Summary
Fysiologiskt, som luktämnen receptorer aktiveras av luktämnet molekyler inandning i gasfasen. Men, mest in vitro-system använda flytande fas luktämnet stimulering. Här presenterar vi en metod som möjliggör realtidsövervakning av in vitro-av luktämnet receptor aktiveringen vid luktämnet stimulering i gasfasen.
Abstract
Olfactory uppfattning börjar med samspelet mellan odoranter med luktämnet receptorer (eller) uttryckt av lukt sensoriska neuroner (OSN). Lukt erkännande följer en kombinatoriska kodning, där en OR kan aktiveras av en uppsättning odoranter och en luktämnen kan aktivera en kombination av ORs. Genom sådana kombinatoriska kodning, kan organismer upptäcka och diskriminera en myriad av flyktiga lukt molekyler. En lukt vid en given koncentration kan således beskrivas av en aktivering mönster av ORs, som är specifika för varje lukt. I det avseendet knäcka de mekanismer som hjärnan använder för att uppfatta lukt kräver förståelse luktämnet-OR interaktioner. Det är därför olfaction gemenskapen har förbundit sig att ”de-orphanize” dessa receptorer. Konventionella in vitro-system används för att identifiera luktämnet- eller interaktioner har utnyttjat ruvande cell media med luktämnen, som är skild från naturlig detektion av lukter via vapor odoranter upplösning i nässlemhinnan före interagera med ORs. Här beskriver vi en ny metod som möjliggör realtidsövervakning av OR aktiveringen via gasfasen doftämnen. Vår metod bygger på mätning cAMP release av luminiscens med Glosensor analys. Det överbryggar nuvarande luckor mellan in vivo och in vitro-metoder och ger en grund för en biomimetiska flyktiga kemiska sensor.
Introduction
Luktsinnet kan landlevande djur att interagera med sin flyktiga kemiska miljö till drive beteenden och känslor. Fundamentalt, lukt upptäckt processen börjar med första växelverkan av luktämnet molekyler med luktsinnet, i nivå med luktämnet receptorer (ORs)1. Hos däggdjur uttrycks ORs individuellt i lukt sensoriska nervceller (OSNs) ligger i luktepitel2. De tillhör familjen G-protein kopplade receptorer (GPCR) och mer exakt till familjen rhodopsin-liknande sub (kallas även klass A). ORs par med den stimulerande G protein Golf vars aktivering leder till cAMP produktion följt av öppnandet av cykliska nukleotid gated kanaler och generering av handlingspänningar. Det är accepterat att en lukt percept förlitar sig på ett visst mönster av aktiverade ORs3,4 och lukt erkännande följer således en kombinatoriska kodning, där en OR kan aktiveras av en uppsättning odoranter och en luktämnen kan aktivera ett kombination av ORs. Och genom sådana kombinatoriska kodning, är det postulerade att organismer kan upptäcka och diskriminera en myriad av flyktiga lukt molekyler. En av nycklarna till att förstå hur lukter uppfattas är att förstå hur och som ORs aktiveras av en viss lukt.
I ett försök att belysa luktämnet- eller interaktioner, in vitro-funktionella analyser har spelat en viktig roll. Identifiering av agonist illaluktande ligander för föräldralös ORs (OR de orphanization) har varit ett mycket aktivt fält för de senaste tjugo åren, med hjälp av olika in vitro, ex vivo och Invivo funktionella analyser5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17.
In vitro test system är bäst lämpade för detaljerad funktionell karakterisering av ORs, inklusive att identifiera funktionella domäner och kritiska rester av ORs, liksom potentiella tekniska tillämpningar. Dock har ytterligare utveckling av värdefulla in vitro-system för ORs varit en utmaning, delvis på grund av svårigheter med odling OSNs och funktionella uttryck för ORs i heterologa celler. Den första utmaningen hade varit att upprätta protokoll som tillåts av cell surface uttryck för funktionella ORs i kartläggningen av luktämnet-OR interaktioner. Ett antal oberoende grupper har använt olika metoder5,6,7,8,9,10,11,12, 14,18,19,20. En av de tidigaste landvinningar gjordes av Krautwurst et al. i märkta N-terminalen av ORs med en förkortad sekvens av rhodopsin (Rho-tag) och observerade ett förbättrad yta uttryck i mänskliga embryonala njurar (HEK) celler13. Ändringar i för fästade OR sekvensen är fortfarande en sökväg som utforskas för att förbättra OR uttryck och funktionalitet19,21. Saito et al. sedan identifierat receptor-transporterar protein 1 (RTP1) och RTP2 som underlättar OR människohandel. 22 en kortare version av RTP1, kallas RTP1S, har också visat sig vara ännu effektivare än den ursprungliga protein23. Utvecklingen av en cellinje (Hana3A) som stabilt uttrycker Golf, REEP1, RTP1 och RTP2 24, tillsammans med användning av cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP) reportrar har aktiverat identifiering av luktämnet-OR interaktioner. Mekanismen genom vilken familjen RTP av proteiner främjar cell surface uttryck för ORs återstår för att pröva.
En varning av dessa etablerade metoder är att de som är beroende av luktämnet stimulering i flytande fas, vilket innebär att odoranter löses före till en stimulering medium och stimulera celler genom att ersätta mediet. Detta skiljer sig mycket från de fysiologiska förhållanden där luktämnet molekyler nå luktepitel i gasfasen och aktivera ORs genom upplösning i nässlemhinnan. För att mer likna fysiologiskt relevanta stimulans exponering, Sanz et al.20 föreslog ett test baserat på vapor stimulering genom att tillämpa en droppe luktämnet lösning att hänga under inre ansikte av en plastfilm som placeras på toppen av cell brunnar. De spelade in kalcium Svaren genom att övervaka fluorescensintensiteten. Denna metod var de första att använda air-fas luktämnet stimulering, men det tillät inte en stor genomgång av OR aktivering.
Här utvecklade vi en ny metod som möjliggör realtidsövervakning av in vitro-OR aktiveringen via vapor fas luktämnet stimulering av Glosensor analysen (figur 1). Denna analys har använts tidigare i samband med flytande luktämnet stimulering18,19,25,26,27,28,29, 30 , 31. övervakning kammaren av luminometern är först jämviktas med förångade luktämnet innan plattan läsning (figur 1A). Luktämnet molekyler är sedan solvatiserade in i bufferten, bad Hana3A celler som uttrycker eller intresse, RTP1S och Glosensor proteiner (figur 1B). Om luktämnet är en agonist av eller, kommer att eller byta till en aktiverad konformation binda den Golf, aktivera den viktreglerande cyclase (AC) och slutligen orsaka cAMP-nivåerna stiger. Detta stigande läger kommer att binda till och aktivera det Glosensor proteinet för att generera luminiscens katalysera luciferin. Detta luminiscens registreras sedan av luminometern och möjliggör OR aktiveringen övervakning. Denna metod är av stort intresse i samband med OR deorphanization det leder in vitro-system närmare till naturliga uppfattningen av lukter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hana3A celler kultur
- Förbereda M10 (minst viktigt Medium (MEM) plus 10% v/v fetalt bovint serum (FBS)) och M10PSF (M10 plus 100 µg/mL penicillin-streptomycin och 1,25 µg/mL amfotericin B).
- Odla cellerna i 10 mL M10PSF i en 100 mm cell kultur maträtt i en inkubator inställd på 37 ° C och 5% koldioxid (CO2).
- Dela upp cellerna varannan dag i förhållandet 20%: när 100% sammanflödet av celler (cirka 1,1 x 107 celler) observeras under en faskontrastmikroskop, aspire media och tvätta cellerna försiktigt med 10 mL fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS).
- Aspirera PBS och tillsätt 3 mL 0,05% trypsin-etylendiamintetraättiksyra (EDTA, 0,48 mM). Låt verka i ca 1 min, tills cellerna ta avstånd från plattan.
- Tillsätt 5 mL av M10 att inaktivera trypsin och så småningom loss cellerna fortfarande fäst plattan med pipettering upp och ner.
- Överföra volymen (8 mL) till en 15 mL rör och centrifugera 200 x g för 5 min. aspirera supernatanten och resuspendera cellerna i 5 mL M10PSF av pipettering upp och ned för att bryta någon cell mass. Undvik att skapa bubblor i röret.
- Överför 1 mL återsuspenderade celler lösningen i en ny 100 mm cell kultur maträtt och tillsätt 9 mL färsk M10PSF. Inkubera vid 37 ° C och 5% CO2.
2. förberedelse av cellerna för Transfection
- Utvärdera sammanflödet, eller antalet celler, genom att observera dem under ett faskontrastmikroskop. Minst 10% sammanflödet (cirka 1,1 x 106 celler) som behövs för en platta.
- Aspirera media och tvätta cellerna försiktigt med 10 mL PBS. Aspirera PBS och tillsätt 3 mL av EDTA. Låt verka i cirka 1 min i rumstemperatur, tills cellerna ta avstånd från plattan.
- Tillsätt 5 mL av M10 att inaktivera trypsin och så småningom loss cellerna fortfarande fäst plattan med pipettering upp och ner. Överföra volymen (8 mL) till en 15 mL rör och centrifugera vid 200 x g under 5 minuter.
- Aspirera supernatanten och resuspendera cellerna i 5 mL M10PSF av pipettering upp och ned för att bryta någon cell mass. Undvik att skapa bubblor i röret.
- Beroende på antalet plattor att vara transfekterade, överföra en lämplig mängd celler i en reservoar med ordentlig motsvarande volym av M10PSF. Ena plattan med 96 brunnar bör beläggas med 1/10 av en 100% konfluenta 100 mm maträtt (cirka 1,1 x 106 celler) utspätt i M10PSF att nå en total volym på 6 mL. För en plattan med 96 brunnar börjar med en 100% sammanflödet 100 mm maträtt, tillsätt 500 µL från 5 mL återsuspenderade celler till 5,5 mL färska M10PSF. Blanda celler och M10PSF utan att generera luftbubblor.
- Överför med pipett 50 μl av suspenderade celler till varje brunn den plattan med 96 brunnar med hjälp av en flerkanalspipett. Inkubera över natten vid 37 ° C och 5% CO2.
3. plasmid Transfection
- Observera plattan med 96 brunnar under ett faskontrastmikroskop att försäkra en cell sammanflödet mellan 30% och 50%.
- Förbereda en första transfection blandning som innehåller plasmidsna som är gemensamma för hela plattan (RTP1S, eller och Glosensor protein, se Tabell för material) efter volymerna i tabell 1. Observera att mängden Rho-taggade OR bör delas med antalet ORs om flera ORs.
Obs: Vi starkt råd att lägga till en tom vektor negativ kontroll (här Rho-pCI) och någon positiv kontroll (OR känd att bemöta testade luktämnet) experiment planen. - Förbereda en andra transfection blandning innehållande 500 µL MEM och 20 µL av Lipofectamine 2000 reagens (giltig för en plattan med 96 brunnar, se Tabell för material). Lägg den andra blandningen till den första, och blanda försiktigt genom pipettering upp och ner och inkubera i 15 min i rumstemperatur. Tillsätt 5 mL av M10 och blanda försiktigt.
- Ersätta M10PSF i den tidigare platted plattan med 96 brunnar med 50 µL av det slutliga transfection mediet. Inkubera i en inkubator inställd på 37 ° C och 5% CO2 och vakuum kammaren av luminometer natten följande förfarandet som beskrivs i steg 6.
4. substrat inkubation
- Observera plattan med 96 brunnar under ett faskontrastmikroskop att försäkra en cell sammanflödet mellan 60% och 100%. Bered en stimulering av Hank's Balanced Salt lösning (HBSS) innehållande 10 mM hydroxietylstärkelse piperazineethanesulfonic syra (HEPES) och 5 mM av D-glukos.
- Späd 75 µL av cAMP reagens (se tabellen för material) lösning till 2,75 mL av stimulering lösningen. Ta bort transfection mediet från plattan med 96 brunnar och tvätta cellerna genom att lägga 50 µL färska stimulering lösning till varje brunn.
- Ta bort stimulering lösningen och tillsätt 25 µL av cAMP reagenslösningen som bereddes i steg 4,2 till varje brunn. Inkubera i plattan med 96 brunnar i rumstemperatur i ett mörkt och luktfri miljö (till exempel en ren Tom låda långt från kemikalier eller luktämnet källa) för 2 h.
5. Luktämnet stimulering
- Först, temperera luminometer kammaren med flyktiga luktämnet molekyler. Späd luktämnet till önskad koncentration i 10 mL av mineralolja (figur 2A). Innan slutet av lägret reagens inkubationstiden, tillsätt 25 µL av luktämnet lösningen i en nya plattan med 96 brunnar (inte en som innehåller celler). Inkubera montageplåten luktämnet i rumstemperatur i luminometer kammaren för 5 min (figur 2B) (ingen luminometer inspelning krävs här).
- Ange luminometern att registrera luminescence med 0 s försening under 20 cykler av plattan mätning av 90 s med 0,7 s tidsintervall mellan cykler.
- Precis innan du läser plattan, ta bort luktämnen plattan från kammaren. Tillsätt 25 µL av luktämnet mellan brunnarna av den plattan med 96 brunnar som innehåller celler (inte Lägg luktämnet i brunnarna som innehåller celler) och snabbt starta luminiscens mätning av alla brunnar i 20 cykler inom 30 minuter (figur 2C).
6. avlägsnande av kvarvarande luktämnet inuti Luminometern
- Öppna dörren till luminometern. För in röret anslutet till vakuumpumpen.
- Vakuum odoranter i behandlingen avdelningen flitigt (minst 2 timmar, helst över natten) mellan två odoranter att undvika korskontaminering av lukt flyktiga ämnen från ett experiment till en annan. Ersätt med frisk luft genom att skicka tryckluft under 5 min innan ruvning nästa luktämnet.
7. dataanalys
- Exportera data från programvaran luminometern.
- Genomsnittliga replikerar den av samma eller för varje inspelningstid. Beräkna normaliserade OR svaret på någon eventuell kontroll (t.ex. Tom vektor, figur 3A och representativa resultat avsnitt) genom att dividera kontrollvärdet i genomsnitt eller i genomsnitt värde på varje inspelningstid (figur 3B och representativa resultat avsnitt).
- Normalisera varje OR svaret på deras basal aktivitet genom att dividera i genomsnitt OR reaktionen vid 0 s till varje inspelning tid svar (se figur 3C och representativa resultat avsnitt).
- Beräkna arean under kurvan för varje eller att erhålla ett enda OR svarsvärde. Summera alla luminiscens värdena varje inspelningstid för varje eller gör så.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi tre mus ORs, Olfr746, Olfr124 och Olfr1093 svar använda kanelaldehyd vapor stimulering (figur 3). Samtidigt, vi använde en tom vector kontroll (Rho-pCI) för att säkerställa att de testade ORs luktämnet-inducerad verksamhet var specifika (figur 3A). Realtid aktiveringen av de yttersta randområdena vid vapor luktämnen stimulanspaket var övervakade över 20 mätning cykler. Data för varje var väl först normaliserade till Tom vektor i genomsnitt kontrollvärdet för varje cykel (figur 3B). Det är viktigt att notera att ORs kan Visa variabla nivåer av basal aktivitet i denna analys på ett OR-beroende sätt och det kan vara viktigt att även normalisera deras svar på denna parameter (figur 3C). Det genomsnittliga värdet av ett eller kan delas av dess respons vid t = 0 s, gör det möjligt för att jämföra mellan ORs. Enda aktiveringen värden för varje OR kan också beräknas genom att beräkna arean under kurvan (AUC) för varje eller genom att summera alla mätvärden cykel (figur 3D).
Dessutom kan dosberoende Svaren mätas med den här metoden använder ökande luktämnet doser. Vi presenterar Olfr1377 svar på acetofenon stimulering registreras på samma sätt (figur 4). Acetofenon volatilitet kan utvärderas av dess ångtryck, vilket är lika med 0,44 mm Hg vid 25 ° C. Vid en given temperatur är en luktämnen som har ett högre ångtryck mer volatil än en luktämnen med ett lägre ångtryck. Acetofenon är följaktligen en måttligt flyktiga luktämnen och utsätts för cellen ren och utspädda på 10-2, 10-4, 10-6 och 10-8. Endast de tre högsta koncentrationerna (ren, 10-2 och 10-4) kan du aktivera Olfr1377 (figur 4A). Vi kan också märka att ren sammansatta stimulering visar en tendens att minska OR svaret under tiden, sannolikt på grund av cell toxicitet, eftersom det har visat för eugenol i senaste publikation32. Dock kan vi konstatera en typiska dosen beroende beteende av Olfr1377 (figur 4B), visar att denna metod kan också användas för att fastställa EC50 av eller till flyktiga föreningar.
Observera att när dosberoende experiment utförs, vi inte dammsuga luminometer kammaren. Dock utförs alltid experiment från låg till hög, ökande luktämnet doser att minimera föroreningar. Ytterligare, eftersom den verkliga koncentrationen av luktämnet molekyler i cellen media inte är känd, de EC50s som erhålls med denna metod är inte nödvändigtvis jämförbara med dem som erhålls genom flytande stimulering. De EC50-värden som bestäms av vår metod beakta luktämnet volatiliteten, kineticsen av luktämnet upplösning till mediet, luktämnets löslighet och samhörigheten mellan luktämnet och eller, vilket är närmare den naturliga uppfattningen av lukt. För vår exempel av Olfr1377 stimulering av acetofenon är EC50 värdet från våra vapor dos-respons 161 µM (0.001874%), som är runt 50 gånger högre än den flytande stimuleringen (3.28 µM från Saito et al.6). Denna skillnad mellan vätska och ånga stimuli rapporterades också av Sanz et al.20 i sina vapor stimulering analysen där ånga stimulering gav 100 till 1000 gånger lägre EC50-värden än flytande stimulering.
Figur 1 : Principen om övervakning i realtid av luktämnet receptor aktiveringen av vapored luktämnet. (A) plattan med 96 brunnar placerades i den redan skakad med lukt (violett cloud) luminometer kammare. (B) förångas luktämnet molekyler (violett) på ytan av cell media bufferten upplösts i det att nå OR hålrummet, vid Hana3A cellmembran ytan. Tillbehör proteinet RTP1S (grå) var transfekterade samt, för att gynna cell surface uttryck för eller. Om luktämnet molekylen var en OR-agonist, eller bytte till en aktiverad stat och bunden i Golf, utlösa aktivering av viktreglerande cyclase (AC) och produktionen av cykliskt AMP (cAMP, grön). Proteinet Glosensor (luciferas) besitter en bindningsstället för lägret som, bindning, gör att proteinet att binda dess ligand, luciferin (gul). Slutliga komplexa Glosensor protein/luciferin/lägret producerade den luminiscens som spelades in för att övervaka OR aktiveringen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Schematisk protokoll för övervakning i realtid av luktämnet receptor aktiveringen av vapored luktämnet. Luktämnet (violett) var utspätt till önskad koncentration i mineralolja (A). Lösningen var då klädd i en nya plattan med 96 brunnar, som placerades in i luminometer kammaren för 5 min temperera volymen med vapored luktämnet innan övervakning de transfekterade plattan med 96 brunnar (B). Luktämnet lösningen var pipetteras i varje utrymme mellan brunnarna av de transfekterade plattan med 96 brunnar (se zooma). Plattan var då Läs i 20 cykler i luminometer kammaren jämviktas vapor luktämnet (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Exempel på normalisering som kan utföras efter dataregistrering. (A), en tom vektor (negativa) kontroll infogades i transfection planen för att kunna identifiera eventuella potentiella icke-eller specifik lukt aktiveringar av celler. Det gav också information om den bakgrunden luminiscens av plattan. (B) varje eller svar var då normaliseras genom att dividera värdet utsläpp varje brunn av det genomsnittliga värdet av vektorn som kontroll i varje platta. Luminiscens var av varje eller då medelvärdet längs de mätning cyklerna. (C) eller Svaren kan också sedan normaliseras mot deras basal aktivitet genom ytterligare att dividera varje cykel värde av det genomsnittliga värdet av 1st cykel av mätning (t = 0 s). (D) The AUC kan beräknas genom att summera utsläppsgränsvärden för varje mätcykel. För B, C och D, felstaplar representera standardavvikelsen för medelvärdet (SEM, n = 3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . Exempel på dosen beroende svar erhållits med metod. (A), Olfr1377 svar på acetofenon spelades för fem olika spädningar i mineralolja (10 10-2, 10-6, 10-4,0, 10-8), och utan luktämnet (0), och normaliserade efter den normalisering-protokoll som visas i figur 3. (B) data under mätningen cykler översattes till en AUC-värdet för varje spädning. Denna siffra har ändrats från Kida et al.32. Denna siffra är licensierat under en Creative Commons Attribution 4.0 International (CC av 4.0). Felstaplar representera standardavvikelsen för medelvärdet (SEM, n = 3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Per plattan med 96 brunnar | |
| MEM | 500 ΜL |
| pGlosensor | 10 ng |
| RTP1S | 5 ng |
| ELLER | 75 ng |
Tabell 1: Mix för transfection. Mängder av plasmider (Glosensor protein, RTP1S och eller) att lägga till MEM till transfect till en plattan med 96 brunnar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Uppfattningen av lukt är grunden beroende av aktiveringen av ORs. Följaktligen krävs förståelse för deras funktionalitet att knäcka de komplexa mekanismer som hjärnan använder för att uppfatta dess flyktiga kemiska miljö. Dock har förståelse för denna process hämmats av svårigheterna att fastställa en robust metod skärm OR repertoaren för funktionalitet mot odoranter in vitro-. Cell surface och heterologa uttryck för ORs har delvis lösts genom skapandet av märkta receptorer13,19 och upptäckten och optimering av receptor-transport proteiner (RTPs) uttryckt i OSNs22 , 23. den första screening studier då dök upp, få nya insikter till vår förståelse av eller-funktion såsom deras luktämnet erkännande mönster6,7,26,33, aktivering mekanismen34,35, teoretiska tredimensionella struktur36,37, evolution38,39, lukt utrymme40,41, 42, och konsekvenser i lukt upptäckt43,44,45,46. Vi tror att förbättra de in vitro-metoderna kan öka dechiffrera lukt kodning. Som sådan, utvecklat vi här en ny funktionell analys för att möjliggöra övervakning av OR aktivering av förångade luktämnet molekyler.
Framgången för denna metod beror på flera viktiga steg. Även om förbättrats de senaste åren, fortfarande heterologa uttryck för vissa ORs svårt, vilket kan påverka OR lyhördhet för luktämnen. Uttryck av ORs vid cellmembranet kan utvärderas i en parallell experiment med hjälp av flödet flödescytometri19,24. Märke att låga nivåer av ytan uttryck kan fortfarande närvarande robust svaren i heterologa cell system35. En annan kritisk punkt är att undvika luktämnet kontaminering. Med tanke på känsligheten i denna analys, kan luktämnen molekyler från parfym, mat, eller föregående analys förorena experimentet genom att inducera okontrollerad OR Svaren. Det är därför vi rekommenderar för att vakuum kammaren av luminometern för minst 2 timmar, helst över natten, innan du utför ett test med en olika luktämnen. Det är också viktigt att tänka på en potentiell cytotoxicitet av luktämnet används i experimentet. En potentiell minskning i svaret av eller under 30 min övervakning kan visa att luktämnet sig har en negativ effekt på cell hälsa. Luktämnet Cytotoxiciteten kan utvärderas genom att utföra en cell lönsamhet analysen efter utsätta celler till luktämnet. För att mildra detta problem, är det möjligt att betrakta endast de första 10 min av lagringstiden för analys av data, beskärning i slutet. Vi märkte att luktämnet toxicitet uppstår främst när luktämnet testas ren eller vid mycket höga koncentrationer. Känsligheten för vår analys tillåter detektion av luktämnet utspätt i mineralolja. Den optimala koncentrationen att framkalla maximalt svar varierar från en luktämnet till en annan, men vi har observerat att en 1% utspädning räcker för att framkalla en mättnad av en OR svar32. Dock vissa luktämnet molekyler kan ha lågt ångtryck (och därför låg volatilitet) och kanske behöver vissa justeringar göras till protokollet presenteras. Inkubationstiden av luktämnet i luminometer kammaren här är inställd på 5 min. Vi antog att denna tid är tillräcklig temperera kammaren med luktämnet flyktiga molekyler, men låg volatilitet doftämnen kan kräva längre inkubationstider.
Förutom dessa kritiska punkter, denna metod ger många nya möjligheter att utforska de struktur-funktionssamband av luktämnet-OR interaktioner. Realtid övervakning aspekten av denna metod möjliggör också förståelsen av kineticsen av händelser som inträffar under en lukt perception. Som ett exempel använde vi protokollet för att utforska funktionaliteten av en metabolit enzym, den carboxyl esteras 1d (Ces1d), hittade skall uttryckas i däggdjur47olfactory slemhinna. Detta enzym är känt att konvertera estrar till karboxylsyra och alkohol48. Den samtidig transfection av Ces1d visade en modulering av in vitro-OR Svaren till ester föreningar,32 visar att detta nya protokoll är effektiva i att utforska betydelsen av metabola enzymer i luktämnet upptäckt. Dessutom kommer att använda denna plattform för att undersöka luktämnet blandningar, och det sätt lukter presenteras i inställningar som är mer naturligt, möjliggöra framtida studie för att förstå mer komplexa luktämnet interaktioner. Slutligen, upptäckt av luktämnet molekyler av ORs är också av stort intresse i utvecklingen av en lukt sensor. Denna metod har visat att vårt system kan detektera luktämnet molekyler presenteras i en gasfasen, och är ett första steg i utvecklingsprocessen av en miniatyriserade biosensor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Y.F., H. K och H.M. lämnat in en patentansökan relevanta för detta arbete den 27 oktober 2016.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av bidrag från NIH (DC014423 och DC016224) och Defense Advanced projektet byrån RealNose forskningsprojektet. YF bott vid Duke University med ekonomiskt stöd från JSPS Program för att främja strategiska internationella nätverk att påskynda spridningen av begåvade forskarna (R2801). Vi tackar Sahar Kaleem för redigering av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05 % trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | 0.05% Trypsin - EDTA (1x), phenol red - store at 4°C |
| 100 mm cell culture dish | BD Falcon | 353003 | 100 mm x 20 mm cell culture dish |
| 15 mL tube | BD Falcon | 352099 | 17 mm x 120 mm conical tubes |
| 96-well plate | Corning | 3843 | 96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | Amphotericin B 250 µg/mL - store at 4 °C |
| centrifuge machine | Jouan | C312 | Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL |
| Class II Type A/B3 fumehood | NUAIRE | NU-407-500 | fumehood for cell culturing |
| FBS | Gibco | 16000-044 | Fetal Bovine Serum - store at -20 °C |
| GloSensor cAMP Reagent | Promega | E1290 | GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate - store at -20 °C |
| Incubator 37 °C; 5 % CO2 | Fisher Scientific | 11-676-604 | Incubator for cell culturing |
| Lipofectamine 2000 reagent | Invitrogen | 11668-019 | Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent - store at 4 °C |
| Luminometer POLARstar OPTIMA | BMG LABTECH | discontinued | 96 well plate reader for luminescence |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | Solvent for odorants - store at room temperature |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Corning cellgro | 10-010-CV | Minimum Essential Medium Eagle with Earle’s salts & L-glutamine - store at 4 °C |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin - store at -20 °C |
| pGlosensor | Promega | E2301 | pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid - store at 4 °C |
| Phase contrast microscope | Leica | 090-131.001 | phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives |
| RTP1S | H. Matsunami lab | - | 100 ng/µL plasmid - store at 4 °C |
References
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Serizawa, S., Miyamichi, K., Sakano, H. One neuron-one receptor rule in the mouse olfactory system. Trends in Genetics. 20 (12), 648-653 (2004).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
- Peterlin, Z., Firestein, S., Rogers, M. E. The state of the art of odorant receptor deorphanization: a report from the orphanage. The Journal of General Physiology. 143 (5), 527-542 (2014).
- Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Science Signal. 2 (60), (2009).
- Geithe, C., Noe, F., Kreissl, J., Krautwurst, D. The broadly tuned odorant receptor OR1A1 is highly selective for 3-methyl-2, 4-nonanedione, a key food odorant in aged wines, tea, and other foods. Chemical Senses. 42 (3), 181-193 (2017).
- Nishizumi, H., Sakano, H. Decoding and deorphanizing an olfactory map. Nature Neuroscience. 18 (10), 1432 (2015).
- Wetzel, C. H., et al. Functional expression and characterization of a Drosophila odorant receptor in a heterologous cell system. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (16), 9377-9380 (2001).
- Touhara, K., et al. Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (7), 4040-4045 (1999).
- Levasseur, G., et al. Ligand-specific dose-response of heterologously expressed olfactory receptors. European Journal Of Biochemistry. 270 (13), 2905-2912 (2003).
- Zhao, H., et al. Functional expression of a mammalian odorant receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
- Krautwurst, D., Yau, K. -W., Reed, R. R. Identification of ligands for olfactory receptors by functional expression of a receptor library. Cell. 95 (7), 917-926 (1998).
- Wetzel, C. H., et al. Specificity and Sensitivity of a Human Olfactory Receptor Functionally Expressed in Human Embryonic Kidney 293 Cells andXenopus Laevis Oocytes. Journal of Neuroscience. 19 (17), 7426-7433 (1999).
- Kajiya, K., et al. Molecular bases of odor discrimination: reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. Journal of Neuroscience. 21 (16), 6018-6025 (2001).
- Jiang, Y., et al. Molecular profiling of activated olfactory neurons identifies odorant receptors for odors in vivo. Nature Neuroscience. 18 (10), 1446 (2015).
- Von Der Weid, B., et al. Large-scale transcriptional profiling of chemosensory neurons identifies receptor-ligand pairs in vivo. Nature Neuroscience. 18 (10), 1455 (2015).
- Geithe, C., Andersen, G., Malki, A., Krautwurst, D. A butter aroma recombinate activates human class-I odorant receptors. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (43), 9410-9420 (2015).
- Noe, F., et al. IL-6-HaloTag® enables live-cell plasma membrane staining, flow cytometry, functional expression, and de-orphaning of recombinant odorant receptors. Journal of Biological Methods. 4 (4), 81 (2017).
- Sanz, G., Schlegel, C., Pernollet, J. -C., Briand, L. Comparison of odorant specificity of two human olfactory receptors from different phylogenetic classes and evidence for antagonism. Chemical Senses. 30 (1), 69-80 (2005).
- Shepard, B. D., Natarajan, N., Protzko, R. J., Acres, O. W., Pluznick, J. L. A cleavable N-terminal signal peptide promotes widespread olfactory receptor surface expression in HEK293T cells. PLoS One. 8 (7), 68758 (2013).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119 (5), 679-691 (2004).
- Wu, L., Pan, Y., Chen, G. -Q., Matsunami, H., Zhuang, H. Receptor-Transporting Protein 1 Short (RTP1S) Mediates the Translocation and Activation of Odorant Receptors by Acting through Multiple Steps. Journal of Biological Chemistry. , (2012).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nature Protocols. 3 (9), 1402 (2008).
- Zhang, Y., Pan, Y., Matsunami, H., Zhuang, H. Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay. Journal of Visualized Experiments. (128), e55831 (2017).
- Li, S., et al. Smelling sulfur: Copper and silver regulate the response of human odorant receptor OR2T11 to low-molecular-weight thiols. Journal of the American Chemical Society. 138 (40), 13281-13288 (2016).
- Ahmed, L., et al. Molecular mechanism of activation of human musk receptors OR5AN1 and OR1A1 by (R)-muscone and diverse other musk-smelling compounds. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (17), 3950-3958 (2018).
- Duan, X., et al. Crucial role of copper in detection of metal-coordinating odorants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (9), 3492-3497 (2012).
- Sekharan, S., et al. QM/MM model of the mouse olfactory receptor MOR244-3 validated by site-directed mutagenesis experiments. Biophysical journal. 107 (5), 5-8 (2014).
- Liu, M. T., et al. Carbon chain shape selectivity by the mouse olfactory receptor OR-I7. Organic & Biomolecular Chemistry. 16 (14), 2541-2548 (2018).
- Li, Y., et al. Aldehyde Recognition and Discrimination by Mammalian Odorant Receptors via Functional Group-Specific Hydration Chemistry. ACS Chemical Biology. 9 (11), 2563-2571 (2014).
- Kida, H., et al. Vapor detection and discrimination with a panel of odorant receptors. Nature Communications. 9 (1), 4556 (2018).
- Yu, Y., et al. Responsiveness of G protein-coupled odorant receptors is partially attributed to the activation mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (48), 14966-14971 (2015).
- de March, C. A., et al. Conserved residues control Activation of mammalian G protein-coupled odorant receptors. Journal of the American Chemical Society. 137 (26), 8611-8616 (2015).
- de March, C. A., et al. Odorant receptor 7D4 activation dynamics. Angewandte Chemie. 130 (17), 4644-4648 (2018).
- Kim, S. -K., Goddard, W. A. Predicted 3D structures of olfactory receptors with details of odorant binding to OR1G1. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 28 (12), 1175-1190 (2014).
- de March, C. A., Kim, S. K., Antonczak, S., Goddard, W. A., Golebiowski, J. G protein-coupled odorant receptors: From sequence to structure. Protein Science. 24 (9), 1543-1548 (2015).
- Adipietro, K. A., Mainland, J. D., Matsunami, H. Functional evolution of mammalian odorant receptors. PLoS Genetics. 8 (7), 1002821 (2012).
- Mainland, J. D., et al. The missense of smell: functional variability in the human odorant receptor repertoire. Nature Neuroscience. 17 (1), 114 (2014).
- Meister, M.
- Bushdid, C., Magnasco, M. O., Vosshall, L. B., Keller, A. Humans can discriminate more than 1 trillion olfactory stimuli. Science. 343 (6177), 1370-1372 (2014).
- Gerkin, R. C., Castro, J. B. The number of olfactory stimuli that humans can discriminate is still unknown. Elife. 4, 08127 (2015).
- Shirasu, M., et al. Olfactory receptor and neural pathway responsible for highly selective sensing of musk odors. Neuron. 81 (1), 165-178 (2014).
- Keller, A., Zhuang, H., Chi, Q., Vosshall, L. B., Matsunami, H. Genetic variation in a human odorant receptor alters odour perception. Nature. 449 (7161), 468 (2007).
- McRae, J. F., et al. Genetic variation in the odorant receptor OR2J3 is associated with the ability to detect the "grassy" smelling odor, cis-3-hexen-1-ol. Chemical Senses. 37 (7), 585-593 (2012).
- de March, C. A., Ryu, S., Sicard, G., Moon, C., Golebiowski, J. Structure-odour relationships reviewed in the postgenomic era. Flavour and Fragrance Journal. 30 (5), 342-361 (2015).
- Olson, M. J., Martin, J. L., LaRosa, A. C., Brady, A. N., Pohl, L. R. Immunohistochemical localization of carboxylesterase in the nasal mucosa of rats. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 41 (2), 307-311 (1993).
- Nagashima, A., Touhara, K. Enzymatic conversion of odorants in nasal mucus affects olfactory glomerular activation patterns and odor perception. Journal of Neuroscience. 30 (48), 16391-16398 (2010).
