इस पत्र में प्रतिरक्षा elicitors के लिए जोखिम के बाद Arabidopsis thaliana में रक्षा प्रतिक्रियाओं की मात्रा निर्धारित करने के लिए दो तरीकों का वर्णन: क्षणिक ऑक्सीडेटिव फट, और अंकुर विकास के निषेध.
पौधों रोगजनकों को अनुभव और रोग के खिलाफ की रक्षा करने के लिए एक मजबूत प्रतिरक्षा प्रणाली विकसित की है। इस पत्र में दो assays कि प्राप्त करने वाले अणुओं के साथ उपचार के बाद Arabidopsis thaliana में प्रतिरक्षा सक्रियण की ताकत को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है का वर्णन करता है. पहले प्रस्तुत तेजी से प्रेरित और गतिशील ऑक्सीडेटिव फट पर कब्जा करने के लिए एक विधि है, जो एक luminol आधारित परख का उपयोग कर नजर रखी जा सकती है. प्रस्तुत दूसरा एक तरीका है वर्णन कैसे अंकुर विकास की प्रतिरक्षा प्रेरित निषेध को मापने के लिए है. इन प्रोटोकॉल तेजी से और विश्वसनीय हैं, विशेष प्रशिक्षण या उपकरणों की आवश्यकता नहीं है, और व्यापक रूप से संयंत्र प्रतिरक्षा के आनुवंशिक आधार को समझने के लिए उपयोग किया जाता है.
रोगजनकों को देखने और उनकी रक्षा करने के लिए, पौधों ने झिल्ली-बद्ध पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स (पीआरआर) विकसित किए हैं जो माइक्रोब-संबद्ध आण्विक पैटर्न (एमएआरपी)1के रूप में जाने जाने वाली कोशिका के बाहर संरक्षित माइक्रोब ीय अणुओं का पता लगाते हैं। MAMPs की बाध्यता उनके cognate PRRs के लिए प्रोटीन kinase-मध्यस्थ प्रतिरक्षा संकेत नजारे जिसके परिणामस्वरूप व्यापक स्पेक्ट्रम रोग प्रतिरोध2. पीआरआर सक्रियण के बाद जल्द से जल्द प्रतिक्रियाओं में से एक फॉस्फोरिलेशन और अभिन्न प्लाज्मा झिल्ली के सक्रियण है श्वसन BURST OXIDASE HOMOLOG (RBOH) प्रोटीन है कि extracellular प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन को उत्प्रेरित (ROS)3 , 4. आरओएस रोग प्रतिरोध स्थापित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं ,प्रतिरक्षा संकेतन के साथ-साथ प्रत्यक्ष एंटीमाइक्रोबियल एजेंट5 का प्रचार करने के लिए माध्यमिक दूत के रूप में कार्य करते हैं . प्रतिरक्षा-प्राप्त ऑक्सीडेटिव फट के पहले अवलोकन का वर्णन phytophthora infestans inoculation6के बाद cv. Rishiri के आलू कंद का उपयोग कर के लिए किया गया था। आरओएस उत्पादन का मूल्यांकन कई पादप प्रजातियों में किया गया है जिसमें पत्ती डिस्क7, सेल निलंबन संस्कृतियों8और प्रोटोप्लास्ट6का उपयोग किया गया है . यहाँ वर्णित अरबिडोप्सिस थालियाना (अरबीडोप्सिस) की पत्ती डिस्क में पैटर्न-ट्रिगर किए गए आरओएस उत्पादन पर ाााली करने का एक सरल तरीका है.
MAMP धारणा के लिए एक प्रतिक्रिया के रूप में, सक्रिय RBOH प्रोटीन superoxide कण के उत्पादन को उत्प्रेरित (O2–), hydroxyl कण (•OH), और एकल ऑक्सीजन (1हे2) कि हाइड्रोजन पेरोक्साइड में परिवर्तित कर रहे हैं (एच2हे 2) अतिरिक्त कोशिकीय अंतरिक्ष में9. ज2व्2 को ऑक्सीकरण एजेंट हॉर्सराडिश परोक्सिडेस (एचआरपी)10की उपस्थिति में ल्यूमिनोल-आधारित केमियुमिनेसन द्वारा परिमाणित किया जा सकता है। एचआरपी एच2ओ2 को एक हाइड्रॉक्साइड आयन (ओएच)और ऑक्सीजन गैस (ओ2) पैदा करता है जो ल्यूमिनोल के साथ प्रतिक्रिया करता है जो एक अस्थिर मध्यवर्ती का उत्पादन करता है जो प्रकाश10का फोटॉन रिलीज करता है . फोटॉन उत्सर्जन सापेक्ष प्रकाश इकाइयों के रूप में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है (RLUs) एक microplate पाठक या छविक luminescence का पता लगाने में सक्षम है, जो सबसे आणविक प्रयोगशालाओं में उपकरणों के मानक टुकड़े बन गए हैं का उपयोग कर. 40-60 मिनट के अंतराल पर उत्पादित प्रकाश को मापने के द्वारा, एक क्षणिक ऑक्सीडेटिव फट के रूप में जल्दी के रूप में 2-5 मिनट के रूप में प्रकाश की प्राप्ति उपचार के बाद पता लगाया जा सकता है, 10-20 मिनट में चोटी, और $ 60 मिनट11के बाद बेसल के स्तर पर लौटने . इस समय पाठ्यक्रम के दौरान उत्पादित संचयी प्रकाश का उपयोग आरबीओडब्ल्यूई एफ प्रोटीन12के सक्रियण के अनुरूप प्रतिरक्षा शक्ति के माप के रूप में किया जा सकता है . सुविधाजनक, इस परख विशेष उपकरण या बोझिल नमूना तैयारी की आवश्यकता नहीं है.
MAMP का पता लगाने के तुरंत बाद पीकिंग, ऑक्सीडेटिव फट एक प्रारंभिक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया माना जाता है, MAPK सक्रियण और ethylene उत्पादन5के साथ. बाद में प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में ट्रांसक्रिप्शनल रीप्रोग्रामिंग,स्टोमटल क्लोजर, और कैलोज निक्षेप2,5शामिल हैं। MAMPs के लिए लंबे समय तक जोखिम लगातार ऊर्जावान रूप से लागत प्रतिरक्षा संकेत सक्रिय करता है जिसके परिणामस्वरूप पौधे के विकास में बाधा होती है, विकास और प्रतिरक्षा13के बीच व्यापार बंद होने का संकेत मिलता है। पैटर्न-ट्रिगर अंकुर विकास निषेध (SGI) व्यापक रूप से Arabidopsis में प्रतिरक्षा उत्पादन का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है और पीआरआर सहित प्रतिरक्षा संकेतन के कई प्रमुख घटकों की पहचान करने के लिए अभिन्न रहा है14,15 ,16. इसलिए, इस कागज के अतिरिक्त Arabidopsisमें पैटर्न ट्रिगर SGI के लिए एक परख प्रस्तुत करता है, जिससे अंकुर मानक मीडिया या मीडिया 8-12 दिनों के लिए एक प्रतिरक्षा elicitor के साथ पूरक युक्त बहु अच्छी तरह से प्लेटों में बड़े हो रहे हैं और फिर तौला एक विश्लेषणात्मक पैमाने का उपयोग कर.
प्रदर्शित करने के लिए कैसे ROS और SGI परख पीआरआर मध्यस्थता संकेतन की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, तीन जीनोटाइप है कि अलग प्रतिरक्षा outputs का प्रतिनिधित्व चुना गया: (1) जंगली प्रकार Arabidopsis accession कोलंबिया (कोल-0), (2) प्रमुख-नकारात्मक bak1-5 उत्परिवर्ती जिसमें बहु-कार्यात्मक पीआरआर सह-रिसेप्टर ब्रैसिनोस्टीड असंवेदनशील 1-एसोसिएटेड किने1 (BAK1) प्रतिरक्षा संकेतन में गैर-कार्यात्मक है17,18, और (3) अप्रभावी cpk28-1 उत्परिवर्ती, जो कमी है नियामक प्रोटीन कोल्हो-डिप्रेंडेंट प्रोफेन्डो किनेस 28 (CPK28) और प्रदर्शित करता है बढ़ प्रतिरक्षा ट्रिगर प्रतिक्रियाओं19,20. ROS और SGI परख एक कृत्रिम रूप से उत्पादित एल्फ18 पेप्टाइड जीवाणु दीर्घीकरण फैक्टर तू (EF-Tu) के epitope के जवाब में प्रस्तुत कर रहे हैं, PRR EF-Tu RECEPTOR (EFR)15द्वारा Arabidopsis में मान्यता प्राप्त . इन प्रोटोकॉल अन्य प्रतिरक्षा elicitors के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है जैसे जीवाणु गतिशीलता प्रोटीन flagellin14 या अंतर्जात संयंत्र Elicitor प्रोटीन (AtPeps)16, तथापि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि संयंत्र जवाबदेही के आधार पर अलग है प्राप्त करने वाला21| साथ में, ROS और SGI परख जल्दी और देर से पीआरआर मध्यस्थता प्रतिक्रियाओं के त्वरित और मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
इस कागज पर assaying पैटर्न के लिए दो तरीकों का वर्णन करता है Arabidopsisमें प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं ट्रिगर, विशेष उपकरणों के उपयोग के बिना प्रतिरक्षा उत्पादन का मूल्यांकन करने के लिए मात्रात्मक दृष्टिकोण की…
The authors have nothing to disclose.
हमारी प्रयोगशाला में काम कनाडा के प्राकृतिक संसाधन और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (NSERC) डिस्कवरी कार्यक्रम, अभिनव जॉन आर इवांस नेता कोष के लिए कनाडा फाउंडेशन, और रानी विश्वविद्यालय के माध्यम से वित्त पोषित है. केएस और आईएस मास्टर के छात्रों (सीजीएस-एम) के लिए अग्रानुक्रम ओंटारियो स्नातक छात्रवृत्ति और NSERC कनाडा स्नातक छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित हैं।
20-20-20 Fertilizer | Plant Prod | 10529 | Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth. |
4 mm Biopsy Punch | Medical Mart | 232-33-34-P | A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used. |
48-Well Sterile Plates with Lid | Sigma-Aldrich | CLS3548 | |
Analytical Scale with Draft Sheid | VWR | VWR-225AC | Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal. |
BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL) | Sartorius | 725240 | Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary. |
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) | EZ Biolab | cp7211 | Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C. |
Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
Horseradish Peroxidase | Sigma-Aldrich | P6782 | Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light. |
Luminol | Sigma-Aldrich | A8511 | Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light. |
Murisage and Skoog Basal Salts | Cedarlane Labs | MSP09-100LT | Store at 4C. |
Soil | SunGrow Horticulture | Sunshine Mix #1 | Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots. |
SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module | Molecular Devices | Must request a quote | Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays. |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-1KG | Store at room temperature. |
White Polystyrene 96-Well Plates | Fisher Scientific | 07-200-589 |