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Neuroscience

气相臭受体活化的实时体外监测

Published: April 23, 2019 doi: 10.3791/59446
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,3,5,6
1Department of Molecular Genetics and Microbiology, Duke University Medical Center, 2Department of Biotechnology and Life Science, Tokyo University of Agriculture and Technology, 3Department of Neurobiology, Duke University Medical Center, 4Department of Mechanical Systems, Engineering, Tokyo University of Agriculture and Technology, 5Institute of Global Innovation Research, Tokyo University of Agriculture and Technology, 6Duke Institute for Brain Sciences, Duke University

Summary

从生理上讲, 气味受体是由在气相中吸入的气味分子激活的。然而, 大多数体外系统使用液相气味刺激。在这里, 我们提出了一种方法, 允许实时体外监测气味受体激活对气味刺激在气相。

Abstract

嗅觉感知始于气味与嗅觉感觉神经元 (OSN) 表达的气味受体 (OR) 的相互作用。气味识别遵循组合编码方案, 其中一个 OR 可以由一组气味激活, 一个气味可以激活 Or 的组合。通过这种组合编码, 生物体可以检测和区分无数的挥发性气味分子。因此, 在给定浓度下的气味可以用 Or 的激活模式来描述, 这是指每个气味所特有的。从这个意义上说, 破解大脑用来感知气味的机制需要理解气味或相互作用。这就是为什么嗅觉社区致力于 "去孤儿" 这些受体。传统的体外系统用于识别气味或相互作用, 使用了与气味的培养细胞介质, 这与自然检测气味的自然检测通过蒸汽气味溶解到鼻黏膜之前与 ORs。在这里, 我们描述了一种新的方法, 允许实时监测或激活通过气相气味。我们的方法依赖于使用光泽度测定的发光方法来测量 cAMP 释放。它弥合了目前体内和体外方法之间的差距, 并为仿生挥发性化学传感器提供了基础。

Introduction

嗅觉使陆地动物能够与它们易挥发的化学环境相互作用, 从而激发行为和情绪。从根本上说, 气味检测过程始于气味分子与嗅觉系统的第一次相互作用, 达到气味受体 (ORs)的水平1。在哺乳动物中, Or 在位于嗅觉上皮2中的嗅觉感觉神经元 (Osn) 中单独表达.它们属于 g 蛋白偶联受体 (GPCR) 家族, 更精确地属于罗多普素类亚家族 (也称为 a 类)。ORs 与刺激 g 蛋白 G f结合, 其激活导致 camp 产生, 然后打开循环核苷酸门控通道和动作电位的产生。人们承认, 气味感知依赖于激活 ors3, 4 的特定模式, 因此气味识别遵循组合编码方案, 其中一个 or 可以被一组气味激活, 一个气味可以激活运算。通过这种组合编码, 人们假设生物体可以检测并区分无数挥发性气味分子。了解气味是如何被感知的关键之一是了解如何以及哪些 ORs 是由给定的气味激活的。

为了阐明气味或相互作用, 体外功能检测发挥了至关重要的作用。通过使用各种体外、体外和体内功能检测 5, 6, 7, 鉴定孤儿的激动剂气味配体 (or 去孤儿) 是一个非常活跃的领域. , 8,9,10,11,12, 13,14, 15,16, 17岁

体外检测系统最适合于 Or 的详细功能表征, 包括识别 Or 的功能域和关键残基, 以及潜在的工程应用。然而, 进一步开发有价值的 ORs 体外系统一直是一个挑战, 部分原因是难以培养 Osn 和在异源细胞中的 ORs 的功能表达。第一个挑战是建立协议, 允许在气味或相互作用的映射中表达功能 Or 的细胞表面。一些独立小组采用了各种办法5、6、7、8、9、10、11、12、 14,18,19,20。K拿特沃斯特等人在标记为 ors n 端的结果中, 用缩短的视紫红质 (rhor 标记) 序列, 观察到人类胚胎肾 (HEK) 细胞13的表面表达得到改善。对附加到 or 序列的标记所做的更改仍然是为改进 or 表达式和功能19、21 而探索的路径。Saito 等人随后确定了促进或贩运的受体转运蛋白 1 (rtp1) 和 RTP2。22一个较短的 RTP1 版本, 称为 RTP1S, 也被证明比原来的蛋白质23更有效。稳定表达 g f、reep1、RTP1 和 RTP2 24的细胞系 (Hana3A) 的发展, 再加上使用环状单磷酸腺苷 (camp) 记者, 可以识别气味或相互作用.RTP 系列蛋白质促进 ors 细胞表面表达的机制仍有待确定。

这些既定的方法之一是, 他们依靠在液相气味刺激, 这意味着气味是预先溶解到刺激介质, 并通过取代培养基刺激细胞。这与气味分子在气相到达嗅觉上皮并通过溶解到鼻黏膜中激活 Or 的生理条件有很大的不同。为了更接近生理相关的刺激暴露, Sanz 等人20 提出了一种基于蒸汽刺激的方法, 应用一滴气味溶液挂在放置在细胞井顶部的塑料薄膜的内脸下。他们通过监测荧光强度记录钙的反应。这种方法是首次使用气相气味刺激, 但它不允许大的筛选 OR 激活。

在这里, 我们开发了一种新的方法, 通过光泽度分析, 可以通过气相气味刺激实时监测体外或体外激活 (图 1)。这种检测方法以前曾用于液体气味刺激18,19,25,26, 27,28, 29,30,31. 在平板读数之前, 发光计的监测室首先与蒸发气味平衡 (图 1a)。然后将气味分子溶解到缓冲液中, 沐浴表示有兴趣的 Or、RTP1S 和光泽细胞蛋白的 Hana3A 细胞 (图 1b)。如果气味剂是 OR 的激动剂, OR 将切换到激活的构象并绑定 Gf,激活腺苷环化酶 (ac), 并最终导致 camp 水平上升。这种上升的 cAMP 将结合和激活光泽蛋白, 产生发光催化荧光素。然后, 该发光被测光仪记录, 并启用或激活监测。这种方法在 OR 脱非的背景下引起了极大的兴趣, 因为它使体外系统更接近于气味的自然感知。

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Protocol

1. Hana3A 细胞培养

  1. 制备 M10 (最小必需培养基 (MEM) 加 10% v/v 胎儿牛血清 (FBS)) 和 M10PSF (M10 + 100μgml penicilin 链霉素和1.25μgml 两性霉素 B)。
  2. 在37°c 和5% 二氧化碳 (CO 2) 的孵化器中, 在100毫米细胞培养盘中培养 M10PSF 10 毫升中的细胞.
  3. 每2天以20% 的比例分割细胞: 当在相对照显微镜下观察到100% 的细胞融合 (约 1.1 x 10 7 细胞) 时, 渴望培养基, 并用10毫升磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 轻轻清洗细胞。
  4. 吸入 PBS, 加入3毫升0.05% 的胰蛋白酶二胺四乙酸 (EDTA, 0.48 mM)。让行为大约 1分钟, 直到细胞脱离板块。
  5. 加入5毫升的 ML, 以灭活胰蛋白酶, 并最终通过上下移液分离仍连接在盘子上的细胞。
  6. 将体积 (8 毫升) 转移到一个15毫升的管和离心机, 在 200 x g下 5分钟, 将上清液吸走, 然后通过上下移液将细胞重新悬浮到 M10PSF 的5毫升中, 以打破任何细胞质量。避免在试管中产生气泡。
  7. 在新的100毫米细胞培养盘中转移1毫升的再悬浮细胞溶液, 并加入9毫升的新鲜 M10PSF。在37°c 和 5% co 2 下孵化.

2. 转染细胞的制备

  1. 通过在相对比显微镜下观察细胞的融合或细胞数量来评估它们。一个盘子至少需要10% 的融合 (大约 1.1 x 10 6 细胞)。
  2. 用10毫升的 PBS 吸气和轻轻清洗细胞。吸收 PBS, 并添加3毫升的 EDTA。让我们在室温下行动大约 1分钟, 直到细胞与盘子分离。
  3. 加入5毫升的 ML, 以灭活胰蛋白酶, 并最终通过上下移液分离仍连接在盘子上的细胞。将体积 (8 毫升) 转移到一个15毫升管和离心机在 200 x g 的时间5分钟。
  4. 通过上下移液将细胞吸收到 M10PSF 的5毫升中, 以打破任何细胞质量, 从而将细胞重新悬浮到 M10PSF 中。避免在试管中产生气泡。
  5. 根据要转染的板的数量, 在具有适当的对应体积的 M10PSF 的储层中转移适当数量的细胞。一个96孔板应该镀上一半的100% 汇合100毫米盘 (约 1.1 x 10 6 细胞) 在 M10PSF 中稀释, 以达到6毫升的总体积.对于一个96孔板, 从100% 汇流100毫米盘开始, 从5毫升的再悬浮细胞中加入 500Μl, 到新鲜 M10PSF 的 5.5 mL。混合细胞和 M10PSF, 而不产生气泡。
  6. 使用多通道移液器将悬浮细胞的50Μl 插入96孔板的每一口井。在37°c 和 5% CO2下隔夜孵化。

3. 质粒转染

  1. 在相对比显微镜下观察96孔板, 以确保细胞融合在30% 至50% 之间。
  2. 按照表 1中的体积, 准备包含整个板材共有的质粒 (RTP1S、Or 和光泽蛋白, 见材料表) 的第一次转染混合物。请注意, 如果有几个 Or, 应将 Rho-tagged 的数量除以 or 的数量。
    请注意:我们强烈建议在实验计划中添加一个空的矢量负控制 (这里的 Rho-pCI) 和任何阳性控制 (或已知对测试的气味做出反应)。
  3. 制备含有 500μl MEM 和20Μl 的脂质胺2000试剂的第二次转染混合物 (适用于一个96孔板, 见材料表)。将第二种混合物加入第一个混合物, 通过上下移液轻轻混合, 在室温下孵育15分钟。加入5毫升的 ML, 轻轻搅拌。
  4. 将先前盘片96孔板中的 M10PSF 更换为最终转染介质的50ΜL。按照步骤6中所述的步骤, 在设定为37°C 和 5% CO2的孵化器中孵育, 并在夜间真空测量仪的腔。

4. 基板孵化

  1. 在相对比显微镜下观察96孔板, 以确保细胞融合在60% 至100% 之间。制备含 10 mm 羟基乙基哌嗪磺酸 (HEPES) 和 5 mM d-葡萄糖的汉克平衡盐溶液 (HBSS) 的刺激溶液。
  2. 将 cAMP 试剂 (见材料表)溶液稀释75μl 至2.75 毫升的刺激溶液。从96孔板上取出转染介质, 通过在每口井中加入50Μl 的新鲜刺激溶液清洗细胞。
  3. 去除刺激液, 在每口井中加入步骤4.2 中制备的 25Μl camp 试剂溶液。在室温下, 在黑暗和无异味的环境中 (例如, 远离化学品或任何气味源的干净的空抽屉) 孵化2小时。

5. 臭泡刺激

  1. 首先, 用挥发性气味分子平衡发光计室。将气味稀释到所需浓度的10毫升矿物油 (图 2a)。在 cAMP 试剂孵育时间结束前, 在新的96孔板 (而不是含有细胞的板) 中加入25Μl 的气味溶液。在室温下在灯管室中将此气味板孵化 5分钟 (图 2b) (此处不需要进行光表记录)。
  2. 设置测光仪以记录在20个周期的板材测量过程中延迟为0的发光, 并在周期间隔之间间隔0.7秒。
  3. 在阅读盘子之前, 将气味板从房间里取出。在含有电池的96孔板的井间添加25Μl 的气味 (不要在含有电池的井中添加气味), 并在30分钟内快速开始对所有井进行20个周期的发光测量 (图 2c)。

6. 去除照明仪内残留的气味

  1. 打开计价器的门。插入连接到真空泵的管子。
  2. 在两个气味之间广泛使用阅读室中的真空气味 (至少 2小时, 最好是夜间), 以避免气味挥发物从一个实验到另一个实验的交叉污染。在孵育下一个气味之前, 在5分钟内发送压缩空气, 以新鲜空气取代新鲜空气。

7. 数据分析

  1. 从发光计软件导出数据。
  2. 每个录制时间的相同 OR 的平均复制。通过将控件平均值除以每个记录时间的 or 平均值, 计算对任何最终控件的归一化或响应 (例如, 空向量、图 3a 和代表性结果部分) (图 3b)和具有代表性的结果部分)。
  3. 通过将0时的平均 OR 响应除以每个记录时间响应, 使每个 OR 对其基本活动的响应规范化 (参见图 3c和代表性结果部分)。
  4. 计算每个 OR 曲线下的区域, 以获得单个 OR 响应值。为此, 请为每个 OR 的每个录制时间的所有发光值求和。

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Representative Results

我们用肉桂醛蒸汽刺激筛选了三个小鼠 ORs 的反应, Olfr746、Olfr124 和 Olfr746 (图 3)。同时, 我们使用空矢量控制 (Rho-pCI) 来确保被测试的 Or 的气味诱导的活动是特定的 (图 3a)。在20个测量周期中监测了蒸汽气味刺激下的 ORs 实时激活情况。每个井的数据首先被归一化为每个周期的空矢量控制平均值 (图 3b)。需要注意的是, Or 可以以依赖于 or 的方式显示此检测中的不同水平的基础活性, 并且也必须使其对此参数的响应正常化 (图 3c)。OR 的平均值可以除以它在 t = 0 s 时的响应, 允许在 Or 之间进行比较。还可以通过将所有测量周期值求和来计算每个 OR 的曲线 (AUC) 下的面积 (图 3d), 从而计算每个 or 的单个激活值。

此外, 剂量依赖性的反应可以通过这种方法测量使用增加气味剂量。我们提出了 Olfr1377 对在同一程序后记录的乙酮刺激的反应 (图 4)。乙苯酮挥发性可以通过其蒸气压来评估, 在25°c 时, 其蒸气压等于 0.44 mm 汞。在给定的温度下, 蒸汽压力较高的气味比蒸汽压力较低的气味更不稳定。因此, 乙苯酮是一种中等挥发性的气味, 暴露在细胞中, 在 10-2、10-4、10-6 和 10-8时稀释.只有三种浓度较高的浓度 (纯, 10-2和10-4) 能够激活 Olfr1377 (图 4a)。我们还可以注意到, 纯化合物刺激显示出在一段时间内减少 OR 反应的趋势, 很可能是由于细胞毒性, 正如最近的一份出版物32中所显示的丁香酚。然而, 我们可以观察到 Olfr1377 的典型剂量依赖性行为 (图 4b), 表明这种方法也可以用来确定 or 对挥发性化合物的 ec50。

请注意, 当进行剂量依赖性实验时, 我们不会对发光计室进行真空清洗。然而, 实验总是进行从低到高, 增加气味剂量, 以尽量减少污染。此外, 由于细胞介质中气味分子的实际浓度尚不清楚, 这种方法获得的 Ec50 不一定与液体刺激获得的 Ec50 相当。我们的方法确定的 EC50 值考虑到了气味的挥发性、气味溶解到介质中的动力学、气味的溶解度以及气味与 OR 之间的亲和力, 这些都更接近于气味的自然感知。对于我们的乙苯酮刺激 Olfr1377 的例子, 我们蒸汽剂量响应的 EC50 值为 161Μm (0.00184%), 比液体刺激高50倍左右 (Saito 等人 3.28Μm).Sanz 等人在其蒸汽刺激试验中也报告了液体和蒸汽刺激之间的差异, 其中蒸汽刺激给出的 ec50 值比液体刺激低100至1000倍。

Figure 1
图 1: 采用蒸汽气味实时监测气味受体活化的原则.(A) 96 孔板被放置在已经与气味 (紫罗兰色云) 的灯室中。(B) 在细胞介质表面溶解的蒸发气味分子 (紫色) 到其到达在 Hana3A 细胞膜表面的 or 腔。并转染辅助蛋白 RTP1S (灰色), 有利于 OR 的细胞表面表达。如果气味分子是 OR 激动剂, OR 切换到激活状态并将 Gf 结合, 从而触发腺苷环化酶 (ac) 的活化和循环 amp (camp; 绿色) 的产生。光泽酶 (荧光素酶) 具有 camp 的结合位点, 一旦结合, 使蛋白质结合其配体, 荧光素 (黄色)。最后的复合体光泽蛋白/荧光素/camp 产生的发光, 记录, 以监测 OR 激活。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 用于通过蒸汽气味实时监测气味受体激活的原理图方案.气味 (紫罗兰色) 在矿物油 (a) 中按所需浓度稀释。然后将溶液镀到一个新的96孔板中, 将其放入发光室 5分钟, 以平衡与蒸汽除臭剂的体积, 然后再监测转染的96孔板 (b)。气味溶液被移入转染96孔板的井之间的每个空间 (见缩放)。然后在发光二极管室平衡蒸汽气味 (c) 中读取该板20个周期。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 数据记录后可以执行的规范化示例.(A) 在转染计划中插入了一个空矢量 (负) 控件, 以便能够识别细胞的任何潜在的非或特定气味激活。它还提供了关于板的背景发光的信息。(B) 然后, 通过将每口井的排放值除以每个板块中控制向量的平均值, 对每个 or 响应进行归一化。然后沿着测量周期对每个 OR 的发光值进行平均。(C) or 响应也可以通过进一步将每个周期值除以第一个测量周期的平均值 (t = 0 s) 来归一化为其基本活动。(D) 经计算的是每个测量周期的排放值。对于 B、C 和 D, 误差条表示平均值的标准误差 (SEM, n = 3)。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4.该方法获得的剂量依赖性响应示例。(A) 在矿物油 (100、10-2、10-4、10-6、10-8) 和无气味 (0) 中记录了 olfr1377 对乙酮的反应, 并在规范化协议如图 3所示。(B) 测量周期内的数据被转换为每次稀释的 auc 值。这一数字已从 Kida 等人32人的报告中修改。此数字是在知识共享归因4.0 国际(cc by 4.0) 下获得许可的。错误条表示平均值的标准误差 (SEM, n = 3)。请点击这里查看此图的较大版本.

每96孔板
Mem 500μl
普格洛森索 10纳克
RTP1S 5纳克
或 75纳克

表 1: 用于转染的混合.添加到 MEM 以转染到一个96孔板的质粒 (光泽蛋白、RTP1S 和 OR) 的数量。

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Discussion

气味的感知从根本上取决于 ORs 的激活。因此, 需要了解它们的功能, 以破解大脑用来感知其挥发性化学环境的复杂机制。然而, 由于难以建立一个可靠的方法来筛选 OR 曲目的功能, 以防止在体外的气味, 这阻碍了对这一过程的理解.通过创建标记受体13、19以及发现和优化 osn22中表达的受体-运输蛋白 (rtp), 部分解决了 or 的细胞表面和异源表达问题。,23. 随后出现了第一批筛选研究, 为我们对 or 功能的理解带来了新的见解, 例如它们的气味识别模式6、7、26、33、激活机制34,35, 理论三维结构36,37, 进化38,39, 气味空间40,41, 42, 以及气味检测中 43、44、45、46 的影响。我们相信改进体外方法可以促进气味编码的破译。因此, 我们在这里开发了一种新的功能分析, 允许监测或激活的蒸发气味分子。

此方法的成功取决于几个关键步骤。虽然近年来有了改进, 但一些 Or 的异源表达仍然困难, 这可能会影响或对气味的反应。在流式细胞仪 19,24的平行实验中, 可以评估 ors 在细胞膜上的表达。请注意, 在异源细胞系统35中, 低水平的表面表达仍然会产生鲁棒的反应。另一个关键点是避免气味污染。考虑到这种检测的敏感性, 任何香水、食物或以前的检测产生的气味分子都会通过诱导不受控制的或有反应而污染实验。这就是为什么我们建议在使用不同的气味进行检测之前, 将发光计的腔内吸尘至少 2小时, 最好是一夜之间。考虑实验中使用的气味的潜在细胞毒性也很重要。在30分钟的监测过程中, OR 的反应可能减少, 这可以表明气味本身对细胞健康有负面影响。在将细胞暴露在气味中之后, 可以通过进行细胞活力分析来评估气味细胞毒性。为了缓解此问题, 可以只考虑记录时间的前10分钟进行数据分析, 裁剪结束。我们注意到, 气味毒性主要发生在气味被测试为纯净或浓度非常高的时候。我们的检测灵敏度允许检测在矿物油中稀释的气味。引起最大反应的最佳浓度因气味的不同而不同, 但我们观察到1% 的稀释足以引起 OR 反应32的饱和度.然而, 一些气味分子可以拥有较低的蒸汽压力 (因此波动性较低), 可能需要对所提出的协议进行一些调整。在这里的发光计室中, 气味的孵化时间设置为5分钟。我们认为, 这段时间足以使室内与气味挥发性分子平衡, 但低挥发性气味可能需要更长的孵育时间。

除了这些临界点外, 这种方法还为探索气味或相互作用的结构-函数关系带来了许多新的可能性。这种方法的实时监测方面还可以理解在气味感知过程中发生的事件的动力学。例如, 我们使用该协议来探索代谢物酶的功能, 羧基酯酶 1d (Ces1d), 被发现在哺乳动物47的嗅觉黏膜中表达。据悉, 这种酶能将酯类转化为羧酸和酒精48。Ces1d 的共同转染显示了体外或对酯类化合物反应的调节,32表明这一新的协议在探索代谢酶在气味检测中的重要性方面是有效的。此外, 利用这个平台来研究气味混合物, 以及气味在更自然的环境中的呈现方式, 将使今后能够进行研究, 了解更复杂的气味相互作用。最后, 用 Or 检测气味分子也是气味传感器开发中的一个很大的问题。在证明我们的系统能够检测到蒸汽相中的气味分子之后, 这种方法是微型生物传感器开发过程中的第一步。

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Disclosures

Y. f.、H. k. 和 h. m. 于2016年10月27日提交了与这项工作有关的专利申请。

Acknowledgments

这项工作得到了国家卫生研究院 (DC014423 和 DC016224) 和国防高级研究项目机构现实鼻子项目的赠款。YF 留在杜克大学, 得到 JPS 推进战略国际网络以加快人才培养人员流通的财政支持 (R2801)。我们感谢萨哈尔·卡莱姆编辑的手稿。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05 % trypsin-EDTA Gibco 25300-054 0.05% Trypsin - EDTA (1x), phenol red - store at 4°C
100 mm cell culture dish  BD Falcon 353003 100 mm x 20 mm cell culture dish 
15 mL tube BD Falcon 352099 17 mm x 120 mm conical tubes
96-well plate Corning 3843 96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene
Amphotericin Gibco 15290-018 Amphotericin B 250 µg/mL - store at 4 °C
centrifuge machine Jouan C312 Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL
Class II Type A/B3 fumehood NUAIRE NU-407-500 fumehood for cell culturing
FBS Gibco 16000-044 Fetal Bovine Serum - store at -20 °C
GloSensor cAMP Reagent Promega E1290 GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate - store at -20 °C
Incubator 37 °C; 5 % CO2 Fisher Scientific 11-676-604 Incubator for cell culturing
Lipofectamine 2000 reagent Invitrogen 11668-019 Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent - store at 4 °C
Luminometer POLARstar OPTIMA BMG LABTECH discontinued 96 well plate reader for luminescence
Mineral oil Sigma M8410 Solvent for odorants - store at room temperature
Minimum Essential Medium (MEM) Corning cellgro 10-010-CV Minimum Essential Medium Eagle with Earle’s salts & L-glutamine - store at 4 °C
Penicillin/Streptomycin Sigma Aldrich P4333 Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin - store at -20 °C
pGlosensor Promega E2301 pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid - store at 4 °C
Phase contrast microscope Leica 090-131.001 phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives
RTP1S H. Matsunami lab - 100 ng/µL plasmid - store at 4 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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神经科学 第146期 蒸汽刺激 气味感受器 实时激活 气味分子 组合代码 功能分析
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de March, C. A., Fukutani, Y., Vihani, A., Kida, H., Matsunami, H. Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase. J. Vis. Exp. (146), e59446, doi:10.3791/59446 (2019).

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