., Lutz, B., Lomazzo, E., Bindila, L. Lipidomics and Transcriptomics in Neurological Diseases. J. Vis. Exp. (181), e59423, doi:10.3791/59423 (2022).

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