Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Real-time i Vitro overvågning af lugtstof Receptor aktivering af en lugtstof i fasen for damp

Published: April 23, 2019 doi: 10.3791/59446
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,3,5,6
1Department of Molecular Genetics and Microbiology, Duke University Medical Center, 2Department of Biotechnology and Life Science, Tokyo University of Agriculture and Technology, 3Department of Neurobiology, Duke University Medical Center, 4Department of Mechanical Systems, Engineering, Tokyo University of Agriculture and Technology, 5Institute of Global Innovation Research, Tokyo University of Agriculture and Technology, 6Duke Institute for Brain Sciences, Duke University

Summary

Fysiologisk, aktiveres lugtstof receptorer af lugtstof molekyler inhaleret i fasen for damp. Dog anvender mest in vitro-systemer flydende fase lugtstof stimulation. Vi præsenterer her, en metode, der giver mulighed for real-time in vitro-overvågning af lugtstof receptor aktivering efter lugtstof stimulation i vapor fase.

Abstract

Olfaktoriske perception begynder med samspillet mellem duftstoffer med lugtstof receptorer (eller) udtrykt af olfaktoriske sensoriske neuroner (OSN). Lugt anerkendelse følger en kombinatorisk kodning ordningen, hvor en OR kan aktiveres ved et sæt af Duftenes og én lugtstof kan aktivere en kombination af ORs. Gennem sådanne kombinatorisk kodning, kan organismer registrere og skelne mellem et utal af flygtige lugt molekyler. En lugt ved en given koncentration kan således betegnes ved en aktivering mønster af ORs, der er specifikke for hver lugt. I forstand, revner de mekanismer, som hjernen bruger til at opfatte lugt kræver forståelse lugtstof-OR interaktioner. Dette er grunden til, at Fællesskabets lugtesansen er forpligtet til at "de-orphanize" Disse receptorer. Konventionelle in vitro-systemer anvendes til at identificere lugtstof- eller interaktioner har udnyttet kvægbruget celle medier med lugtstof, som er forskellig fra den naturlige påvisning af lugte via damp Duftenes opløsning i næseslimhinden før interagere med ORs. Her, beskriver vi en ny metode, der giver mulighed for tidstro overvågning af OR aktivering via damp-fase duftstoffer. Vores metode er baseret på måling lejr frigivelse af luminescence ved hjælp af Glosensor assay. Det broer nuværende huller mellem in vivo og in vitro-metoder og danner grundlag for en biomimetiske flygtige kemiske sensor.

Introduction

Lugtesansen giver mulighed for terrestriske dyr til at interagere med deres flygtige kemiske miljø til kørsel adfærd og følelser. Fundamentalt, lugt afsløring proces begynder med den første interaktion af lugtstof molekyler med det olfaktoriske system, på niveauet af lugtstof receptorer (ORs)1. I pattedyr udtrykkes ORs individuelt i olfaktoriske sensoriske neuroner (OSNs) beliggende i Lugtepithelet2. De tilhører familien G-protein koblet receptor (GPCR) og mere præcist den rhodopsin-lignende undergruppe (også kaldet klasse A). ORs par med den stimulerende G protein Golf hvis aktivering fører til cAMP produktion efterfulgt af åbningen af cykliske nukleotid gated-kanaler og generation af handling potentialer. Det er accepteret, at en lugt percept bygger på et bestemt mønster af aktiverede ORs3,4 og derfor lugt anerkendelse følger en kombinatorisk kodning ordningen, hvor en OR kan aktiveres ved et sæt af Duftenes og én lugtstof kan aktivere en kombination af ORs. Og gennem sådanne kombinatorisk kodning, det er postuleret at organismer kan registrere og skelne mellem et utal af flygtige lugt molekyler. En af nøglerne til forståelsen af hvordan lugt opfattes er at forstå, hvordan og hvilke ORs er aktiveret af en given lugt.

I et forsøg på at belyse lugtstof- eller interaktioner, in vitro-funktionelle assays har spillet en væsentlig rolle. Identifikation af agonist lugtende ligander for sjældne ORs (OR nedtrapning orphanization) har været en meget aktiv inden for de sidste tyve år, ved hjælp af forskellige in vitro ex vivo og in vivo funktionelle assays5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17.

In vitro assay systemer er bedst egnet til den detaljerede funktionelle karakterisering af ORs, herunder identifikation af funktionelle domæner og kritisk rester af ORs, såvel som potentielle ingeniørmæssige anvendelser. Dog, yderligere udvikling af værdifulde in vitro-systemer til ORs har været en udfordring, dels på grund af vanskeligheder med dyrkningsbaserede OSNs og funktionelle udtryk af ORs i heterolog celler. Den første udfordring var at fastlægge protokoller, der er tilladt for celle overflade udtryk for funktionelle ORs i kortlægningen af lugtstof-OR interaktioner. En række uafhængige grupper har udnyttet forskellige tilgange5,6,7,8,9,10,11,12, 14,18,19,20. Et af de tidligste resultater blev foretaget af Krautwurst et al. i markeret N-terminalen af ORs med en forkortet sekvens af rhodopsin (Rho-tag) og observeret en forbedret overflade udtryk i menneskelige embryonale nyre (HEK) celler13. Ændringer til koden knyttet til OR sekvens er stadig en sti udforskes for at forbedre OR udtryk og funktionalitet19,21. Saito mfl. derefter identificeret receptor-transport protein 1 (RTP1) og RTP2, som letter OR handel. 22 en kortere version af RTP1, kaldet RTP1S, har også vist sig at være endnu mere effektiv end den oprindelige protein23. Udviklingen af en cellelinje (Hana3A), som stabilt udtrykker Golf, REEP1, RTP1 og RTP2 24, kombineret med brugen af cyklisk adenosin fra (cAMP) journalister har muliggjort identifikation af lugtstof-OR interaktioner. Den mekanisme, hvormed RTP receptorgruppen af proteiner fremmer celle overflade udtryk af ORs stadig skal fastlægges.

En advarsel af disse etablerede metoder er at de er afhængige af lugtstof stimulation i flydende fase, hvilket betyder at Duftenes pre opløses i en stimulation medium og stimulere cellerne ved at erstatte mediet. Dette er meget forskellige fra de fysiologiske tilstande hvor lugtstof molekyler nå Lugtepithelet i vapor fase og aktivere ORs ved opløsning i næseslimhinden. For at mere ligner fysiologisk relevante stimulus eksponering, Sanz et al.20 foreslås en analyse baseret på vapor stimulation ved at anvende en dråbe af lugtstof løsning at hænge under indersiden af plastfolie placeret på toppen af celle brønde. De indspillede calcium svar ved at overvåge fluorescens intensitet. Denne metode var først til at bruge air-fase lugtstof stimulation, men det tillade ikke en stor screening af OR aktivering.

Her, udviklet vi en ny metode, der muliggør real-time overvågning af in vitro-OR aktivering via damp fase lugtstof stimulation af Glosensor assay (figur 1). Denne analyse har været anvendt tidligere i forbindelse med flydende lugtstof stimulation18,19,25,26,27,28,29, 30 , 31. luminometrisk overvågning kammer er først ekvilibreres med forstøvet lugtstof før pladen læsning (figur 1A). Lugtstof molekyler er derefter solvated i bufferen, badning Hana3A celler, der udtrykker eller interesse, RTP1S og Glosensor proteiner (figur 1B). Hvis lugtstof er en agonist i regionerne, vil eller skifte til en aktiveret kropsbygning og binde Golf, aktivering adenylyl cyclase (AC) og i sidste ende medføre lejr niveauer til at stige. Denne stigende cAMP vil binder til og aktivere Glosensor proteinet til at generere luminescence katalysere luciferin. Denne luminescence registreres derefter af en luminometrisk og muliggør OR aktivering overvågning. Denne metode er af stor interesse i forbindelse med OR deorphanization som det bringer in vitro-systemer tættere på den fysiske opfattelse af lugte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Hana3A celler kultur

  1. Forberede M10 (Minimum afgørende Medium (MEM) plus 10% v/v føtal bovint serum (FBS)) og M10PSF (M10 plus 100 µg/mL penicillin-streptomycin og 1,25 µg/mL amphotericin B).
  2. Kultur celler i 10 mL af M10PSF i en 100 mm celle kultur fad i en inkubator, indstillet på 37 ° C og 5% kuldioxid (CO2).
  3. Opdele celler hver 2 dage på en 20% ratio: når 100% sammenløbet af celler (ca 1,1 x 107 celler) er observeret under et fasekontrast mikroskop, aspire medierne og cellerne vaskes forsigtigt med 10 mL af fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
  4. Opsug PBS og tilsættes 3 mL 0,05% trypsin-ethylendiamin tetraacetic acid (EDTA, 0,48 mM). Lad handling for ca 1 min, indtil cellerne tage afstand fra pladen.
  5. Der tilsættes 5 mL af M10 til at inaktivere trypsin og til sidst frigør de celler, der stadig er knyttet til pladen af pipettering op og ned.
  6. Overføre volumen (8 mL) til en 15 mL tube og centrifugeres ved 200 x g i 5 min. aspirat supernatanten og resuspend cellerne i 5 mL af M10PSF af pipettering op og ned for at bryde enhver celle masse. Undgå at skabe bobler i glasset.
  7. Der overføres 1 mL af den resuspenderede celler løsning i en ny 100 mm celle kultur parabol og tilføje 9 mL frisk M10PSF. Der inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2.

2. forberedelse af celler til Transfektion

  1. Evaluere sammenløbet, eller antallet af celler, ved at observere dem under en fase-kontrast mikroskop. Mindst 10% sammenløbet (ca 1,1 x 106 celler) er nødvendig for en plade.
  2. Opsug mediet og cellerne vaskes forsigtigt med 10 mL PBS. Opsug PBS og tilsættes 3 mL af EDTA. Lad handling for ca. 1 min. ved stuetemperatur, indtil cellerne tage afstand fra pladen.
  3. Der tilsættes 5 mL af M10 til at inaktivere trypsin og til sidst frigør de celler, der stadig er knyttet til pladen af pipettering op og ned. Overføre volumen (8 mL) til en 15 mL rør og centrifugeres ved 200 x g i 5 min.
  4. Opsug supernatanten og resuspend cellerne i 5 mL af M10PSF af pipettering op og ned for at bryde enhver celle masse. Undgå at skabe bobler i glasset.
  5. Afhængigt af antallet af plader til at være transfekteret, overføre en passende mængde af celler i et reservoir med ordentlig tilsvarende volumen af M10PSF. En 96-brønd plade skal være belagt med 1/10 af en 100% sammenflydende 100 mm parabol (ca 1,1 x 106 celler) fortyndet i M10PSF at nå frem til en samlet maengde paa 6 mL. For en 96-brønd plade starter med en 100% sammenløbet 100 mm parabol, tilsættes 500 µL fra 5 mL resuspenderet celler 5,5 mL frisk M10PSF. Bland celler og M10PSF uden at generere luftbobler.
  6. Tilsæt 50 µL af de suspenderede celler i hver brønd af 96-brønd plade ved hjælp af en multikanalpipette. Der inkuberes natten over ved 37 ° C og 5% CO2.

3. plasmid Transfektion

  1. Observere 96-brønd plade under et fasekontrast mikroskop til at forsikre en celle sammenløbet mellem 30% og 50%.
  2. Udarbejde en første Transfektion blanding, der indeholder plasmider fælles for hele pladen (RTP1S, eller og Glosensor protein, se Tabel af materialer) efter mængder i tabel 1. Bemærk, at mængden af Rho-tagged OR bør divideret med antallet af ORs, hvis flere ORs.
    Bemærk: Vi kraftigt rådgivning til at tilføje en tom vektor negativ kontrol (her Rho-pCI) og enhver positiv kontrol (OR kendte til at reagere på de testede lugtstof) til eksperiment plan.
  3. Forberede en anden Transfektion blanding indeholdende 500 µL af MEM og 20 µL af Lipofectamine 2000 reagens (gyldig for en 96-brønd plade, se Tabel af materialer). Tilføje den anden mix til den første, og forsigtigt mix af pipettering op og ned og der inkuberes i 15 min ved stuetemperatur. Der tilsættes 5 mL af M10 og bland forsigtigt.
  4. Erstat M10PSF i den tidligere platted 96-brønd plade af 50 µL af de endelige Transfektion medier. Ruger i en kuvøse sæt til 37 ° C og 5% CO2 og støvsuge salen luminometrisk natten følge proceduren beskrevet i trin 6.

4. substrat inkubation

  1. Observere 96-brønd plade under et fasekontrast mikroskop til at forsikre en celle sammenløbet mellem 60% og 100%. Forberede en stimulation løsning af Hank's Balanced Salt løsning (HBSS) der indeholder 10 mM hydroxyethylmethacrylat piperazineethanesulfonic syre (HEPES) og 5 mM af D-glucose.
  2. Fortynd 75 µL lejr reagens (Se tabel af materialer) løsning til 2,75 mL af opløsningen, stimulation. Fjern Transfektion medium fra 96-brønd plade og vaske cellerne ved at tilføje 50 µL af frisk stimulation løsning til hver brønd.
  3. Fjern stimulation løsning og tilsæt 25 µL af cAMP reagens rengøringsopløsning taktfast 4.2 til hver brønd. Inkuber 96-brønd pladen ved stuetemperatur i en mørk og lugt-fri miljø (f.eks, en ren Tom skuffe langt væk fra kemikalier eller lugtstof kilde) for 2 h.

5. lugtstof Stimulation

  1. Først, reagensglasset luminometrisk afdeling med flygtige lugtstof molekyler. Fortynd lugtstof til den ønskede koncentration i 10 mL af mineralsk olie (fig. 2A). Inden udgangen af inkubationstiden lejr reagens, tilføje 25 µL af opløsningen lugtstof i en ny 96-brønd plade (ikke den, der indeholder cellerne). Inkuber denne lugtstof plade ved stuetemperatur i luminometrisk kammer i 5 min (figur 2B) (ingen luminometrisk optagelse er påkrævet her).
  2. Indstille luminometrisk optage luminescence med 0 s forsinkelse under 20 cyklusser af plade måling af 90 s med 0,7 s af intervallet mellem cyklusser.
  3. Lige før du læser pladen, skal du fjerne lugtstof plade fra salen. Tilsæt 25 µL af lugtstof mellem wells af 96-brønd pladen med de celler (ikke tilføjer lugtstof i brøndene med cellerne) og hurtigt begynde at luminescence måling af alle brønde til 20 cykler indenfor 30 min (figur 2C).

6. fjernelse af resterende lugtstof inde luminometrisk

  1. Åbn døren til en luminometrisk. Indsæt røret tilsluttet vakuumpumpe.
  2. Vakuum duftstoffer i læsning kammer udførligt (mindst 2 h, helst natten over) mellem to Duftenes at undgå krydskontaminering af lugt flygtige stoffer fra et eksperiment til en anden. Erstatte med frisk luft ved at sende trykluft under 5 min før inkubere den næste lugtstof.

7. dataanalyse

  1. Eksportere data fra luminometrisk software.
  2. Gennemsnitlig replikater af det samme eller for hver optagetid. Beregne den normaliserede OR svar på enhver eventuel kontrol (f.eks Tom vektor, figur 3A og repræsentative resultater sektion) ved at dividere værdien kontrol gennemsnit eller i gennemsnit værdi på hver optagetid (figur 3B og repræsentative resultater afsnit).
  3. Normalisere den enkelte OR svar på deres basale aktivitet ved at dividere den gennemsnit OR svar på 0 s til hver optagelse gang svar (Se figur 3C og repræsentative resultater afsnit).
  4. Beregn arealet under kurven for hver OR at få en enkelt OR svar værdi. Gør du opsummere alle luminescence værdier af hver optagelse gang for hver OR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi gennemgået tre mus ORs, Olfr746, Olfr124 og Olfr1093 reaktion ved hjælp af cinnamaldehyd damp stimulation (figur 3). Samtidig, vi brugte en tom vektor kontrol (Rho-pCI) til at forsikre, at de testede ORs lugtstof-induceret aktiviteter var specifikke (fig. 3A). Real-time aktivering af ORs på vapor lugtstof stimulus blev overvåget over 20 måling cyklusser. Data for hver blev godt først normaliseret til tomme vektor kontrol i gennemsnit værdi for hver cyklus (fig. 3B). Det er vigtigt at bemærke at ORs kan vise variable niveauer af basal aktivitet i denne analyse i en OR-afhængige måde og det kan være vigtigt at også normalisere deres svar på denne parameter (figur 3C). Den gennemsnitlige værdi af en OR kan divideres med sit svar på t = 0 Sørensen, gør det muligt for at sammenligne mellem ORs. Enkelt aktivering værdier for hver OR kan også beregnes, ved at beregne arealet under kurven (AUC) for hver eller ved at addere alle måling cyklus værdier (figur 3D).

Derudover kan dosisafhængig svar måles ved hjælp af denne metode, ved hjælp af stigende lugtstof doser. Vi præsenterer svaret fra Olfr1377 til acetophenone stimulation registreres efter samme procedure (figur 4). Acetophenone volatilitet kan vurderes af sin damptryk, hvilket er lig med 0,44 mm Hg ved 25 ° C. Ved en given temperatur og er en lugtstof besidder en højere damptryk mere svingende end en lugtstof med et lavere damptryk. Acetophenone er derfor en moderat flygtige lugtstof og er udsat for cellen ren og fortyndet på 10-2, 10-4, 10-6 og 10-8. Kun de tre højere koncentrationer (ren, 10-2 og 10-4) er i stand til at aktivere Olfr1377 (figur 4A). Vi kan også mærke, at den rene sammensatte stimulation viser en tendens til at formindske OR svar i løbet af tid, sandsynligvis på grund af celle toksicitet, som det har været vist for eugenol i en nylig publikation32. Ikke desto mindre, vi kan iagttage en typisk dosis afhængighed opførsel af Olfr1377 (fig. 4B), viser, at denne metode kan også bruges til at bestemme den EC50 eller flygtige forbindelser.

Bemærk, at når dosis-afhængige eksperimenter er udført, vi ikke støvsuge ren luminometrisk kammer. Forsøg udføres dog altid fra lav til høj, stigende lugtstof doser for at minimere kontaminering. Yderligere, da den reelle koncentration af lugtstof molekyler i cellen medier ikke er kendt, de EC50s, der er opnået ved denne metode er ikke nødvendigvis sammenlignelige med dem, der opnås ved flydende stimulation. EC50 værdier bestemmes af vores metode tage hensyn til lugtstof volatilitet, kinetik af lugtstof opløsning i mediet, det lugtstof opløselighed og affinitet mellem lugtstof og OR, som er tættere på den fysiske opfattelse af lugt. Vores eksempel på Olfr1377 stimulation af acetophenone er EC50-værdi fra vores vapor dosis-respons 161 µM (0.001874%), hvilket er ca. 50 fold højere end den flydende stimulation (3,28 µM fra Saito et al.6). Denne forskel mellem væske og damp stimulering blev også rapporteret af Sanz et al.20 i deres vapor stimulation assay hvor vapor stimulation gav 100 til 1000 gange lavere EC50-værdier end den flydende stimulation.

Figure 1
Figur 1 : Princippet om real-time overvågning af lugtstof receptor aktivering af vapored lugtstof. (A) 96-brønd pladen var placeret i den allerede afbalancerede med lugt (violet cloud) luminometrisk kammer. (B) fordampet lugtstof molekyler (violet) på overfladen af cellen media buffer opløst i det at nå OR hulrum, på Hana3A celle membranen overflade. Tilbehør proteinet RTP1S (grå) var transfekteret så godt, til at favorisere celle overflade udtryk for OR. Hvis lugtstof molekylet var en OR agonist, eller skiftes til en aktiveret og bundet Golf, udløser aktivering af adenylyl cyclase (AC) og produktion af cyklisk AMP (cAMP; grøn). Glosensor protein (luciferase) besidder en bindingssted for cAMP, der en gang bundet, giver protein til at binde sine ligand, luciferin (gul). Den endelige komplekse Glosensor protein/luciferin/cAMP produceret den luminescence, der blev optaget til at overvåge OR aktivering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Skematisk protokoller til real-time overvågning af lugtstof receptor aktivering af vapored lugtstof. Lugtstof (violet) var fortyndet med den ønskede koncentration i mineralsk olie (A). Løsningen var så forgyldt ind i en ny 96-brønd plade, som var placeret i luminometrisk kammer for 5 min til Reagensglasset volumen med vapored lugtstof før overvågning transfected 96 brønde plade (B). Lugtstof løsning var pipetted i hver rum mellem wells af transfected 96 brønde plade (Se zoom). Pladen var så Læs for 20 cykler i luminometrisk kammer ekvilibreres vapor lugtstof (C). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Eksempel på normalisering, der kan udføres efter dataregistrering. (A) en tom vektor (negativ) kontrol blev indsat i Transfektion planen om at være i stand til at identificere alle potentielle ikke-eller specifikke lugt aktiveringer af celler. Det gav også oplysninger på baggrund luminescence af pladen. (B) hver eller svar var derefter normaliseret ved at dividere emissionsværdien i hver brønd af den gennemsnitlige værdi af kontrolelementet vektor i hver tallerken. Luminescence værdierne for hver OR blev derefter gennemsnit langs måling cyklusser. (C) eller svar kan også derefter normaliseres deres basale aktivitet af yderligere dividere hver cyklus værdi efter den gennemsnitlige værdi af 1st cyklus af måling (t = 0 s). (D) The AUC kan beregnes ved at addere emissionsværdier for hver måling cyklus. B, C og D, fejllinjer repræsenterer standard fejlen af middelværdien (SEM, n = 3). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 . Eksempel på dosis afhængige svar opnås med metoden. (A) svar af Olfr1377 til acetophenone blev indspillet for fem forskellige fortyndinger i mineralsk olie (100, 10-2, 10-4, 10-6, 10-8), og uden lugtstof (0), og normaliseret efter den normalisering protokol vist i figur 3. (B) dataene under målingen cykler var oversat til et AUC værdi for hver fortynding. Dette tal er blevet ændret fra Kida et al.32. Dette tal er licenseret under en Creative Commons Attribution 4.0 International (CC af 4.0). Fejllinjer udgør standard fejlen af middelværdien (SEM, n = 3). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Per 96-brønd plade
MEM 500 ΜL
pGlosensor 10 ng
RTP1S 5 ng
ELLER 75 ng

Tabel 1: Mix for Transfektion. Mængder af plasmider (Glosensor proteiner, RTP1S og eller) til at tilføje til MEM til transfect til en 96-brønd plade.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Opfattelsen af lugt er grundlæggende afhængig af aktivering af ORs. Dermed, forståelse af deres funktionalitet er krævede hen til knæk de komplekse mekanismer, som hjernen bruger til at opfatte sin flygtige kemiske miljø. Men forståelsen af denne proces er blevet hæmmet af vanskelighederne med at etablere en robust metode til at screene OR repertoire for funktionalitet mod Duftenes in vitro-. Celle overflade og heterolog udtryk af ORs er blevet delvist løst ved oprettelsen af mærket receptorer13,19 , discovery og optimering af receptor-transport proteiner (RTPs) udtrykt i OSNs22 , 23. de første screening undersøgelser så syntes, at bringe nye indsigter til vores forståelse af OR funktion som deres lugtstof anerkendelse mønster6,7,26,33, aktivering mekanisme34,35, teoretiske tridimensional struktur36,37, evolution38,39, lugt plads40,41, 42, og følger i lugt afsløring43,44,45,46. Vi mener, at forbedre de in vitro-metoder kan øge decifrere lugt kodning. Som sådan, udviklet vi her en ny funktionel analyse for at give mulighed for overvågning af OR aktivering af forstøvet lugtstof molekyler.

Succes af denne metode afhænger af flere vigtige skridt. Selv om forbedret i de seneste år, stadig Heterolog ekspression af nogle ORs vanskeligt, som kan påvirke OR lydhørhed over for lugtstof. Udtryk af ORs på cellemembranen kan evalueres i en parallel eksperiment ved hjælp af flow flowcytometri19,24. Bemærk, at lave niveauer af overflade udtryk kan stadig findes robuste svar i heterolog celle systemer35. Et andet kritisk punkt er at undgå lugtstof kontaminering. I betragtning af følsomheden af denne analyse, kan lugtstof molekyler fra parfume, mad eller tidligere assay forurene eksperimentet ved at inducere ukontrolleret OR svar. Det er derfor, vi anbefaler for at støvsuge salen af luminometrisk for mindst 2 h, helst natten over, før du udfører en analyse med en anden lugtstof. Det er også vigtigt at overveje en potentiel cytotoksicitet af lugtstof anvendes i forsøget. En potentiel nedgang af eller reaktion under 30 min overvågning kan vise, at lugtstof, selv har en negativ effekt på celle sundhed. Lugtstof cytotoksicitet kan vurderes ved at udføre en celle levedygtighed assay efter udsætter celler til lugtstof. For at afhjælpe dette problem, er det muligt at overveje kun de første 10 min af optagetiden til analyse af data, beskæring i slutningen. Vi har bemærket, at lugtstof toksicitet primært opstår, når lugtstof er testet ren eller i meget høje koncentrationer. Følsomheden af vores analyse giver påvisning af lugtstof fortyndet i mineralsk olie. Den optimale koncentration til at fremkalde maksimal reaktion varierer fra én lugtstof til en anden, men vi observerede, at en 1% opløsning er nok til at fremkalde en mætning af en OR svar32. Men nogle lugtstof molekyler kan besidde lavt damptryk (og derfor lav volatilitet) og kan have behov for nogle justeringer af den protokol, der præsenteres. Inkubationstiden for lugtstof i luminometrisk salen her er sat til 5 min. Vi antog, at dette beløb af tid er tilstrækkelige til Reagensglasset kammer med lugtstof flygtige molekyler, men lav volatilitet duftstoffer kan kræve længere inkuberingstider.

Bortset fra disse kritiske punkter, denne metode bringer mange nye muligheder for at udforske struktur-funktion relationerne af lugtstof-OR interaktioner. Den real-time overvågning aspekt af denne metode giver også mulighed for forståelsen af kinetik af hændelser, der opstår under en lugt perception. Som et eksempel anvendte vi protokollen til at undersøge funktionaliteten af en metabolit enzym, carboxyl-esterase 1d (Ces1d), fundet skal udtrykkes i det olfaktoriske slimhinde af pattedyr47. Dette enzym er kendt for at konvertere estere til carboxylsyre og alkohol48. Fælles Transfektion af Ces1d viste en graduering af in vitro-OR svar til ester forbindelser,32 viser, at denne nye protokol er effektiv i at udforske betydningen af metaboliske enzymer i lugtstof påvisning. Derudover vil bruger denne platform til at undersøge lugtstof blandinger, og den måde lugte præsenteres i indstillinger, der er mere naturligt, sætte fremtidige undersøgelse i at forstå mere komplekse lugtstof interaktioner. Endelig, påvisning af lugtstof molekyler af ORs er også af stor interesse i udviklingen af en lugt sensor. Har vist, at vores system kan registrere lugtstof molekyler præsenteret i en damp fase, er denne metode et første skridt i udviklingsprocessen af en minituariseret biosensor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Y.F., H. K og H.M. indgivet en patentansøgning relevant til dette arbejde på 27 oktober 2016.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra NIH (DC014423 og DC016224) og Defense Advanced Research projekt agenturet RealNose projektet. YF boede på Duke University med finansiel støtte fra JSP'ER Program til at fremme strategiske internationale net skal fremskynde omsætning af talentfulde forskere (R2801). Vi takker Sahar Kaleem til redigering af manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05 % trypsin-EDTA Gibco 25300-054 0.05% Trypsin - EDTA (1x), phenol red - store at 4°C
100 mm cell culture dish  BD Falcon 353003 100 mm x 20 mm cell culture dish 
15 mL tube BD Falcon 352099 17 mm x 120 mm conical tubes
96-well plate Corning 3843 96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene
Amphotericin Gibco 15290-018 Amphotericin B 250 µg/mL - store at 4 °C
centrifuge machine Jouan C312 Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL
Class II Type A/B3 fumehood NUAIRE NU-407-500 fumehood for cell culturing
FBS Gibco 16000-044 Fetal Bovine Serum - store at -20 °C
GloSensor cAMP Reagent Promega E1290 GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate - store at -20 °C
Incubator 37 °C; 5 % CO2 Fisher Scientific 11-676-604 Incubator for cell culturing
Lipofectamine 2000 reagent Invitrogen 11668-019 Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent - store at 4 °C
Luminometer POLARstar OPTIMA BMG LABTECH discontinued 96 well plate reader for luminescence
Mineral oil Sigma M8410 Solvent for odorants - store at room temperature
Minimum Essential Medium (MEM) Corning cellgro 10-010-CV Minimum Essential Medium Eagle with Earle’s salts & L-glutamine - store at 4 °C
Penicillin/Streptomycin Sigma Aldrich P4333 Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin - store at -20 °C
pGlosensor Promega E2301 pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid - store at 4 °C
Phase contrast microscope Leica 090-131.001 phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives
RTP1S H. Matsunami lab - 100 ng/µL plasmid - store at 4 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
  2. Serizawa, S., Miyamichi, K., Sakano, H. One neuron-one receptor rule in the mouse olfactory system. Trends in Genetics. 20 (12), 648-653 (2004).
  3. Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
  4. Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
  5. Peterlin, Z., Firestein, S., Rogers, M. E. The state of the art of odorant receptor deorphanization: a report from the orphanage. The Journal of General Physiology. 143 (5), 527-542 (2014).
  6. Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Science Signal. 2 (60), (2009).
  7. Geithe, C., Noe, F., Kreissl, J., Krautwurst, D. The broadly tuned odorant receptor OR1A1 is highly selective for 3-methyl-2, 4-nonanedione, a key food odorant in aged wines, tea, and other foods. Chemical Senses. 42 (3), 181-193 (2017).
  8. Nishizumi, H., Sakano, H. Decoding and deorphanizing an olfactory map. Nature Neuroscience. 18 (10), 1432 (2015).
  9. Wetzel, C. H., et al. Functional expression and characterization of a Drosophila odorant receptor in a heterologous cell system. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (16), 9377-9380 (2001).
  10. Touhara, K., et al. Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (7), 4040-4045 (1999).
  11. Levasseur, G., et al. Ligand-specific dose-response of heterologously expressed olfactory receptors. European Journal Of Biochemistry. 270 (13), 2905-2912 (2003).
  12. Zhao, H., et al. Functional expression of a mammalian odorant receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
  13. Krautwurst, D., Yau, K. -W., Reed, R. R. Identification of ligands for olfactory receptors by functional expression of a receptor library. Cell. 95 (7), 917-926 (1998).
  14. Wetzel, C. H., et al. Specificity and Sensitivity of a Human Olfactory Receptor Functionally Expressed in Human Embryonic Kidney 293 Cells andXenopus Laevis Oocytes. Journal of Neuroscience. 19 (17), 7426-7433 (1999).
  15. Kajiya, K., et al. Molecular bases of odor discrimination: reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. Journal of Neuroscience. 21 (16), 6018-6025 (2001).
  16. Jiang, Y., et al. Molecular profiling of activated olfactory neurons identifies odorant receptors for odors in vivo. Nature Neuroscience. 18 (10), 1446 (2015).
  17. Von Der Weid, B., et al. Large-scale transcriptional profiling of chemosensory neurons identifies receptor-ligand pairs in vivo. Nature Neuroscience. 18 (10), 1455 (2015).
  18. Geithe, C., Andersen, G., Malki, A., Krautwurst, D. A butter aroma recombinate activates human class-I odorant receptors. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (43), 9410-9420 (2015).
  19. Noe, F., et al. IL-6-HaloTag® enables live-cell plasma membrane staining, flow cytometry, functional expression, and de-orphaning of recombinant odorant receptors. Journal of Biological Methods. 4 (4), 81 (2017).
  20. Sanz, G., Schlegel, C., Pernollet, J. -C., Briand, L. Comparison of odorant specificity of two human olfactory receptors from different phylogenetic classes and evidence for antagonism. Chemical Senses. 30 (1), 69-80 (2005).
  21. Shepard, B. D., Natarajan, N., Protzko, R. J., Acres, O. W., Pluznick, J. L. A cleavable N-terminal signal peptide promotes widespread olfactory receptor surface expression in HEK293T cells. PLoS One. 8 (7), 68758 (2013).
  22. Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119 (5), 679-691 (2004).
  23. Wu, L., Pan, Y., Chen, G. -Q., Matsunami, H., Zhuang, H. Receptor-Transporting Protein 1 Short (RTP1S) Mediates the Translocation and Activation of Odorant Receptors by Acting through Multiple Steps. Journal of Biological Chemistry. , (2012).
  24. Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nature Protocols. 3 (9), 1402 (2008).
  25. Zhang, Y., Pan, Y., Matsunami, H., Zhuang, H. Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay. Journal of Visualized Experiments. (128), e55831 (2017).
  26. Li, S., et al. Smelling sulfur: Copper and silver regulate the response of human odorant receptor OR2T11 to low-molecular-weight thiols. Journal of the American Chemical Society. 138 (40), 13281-13288 (2016).
  27. Ahmed, L., et al. Molecular mechanism of activation of human musk receptors OR5AN1 and OR1A1 by (R)-muscone and diverse other musk-smelling compounds. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (17), 3950-3958 (2018).
  28. Duan, X., et al. Crucial role of copper in detection of metal-coordinating odorants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (9), 3492-3497 (2012).
  29. Sekharan, S., et al. QM/MM model of the mouse olfactory receptor MOR244-3 validated by site-directed mutagenesis experiments. Biophysical journal. 107 (5), 5-8 (2014).
  30. Liu, M. T., et al. Carbon chain shape selectivity by the mouse olfactory receptor OR-I7. Organic & Biomolecular Chemistry. 16 (14), 2541-2548 (2018).
  31. Li, Y., et al. Aldehyde Recognition and Discrimination by Mammalian Odorant Receptors via Functional Group-Specific Hydration Chemistry. ACS Chemical Biology. 9 (11), 2563-2571 (2014).
  32. Kida, H., et al. Vapor detection and discrimination with a panel of odorant receptors. Nature Communications. 9 (1), 4556 (2018).
  33. Yu, Y., et al. Responsiveness of G protein-coupled odorant receptors is partially attributed to the activation mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (48), 14966-14971 (2015).
  34. de March, C. A., et al. Conserved residues control Activation of mammalian G protein-coupled odorant receptors. Journal of the American Chemical Society. 137 (26), 8611-8616 (2015).
  35. de March, C. A., et al. Odorant receptor 7D4 activation dynamics. Angewandte Chemie. 130 (17), 4644-4648 (2018).
  36. Kim, S. -K., Goddard, W. A. Predicted 3D structures of olfactory receptors with details of odorant binding to OR1G1. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 28 (12), 1175-1190 (2014).
  37. de March, C. A., Kim, S. K., Antonczak, S., Goddard, W. A., Golebiowski, J. G protein-coupled odorant receptors: From sequence to structure. Protein Science. 24 (9), 1543-1548 (2015).
  38. Adipietro, K. A., Mainland, J. D., Matsunami, H. Functional evolution of mammalian odorant receptors. PLoS Genetics. 8 (7), 1002821 (2012).
  39. Mainland, J. D., et al. The missense of smell: functional variability in the human odorant receptor repertoire. Nature Neuroscience. 17 (1), 114 (2014).
  40. Meister, M. On the dimensionality of odor space. Elife. 4, 07865 (2015).
  41. Bushdid, C., Magnasco, M. O., Vosshall, L. B., Keller, A. Humans can discriminate more than 1 trillion olfactory stimuli. Science. 343 (6177), 1370-1372 (2014).
  42. Gerkin, R. C., Castro, J. B. The number of olfactory stimuli that humans can discriminate is still unknown. Elife. 4, 08127 (2015).
  43. Shirasu, M., et al. Olfactory receptor and neural pathway responsible for highly selective sensing of musk odors. Neuron. 81 (1), 165-178 (2014).
  44. Keller, A., Zhuang, H., Chi, Q., Vosshall, L. B., Matsunami, H. Genetic variation in a human odorant receptor alters odour perception. Nature. 449 (7161), 468 (2007).
  45. McRae, J. F., et al. Genetic variation in the odorant receptor OR2J3 is associated with the ability to detect the "grassy" smelling odor, cis-3-hexen-1-ol. Chemical Senses. 37 (7), 585-593 (2012).
  46. de March, C. A., Ryu, S., Sicard, G., Moon, C., Golebiowski, J. Structure-odour relationships reviewed in the postgenomic era. Flavour and Fragrance Journal. 30 (5), 342-361 (2015).
  47. Olson, M. J., Martin, J. L., LaRosa, A. C., Brady, A. N., Pohl, L. R. Immunohistochemical localization of carboxylesterase in the nasal mucosa of rats. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 41 (2), 307-311 (1993).
  48. Nagashima, A., Touhara, K. Enzymatic conversion of odorants in nasal mucus affects olfactory glomerular activation patterns and odor perception. Journal of Neuroscience. 30 (48), 16391-16398 (2010).

Tags

Neurovidenskab spørgsmålet 146 vapor stimulation lugtstof receptorer real-time aktivering lugtstof molekyler kombinatorisk kode funktionel analyse
Real-time i Vitro overvågning af lugtstof Receptor aktivering af en lugtstof i fasen for damp
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

de March, C. A., Fukutani, Y.,… More

de March, C. A., Fukutani, Y., Vihani, A., Kida, H., Matsunami, H. Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase. J. Vis. Exp. (146), e59446, doi:10.3791/59446 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter