Summary

Технология CRISPR/Cas9 в восстановлении экспрессии дистрофинов в iPSC-производных мышечных прародителях

Published: September 14, 2019
doi:

Summary

Здесь мы представляем протокол удаления Exon23 на основе Cas9 для восстановления экспрессии дистрофина в iPSC из фибробластов кожи, полученных из мышиDmdx, полученных от мыши, и непосредственно дифференцировать iPSCs в миогенные клетки-предродители (MPC) с помощью системы активации Tet-on MyoD.

Abstract

Мышечная дистрофия Дюшенна (DMD) является тяжелым прогрессирующим заболеванием мышц, вызванным мутациями в гене дистрофина, что в конечном итоге приводит к истощению клеток-прародителей мышц. Кластерные регулярно interspaced короткие палиндромные повторы / CRISPR-ассоциированных 9 (CRISPR/ Cas9) редактирование генов имеет потенциал для восстановления экспрессии гена дистрофина. Автологические индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) полученных мышечных клеток-прародителей (MPC) может пополнить стволовых / прародителей клеток бассейн, ремонт повреждений, и предотвратить дальнейшие осложнения в DMD, не вызывая иммунного ответа. В этом исследовании мы представляем сочетание CRISPR/Cas9 и неинтегрированных технологий iPSC для получения мышечных прародителей с восстановленным выражением белка дистрофина. Вкратце, мы используем неинтегрируя вектор Sendai для того чтобы установить линию iPSC от дермальных fibroblasts мышейMdx Dmd. Затем мы используем стратегию удаления CRISPR/Cas9 для восстановления экспрессии дисстрофинов через негомологический конец соединения рерамбированный ген дистрофина. После проверки PCR exon23 истощения в трех колониях из 94 выбрали iPSC колоний, мы дифференцировать iPSC в MPC по доксициклин (Dox) индуцированной выражение MyoD, ключевой фактор транскрипции играет значительную роль в регулировании дифференциации мышц. Наши результаты показывают возможность использования стратегии удаления CRISPR/Cas9 для восстановления экспрессии дистрофина в IPC-производных MPC, который имеет значительный потенциал для разработки будущих методов лечения DMD.

Introduction

Мышечная дистрофия Дюшенна (DMD) является одной из наиболее распространенных мышечных дистрофий и характеризуется отсутствием дистрофина, затрагивающих 1 из примерно 5000 новорожденных мальчиков во всем мире1. Потеря функции гена дистрофина приводит к структурным мышечным дефектам, приводяк к прогрессирующей дегенерации миофиберд1,2. Рекомбинантный адено-ассоциированный вирус (rAAV)-опосредованная система генной терапии была протестирована для восстановления экспрессии дистрофина и улучшения функции мышц, таких как замена генов с помощью микро-дистрофинов (з-Дис). Тем не менее, подход rAAV требует повторных инъекций для поддержания экспрессии функционального белка3,4. Поэтому нам нужна стратегия, которая может обеспечить эффективное и постоянное восстановление экспрессии генов дистрофинов у пациентов с DMD. Мышь Dmdmdx, модель мыши для DMD, имеет мутацию точки в экзоне 23 гена дистрофина, который вводит преждевременное прекращение кодона и приводит к нефункциональному усеченного белка, не имеющего C-терминального дистрогликанового связующего домена. Недавние исследования показали использование технологии CRISPR/Cas9 для восстановления экспрессии генов дистрофина путем точной коррекции генов или удаления мутантов экзона у малых и крупных животных5,6,7. Long et al.8 сообщили о методе коррекции мутации гена дистрофинов в зародыше мыши Dmdmdx с помощью гомологического ремонта (HDR) на основе редактирования генома CRISPR/Cas9. El Refaey et al.9 сообщили, что RAAV может эффективно акцизного мутанта экзона 23 у дистрофических мышей. В этих исследованиях, gRNAs были разработаны в интронах 20 и 23, чтобы вызвать двухцепочечные разрывы ДНК, которые частично восстановили экспрессию дистрофина после восстановления ДНК через негомологический конец соединения (NHEJ). Еще более захватывающим, Amoasii et al.10 недавно сообщили об эффективности и осуществимости редактирования генов rAAV CRISPR в восстановлении экспрессии дистрофина в собачьих моделях, что является важным шагом в будущем клиническом применении.

DMD также вызывает нарушения стволовых клеток11. Для повреждения мышц, жилые стволовые клетки мышц пополнить умирающих мышечных клеток после дифференциации мышц. Однако последовательные циклы травм и ремонта приводят к сокращению теломер в мышечных стволовых клетках12,а преждевременное истощение пулов стволовых клеток13,14. Таким образом, сочетание аутологичной терапии стволовыми клетками с редактированием генома для восстановления экспрессии дистрофина может быть практическим подходом для лечения ДМД. Технология CRISPR/Cas9 предоставляет возможность генерации аутологичной генетически исправленной пурипотентной пурипотентной реакции (iPSC) для функциональной регенерации мышц и предотвращения дальнейших осложнений DMD, не вызывая иммунного отторжения. Тем не менее, iPSCs имеют риск образования опухоли, которые могут быть смягчены дифференциации iPSC в миогенных клеток-прародителей.

В этом протоколе мы описываем использование неинтегрирующего вируса Сендай для перепрограммирования дермальных фибробластов мышей Dmdmdx в iPSCs, а затем восстановления экспрессии дистрофина путем удаления генома CRISPR/Cas9. После проверки удаления Exon23 в iPSC путем генотипирования, мы дифференцировали геном-исправлено iPSC в миогенных прародителей (MPC) через MyoD-индуцированной миогенной дифференциации.

Protocol

Все обработки животных и хирургические процедуры были выполнены протоколом, утвержденным Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Университета Августы (IACUC). Мышей кормили стандартной диетой и водой ad libitum. 1. Изоляция первичных фибробластов мыши от…

Representative Results

Создание фибробластов кожи Dmdmdx, полученных iPSC. Мы продемонстрировали эффективность генерации мыши iPSCs от мышей Dmdmdx, полученных фибробластом кожи, используя безинтеграционные векторы перепрограммирования. Рисунок 1A показал, что появление эмб?…

Discussion

Мышечная дистрофия Дюшенна (DMD) является разрушительным и в конечном итоге смертельным наследственным заболеванием, характеризующимся отсутствием дистрофии, что приводит к прогрессирующей атрофии мышц1,2. Наши результаты демонстрируют восстановленную …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Тан и Вайнтрауб были частично поддержаны NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.

Materials

Surgical Instruments
31-gauge needle Various 
Sharp Incision Various 
Sterile Scalpels Various 
Tweezers Various 
Fibroblast medium (for 100 mL of complete medium) Company Catalog Number Volume
2-Mercaptoethanol (55 mM) Gibco 21-985-023 0.1 mL
Antibiotic Antimycotic Slution 100x CORNING MT30004CI 1 mL
Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose SIGMA D6429 87 mL
Fetal Bovine Serum Characterized HyClone SH30396.03 10 mL
L-Glutamine solution SIGMA G7513 1 mL
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)  Gibco 11140076 1 mL
TVP solution (for 500 mL of complete solution) Company Catalog Number Volume
Chicken Serum Gibco 16110-082 5 mL
EDTA Sigma-Aldrich E6758 186 mg
Phosphat-buffered saline to 500 mL
Trypsin (2.5%) Thermo 15090046 5 mL
mES growth medium(for 500 mL of complete solution) Company Catalog Number Volume
2-Mercaptoethanol (55 mM) Gibco 21-985-023 0.5 mL
Antibiotic Antimycotic Slution 100x CORNING MT30004CI 5 mL
Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose SIGMA D6429 408.5 mL
Fetal Bovine Serum Characterized HyClone SH30396.03 75 mL
L-Glutamine solution SIGMA G7513 5 mL
Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL EMD Millipore Corp CS210511 500 μL
MEK/GS3 Inhibitor Supplement EMD Millipore Corp CS210510-500UL 500 μL
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)  Gibco 11140076 5 mL
The ES cell media should not be stored for more than 4 weeks and with inhibitors not more than 2 weeks.
mES frozen medium(for 50 mL of complete solution) Company Catalog Number Volume
Dimethyl sulfoxide (DMSO) SIGMA D2650 5 mL
Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose SIGMA D6429 24.9 mL
Fetal Bovine Serum Characterized HyClone SH30396.03 25 mL
Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL EMD Millipore Corp CS210511 50 μL
Name of Material/ Equipment Company Catalog Number RRID
0.05% Trypsin/0.53 mM EDTA CORNING 25-052-CI
4% Paraformaldehyde Thermo scientific J19943-k2
Accutase solution SIGMA A6964 Cell detachment solution
AgeI-HF NEB R3552L
Alexa488-conjugated goat-anti-mouse antibody Invitrogen A32723 AB_2633275
Alexa488-conjugated goat-anti-rabbit antibody Invitrogen A32731 AB_2633280
Alexa555-conjugated goat-anti-rabbit antibody Invitrogen A32732 AB_2633281
anti-AFP Thermo scientific RB-365-A1 AB_59574
anti-α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP CST 19245S AB_2734735
anti-Dystrophin Thermo PA5-32388 AB_2549858
anti-LIN28A (D1A1A) XP    CST 8641S AB_10997528
anti-MYH2 DSHB mAb2F7 AB_1157865
anti-Nanog-XP CST 8822S AB_11217637
anti-Oct-4A (D6C8T) CST 83932S AB_2721046
anti-Sox2 abcam ab97959 AB_2341193
anti-SSEA1(MC480)  CST 4744s AB_1264258
anti-TH (H-196) SANTA CRUZ  sc-14007 AB_671397
Alkaline Phosphatase Live Stain (500x) Thermo A14353
Blasticidin S Sigma-Aldrich 203350
BsmBI/Esp3I NEB R0580L/R0734L
Carbenicillin Millipore 205805-250MG
Collagenase IV  Worthington Biochemical Corporation LS004189
Competent Cells TakaRa 636763
CutSmart  NEB B7204S
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit Thermo A16517
DirectPCR Lysis Reagent (cell) VIAGEN BIOTECH 302-C
Dispase (1 U/mL) STEMCELL Technologies 7923
Doxycycline Hydrochloride Fisher BioReagents BP26535
EcoRI-HF NEB R3101L
Fibronectin bovine plasma SIGMA F1141
 
QIAEX II Gel Extraction Kit (500)
QIAGEN 20051
Gelatin from porcine skin, type A SIGMA G1890
HardSet Antifade Mounting Medium with DAPI Vector H-1500
Hygromycin B (50 mg/mL) Invitrogen 10687010
Ketamine HCL Injection HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH 45822
KpnI-HF NEB R3142L
lenti-CRISPRv2-blast Addgene 83480
lenti-Guide-Hygro-iRFP670 Addgene 99377
Lipofectamin 3000 Transfection Kit Invitrogen L3000015
LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2   Addgene 60625
LV-TRE-VP16 mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 Addgene 60626
Mouse on Mouse (M.O.M.) Basic Kit Vector BMK-2202
NotI-HF NEB R3189L
Opti-MEM I Reduced Serum Media ThermoFisher 31985070
Polyethylene glycol 4,000 Alfa Aesar AAA161510B
Polybrene SIGMA TR1003
Corning BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Culture Slide CORNING CB354688
PowerUp SYBR Green Master Mix ThermoFisher A25742
PrimeSTAR Max Premix TakaRa R045
Proteinase K VIAGEN BIOTECH 507-PKP
Puromycin Dihydrochloride MP Biomedicals ICN19453980
qPCR Lentivirus Titration Kit abm LV900
Quick ligation kit NEB M2200S
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) QIAGEN 27106
QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100) QIAGEN 12945
RevertAid RT Reverse Transcription Kit Thermo scientific K1691
RNAzol RT Molecular Research Center, INC RN 190
T4 DNA Ligase Reaction Buffer NEB B0202S
T4 Polynucleotide Kinase NEB M0201S
Terrific Broth Modified Fisher BioReagents BP9729-600
ViralBoost Reagent (500x) ALSTEM VB100

References

  1. Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).
  2. Batchelor, C. L., Winder, S. J. Sparks, signals and shock absorbers: how dystrophin loss causes muscular dystrophy. Trends Cell Biology. 16 (4), 198-205 (2006).
  3. Gregorevic, P., et al. Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors. Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).
  4. Bengtsson, N. E., Seto, J. T., Hall, J. K., Chamberlain, J. S., Odom, G. L. Progress and prospects of gene therapy clinical trials for the muscular dystrophies. Human Molecular Genetics. 25 (R1), R9-R17 (2016).
  5. Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351 (6271), 407-411 (2016).
  6. Long, C., et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 400-403 (2016).
  7. Nelson, C. E., et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 403-407 (2016).
  8. Long, C., et al. Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA. Science. 345 (6201), 1184-1188 (2014).
  9. El Refaey, M., et al. In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice. Circulation Research. 121 (8), 923-929 (2017).
  10. Amoasii, L., et al. Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 362 (6410), 86-91 (2018).
  11. Eisen, B., et al. Electrophysiological abnormalities in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes generated from Duchenne muscular dystrophy patients. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (3), 2125-2135 (2019).
  12. Marion, R. M., et al. Telomeres acquire embryonic stem cell characteristics in induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 4 (2), 141-154 (2009).
  13. Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
  14. Sacco, A., et al. Short telomeres and stem cell exhaustion model Duchenne muscular dystrophy in mdx/mTR mice. Cell. 143 (7), 1059-1071 (2010).
  15. Su, X., et al. Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
  16. Su, X., et al. Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 412-419 (2018).
  17. Ousterout, D. G., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy. Nature Communications. 6, 6244 (2015).
  18. Barde, I., et al. Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector. Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).
  19. Glass, K. A., et al. Tissue-engineered cartilage with inducible and tunable immunomodulatory properties. Biomaterials. 35 (22), 5921-5931 (2014).

Play Video

Cite This Article
Jin, Y., Shen, Y., Su, X., Weintraub, N., Tang, Y. CRISPR/Cas9 Technology in Restoring Dystrophin Expression in iPSC-Derived Muscle Progenitors. J. Vis. Exp. (151), e59432, doi:10.3791/59432 (2019).

View Video