Summary

Realtid i Vitro övervakning av luktreceptor aktivering av en Luktämnet i gasfasen

Published: April 23, 2019
doi:

Summary

Fysiologiskt, som luktämnen receptorer aktiveras av luktämnet molekyler inandning i gasfasen. Men, mest in vitro-system använda flytande fas luktämnet stimulering. Här presenterar vi en metod som möjliggör realtidsövervakning av in vitro-av luktämnet receptor aktiveringen vid luktämnet stimulering i gasfasen.

Abstract

Olfactory uppfattning börjar med samspelet mellan odoranter med luktämnet receptorer (eller) uttryckt av lukt sensoriska neuroner (OSN). Lukt erkännande följer en kombinatoriska kodning, där en OR kan aktiveras av en uppsättning odoranter och en luktämnen kan aktivera en kombination av ORs. Genom sådana kombinatoriska kodning, kan organismer upptäcka och diskriminera en myriad av flyktiga lukt molekyler. En lukt vid en given koncentration kan således beskrivas av en aktivering mönster av ORs, som är specifika för varje lukt. I det avseendet knäcka de mekanismer som hjärnan använder för att uppfatta lukt kräver förståelse luktämnet-OR interaktioner. Det är därför olfaction gemenskapen har förbundit sig att ”de-orphanize” dessa receptorer. Konventionella in vitro-system används för att identifiera luktämnet- eller interaktioner har utnyttjat ruvande cell media med luktämnen, som är skild från naturlig detektion av lukter via vapor odoranter upplösning i nässlemhinnan före interagera med ORs. Här beskriver vi en ny metod som möjliggör realtidsövervakning av OR aktiveringen via gasfasen doftämnen. Vår metod bygger på mätning cAMP release av luminiscens med Glosensor analys. Det överbryggar nuvarande luckor mellan in vivo och in vitro-metoder och ger en grund för en biomimetiska flyktiga kemiska sensor.

Introduction

Luktsinnet kan landlevande djur att interagera med sin flyktiga kemiska miljö till drive beteenden och känslor. Fundamentalt, lukt upptäckt processen börjar med första växelverkan av luktämnet molekyler med luktsinnet, i nivå med luktämnet receptorer (ORs)1. Hos däggdjur uttrycks ORs individuellt i lukt sensoriska nervceller (OSNs) ligger i luktepitel2. De tillhör familjen G-protein kopplade receptorer (GPCR) och mer exakt till familjen rhodopsin-liknande sub (kallas även klass A). ORs par med den stimulerande G protein Golf vars aktivering leder till cAMP produktion följt av öppnandet av cykliska nukleotid gated kanaler och generering av handlingspänningar. Det är accepterat att en lukt percept förlitar sig på ett visst mönster av aktiverade ORs3,4 och lukt erkännande följer således en kombinatoriska kodning, där en OR kan aktiveras av en uppsättning odoranter och en luktämnen kan aktivera ett kombination av ORs. Och genom sådana kombinatoriska kodning, är det postulerade att organismer kan upptäcka och diskriminera en myriad av flyktiga lukt molekyler. En av nycklarna till att förstå hur lukter uppfattas är att förstå hur och som ORs aktiveras av en viss lukt.

I ett försök att belysa luktämnet- eller interaktioner, in vitro-funktionella analyser har spelat en viktig roll. Identifiering av agonist illaluktande ligander för föräldralös ORs (OR de orphanization) har varit ett mycket aktivt fält för de senaste tjugo åren, med hjälp av olika in vitro, ex vivo och Invivo funktionella analyser5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17.

In vitro test system är bäst lämpade för detaljerad funktionell karakterisering av ORs, inklusive att identifiera funktionella domäner och kritiska rester av ORs, liksom potentiella tekniska tillämpningar. Dock har ytterligare utveckling av värdefulla in vitro-system för ORs varit en utmaning, delvis på grund av svårigheter med odling OSNs och funktionella uttryck för ORs i heterologa celler. Den första utmaningen hade varit att upprätta protokoll som tillåts av cell surface uttryck för funktionella ORs i kartläggningen av luktämnet-OR interaktioner. Ett antal oberoende grupper har använt olika metoder5,6,7,8,9,10,11,12, 14,18,19,20. En av de tidigaste landvinningar gjordes av Krautwurst et al. i märkta N-terminalen av ORs med en förkortad sekvens av rhodopsin (Rho-tag) och observerade ett förbättrad yta uttryck i mänskliga embryonala njurar (HEK) celler13. Ändringar i för fästade OR sekvensen är fortfarande en sökväg som utforskas för att förbättra OR uttryck och funktionalitet19,21. Saito et al. sedan identifierat receptor-transporterar protein 1 (RTP1) och RTP2 som underlättar OR människohandel. 22 en kortare version av RTP1, kallas RTP1S, har också visat sig vara ännu effektivare än den ursprungliga protein23. Utvecklingen av en cellinje (Hana3A) som stabilt uttrycker Golf, REEP1, RTP1 och RTP2 24, tillsammans med användning av cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP) reportrar har aktiverat identifiering av luktämnet-OR interaktioner. Mekanismen genom vilken familjen RTP av proteiner främjar cell surface uttryck för ORs återstår för att pröva.

En varning av dessa etablerade metoder är att de som är beroende av luktämnet stimulering i flytande fas, vilket innebär att odoranter löses före till en stimulering medium och stimulera celler genom att ersätta mediet. Detta skiljer sig mycket från de fysiologiska förhållanden där luktämnet molekyler nå luktepitel i gasfasen och aktivera ORs genom upplösning i nässlemhinnan. För att mer likna fysiologiskt relevanta stimulans exponering, Sanz et al.20 föreslog ett test baserat på vapor stimulering genom att tillämpa en droppe luktämnet lösning att hänga under inre ansikte av en plastfilm som placeras på toppen av cell brunnar. De spelade in kalcium Svaren genom att övervaka fluorescensintensiteten. Denna metod var de första att använda air-fas luktämnet stimulering, men det tillät inte en stor genomgång av OR aktivering.

Här utvecklade vi en ny metod som möjliggör realtidsövervakning av in vitro-OR aktiveringen via vapor fas luktämnet stimulering av Glosensor analysen (figur 1). Denna analys har använts tidigare i samband med flytande luktämnet stimulering18,19,25,26,27,28,29, 30 , 31. övervakning kammaren av luminometern är först jämviktas med förångade luktämnet innan plattan läsning (figur 1A). Luktämnet molekyler är sedan solvatiserade in i bufferten, bad Hana3A celler som uttrycker eller intresse, RTP1S och Glosensor proteiner (figur 1B). Om luktämnet är en agonist av eller, kommer att eller byta till en aktiverad konformation binda den Golf, aktivera den viktreglerande cyclase (AC) och slutligen orsaka cAMP-nivåerna stiger. Detta stigande läger kommer att binda till och aktivera det Glosensor proteinet för att generera luminiscens katalysera luciferin. Detta luminiscens registreras sedan av luminometern och möjliggör OR aktiveringen övervakning. Denna metod är av stort intresse i samband med OR deorphanization det leder in vitro-system närmare till naturliga uppfattningen av lukter.

Protocol

1. Hana3A celler kultur Förbereda M10 (minst viktigt Medium (MEM) plus 10% v/v fetalt bovint serum (FBS)) och M10PSF (M10 plus 100 µg/mL penicillin-streptomycin och 1,25 µg/mL amfotericin B). Odla cellerna i 10 mL M10PSF i en 100 mm cell kultur maträtt i en inkubator inställd på 37 ° C och 5% koldioxid (CO2). Dela upp cellerna varannan dag i förhållandet 20%: när 100% sammanflödet av celler (cirka 1,1 x 107 celler) observeras under en faskontrastmikroskop, as…

Representative Results

Vi tre mus ORs, Olfr746, Olfr124 och Olfr1093 svar använda kanelaldehyd vapor stimulering (figur 3). Samtidigt, vi använde en tom vector kontroll (Rho-pCI) för att säkerställa att de testade ORs luktämnet-inducerad verksamhet var specifika (figur 3A). Realtid aktiveringen av de yttersta randområdena vid vapor luktämnen stimulanspaket var övervakade över 20 mätning cykler. Data för varje var väl först normaliserade till Tom vektor i…

Discussion

Uppfattningen av lukt är grunden beroende av aktiveringen av ORs. Följaktligen krävs förståelse för deras funktionalitet att knäcka de komplexa mekanismer som hjärnan använder för att uppfatta dess flyktiga kemiska miljö. Dock har förståelse för denna process hämmats av svårigheterna att fastställa en robust metod skärm OR repertoaren för funktionalitet mot odoranter in vitro-. Cell surface och heterologa uttryck för ORs har delvis lösts genom skapandet av märkta receptorer<sup class="xref"…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöds av bidrag från NIH (DC014423 och DC016224) och Defense Advanced projektet byrån RealNose forskningsprojektet. YF bott vid Duke University med ekonomiskt stöd från JSPS Program för att främja strategiska internationella nätverk att påskynda spridningen av begåvade forskarna (R2801). Vi tackar Sahar Kaleem för redigering av manuskriptet.

Materials

0.05 % trypsin-EDTA Gibco 25300-054 0.05% Trypsin – EDTA (1x), phenol red – store at 4°C
100 mm cell culture dish  BD Falcon 353003 100 mm x 20 mm cell culture dish 
15 mL tube BD Falcon 352099 17 mm x 120 mm conical tubes
96-well plate Corning 3843 96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene
Amphotericin Gibco 15290-018 Amphotericin B 250 µg/mL – store at 4°C
centrifuge machine Jouan C312 Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL
Class II Type A/B3 fumehood NUAIRE NU-407-500 fumehood for cell culturing
FBS Gibco 16000-044 Fetal Bovine Serum – store at -20°C
GloSensor cAMP Reagent Promega E1290 GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate – store at -20°C
Incubator 37 °C; 5 % CO2 Fisher Scientific 11-676-604 Incubator for cell culturing
Lipofectamine 2000 reagent Invitrogen 11668-019 Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent – store at 4°C
Luminometer POLARstar OPTIMA BMG LABTECH discontinued 96 well plate reader for luminescence
Mineral oil Sigma M8410 Solvent for odorants – store at room temperature
Minimum Essential Medium (MEM) Corning cellgro 10-010-CV Minimum Essential Medium Eagle with Earle’s salts & L-glutamine – store at 4°C
Penicillin/Streptomycin Sigma Aldrich P4333 Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin – store at -20°C
pGlosensor Promega E2301 pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid – store at 4°C
phase contrast microscope Leica 090-131.001 phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives
RTP1S H. Matsunami lab 100 ng/µL plasmid – store at 4°C

References

  1. Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
  2. Serizawa, S., Miyamichi, K., Sakano, H. One neuron-one receptor rule in the mouse olfactory system. Trends in Genetics. 20 (12), 648-653 (2004).
  3. Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
  4. Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
  5. Peterlin, Z., Firestein, S., Rogers, M. E. The state of the art of odorant receptor deorphanization: a report from the orphanage. The Journal of General Physiology. 143 (5), 527-542 (2014).
  6. Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Science Signal. 2 (60), (2009).
  7. Geithe, C., Noe, F., Kreissl, J., Krautwurst, D. The broadly tuned odorant receptor OR1A1 is highly selective for 3-methyl-2, 4-nonanedione, a key food odorant in aged wines, tea, and other foods. Chemical Senses. 42 (3), 181-193 (2017).
  8. Nishizumi, H., Sakano, H. Decoding and deorphanizing an olfactory map. Nature Neuroscience. 18 (10), 1432 (2015).
  9. Wetzel, C. H., et al. Functional expression and characterization of a Drosophila odorant receptor in a heterologous cell system. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (16), 9377-9380 (2001).
  10. Touhara, K., et al. Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (7), 4040-4045 (1999).
  11. Levasseur, G., et al. Ligand-specific dose-response of heterologously expressed olfactory receptors. European Journal Of Biochemistry. 270 (13), 2905-2912 (2003).
  12. Zhao, H., et al. Functional expression of a mammalian odorant receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
  13. Krautwurst, D., Yau, K. -. W., Reed, R. R. Identification of ligands for olfactory receptors by functional expression of a receptor library. Cell. 95 (7), 917-926 (1998).
  14. Wetzel, C. H., et al. Specificity and Sensitivity of a Human Olfactory Receptor Functionally Expressed in Human Embryonic Kidney 293 Cells andXenopus Laevis Oocytes. Journal of Neuroscience. 19 (17), 7426-7433 (1999).
  15. Kajiya, K., et al. Molecular bases of odor discrimination: reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. Journal of Neuroscience. 21 (16), 6018-6025 (2001).
  16. Jiang, Y., et al. Molecular profiling of activated olfactory neurons identifies odorant receptors for odors in vivo. Nature Neuroscience. 18 (10), 1446 (2015).
  17. Von Der Weid, B., et al. Large-scale transcriptional profiling of chemosensory neurons identifies receptor-ligand pairs in vivo. Nature Neuroscience. 18 (10), 1455 (2015).
  18. Geithe, C., Andersen, G., Malki, A., Krautwurst, D. A butter aroma recombinate activates human class-I odorant receptors. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (43), 9410-9420 (2015).
  19. Noe, F., et al. IL-6-HaloTag® enables live-cell plasma membrane staining, flow cytometry, functional expression, and de-orphaning of recombinant odorant receptors. Journal of Biological Methods. 4 (4), 81 (2017).
  20. Sanz, G., Schlegel, C., Pernollet, J. -. C., Briand, L. Comparison of odorant specificity of two human olfactory receptors from different phylogenetic classes and evidence for antagonism. Chemical Senses. 30 (1), 69-80 (2005).
  21. Shepard, B. D., Natarajan, N., Protzko, R. J., Acres, O. W., Pluznick, J. L. A cleavable N-terminal signal peptide promotes widespread olfactory receptor surface expression in HEK293T cells. PLoS One. 8 (7), 68758 (2013).
  22. Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119 (5), 679-691 (2004).
  23. Wu, L., Pan, Y., Chen, G. -. Q., Matsunami, H., Zhuang, H. Receptor-Transporting Protein 1 Short (RTP1S) Mediates the Translocation and Activation of Odorant Receptors by Acting through Multiple Steps. Journal of Biological Chemistry. , (2012).
  24. Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nature Protocols. 3 (9), 1402 (2008).
  25. Zhang, Y., Pan, Y., Matsunami, H., Zhuang, H. Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay. Journal of Visualized Experiments. (128), e55831 (2017).
  26. Li, S., et al. Smelling sulfur: Copper and silver regulate the response of human odorant receptor OR2T11 to low-molecular-weight thiols. Journal of the American Chemical Society. 138 (40), 13281-13288 (2016).
  27. Ahmed, L., et al. Molecular mechanism of activation of human musk receptors OR5AN1 and OR1A1 by (R)-muscone and diverse other musk-smelling compounds. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (17), 3950-3958 (2018).
  28. Duan, X., et al. Crucial role of copper in detection of metal-coordinating odorants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (9), 3492-3497 (2012).
  29. Sekharan, S., et al. QM/MM model of the mouse olfactory receptor MOR244-3 validated by site-directed mutagenesis experiments. Biophysical journal. 107 (5), 5-8 (2014).
  30. Liu, M. T., et al. Carbon chain shape selectivity by the mouse olfactory receptor OR-I7. Organic & Biomolecular Chemistry. 16 (14), 2541-2548 (2018).
  31. Li, Y., et al. Aldehyde Recognition and Discrimination by Mammalian Odorant Receptors via Functional Group-Specific Hydration Chemistry. ACS Chemical Biology. 9 (11), 2563-2571 (2014).
  32. Kida, H., et al. Vapor detection and discrimination with a panel of odorant receptors. Nature Communications. 9 (1), 4556 (2018).
  33. Yu, Y., et al. Responsiveness of G protein-coupled odorant receptors is partially attributed to the activation mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (48), 14966-14971 (2015).
  34. de March, C. A., et al. Conserved residues control Activation of mammalian G protein-coupled odorant receptors. Journal of the American Chemical Society. 137 (26), 8611-8616 (2015).
  35. de March, C. A., et al. Odorant receptor 7D4 activation dynamics. Angewandte Chemie. 130 (17), 4644-4648 (2018).
  36. Kim, S. -. K., Goddard, W. A. Predicted 3D structures of olfactory receptors with details of odorant binding to OR1G1. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 28 (12), 1175-1190 (2014).
  37. de March, C. A., Kim, S. K., Antonczak, S., Goddard, W. A., Golebiowski, J. G protein-coupled odorant receptors: From sequence to structure. Protein Science. 24 (9), 1543-1548 (2015).
  38. Adipietro, K. A., Mainland, J. D., Matsunami, H. Functional evolution of mammalian odorant receptors. PLoS Genetics. 8 (7), 1002821 (2012).
  39. Mainland, J. D., et al. The missense of smell: functional variability in the human odorant receptor repertoire. Nature Neuroscience. 17 (1), 114 (2014).
  40. Meister, M. On the dimensionality of odor space. Elife. 4, 07865 (2015).
  41. Bushdid, C., Magnasco, M. O., Vosshall, L. B., Keller, A. Humans can discriminate more than 1 trillion olfactory stimuli. Science. 343 (6177), 1370-1372 (2014).
  42. Gerkin, R. C., Castro, J. B. The number of olfactory stimuli that humans can discriminate is still unknown. Elife. 4, 08127 (2015).
  43. Shirasu, M., et al. Olfactory receptor and neural pathway responsible for highly selective sensing of musk odors. Neuron. 81 (1), 165-178 (2014).
  44. Keller, A., Zhuang, H., Chi, Q., Vosshall, L. B., Matsunami, H. Genetic variation in a human odorant receptor alters odour perception. Nature. 449 (7161), 468 (2007).
  45. McRae, J. F., et al. Genetic variation in the odorant receptor OR2J3 is associated with the ability to detect the “grassy” smelling odor, cis-3-hexen-1-ol. Chemical Senses. 37 (7), 585-593 (2012).
  46. de March, C. A., Ryu, S., Sicard, G., Moon, C., Golebiowski, J. Structure-odour relationships reviewed in the postgenomic era. Flavour and Fragrance Journal. 30 (5), 342-361 (2015).
  47. Olson, M. J., Martin, J. L., LaRosa, A. C., Brady, A. N., Pohl, L. R. Immunohistochemical localization of carboxylesterase in the nasal mucosa of rats. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 41 (2), 307-311 (1993).
  48. Nagashima, A., Touhara, K. Enzymatic conversion of odorants in nasal mucus affects olfactory glomerular activation patterns and odor perception. Journal of Neuroscience. 30 (48), 16391-16398 (2010).

Play Video

Cite This Article
de March, C. A., Fukutani, Y., Vihani, A., Kida, H., Matsunami, H. Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase. J. Vis. Exp. (146), e59446, doi:10.3791/59446 (2019).

View Video