Summary
Fisiologicamente, odorant recettori sono attivati da molecole odorant inalati in fase gassosa. Tuttavia, più sistemi in vitro utilizzano stimolazione odorant fase liquida. Qui, presentiamo un metodo che consente il monitoraggio in tempo reale in vitro dell'attivazione del recettore odorant stimolazione odorant in fase vapore.
Abstract
Percezione olfattiva inizia con l'interazione di odorizzazione con recettori odorant (o) espressi dai neuroni sensoriali olfattivi (OSN). Riconoscimento di odore segue uno schema di codifica combinatorio, dove uno o può essere attivato da un set di odorizzazione e una odorant può attivare una combinazione di ORs. Attraverso tale codifica combinatoria, organismi possono rilevare e discriminare tra una miriade di molecole odorose volatili. Così, un odore a una data concentrazione può essere descritto da un modello di attivazione di ORs, che è specifico per ogni odore. In questo senso, i meccanismi che il cervello utilizza per percepire odore richiede la comprensione odorant di cracking-interazioni OR. Ecco perché la comunità di olfatto è impegnata a "de-orphanize" questi recettori. Sistemi in vitro convenzionali utilizzati per identificare odorant- o interazioni hanno utilizzato incubazione delle cellule media con odorant, che è distinto dal rilevamento naturale degli odori tramite dissoluzione odoranti del vapore nella mucosa nasale prima di interagire con ORs. Qui, descriviamo un nuovo metodo che consente il monitoraggio in tempo reale di attivazione OR via odoranti di fase del vapore. Il nostro metodo si basa sul rilascio campo di misura di luminescenza usando l'analisi di Glosensor. E colma le lacune attuali tra approcci in vivo e in vitro e fornisce una base per un sensore chimico volatile biomimetici.
Introduction
Il senso dell'olfatto permette animali terrestri interagire con il loro ambiente chimico volatile per unità comportamenti ed emozioni. Fondamentalmente, il processo di rilevamento di odore comincia con la prima interazione di molecole odorant con il sistema olfattivo, a livello di odorizzante recettori (ORs)1. Nei mammiferi, ORs individualmente sono espressi nei neuroni sensoriali olfattivi (OSNs) situati in epitelio olfattivo2. Appartengono alla famiglia del ricevitore (GPCR) accoppiati a proteine G e più precisamente alla rodopsina-come Sub-famiglia (anche chiamato classe A). Coppia di ORs con stimolatore G proteine Golf cui attivazione porta alla produzione di cAMP seguita dall'apertura di canali di gated nucleotide ciclico e la generazione di potenziali d'azione. È accettato che una percezione di odore si basa su un modello specifico di attivato ORs3,4 e quindi riconoscimento di odore segue uno schema di codifica combinatorio, dove uno o può essere attivato da un set di odorizzazione e una odorant può attivare un combinazione di ORs. E attraverso tale codifica combinatoria, è postulato che gli organismi possono rilevare e discriminare tra una miriade di molecole odorose volatili. Una delle chiavi per comprendere il modo in cui sono percepiti odori è capire come e quali ORs sono attivati da un determinato odore.
Nel tentativo di delucidare odorant- o interazioni, analisi funzionale in vitro hanno giocato un ruolo essenziale. L'identificazione di ligandi odorose agonista per orfano ORs (de-orphanization OR) è stato un campo molto attivo negli ultimi venti anni, attraverso l'uso di vari in vitro, ex vivo e saggi funzionali in vivo5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17.
Sistemi di analisi in vitro sono più adatti per la dettagliata caratterizzazione funzionale di ORs, inclusa l'identificazione i domini funzionali e residui critici di ORs, nonché potenziali applicazioni di ingegneria. Tuttavia, ulteriore sviluppo di sistemi in vitro preziosi per ORs è stata una sfida, in parte a causa di difficoltà con coltura OSNs ed espressione funzionale di ORs in cellule eterologhe. La prima sfida era stato di stabilire protocolli consentiti per l'espressione di superficie delle cellule di ORs funzionale nella mappatura della odorant-interazioni OR. Un numero di gruppi indipendenti hanno utilizzato vari approcci5,6,7,8,9,10,11,12, 14,18,19,20. Uno dei primi risultati è stato effettuato da Krautwurst et in tag N-terminale di ORs con una sequenza abbreviata della rodopsina (Rho-tag) e osservato una miglioramento espressione di superficie di cellule embrionali umane del rene (HEK)13. Variazioni apportate il cartellino attaccato alla sequenza OR è ancora un percorso esplorato per migliorare OR espressione e funzionalità19,21. Saito et al.. quindi identificato il recettore-il trasporto della proteina 1 (RTP1) e RTP2 che facilitano il traffico di OR. 22 una versione più breve di RTP1, chiamato RTP1S, ha anche dimostrata di essere ancor più efficace che la proteina originale23. Lo sviluppo di una linea cellulare (Hana3A) che esprime stabilmente Golf, REEP1, RTP1, RTP2 24, accoppiato con l'uso di adenosina monofosfato ciclico (cAMP) reporter ha permesso la identificazione di odorant-interazioni OR. Il meccanismo da cui la famiglia RTP di proteine promuove espressione di superficie delle cellule di ORs rimane essere determinata.
Un avvertimento di questi metodi consolidati è che si basano sulla stimolazione odorant in fase liquida, ovvero odoranti sono pre-disciolti in un mezzo di stimolazione e stimolano le cellule sostituendo il mezzo. Questo è molto diverso dalle condizioni fisiologiche dove molecole odorant raggiungere l'epitelio olfattivo in fase vapore e attivare ORs di dissoluzione nella mucosa nasale. Per assomigliare più molto attentamente l'esposizione stimolo fisiologicamente rilevanti, Sanz et al.20 proposto un test basato sulla stimolazione vapor applicando una goccia di soluzione di odorizzante per appendere sotto la faccia interna di una pellicola di plastica posizionata sulla cima di pozzi di cella. Hanno registrato le risposte di calcio monitorando l'intensità di fluorescenza. Questo metodo è stato il primo ad utilizzare la stimolazione odorant fase di aria, ma non consentiva una grande proiezione di attivazione OR.
Qui, abbiamo sviluppato un nuovo metodo che consente il monitoraggio in tempo reale di attivazione in vitro OR via stimolazione odorant fase di vapore mediante l'analisi di Glosensor (Figura 1). Questo test è stato utilizzato in precedenza nel contesto del liquido odorizzante stimolazione18,19,25,26,27,28,29, 30 , 31. la sezione monitoraggio del luminometro prima è equilibrata con odorant vaporizzato prima piastra di lettura (Figura 1A). Molecole odorant sono quindi solvatato nel buffer, balneazione Hana3A cellule che esprimono l'OR di interesse, RTP1S e le proteine Glosensor (Figura 1B). Se l'odorant è un agonista dell'OR, OR passare a una conformazione attivata e associare il Golf, attivando l'adenilato ciclasi (AC) e infine causare livelli di cAMP a salire. Questo cAMP aumentante sarà associare a e attivare la proteina di Glosensor per generare luminescenza catalizzando luciferina. Questa luminescenza viene quindi registrato dal luminometro e consente il monitoraggio di attivazione OR. Questo metodo è di grande interesse nel contesto del deorphanization OR come porta sistemi in vitro più vicino alla naturale percezione di odori.
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Protocol
1. Hana3A cellule di cultura
- Preparare M10 (Medium essenziale minimo (MEM) più 10% siero bovino fetale di v/v (FBS)) e M10PSF (M10 plus 100 µ g/mL di penicillina-streptomicina e 1.25 µ g/mL amfotericina B).
- Coltura di cellule in 10 mL di M10PSF in una piastra di coltura cellulare di 100 mm in un incubatore a 37 ° C e 5% di anidride carbonica (CO2).
- Dividere le celle ogni 2 giorni con un rapporto di 20%: quando la confluenza del 100% delle cellule (circa 1,1 x 107 cellule) è osservata con un microscopio a contrasto di fase, i media di aspirare e lavare le cellule delicatamente con 10 mL di tampone fosfato salino (PBS).
- Aspirare la PBS e aggiungere 3 mL di 0.05% tripsina-acido etilendiamminotetraacetico (EDTA, 0,48 mM). Lasciare agire per circa 1 min, fino a quando le cellule si dissociano dalla piastra.
- Aggiungere 5 mL di M10 per inattivare la tripsina e finalmente staccare le cellule ancora attaccate alla piastra pipettando su e giù.
- Trasferire il volume (8 mL) in una provetta da 15 mL e centrifugare a 200 x g per 5 min. aspirare il supernatante e risospendere le cellule in 5 mL di M10PSF pipettando su e giù per rompere qualsiasi cellula massa. Evitare la creazione di bolle nel tubo.
- Trasferire 1 mL della soluzione di sedimento cellule in una piastra di coltura cellulare 100mm nuovo e aggiungere 9 mL di M10PSF fresco. Incubare a 37 ° C e 5% CO2.
2. preparazione delle cellule per la transfezione
- Valutare la confluenza, o il numero di celle, osservandoli con un microscopio a contrasto di fase. Almeno 10% confluenza (circa 1,1 x 106 cellule) è necessaria per una piastra.
- I media di aspirare e lavare le cellule delicatamente con 10 mL di PBS. Aspirare la PBS e aggiungere 3 mL di EDTA. Lasciare agire per circa 1 min a temperatura ambiente, fino a quando le cellule si dissociano dalla piastra.
- Aggiungere 5 mL di M10 per inattivare la tripsina e finalmente staccare le cellule ancora attaccate alla piastra pipettando su e giù. Trasferire il volume (8 mL) in una provetta da 15 mL e centrifugare a 200 x g per 5 min.
- Aspirare il supernatante e risospendere le cellule in 5 mL di M10PSF pipettando su e giù per rompere qualsiasi cellula massa. Evitare la creazione di bolle nel tubo.
- A seconda del numero di piastre per essere transfected, trasferire una quantità appropriata di cellule in un serbatoio con il corretto volume corrispondente di M10PSF. Una piastra a 96 pozzetti deve essere placcata con 1/10 di un piatto di confluenti 100 mm 100% (circa 1,1 x 106 cellule) diluito in M10PSF raggiungere un volume totale di 6 mL. Per una piastra a 96 pozzetti a partire con un piatto di 100 mm 100% confluenza, aggiungere 500 µ l dai 5 mL di sedimento centrifuga cellule a 5,5 mL di M10PSF fresco. Mescolare le cellule e M10PSF senza generare bolle d'aria.
- Pipettare 50 µ l di cellule sospese in ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti usando una pipetta multicanale. Incubare per una notte a 37 ° C e 5% CO2.
3. plasmide transfezione
- Osservare la piastra a 96 pozzetti con un microscopio a contrasto di fase per assicurare una confluenza di cella tra 30% e 50%.
- Preparare una miscela di transfezione prima che contiene i plasmidi comuni a tutta la piastra (RTP1S, o Glosensor della proteina, Vedi Tabella materialie) seguendo i volumi nella tabella 1. Si noti che la quantità di Rho-etichetta OR dovrebbe essere diviso per il numero di ORs se diversi ORs.
Nota: Vi consiglio vivamente di aggiungere un controllo negativo vettore vuoto (qui Rho-pCI) e qualsiasi controllo positivo (OR noto a rispondere per la testata odorant) per il piano di esperimento. - Preparare una miscela di transfezione seconda contenente 500 µ l di MEM e 20 µ l di reagente di Lipofectamine 2000 (valido per una piastra a 96 pozzetti, Vedi Tabella materiali). Aggiungere il mix secondo al primo e mescolare delicatamente pipettando su e giù e incubare per 15 min a temperatura ambiente. Aggiungere 5 mL di M10 e mescolare delicatamente.
- Sostituire il M10PSF nella piastra 96 pozzetti precedentemente intrecciata da 50 µ l di media finale transfezione. Incubare in un set di incubatore a 37 ° C e 5% CO2 e vuoto la camera del luminometro durante la notte seguente la procedura descritta nel passaggio 6.
4. incubazione del substrato
- Osservare la piastra a 96 pozzetti con un microscopio a contrasto di fase per assicurare una confluenza di cella tra 60% e 100%. Preparare una soluzione di stimolazione di Hank bilanciato sale soluzione (HBSS) contenente 10 mM di idrossietil piperazineethanesulfonic acido (HEPES) e 5 mM di D-glucosio.
- Diluire 75 µ l del reagente cAMP (vedere tabella materiali) soluzione a 2,75 mL della soluzione di stimolazione. Rimuovere il mezzo di transfezione dalla piastra a 96 pozzetti e lavare le cellule aggiungendo 50 µ l di soluzione fresca stimolazione ad ogni pozzetto.
- Rimuovere la soluzione di stimolazione e aggiungere 25 µ l di soluzione di reagente accampamento preparata al punto 4.2 in ciascun pozzetto. Incubare la piastra a 96 pozzetti a temperatura ambiente in un ambiente scuro e inodore (ad esempio, un cassetto vuoto pulito lontano da prodotti chimici o qualsiasi fonte odorant) per 2 h.
5. Odorant stimolazione
- In primo luogo, equilibrare la camera del luminometro con molecole odorant volatili. Diluire l'odorant fino alla concentrazione desiderata in 10 mL di olio minerale (Figura 2A). Prima della fine del tempo di incubazione di accampamento reagente, aggiungere 25 µ l della soluzione odorant in una nuova piastra a 96 pozzetti (non quello contenente le celle). Incubare la piastra odorant a temperatura nella camera di luminometro per 5 min (Figura 2B) (nessuna registrazione luminometro è necessaria qui).
- Impostare il luminometro per registrare la luminescenza con 0 s di ritardo durante 20 cicli di misura piastra di 90 s con 0,7 s di intervallo tra i cicli.
- Proprio prima di leggere la piastra, è necessario rimuovere la piastra odorant dalla camera. Aggiungere 25 µ l di odorizzante tra i pozzetti della piastra 96 pozzetti contenenti le celle (non aggiungere il odorant nei pozzetti contenenti le celle) e rapidamente avviare la misurazione di luminescenza di tutti i pozzetti per 20 cicli entro 30 min (Figura 2C).
6. rimozione del restante odorant dentro il luminometro
- Aprire la porta del luminometro. Inserire il tubo collegato alla pompa del vuoto.
- Odoranti vuoto nella lettura dell'alloggiamento estesamente (almeno 2H, preferibilmente durante la notte) tra due odoranti per evitare la contaminazione incrociata di sostanze volatili di odore da un esperimento a altro. Sostituire con aria fresca inviando aria compressa durante 5 min prima incubando la prossima odorant.
7. analisi dei dati
- Esportare i dati dal luminometro.
- Media la replica dello stesso o per ogni tempo di registrazione. Calcolare la risposta OR normalizzata a qualsiasi eventuale controllo (ad es., vettore vuoto, Figura 3A e sezione risultati rappresentativi) dividendo il valore di controllo in media in sala operatoria una media di valore in ogni momento di registrazione (Figura 3B e sezione risultati rappresentativi).
- Normalizzare l'ogni risposta OR alla loro attività basale dividendo la risposta media OR a 0 s per ogni risposta di tempo di registrazione (Vedi Figura 3C e sezione risultati rappresentativi).
- Calcolare l'area sotto la curva di ogni OR per ottenere un singolo valore di risposta OR. A tale scopo, è necessario sommare tutti i valori di luminescenza di ogni tempo di registrazione per ogni sala operatoria.
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Representative Results
Abbiamo proiettato la risposta di tre mouse ORs, Olfr746, Olfr124 e Olfr1093 utilizzando la stimolazione di cinnamaldeide vapor (Figura 3). Contemporaneamente, abbiamo utilizzato un controllo di vettore vuoto (Rho-pCI) per assicurare che le attività odorant-indotta delle RUP testate erano specifiche (Figura 3A). L'attivazione in tempo reale delle RUP su stimolo odorant vapor è stato monitorato misura oltre 20 cicli. I dati per ogni bene in primo luogo sono stati normalizzati al valore di controllo in media vettore vuoto per ogni ciclo (Figura 3B). È importante notare che ORs può mostrare i livelli variabili di attività basale in questo test in maniera OR-dipendente e può essere importante normalizzare anche loro risposta a questo parametro (Figura 3C). Il valore medio di un OR può essere diviso per la sua risposta a t = 0 s, che permette di confrontare tra ORs. I valori di attivazione singola per ogni sala operatoria possono essere computati anche calcolando l'area sotto la curva (AUC) per ognuno o sommando tutti i valori di ciclo di misurazione (Figura 3D).
Inoltre, le risposte di dose-dipendente possono essere misurate usando questo metodo utilizzando le dosi aumentanti di odorizzante. Presentiamo la risposta del Olfr1377 alla stimolazione di acetofenone registrata seguendo la stessa procedura (Figura 4). Acetofenone volatilità può essere valutata mediante la relativa pressione del vapore, che è pari a 0,44 mm Hg a 25 ° C. Ad una data temperatura, un odorant che possiede una pressione di vapore superiore è più volatile un odorant con una pressione di vapore inferiore. Acetofenone è, di conseguenza, un odorant moderatamente volatili ed è esposto alla cella puro e diluito al 10-2, 10-4, 10-6 e 10-8. Solo le tre più alte concentrazioni (puro, 10-2 e 10-4) sono in grado di attivare Olfr1377 (Figura 4A). Possiamo anche notare che la stimolazione di composta pura Mostra una tendenza a diminuire la risposta OR durante tempo, probabilmente a causa di tossicità delle cellule, come è stato dimostrato per eugenolo in una recente pubblicazione32. Tuttavia, possiamo osservare un comportamento di dipendenza dose tipica di Olfr1377 (Figura 4B), mostrando che questo metodo può essere utilizzato anche per determinare l'EC50 di o composti volatili.
Nota che quando vengono eseguiti esperimenti di dose-dipendente, abbiamo non vuoto pulita la camera di luminometro. Tuttavia, esperimenti vengono sempre eseguiti da basso a alto, crescente odorant dosi per minimizzare le contaminazioni. Ulteriormente, poiché la concentrazione reale di molecole odorant nei media delle cellule non è noto, i EC50s ottenuti con tale metodo non sono necessariamente paragonabili a quelli ottenuti da stimolo liquido. I valori di EC50 determinati dal nostro metodo di prendono in considerazione la volatilità odorant, la cinetica di dissoluzione di odorizzante in mezzo, solubilità di odorizzante e l'affinità tra l'odorizzante e l'OR, che sono più vicini alla naturale percezione di odore. Per il nostro esempio di stimolazione Olfr1377 di acetofenone, il valore di EC50 dal nostro vapor dose-risposta è 161 µM (0.001874%), che è circa 50 volte superiore la stimolazione liquida (3,28 µM da Saito et al.6). Questa differenza tra liquido e vapore stimolazioni è stata segnalata anche da Sanz et al.20 nella loro analisi di stimolazione del vapore dove vapor stimolazione ha dato 100 a 1000 piega valori di EC50 inferiori rispetto alla stimolazione liquido.
Figura 1 : Principio di monitoraggio in tempo reale dell'attivazione del recettore odorizzante da odorant vapored. È stato disposto (A), la piastra a 96 pozzetti in già equilibrato con camera di luminometro odore (nube viola). (B) vaporizzato molecole odorant (viola) sulla superficie del buffer multimediale cellulare disciolti in esso per raggiungere la cavità OR, sulla superficie di membrana delle cellule Hana3A. La proteina accessoria RTP1S (grigio) è stato transfected pure, per favorire l'espressione di superficie delle cellule delle RUP. Se la molecola odorant era un agonista di OR, OR passato a uno stato di attivazione e vincolato il Golf, innescando l'attivazione dell'adenilato ciclasi (AC) e la produzione di AMP ciclico (cAMP; verde). La proteina Glosensor (luciferasi) possiede un sito di legame per il cAMP che, una volta associato, la proteina permette di associare il suo ligando, la luciferina (giallo). Il finale complesso Glosensor proteina/luciferina/cAMP prodotta la luminescenza che è stata registrata per monitorare l'attivazione di OR. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Schematici protocolli per il monitoraggio in tempo reale dell'attivazione del recettore odorant odorant vapored. Odorant (viola) è stato diluito alla concentrazione desiderata in olio minerale (A). La soluzione è stata poi placcata in una nuova piastra a 96 pozzetti, che si trovava nella camera del luminometro per 5 min equilibrare il volume con vapored odorant prima la piastra a 96 pozzetti trasfettata (B) di monitoraggio. La soluzione di odorizzante è stata dispensata in ogni spazio tra i pozzetti della piastra 96 pozzetti trasfettata (vedere zoom). La piastra era poi lettura per 20 cicli nella camera di luminometro equilibrato vapor odorant (C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Esempio di normalizzazione che possa essere eseguiti dopo la registrazione dei dati. Controllo (A) un vettore vuoto (negativo) è stato inserito nel piano di transfezione per essere in grado di identificare qualsiasi potenziale attivazioni non-OR odore specifico delle cellule. Ha inoltre fornito informazioni sulla luminescenza di fondo della piastra. (B) o ogni risposta quindi è stato normalizzato dividendo il valore di emissione di ogni bene per il valore medio del vettore di controllo in ogni piatto. I valori di luminescenza di ciascuna RUP sono state fatte la media poi lungo i cicli di misura. (C) o le risposte possono essere normalizzate anche quindi in loro attività basale dividendo ulteriormente ogni valore di ciclo per il valore medio del ciclo di misura 1st (t = 0 s). (D) l'AUC può essere calcolato sommando i valori di emissione di ogni ciclo di misura. Per B, C e D, barre di errore rappresentano l'errore standard della media (SEM, n = 3). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 . Esempio di risposte dipendenti dose ottenuta con il metodo. (A), la risposta di Olfr1377 a acetofenone è stata registrata per cinque differenti diluizioni in olio minerale (100, 10-2, 10-4, 10-6, 10-8) e senza odorant (0) e si sono normalizzati dopo la protocollo di normalizzazione illustrato nella Figura 3. (B) i dati durante la misurazione cicli è stato tradotto in un valore AUC per ogni diluizione. Questa figura è stata modificata da Kida et al.32. Questa figura è concesso in licenza sotto una Creative Commons Attribution 4.0 internazionale (CC da 4.0). Barre di errore rappresentano l'errore standard della media (SEM, n = 3). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Per piastra a 96 pozzetti | |
| MEM | 500 Μ l |
| pGlosensor | 10 ng |
| RTP1S | 5 ng |
| OR | 75 ng |
Tabella 1: Mix per la transfezione. Quantità di plasmidi (proteina di Glosensor, RTP1S e o) per aggiungere a MEM a transfect per una piastra a 96 pozzetti.
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Discussion
La percezione dell'odore è fondamentalmente dipenda l'attivazione di ORs. Di conseguenza, comprensione delle loro funzionalità è necessaria per rompere i complessi meccanismi che utilizzano il cervello a percepire l'ambiente chimico volatile. Tuttavia, la comprensione di questo processo è stata ostacolata dalle difficoltà nello stabilire un metodo affidabile per schermare il repertorio OR per funzionalità contro odoranti in vitro. Cella espressione eterologa e superficie di ORs è stato parzialmente risolto con la creazione di recettori taggati13,19 e dalla scoperta e ottimizzazione delle proteine del ricevitore-il trasporto (RTPs) espressa in OSNs22 , 23. i primi studi di screening poi apparve, portando nuove idee alla nostra comprensione della funzione OR come loro odorant riconoscimento modello6,7,26,33, attivazione meccanismo34,35, struttura tridimensionale teorico36,37, evoluzione38,39, odore spazio40,41, 42e le implicazioni in odore rilevamento43,44,45,46. Noi crediamo che migliorare i metodi in vitro potrebbe aumentare la decifrazione di odore di codifica. Come tale, abbiamo sviluppato qui una nuova analisi funzionale per consentire il monitoraggio dell'attivazione OR da molecole odorant vaporizzato.
Il successo di questo metodo dipende da diversi passaggi critici. Anche se migliorato negli ultimi anni, l'espressione eterologa di alcuni ORs rimane difficile, che possono influenzare la risposta OR a odorant. L'espressione di ORs alla membrana delle cellule può essere valutata in un esperimento parallelo tramite flusso cytometry19,24. Si noti che i bassi livelli di espressione di superficie possano ancora presenti risposte robuste in cellule eterologhe sistemi35. Un altro punto critico è per evitare la contaminazione di odorizzante. Data la sensibilità di questo test, molecole odorant da qualsiasi profumo, un cibo o un precedente saggio possono inquinare l'esperimento inducendo risposte OR incontrollate. Ecco perché consigliamo a vuoto preferibilmente durante la notte, la camera del luminometro per almeno 2 h prima di eseguire un test con una diversa odorant. È anche importante considerare una potenziale citotossicità di odorizzante utilizzato nell'esperimento. Un potenziale calo della risposta dell'OR durante il monitoraggio di 30 min può mostrare che l'odorant stessa ha un effetto negativo sulla salute delle cellule. La citotossicità odorant può essere valutata eseguendo un'analisi di attuabilità delle cellule dopo esposizione delle cellule all'odorizzante. Per attenuare questo problema, è possibile considerare solo il primo 10 min di tempo di registrazione per l'analisi dei dati, ritaglio alla fine. Abbiamo notato che odorant tossicità si verifica principalmente quando l'odorant viene testato puro o a concentrazioni molto elevate. La sensibilità della nostra analisi permette la rilevazione di odorizzante diluito in olio minerale. La concentrazione ottimale di suscitare la risposta massima varia da uno odorant a altro, ma abbiamo osservato che una diluizione di 1% è sufficiente a suscitare una saturazione di un OR risposta32. Tuttavia, alcune molecole odorant possono possedere bassa pressione di vapore (e quindi bassa volatilità) e potrebbero essere necessario alcune modifiche da apportare al protocollo presentato. Il tempo di incubazione di odorizzante in aula luminometro qui è impostato su 5 minuti. Abbiamo pensato che questo lasso di tempo è sufficiente per equilibrare la camera con molecole volatili odorant, ma odoranti di bassa volatilità possono richiedere tempi di incubazione più lunghi.
Oltre a questi punti critici, questo metodo porta molte nuove possibilità per esplorare le relazioni struttura-funzione di odorant-interazioni OR. L'aspetto di monitoraggio in tempo reale di questo metodo permette anche per la comprensione della cinetica di eventi che si verificano durante una percezione di odore. Ad esempio, abbiamo usato il protocollo per esplorare la funzionalità di un enzima del metabolita, l'esterasi carbossilica 1D (Ces1d), trovato per essere espresso nella mucosa olfattivo dei mammiferi47. Questo enzima è noto per convertire gli esteri di acido carbossilico e alcool48. La co-transfezione di Ces1d ha mostrato una modulazione delle risposte OR in vitro ai composti estere,32 , dimostrando che questo nuovo protocollo è efficiente nell'esplorare l'importanza degli enzimi metabolici nella rilevazione di odorizzante. Inoltre, utilizzando questa piattaforma per indagare odorant miscele e il modo che gli odori sono presentati nelle impostazioni che sono più naturali, consentirà lo studio futuro nella comprensione più complesse interazioni di odorizzante. Infine, rivelazione di molecole odorant da ORs è anche di grande interesse nello sviluppo di un sensore di odore. Dopo aver dimostrato che il nostro sistema può rilevare molecole odorant presentati in una fase di vapore, questo metodo è un primo passo nel processo di sviluppo di un biosensore miniaturizzato.
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Disclosures
Y.F., H. K e H.M depositato una domanda di brevetto pertinenti a questo lavoro il 27 ottobre 2016.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal NIH (DC014423 e DC016224) e il progetto di RealNose con l'agenzia di Defense Advanced Research Project. YF alloggiato presso la Duke University, con il sostegno finanziario dal programma di JSP per avanzare strategico reti internazionali accelerare la circolazione dei ricercatori di talento (R2801). Ringraziamo Sahar Kaleem per l'editing del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05 % trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | 0.05% Trypsin - EDTA (1x), phenol red - store at 4°C |
| 100 mm cell culture dish | BD Falcon | 353003 | 100 mm x 20 mm cell culture dish |
| 15 mL tube | BD Falcon | 352099 | 17 mm x 120 mm conical tubes |
| 96-well plate | Corning | 3843 | 96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | Amphotericin B 250 µg/mL - store at 4 °C |
| centrifuge machine | Jouan | C312 | Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL |
| Class II Type A/B3 fumehood | NUAIRE | NU-407-500 | fumehood for cell culturing |
| FBS | Gibco | 16000-044 | Fetal Bovine Serum - store at -20 °C |
| GloSensor cAMP Reagent | Promega | E1290 | GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate - store at -20 °C |
| Incubator 37 °C; 5 % CO2 | Fisher Scientific | 11-676-604 | Incubator for cell culturing |
| Lipofectamine 2000 reagent | Invitrogen | 11668-019 | Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent - store at 4 °C |
| Luminometer POLARstar OPTIMA | BMG LABTECH | discontinued | 96 well plate reader for luminescence |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | Solvent for odorants - store at room temperature |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Corning cellgro | 10-010-CV | Minimum Essential Medium Eagle with Earle’s salts & L-glutamine - store at 4 °C |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin - store at -20 °C |
| pGlosensor | Promega | E2301 | pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid - store at 4 °C |
| Phase contrast microscope | Leica | 090-131.001 | phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives |
| RTP1S | H. Matsunami lab | - | 100 ng/µL plasmid - store at 4 °C |
References
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