Summary
生理的には、嗅覚受容体は匂い分子気相に吸入によってアクティブ化されます。ただし、ほとんどの in vitro システムは、液相嗅覚刺激を利用します。嗅覚刺激による気相匂い物質受容体活性化のリアルタイムでの in vitro の監視を可能にする方法を紹介します。
Abstract
嗅覚は嗅覚受容体と匂い分子の相互作用で始まる (または) 嗅覚ニューロン (国連) によって表現されます。臭気の認識に続く組合せの符号化方式、1 つまたは一連の匂いによってアクティブにできる、1 つの匂いが嗅覚受容体の組み合わせをアクティブ化できます。このような組合せのコーディング、生物は検出し、揮発性の匂い分子の無数の間で区別できます。したがって、所定濃度の臭気で記述できる、嗅覚受容体の活性化パターン各臭気に固有であります。その意味で、脳を使用して臭気が必要理解匂いを知覚するメカニズムを割れ-または相互作用。これはなぜ嗅覚コミュニティが"デ orphanize"これらの受容器にコミットです。臭気物質を識別するために使用される従来の in vitro システム-相互作用は嗅覚、インキュベーター携帯メディアを利用する ORs と対話する前に鼻粘膜に蒸気匂い解散による悪臭の自然の検出とは異なるであるか。ここでは、気相匂いを経由してまたはアクティベーションをリアルタイムで監視できる新しい手法について述べる。本手法は、Glosensor のアッセイを用いた発光によるキャンプ リリースを測定に依存します。それは生体内および生体外でのアプローチとの間の現在のギャップをブリッジし、バイオミメティック揮発性化学センサーの基礎を提供します。
Introduction
嗅覚には、ドライブの動作や感情に揮発性化学物質の環境と対話する陸生動物ことができます。基本的に、臭気の検出プロセスは嗅覚受容体 (ORs)1のレベルで、嗅覚システムと匂い分子の非常に最初の対話から始まります。哺乳類、ORs 個別2嗅上皮にある嗅覚の感覚ニューロン (OSNs) で表されます。彼らは、G タンパク質共役受容体 (GPCR) 家族にロドプシンのような亜科 (クラス A とも呼ばれます) をより正確に属します。ORs のカップル、促進 G 蛋白質 Golfが活性化 cAMP の産生が続く環状ヌクレオチド ゲート チャネルの開口部と活動電位の発生に 。それが受け入れられる匂い知覚を活性化 Or3,4の特定のパターンに依存している、従って臭気の認識続く組合せの符号化方式、1 つまたは一連の匂いによってアクティブにできる、1 つの臭気物質をアクティブにできます、ORs の組み合わせ。このような組合せのコーディング、それは生物が検出でき、揮発性の匂い分子の無数の間で区別を仮定したが。匂いを知覚する方法を理解するキーの 1 つは理解する、どのようにと ORs は与えられた臭気によって活性化されます。
臭気物質を解明する試みで- または相互作用、体外機能アッセイは、重要な役割を果たしています。ORs (OR オーファン) の孤児アゴニスト匂いリガンドの同定は、過去 20 年間、様々 な生体内および生体内機能アッセイ5,6,7 ex 体外を使用して非常にアクティブなフィールドをされています。 ,8,9,10、11,12,13,14,15,16、 17。
In vitro アッセイ システムは ORs、機能的なドメインと、ORs として潜在的なエンジニア リング アプリケーションの重要な残基を識別するなどの詳細な機能解析に最適です。しかし、さらに ORs の貴重な培養システムの開発に一部養殖 OSNs の難しさと異種細胞における嗅覚受容体の機能発現のための挑戦をされています。嗅覚のマッピング機能嗅覚受容体の細胞表面発現の許可プロトコルを確立する最初の課題であった-または相互作用。いくつかの独立したグループは、様々 なアプローチ5,6,7,8,9,10、11,12を利用して 14,18,19,20。初期成果の一つは Krautwurst らによって作られたロドプシン (Rho-タグ) の短縮シーケンスと ORs の N 末端タグし、人間の萌芽期の腎臓 (HEK) 細胞13で改善された表面式を観察。またはシーケンスに付属のタグに作られたバリエーションはまだまたは表現と機能19、21の改善のために探検パスです。斎藤ら.は、受容体輸送蛋白質 1 (RTP1) を識別および RTP2 または人身売買を促進します。22 RTP1、呼ばれる RTP1S の短いバージョンは、元蛋白質23よりも効果的であることも示されています。開発 Golfを安定して表現する細胞株 (Hana3A) の REEP1、RTP1、RTP2 24, 環状アデノシン一リン酸 (cAMP) 記者の使用と相まってが匂いの識別を有効になって-または相互作用。RTP 蛋白質族が嗅覚受容体の細胞表面発現を促進するメカニズムはまだ未定します。
これらの確立された方法の 1 つの警告は、匂い刺激中に分解済み媒体を置き換えることにより細胞を刺激することを意味液体相における嗅覚刺激に依存していることです。これは匂い分子気相の嗅上皮に到達し、溶解することによって鼻粘膜に ORs をアクティブにする生理学的条件から非常に異なります。密接に関連する生理学的刺激の露出のように、サンスら20セル井戸の上に配置プラスチック フィルムの内側の面の下にハングアップする臭気物質溶液の一滴を適用することによって蒸気の刺激に基づくアッセイを提案しました。彼らは、蛍光強度を監視することによってカルシウム応答を記録しました。本法では、気相嗅覚刺激を使用する最初が、それはまたは活性化の大規模なスクリーニングを許可しませんでした。
ここでは、Glosensor の試金 (図 1) によって蒸気相嗅覚刺激を経由して体外またはアクティベーションのリアルタイム モニタ リングを可能にする新しい方法を開発しました。この試金は液体の匂い刺激18,19,25,26,27,28,29,のコンテキストで以前使用されています30,31. 監視、ルミノ商工はまずプレート (図 1A) を読む前に気化した匂いと平衡に達した。匂い分子が関心、RTP1S と Glosensor 蛋白質 (図 1B) の OR を発現する Hana3A 細胞を入浴、バッファーに溶媒和になります。匂いは OR のアゴニスト、またはバインド Golfアデニル酸シクラーゼ (AC) を活性化されると最終的に上昇する cAMP のレベルを引き起こす活性構造への切り替えこの上昇のキャンプにバインドし、発光ルシフェリンを触媒を生成する Glosensor 蛋白質をアクティブにします。この発光は、ルミノ メーターで記録し、またはライセンス認証の監視を有効に。このメソッドは、悪臭の自然な知覚に近い生体外でシステムをもたらすそれコンテキストまたは deorphanization の関心が高いのです。
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Protocol
1. Hana3A 細胞培養
- M10 を準備 (最小必須培地 (MEM) プラス 10 %v/v ウシ胎児血清 (FBS)) と M10PSF (M10 100 μ g/mL ペニシリン-ストレプトマイシンと 1.25 μ g/mL アムホテリシン B プラス)。
- 37 ° C、5% 二酸化炭素 (CO2) でインキュベーターで 100 mm 細胞培養皿の M10PSF の 10 mL の細胞を培養します。
- 20% の比率で 2 日おきのセルを分割: 位相差顕微鏡下で細胞 (約 1.1 × 10 の7セル) の 100% 合流点を観測すると、メディアを熱望し、10 mL のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で軽くセルを洗浄しています。
- PBS を吸引し、0.05% トリプシン - エチレンジアミン四酢酸 (EDTA、0.48 mM) の 3 mL を追加します。セルのプレートから関連付けが解除されるまで、約 1 分間行動をしましょう。
- 5 mL のトリプシンを不活化し、最終的に上下にピペッティングでプレートに接続されたままセルをデタッチ M10 を追加します。
- 15 mL チューブにボリューム (8 mL) を転送し 200 x gで 5 分間吸引上澄みで遠心し、M10PSF の 5 mL に上下に任意のセルの質量を破るピペッティングにより細胞を再懸濁します。チューブ内の気泡を作成しないでください。
- 新しい 100 ミリメートル細胞培養皿の再懸濁細胞溶液 1 mL を転送し、新鮮な M10PSF の 9 mL を追加します。37 ° C と 5% CO2で孵化させなさい。
2. セルの Transfection のための準備
- 位相差顕微鏡下で観察することによって、合流やセル数を評価します。少なくとも 1 つのプレートに合流 10% (約 1.1 × 10 の6セル) が必要があります。
- メディアを吸引し、10 mL の PBS で軽く細胞を洗ってください。PBS を吸引し、EDTA の 3 mL を加えます。セルのプレートから関連付けが解除されるまで、常温で約 1 分の行動をしましょう。
- 5 mL のトリプシンを不活化し、最終的に上下にピペッティングでプレートに接続されたままセルをデタッチ M10 を追加します。15 mL チューブと 200 x gで 5 分間遠心するボリューム (8 mL) を転送します。
- 上清を吸引し、M10PSF の 5 mL に上下に任意のセルの質量を破るピペッティングにより細胞を再懸濁します。チューブ内の気泡を作成しないでください。
- トランスフェクションする板の数、に応じて適切な対応する M10PSF 量と貯留層における細胞の適切な量を転送します。1 つの 96 ウェル プレートは、6 mL の容量に到達する M10PSF で希釈した 100% コンフルエント 100 mm ディッシュ (約 1.1 × 10 の6セル) の 1/10、めっきする必要があります。100% 合流 100 mm 皿から始まる 1 つの 96 ウェル プレート、新鮮な M10PSF 5.5 mL に再懸濁細胞の 5 mL から 500 μ L を追加します。空気の泡を発生させることがなく細胞と M10PSF をミックスします。
- マルチ チャンネル ピペットを使用して 96 ウェル プレートの各ウェルに浮遊細胞の 50 μ L をピペットします。37 ° C、5% CO2で一晩インキュベートします。
3. プラスミド トランスフェクション
- 96 ウェル プレート 30% と 50% 間セル合流を保証するために位相差顕微鏡下で観察します。
- プレート全体に共通のプラスミドを含む最初のトランスフェクション ミックスを準備 (RTP1S、または Glosensor タンパク質、材料表を参照してください) 次の表 1のボリューム。通知の数量 Rho タグ OR はいくつか場合、ORs の数で割る必要がある ORs。
注:我々 強くアドバイスを実験計画に空のベクター ネガティブ コントロール (ここ Rho pCI) と任意の肯定的な制御 (または知られているテストの匂いに対応する) を追加します。 - MEM の 500 μ L と Lipofectamine 2000 試薬の 20 μ L を含む 2 番目のトランスフェクション ミックスを準備 (1 つの 96 ウェル プレートの有効な材料の表を参照してください)。最初の 1 つ 2 番目のミックスを追加、優しく上下にピペッティングによるミックスし、室温で 15 分間インキュベートします。M10 の 5 mL を加え、軽く混ぜます。
- 最終的なトランスフェクション メディアの 50 μ L で以前 platted 96 ウェル プレートで M10PSF を交換してください。37 ° C、5% CO2インキュベーター セットで孵化させなさい、ルミノ一晩次の手順 6 で説明した手順の部屋を掃除します。
4. 基板インキュベーション
- セル合流の 60% から 100% を保証するために位相差顕微鏡下で 96 ウェル プレートを確認します。準備刺激ソリューションのハンクのバランスの取れた塩ソリューション (HBSS) ヒドロキシエチル piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES)、D-グルコースの 5 mM 10 mM を含みます。
- キャンプの試薬の 75 μ L を希釈 (を参照してください材料表) 2.75 mL 刺激ソリューションにソリューション。トランスフェクション媒体を 96 ウェル プレートから外し、新鮮な刺激溶液 50 μ L を各ウェルに追加することによって、細胞を洗浄します。
- 刺激ソリューションを削除し、各ウェルに 4.2 の手順でキャンプ試薬溶液の 25 μ L を追加します。96 ウェル プレート 2 h の暗く、無臭の環境 (たとえば、化学物質や臭気物質の任意のソースから遠く離れたきれいな空引き出し) に室温で孵化させなさい。
5. 嗅覚刺激
- まず、ルミノ チャンバー内に揮発性芳香物質分子を平衡します。鉱物油 (図 2A) の 10 mL に望ましい集中に臭気物質を希釈します。キャンプ試薬インキュベーション時間の終わりの前に新しい 96 ウェル プレートで (ないセルを含む 1) 臭気物質溶液の 25 μ L を追加します。5 分 (図 2B) (ルミノ記録は不要ですここ) ルミノ室内の室温でこの匂いプレートを孵化させなさい。
- 設定 0 で発光を記録するルミノ 90 のプレートの測定 20 サイクル中に遅延の s 0.7 のサイクル間隔の s。
- プレートを読むと、直前には、商工会議所から匂いプレートを取り外します。(セルを含む井戸で、嗅覚を追加しないでください) セルを含む 96 ウェル プレートのウェル間の匂いを 25 μ l 添加、20 サイクル (図 2C) の 30 分以内のすべての井戸の発光測定をすぐに開始します。
6、ルミノ内残存臭気物質の除去
- ルミノのドアを開きます。真空ポンプに接続されているチューブを挿入します。
- 読書で真空匂い部屋広く (少なくとも 2 時間、できれば一晩) 別に 1 つの実験からにおいの揮発性物質のクロス汚染を避けるために 2 つの匂いの間。次の嗅覚を孵化する前に 5 分間圧縮空気を送ることによって新鮮な空気と交換してください。
7. データ解析
- ルミノ ソフトウェアからデータをエクスポートします。
- 記録するたびに、同じ複製を平均します。またはコントロールの平均値で除して最終的なコントロール (例えば、空のベクター、図 3A代表の結果セクション) に正規化されたまたは応答各録音時 (図 3B の値の平均を計算します。と代表の結果セクション)。
- 0 で平均または応答を割ることによって彼らの基底の活動、各または応答を正規化 (参照してください図 3Cと代表の結果セクション) の各録音時間応答する s。
- 単一または応答値を取得する各または曲線の下の領域を計算します。これを行うには、各 OR の各録音時間の発光値を合計します。
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Representative Results
3 マウス ORs、Olfr746、Olfr124、Olfr1093 の応答で仕切った桂皮アルデヒド蒸気の刺激 (図 3) を使用します。テストの嗅覚受容体の匂いによる活動が特定されたことを保証するために空のベクター コントロール (Rho-pCI) を用いて同時に (図 3A)。蒸気嗅覚刺激に ORs のリアルタイム アクティブ化は、監視対象の以上 20 の測定サイクルだった。それぞれのデータも最初正規化された空のベクター コントロール平均値に各サイクルで (図 3B)。ORs は、OR 依存的にこのアッセイで基底活性の変数のレベルを示すことができる (図 3C) このパラメーターへの応答を正規化が重要になることができることに注意することが重要です。OR の平均値は、t にその応答によって分けることができます = 0 s、ORs の間で比較することができます。(AUC) それぞれの曲線下の領域を計算することによってまたはすべての測定サイクル値 (図 3D) を合計して、各または単一のアクティブ化の値を計算もできます。
また、用量依存的応答は、臭気物質用量の増加を使用してこのメソッドを使用して測定できます。Olfr1377 の同じ手順 (図 4) を記録したアセトフェノン刺激に対する反応を紹介します。アセトフェノン ボラティリティは、25 ° C で 0.44 mm Hg に等しいである、その蒸気圧により評価されます。所定の温度より高い蒸気圧を有する匂い物質はより低い蒸気圧力の匂いよりも揮発性です。アセトフェノンは、結果、適度に揮発性芳香物質とセルにさらされている純粋で、10-810-6 10-410-2で希釈。3 つの高濃度のみ (純粋な 10-2 , 10-4) Olfr1377 をアクティブにすることができます (図 4A)。我々 はまた最近物32のオイゲノールを示されている、純粋な複合刺激が細胞毒性の可能性が高いため、期間中または応答を減少する傾向を示すことを気づくことができます。それにもかかわらず、Olfr1377 の典型的な用量依存性を遵守することができます (図 4B)、EC50 または揮発性化合物を決定するこのメソッドが使えることを示します。
用量依存的実験が実行されると、私たち掃除機をかけないクリーン ルミノ チャンバーに注意してください。ただし、汚染を最小限に抑える高、増加臭気物質線量低いから実験を行った常に。さらに、携帯メディアの匂い分子の実際の濃度は知られていない、この法によって得られた EC50s は必ずしも液体の刺激によって得られるものに匹敵するありません。本手法によって、EC50 値考慮匂いボラティリティ、媒体、臭気物質の溶解度と、匂いと、OR、相性に臭気物質分解の動力学臭気の自然な知覚に近い方であります。アセトフェノンによる Olfr1377 刺激の例では、私たちの蒸気の用量-反応から EC50 値は 161 μ M (0.001874%)、約 50 である折る液体の刺激 (斎藤ら6から 3.28 μ M) よりも高い。液体および蒸気の刺激のこの違いは、サンスら20蒸気刺激が 100 ~ 1000 倍低い EC50 値より液体の刺激を与えたその蒸気刺激の分析によっても報告されました。
図 1: 嗅覚の気化によって匂い物質受容体活性化のリアルタイム モニタ リングの原則です。(A) 96 ウェル プレートが置かれた既に平衡に臭気 (バイオレット クラウド) ルミノを納めた。(B) 匂い分子 (バイオレット) 携帯メディア バッファーの表面でまたはキャビティの Hana3A の細胞膜表面に到達するために解散を蒸発させます。アクセサリ蛋白質 RTP1S (グレー) は OR の細胞表面発現を支持するだけでなく、transfected だった。匂い分子はまたはアゴニスト、OR は活性状態に切り替わるし、バインド Golfアデニル酸シクラーゼ (AC) の活性化とサイクリック AMP (キャンプ; グリーン) の生産をトリガーします。Glosensor 蛋白質 (ルシフェラーゼ) は、キャンプができる、バインドされた後、そのリガンド、ルシフェリン (黄色) をバインドするタンパク質の結合部位を有しています。最終的な複雑な Glosensor 蛋白質/ルシフェリン/キャンプは生産またはアクティブ化を監視して記録された発光です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 嗅覚の気化によって匂い物質受容体活性化のリアルタイム モニタ リングのスケマティック プロトコル。匂い (バイオレット)、鉱物油 (A) で必要な濃度に希釈。ソリューション、transfected 96 ウェル プレート (B) を監視する前に気化嗅覚を持つボリュームを平衡に 5 分間ルミノ室に置かれた新しい 96 ウェル プレートにメッキ。匂いソリューションが transfected 96 ウェル プレートのウェル間の各スペースに戻された (参照してくださいズーム)。ルミノ室 20 サイクルの読み取り平衡蒸気芳香物質 (C) プレートだった。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: のデータ記録後に実行できる正規化の例です。細胞の潜在的なの以外または特定の臭いアクティブ化を識別できるようにトランスフェクション計画 (A) 空のベクター (負) コントロールが挿入されています。それはまた板のバック グラウンド発光に関する情報を提供しました。(B) それぞれまたは応答だった各ウェルの排出値を各板の制御ベクトルの平均値で割ることによって正規化されます。各または発光値計測サイクルに沿って、平均をとる。(C) 応答することができますまた、さらに測定の 1stサイクルの平均値で各サイクルの値を割って基底活動に正規化するか (t = 0 s)。(D) の AUC は、各測定サイクルの排出ガス値を合計することで計算できます。B、C および D、誤差は平均値の標準誤差を表す (SEM, n = 3)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4.メソッドで得られた線量依存応答の例です。(A) アセトフェノンを Olfr1377 の応答は、鉱物油の 5 つの異なる希釈に対して記録された (10 10-8, 10-610-410-20) と嗅覚 (0) せず次を正規化し、図 3に示す正規化プロトコル。(B) 測定データのサイクルは、各希釈の AUC 値に翻訳されました。この図は、木田ら32から変更されています。この図は、クリエイティブ ・ コモンズ帰属 4.0 国際(CC で 4.0) の下でライセンスされます。誤差範囲は、平均値の標準誤差を表す (SEM, n = 3)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 96 ウェル プレートあたり | |
| MEM | 500 Μ L |
| pGlosensor | 10 ng |
| RTP1S | 5 ng |
| または | 75 ng |
表 1: transfection のためミックス。プラスミドの量 (Glosensor 蛋白質、RTP1S や) 1 つの 96 ウェル プレートに使って MEM に追加します。
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Discussion
臭気の認識は根本的に嗅覚受容体の活性化に依存しています。その結果、それらの機能の理解がその揮発性の化学的環境を知覚する脳を使用して、複雑なメカニズムを解読する必要です。しかし、このプロセスの理解は、匂いの in vitro.に対して機能またはレパートリーを選別する手法を確立する難しさによって妨げられています。携帯タグ受容体13,19の創造、発見および受容体輸送タンパク質 (RTPs) OSNs22単位の最適化、ORs の表面と異種発現は、部分的に解決されています。,23. その嗅覚認識パターン6,7,26,33, 活性化など OR 関数を理解するための新しい洞察力をもたらす、最初のスクリーニングの調査が登場しますメカニズム34,35、理論的な三次元構造36,37, 進化38,39, 臭気スペース40,41、 42, と匂い検出43,44,45,46の意味。体外の方法の改善匂いコーディングの解読を高めることができると考えています。そのため、ここで気化した匂い分子またはライセンス認証の監視を許可する新しい機能アッセイを開発しました。
このメソッドの成功は、いくつかの重要なステップに依存します。近年では改善がいくつかの ORs の異種発現が引き続き厳しい嗅覚または反応性に影響を与える可能性があります。流れ cytometry19,24を用いた並列実験で細胞膜に ORs の式を評価できます。異種細胞システム35で今の堅牢な応答ができる表面式の低レベルに注意してください。もう一つの重要なポイントは、臭気物質の汚染を避けるためです。このアッセイの感度を考えると、香水、食品、または以前の試金から匂い分子は無秩序または応答を誘導することによって実験を汚染することができます。だからこそ、できれば一晩、異なる芳香物質の分析を実行する前に、少なくとも 2 時間、ルミノの商工会議所を真空にお勧めです。また、実験で使用される芳香物質の潜在的な細胞毒性を考慮することが重要です。30 分監視中に、または応答の低下する可能性は、匂い自体は細胞の健康に悪影響を及ぼすことを示すことができます。嗅覚細胞毒性、臭気物質に細胞を露出させた後細胞生存率試験を実行することによって評価できます。この問題を軽減するために最後のトリミング、データの解析の記録時間の最初の 10 分だけを考慮することは。私たちに気づいた臭気物質の毒性は、嗅覚の純粋なテスト時や非常に高濃度で主に発生します。我々 の分析の感度鉱油で希釈した臭気物質の検出が可能します。別に 1 つの匂いによって異なります最大応答を引き出すために最適な濃度が 1% 希釈液または応答32の彩度を引き出すことだとわかった。ただし、いくつかの匂い分子低蒸気圧 (およびしたがって低揮発性) を持つことができるし、提案するプロトコルを可能にするいくつかの調整を必要があります。ルミノ室ここで匂いのインキュベーション時間は 5 分に設定されます。我々 はこの時間はチャンバー内に臭気物質揮発性分子を平衡に十分な低揮発性の匂いがより長い培養時間を必要がありますと仮定。
これらの重要なポイントから離れてこのメソッドは、臭気物質の構造と機能の関係を探索するための多くの新しい可能性-または相互作用。このメソッドのリアルタイム監視の面もニオイの知覚の中に発生するイベントの動態を理解するためことができます。例として代謝酵素、カルボキシ エステラーゼ哺乳類47の嗅粘膜に表現されると見つけ 1 d (Ces1d) の機能を探索するのにプロトコルを使用します。この酵素は、カルボン酸とアルコール48エステルに変換する知られています。Ces1d の共トランスフェクションは、この新しいプロトコルが匂い検出における代謝酵素の重要性を探究することに効率的であることを示す32体外またはレスポンス エステル化合物の変調を示した。さらに、このプラットフォームを使用して匂い物質混合物と臭気をより自然な設定で表示する方法を調査するより複雑な芳香物質の相互作用を理解することで今後の研究が可能になります。最後に、ORs による匂い分子の検出はまた匂いセンサーの開発に高い関心です。体制が匂い分子気相の提示を検出できることを示すこと、この方法は小型のバイオ センサーの開発プロセスの最初のステップです。
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Disclosures
陛下、H. K マルチメディアモデルシミュレーション特許を出願 2016 年 10 月 27 日に本作に関連します。
Acknowledgments
この作品は、NIH (DC014423 および DC016224) および防衛先端研究プロジェクト庁 RealNose プロジェクトからの補助金によって支えられました。YF は才能の研究 (R2801) の循環を加速させる戦略的な国際ネットワークを進めるため JSP プログラムからの財政支援とデューク大学に滞在しました。サハル Kaleem は、原稿の編集を感謝いたします。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05 % trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | 0.05% Trypsin - EDTA (1x), phenol red - store at 4°C |
| 100 mm cell culture dish | BD Falcon | 353003 | 100 mm x 20 mm cell culture dish |
| 15 mL tube | BD Falcon | 352099 | 17 mm x 120 mm conical tubes |
| 96-well plate | Corning | 3843 | 96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | Amphotericin B 250 µg/mL - store at 4 °C |
| centrifuge machine | Jouan | C312 | Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL |
| Class II Type A/B3 fumehood | NUAIRE | NU-407-500 | fumehood for cell culturing |
| FBS | Gibco | 16000-044 | Fetal Bovine Serum - store at -20 °C |
| GloSensor cAMP Reagent | Promega | E1290 | GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate - store at -20 °C |
| Incubator 37 °C; 5 % CO2 | Fisher Scientific | 11-676-604 | Incubator for cell culturing |
| Lipofectamine 2000 reagent | Invitrogen | 11668-019 | Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent - store at 4 °C |
| Luminometer POLARstar OPTIMA | BMG LABTECH | discontinued | 96 well plate reader for luminescence |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | Solvent for odorants - store at room temperature |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Corning cellgro | 10-010-CV | Minimum Essential Medium Eagle with Earle’s salts & L-glutamine - store at 4 °C |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin - store at -20 °C |
| pGlosensor | Promega | E2301 | pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid - store at 4 °C |
| Phase contrast microscope | Leica | 090-131.001 | phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives |
| RTP1S | H. Matsunami lab | - | 100 ng/µL plasmid - store at 4 °C |
References
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