Summary
순수, odorant 수용 체 odorant 분자 수증기 단계에서 흡입에 의해 활성화 됩니다. 그러나, 대부분의 생체 외에서 시스템 활용 액체 단계 odorant 자극. 여기, 선물이 odorant 자극 기상에 따라 odorant 수용 체 활성화의 실시간 생체 외에서 모니터링 수 방법.
Abstract
후 각 인식 odorant 수용 체와 odorants의 상호 작용으로 시작 (또는) 후 각 감각 신경 (OSN)에 의해 표현. 냄새 인식 조합 코딩 구성표, 어디 하나 또는 odorants의 세트에 의해 활성화 될 수 있다와 하나의 odorant ORs의 조합을 활성화할 수 있습니다 다음과 같습니다. 이러한 조합 코딩을 통해 생물 감지 하 고 휘발성 냄새 분자의 무수 한 사이 차별 수 있습니다. 따라서, 주어진된 농도에서 냄새는 각 냄새에, ORs의 활성화 패턴으로 설명할 수 있습니다. 그런 의미에서 두뇌를 사용 하 여 냄새 필요 이해 odorant 인식 메커니즘 크래킹-또는 상호 작용. 이 때문에 후각이 지역 사회는 "-orphanize" 이러한 수용 체. 기존의 체 외 시스템 odorant 식별 하는 데 사용-또는 상호 작용 이용 잠복기 셀 미디어 odorant, ORs와 상호 작용 하기 전에 비 강 점 막에 증기 odorants 해산을 통해 냄새의 자연 검색에서 별개입니다. 여기, 우리는 기상 odorants 통해 또는 활성화의 실시간 모니터링을 허용 하는 새로운 방법을 설명 합니다. 우리의 방법은 캠프 릴리스 Glosensor 분석 결과 사용 하 여 발광 측정에 의존 합니다. 그것은 현재 간격 vivo에서 그리고 생체 외에서 접근을 다리 고 biomimetic 휘발성 화학 센서에 대 한 기반을 제공 합니다.
Introduction
냄새의 감각 지상파 동물을 그들의 휘발성 화학 환경 드라이브 행동과 감정에 작용할 수 있습니다. 근본적으로, 냄새 탐지 과정 odorant 수용 체 (ORs)1의 수준에 후 각 시스템과 odorant 분자의 첫 상호 작용으로 시작 됩니다. 포유류에서 ORs 개별적으로 후 각 감각 신경 (OSNs)2후 각 상피 위치한 표현 됩니다. 그들은 rhodopsin 같은 하위 가족 (클래스 A 라고도 함) 보다 정확 하 게 G-단백질 결합 수용 체 (GPCR) 가족에 속한다. ORs는 물질로 G 단백질 Golf 의 활성화 캠프 생산 주기적인 뉴클레오티드 문을 단 수로의 개통 및 활동 전위의 발생에 이르게 된 커플. 그것은 허용 냄새 percept 활성화 ORs,34 의 특정 패턴에 의존 하 고 따라서 냄새 인식와 조합 코딩 체계, 한 또는 odorants의 세트에 의해 활성화 될 수 있다와 하나의 odorant 활성화할 수 있는 ORs의 조합입니다. 그리고 이러한 조합 코딩을 통해 그것은 가정 하는 생물 감지 하 고 휘발성 냄새 분자의 무수 한 사이 차별. 냄새 인식 하는 방법을 이해 하는 열쇠 중 하나를 이해 하는 방법 및 ORs 주어진된 냄새에 의해 활성화 되는.
Odorant 명료 하 게 하려고-또는 상호 작용, 생체 기능 분석은 필수적인 역할을 했다. 고아 ORs (OR 드 orphanization)에 대 한 길 항 제 향기가 ligands의 식별 다양 한 생체 외에서, 비보, vivo에서 기능 분석 실험5,6,7 전을 통해 지난 20 년간 매우 활성 필드 되었습니다. ,8,9,10,11,12,13,,1415,16, 17.
생체 외에서 분석 결과 시스템은 ORs, 식별 기능 도메인 및 ORs, 잠재적인 엔지니어링 응용 프로그램의 중요 한 잔류물 등의 상세한 기능 특성에 가장 적합. 그러나, 추가 ORs 위한 귀중 한 생체 외에서 시스템의 개발 자란 OSNs와 어려움과 분리 셀에서 ORs의 기능적 표현 때문에 부분에 도전이 되었습니다. 첫 번째 도전 odorant의 매핑 기능 ORs의 세포 표면 표현에 대 한 허용 하는 프로토콜 설정 있 었-또는 상호 작용. 다양 한 접근5,6,7,,89,10,11,12을 활용 하는 독립적인 그룹 수 14,18,,1920. 초기 성과 중 하나는 Krautwurst 그 외 여러분에 의해 만들어진에 N-말단 ORs의 rhodopsin (Rho-태그)의 단축 시퀀스를 태그 하 고 인간 미 발달 신장 (HEK) 셀13에 향상 된 표면 식을 관찰. 유사 또는 시퀀스에 연결 된 태그를 여전히 OR 표현과 기능19,21을 향상을 위한 탐험 경로입니다. 사이토 외. 다음 수용 체 수송 단백질 1 (RTP1) 식별 및 RTP2 OR 매매를 용이 하 게. 22 RTP1, RTP1S, 라는의 짧은 버전 원래 단백질23보다 훨씬 더 효과적인 것으로 표시 되었습니다 또한. 개발 선의 셀 (Hana3A) Golf를 안정적으로 표현, REEP1, RTP1, RTP2 24, 순환 아데노신 monophosphate (캠프) 기자 들의 사용과 함께 odorant의 활성화-또는 상호 작용. 단백질의 RTP 가족 ORs의 세포 표면 표현 촉진 메커니즘 확인할 수 있다.
이러한 설립된 방법의 하나 주의할 그들이 odorant 자극 액체 단계에서 odorants 자극 매체에 미리 용 해 세포를 자극 하는 매체를 대체 하 여 의미에 의존입니다. 이 생리 적인 조건 odorant 분자 수증기 단계에서 후 각 상피에 도달 하 고 비 강 점 막에 의해 해산 ORs를 활성화 매우 다릅니다. 더 밀접 하 게 닮은 순수 관련 자극 노출, 펠 레 외.20 플라스틱 필름 셀 웰 스 상단에 배치의 내부 얼굴 아래 걸어 odorant 솔루션의 방울을 적용 하 여 증기 자극에 따라 분석 결과 제안. 그들은 형광 강도 모니터링 하 여 칼슘 응답을 기록 했다. 이 메서드는 공기 단계 odorant 자극을 사용 하 여 처음 하지만 또는 활성화의 큰 심사를 허용 하지 않았다.
여기, 우리는 Glosensor 분석 결과 (그림 1)에 의해 증기 위상 odorant 자극을 통해 생체 외에서 또는 활성화의 실시간 모니터링 하는 새로운 방법을 개발 했다. 이 분석 결과 이전 액체 odorant 자극18,19,25,26,,2728,29, 의 맥락에서 사용 되었습니다. 30 , 31. 모니터링 챔버는 루미 노의 플레이트 (그림 1A)를 읽기 전에 증발된 odorant와 equilibrated 처음 이다. Odorant 분자는 버퍼, 관심, RTP1S 및 Glosensor 단백질 (그림 1B) OR을 표현 하는 Hana3A 세포 목욕으로 solvated. odorant or 주 작동 근 이면 OR 전환 활성화 나 란 하 고 바인딩할 Golfadenylyl 있고 (AC), 활성화 되며 궁극적으로 캠프 레벨 상승 원인이. 이 상승 캠프 바인딩할 하 고 발광 소 catalyzing를 생성 하는 Glosensor 단백질을 활성화할 것 이다. 이 발광 다음는 루미 노에 의해 기록 되 고 또는 활성화 모니터링. 이 메서드는 또는 deorphanization의 문맥에 높은 관심의 냄새의 자연 인식에 생체 외에서 시스템 가까이 제공로 서.
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Protocol
1. Hana3A 셀 문화
- M10 준비 (최소 필수 매체 (MEM) 플러스 10 %v / v 태아 둔감 한 혈 청 (FBS))와 M10PSF (m 10와 100 µ g/mL 페니실린-스 및 1.25 µ g/mL 암포 B).
- 37 ° C와 5% 이산화탄소 (CO2)에서 설정 하는 인큐베이터에서 100 mm 셀 문화 접시에 M10PSF의 10 mL에 셀 문화.
- 분할 셀 20% 비율로 매 2 일: 셀 (약 107 셀 x 1.1)의 100% 합류 단계 대조 현미경 관찰은, 미디어를 갈망 하 고 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 10 mL와 함께 부드럽게 세포를 씻어.
- PBS를 발음 하 고 0.05 %trypsin 에틸렌 diamine tetraacetic 산 (EDTA, 0.48 m m)의 3 mL를 추가 합니다. 셀 접시에서 해리 될 때까지 약 1 분 동안 행동 하자.
- 하는 트립 신을 비활성화 하 고 결국 아래로 pipetting으로 접시에 여전히 연결 된 셀 분리 M10의 5 mL를 추가 합니다.
- 15 mL 튜브를 볼륨 (8 mL)를 전송 5 분 Aspirate는 상쾌한에 대 한 200 x g 에서 원심 및 위쪽 및 아래쪽을 셀 대량 pipetting으로 M10PSF의 5 mL로 세포를 resuspend. 튜브에 거품을 만들지 마십시오.
- Resuspended 셀 솔루션 새로운 100 mm 셀 문화 접시에서의 1 mL를 전송 하 고 신선한 M10PSF의 9 mL를 추가 합니다. 37 ° C, 5% CO2에서 품 어.
2입니다. 세포 Transfection에 대 한 준비
- 단계 대조 현미경으로 관찰 하 여 합류, 또는 세포의 수를 평가 합니다. 적어도 10% 합류 (약 106 셀 x 1.1) 한 접시에 필요한.
- 미디어를 발음 하 고 부드럽게 10 mL의 PBS로 세포를 씻어. PBS를 발음 하 고 EDTA의 3 mL를 추가 합니다. 셀 접시에서 해리 될 때까지 실내 온도에, 대략 1 분 동안 행동 하자.
- 하는 트립 신을 비활성화 하 고 결국 아래로 pipetting으로 접시에 여전히 연결 된 셀 분리 M10의 5 mL를 추가 합니다. 15 mL 튜브를 5 분 동안 200 x g 에서 원심 분리기 (8 mL) 볼륨을 전송.
- 상쾌한 발음 하 고 위쪽 및 아래쪽을 셀 대량 pipetting으로 M10PSF의 5 mL로 세포를 resuspend. 튜브에 거품을 만들지 마십시오.
- 페 수에 번호판의 수에 따라 적당 한 양만큼 저수지에 셀의 M10PSF의 적절 한 해당 볼륨을 전송. 한 96 잘 접시 6 mL의 총 볼륨에 도달 하는 M10PSF에 희석 100% confluent 100 mm 접시 (약 106 셀 x 1.1)의 1/10으로 도금 한다. 한 96 잘 접시 100% 합류 100 mm 접시로 시작, 신선한 M10PSF의 5.5 mL를 사용 resuspended 셀의 5 mL에서 500 µ L을 추가 합니다. 공기 거품을 생성 하지 않고 셀과 M10PSF를 혼합.
- 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 96 잘 접시의 각 음에 일시 중단 된 셀의 50 µ L 플라스틱. 37 ° C, 5% CO2에서 밤새 품 어.
3. 플라스 미드 Transfection
- 30%와 50% 사이 셀 합류 보장 단계 대조 현미경 96 잘 접시를 관찰 합니다.
- 전체 접시에 일반적인 플라스 미드를 포함 하는 첫 번째 transfection 믹스를 준비 (RTP1S, 또는 Glosensor 단백질, 테이블의 자료를 참조 하 고) 다음 표 1에 볼륨. 통보의 수량 여러 경우로 태그 OR ORs의 수로 분할 되어야 ORs.
참고: 우리가 강력 하 게 조언 빈 벡터 부정적인 제어 (여기로 pCI) 및 어떤 긍정적인 제어 (테스트 odorant에 응답 또는 알려진) 실험 계획을 추가 하려면. - MEM의 500 µ L의 Lipofectamine 2000 시 약 20 µ L을 포함 하는 두 번째 transfection 믹스를 준비 (적합 한 96 잘 접시, 테이블의 자료를 참조). 첫 번째, 두 번째 믹스를 추가 하 고 부드럽게 위아래로 pipetting으로 섞어 실 온에서 15 분 동안 품 어. M10의 5 mL을 추가 하 고 부드럽게 혼합.
- 최종 transfection 미디어의 50 µ L에 의해 이전 platted 96 잘 접시에 M10PSF를 교체 합니다. 37 ° C, 5% CO2 배양 기에서에서 incubate 및 루미 노 하룻밤 다음 6 단계에 설명 된 절차의 챔버를 진공.
4. 기판 부 화
- 60%와 100% 사이 셀 합류 보장 단계 대조 현미경 96 잘 접시를 관찰 합니다. 자극 솔루션의 행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 10 mM의 hydroxyethyl piperazineethanesulfonic 산 (HEPES) 및 D-포도 당의 5 mM을 포함 준비.
- 75 µ L 캠프 시 약의 희석 (참조 테이블의 재료) 자극 솔루션의 2.75 mL 해결책. 96 잘 접시에서 transfection 매체를 제거 하 고 각 음을 신선한 자극 솔루션의 50 µ L을 추가 하 여 셀을 세척.
- 자극 솔루션을 제거 하 고 25 µ L 캠프 시 약 해결책 단계 4.2 각 영역에서에서 준비의 추가. 실내 온도 2 h에 대 한 어둡고 냄새 없는 환경 (예: 화학 물질 또는 odorant 소스에서 멀리 떨어져 깨끗 한 빈 서랍) 96 잘 접시를 품 어.
5. Odorant 자극
- 첫째, 휘발성 odorant 분자와 루미 노 챔버 equilibrate. 미네랄 오일 (그림 2A) 10 mL에 원하는 농도에 odorant 희석. 캠프 시 보육 시간 끝나기 전에 추가 25 µ L odorant 솔루션의 새로운 96 잘 접시에서 (아니라 셀을 포함 하는 하나). 실내 온도 5 분 (그림 2B) (루미 노 기록 없음)가 필요 합니다 여기 루미 노 챔버에이 odorant 접시를 품 어.
- 설정 기록 0 발광을 루미 노 s 90의 격판덮개 측정의 20 주기 동안 지연의 0.7의 주기 사이 간격의 s.
- 접시를 읽기 전에 바로 상공에서 odorant 플레이트를 제거 합니다. (추가 하지 않으면는 odorant 우물을 포함 하는 셀) 셀에 포함 된 96 잘 접시의 우물 사이 odorant의 25 µ L을 추가 하 고 신속 하 게 30 분 (그림 2C) 이내 20 사이클에 대 한 모든 우물의 발광 측정을 시작.
6. 나머지 odorant는 루미 노 안에 제거
- 루미 노의 문을 열으십시오. 진공 펌프에 연결 하는 튜브를 삽입 합니다.
- 독서에 진공 odorants 챔버 광범위 하 게 (적어도 2 h, 선호 하룻밤) 다른 한 실험에서 냄새 휘발성의 교차 오염을 피하기 위하여 두 odorants 사이. 다음 odorant 잠복기 전에 5 분 동안 압축 공기를 전송 하 여 신선한 공기를 바꿉니다.
7. 데이터 분석
- 루미 노 소프트웨어에서 데이터를 내보냅니다.
- 녹화 때마다 또는 동일의 복제를 평균. OR 평균 하는 컨트롤 값을 분할 하 여 최종 컨트롤 (예: 빈 벡터 그림 3A , 대표적인 결과 섹션)를 정규화 또는 응답 각 녹화 시간 (그림 3B에 값 평균을 계산합니다 및 대표적인 결과 섹션).
- 0에서 평균된 또는 응답을 분할 하 여 각 OR에 대 한 응답의 기저 활동을 표준화 각 녹음 시간 응답 (참조 그림 3C 와 대표적인 결과 섹션)에 s.
- 단일 또는 응답 값을 가져오기 위해 각 OR의 곡선 아래의 영역을 계산 합니다. 이렇게 하려면 각 OR에 대 한 각 녹음 시간의 모든 발광 값을 합계 하십시오.
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Representative Results
우리는 3 개의 마우스 ORs, Olfr746, Olfr124 및 Olfr1093의 응답 상영 cinnamaldehyde 증기 자극 (그림 3)를 사용 하 여. 동시에, 우리는 테스트 ORs의 odorant 유발 활동은 특정 보장 빈 벡터 제어 (Rho-pCI) 사용 (그림 3A). 증기 odorant 자극 시 ORs의 실시간 활성화 모니터링된 20 측정 주기를 했다. 각 데이터 잘 했다 먼저 정규화 빈 벡터 제어 평균 값을 각 주기 (그림 3B)에 대 한. 그것은 ORs 또는 종속 방식에서이 분석 결과에서 변수 수준의 기저 활동을 표시할 수 있습니다 그것은 또한이 매개 변수 (그림 3C)에 그들의 응답을 정상화 하는 것이 중요 될 수 있습니다 참고 해야 합니다. OR의 평균 값 t에서의 반응에 의해 분할 될 수 있다 0 = s, ORs 사이 비교를 허용. (AUC) 각 곡선 아래 영역을 계산 하 여 또는 모든 측정 주기 값 (그림 3D)을 요약 하 여 각 OR에 대 한 단일 활성화 값 계산 또한 수 있다.
또한, 복용량 의존 응답 증가 odorant 복용량을 사용 하 여이 메서드를 사용 하 여 측정할 수 있습니다. 우리는 Olfr1377 acetophenone 자극 기록 같은 절차 (그림 4)에 대 한 응답을 제시. Acetophenone 변동 하는 25 ° c.에 0.44 m m Hg의 증기 압력에 의해 평가 될 수 있습니다. 주어진된 온도에 높은 증기압을 보유 한 odorant 낮은 증기 압력 odorant 보다 더 휘발성 이다. Acetophenone 결과, 휘발성 알맞게 odorant 이며, 셀에 노출은 순수 하 고 희석 10-2, 10-4, 10-6 , 10-8. 3 높은 농도 (순수, 10-2 , 10-4) Olfr1377를 활성화할 수 있습니다(그림 4). 우리는 또한 그 순수한 화합물 자극 표시 또는 응답 시간 동안에, 세포 독성 때문에 가능성이 감소 하는 경향이 eugenol 최근 게시32에 대 한 표시 되었습니다 통지 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 우리 Olfr1377의 전형적인 복용량 종속성 동작을 관찰할 수 있다 (그림 4B), 보여주는이 방법은 또한 결정 하는 EC50의 휘발성 화합물을 사용할 수 있습니다.
참고는 복용량-의존 실험 수행 될 때 우리가 할 하지 진공 청소 루미 노 챔버. 그러나, 실험 오염 최소화 하 고, 증가 odorant 복용량에서 수행 항상 됩니다. 또한, 이후 셀 미디어에서 odorant 분자의 실제 농도 알 수 없습니다이 방법으로 얻은 EC50s 액체 자극에 의해 얻은 그 반드시 비교 되지 않습니다. 우리의 방법에 의해 결정 EC50 값 고려 odorant 변동, 매체, odorant의 용 해도 odorant 사이 또는, 선호도에 odorant 해산의 활동 하는 냄새의 자연 인식에 가까이. Olfr1377 acetophenone에 의해 자극의 예, 우리의 증기 복용량 응답 EC50 값 161 µ M (0.001874%), 약 50는 액체 자극 (사이토 외.6에서 3.28 µ M) 보다 높은 배입니다. 액체 및 증기 stimulations이이 차이 또한 펠 레 외20 증기 자극 액체 자극 보다 100 ~ 1000 배 낮은 EC50 값을 준 그들의 증기 자극 분석 결과에 의해 보고 되었다.
그림 1 : 표면은 odorant odorant 수용 체 활성화의 실시간 모니터링 원칙. (A) 96 잘 접시 배치 했다 이미 equilibrated에 냄새 (보라색 구름) 루미 노 챔버. (B) 증발 odorant 분자 (보라색) 셀 미디어 버퍼의 표면에 또는 구멍 Hana3A 세포 막 표면에 도달에 해산. 액세서리 단백질 RTP1S (회색) or 셀 표면 표현 하나를 뿐만 아니라, 페 했다. Odorant 분자 또는 주 작동 근 있었다면 OR 활성화 상태로 전환 하 고 바인딩된 Golfadenylyl 있고 (AC)의 활성화 및 순환 앰프 (캠프; 녹색)의 생산을 트리거링. Glosensor 단백질 (luciferase) 캠프 있도록, 한 번 바운스되 어, 그것의 ligand, 소 (노란색)에 바인딩할 단백질 바인딩 사이트를 소유한 다. 마지막 복잡 한 Glosensor 단백질/소/캠프 발광 또는 활성화를 모니터링 하는 데 기록 된 생산. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 표면은 odorant odorant 수용 체 활성화의 실시간 모니터링에 대 한 도식 프로토콜. (바이올렛) odorant 미네랄 오일 (A)에서 원하는 농도에 희석 되었다. 솔루션은 다음 5 분 transfected 96 잘 접시 (B)를 모니터링 하기 전에 표면은 odorant와 볼륨을 equilibrate 루미 노 챔버에 배치 했다 새로운 96 잘 접시에 도금. Odorant 솔루션 transfected 96 잘 접시의 우물 사이의 각 공간에 pipetted 이었다 (참조 확대/축소). 접시 20 주기 루미 노 챔버에 대 한 읽기 equilibrated 증기 odorant (C) 다음 이었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 데이터 기록 후 수행할 수 있는 정규화의 예. (A) 빈 벡터 (네거티브) 제어 셀의 어떤 잠재적인 비 또는 특정 냄새 정품 식별 수 transfection 계획에 삽입 했다. 그것은 또한 접시의 배경 발광에 정보를 제공. (B) 각 또는 응답 다음 방출 가치의 각 잘 각 접시에 제어 벡터의 평균 값으로 나누어 정규화 되었는지. 각 OR의 발광 값 다음 측정 주기 따라 평균 했다. (C) 또는 있으 나 응답 나누어 더 각 주기 값 1세인트 주기의 측정의 평균값에 의해 그들의 기저 활동 또한 다음 정규화 할 수 있습니다 (t = 0 s). (D)는 AUC 각 측정 주기의 방출 값을 합산 하 여 계산할 수 있습니다. B, C, D에 대 한 오차 막대 대표는 의미의 표준 오차 (SEM, n = 3). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . 방법으로 얻은 복용량 의존 응답의 예입니다. (A) acetophenone Olfr1377의 응답 미네랄 오일에 5 개의 다른 희석에 대 한 기록 되었다 (100, 10-2, 10-4, 10-6, 10-8), odorant (0) 없이 다음 정규화 하 고는 그림 3에 표시 된 정규화 프로토콜입니다. (B) 측정 하는 동안 데이터 주기 각 희석에 대 한 AUC 값으로 변환 되었다. 이 그림은 국방 외.32에서 수정 되었습니다. 이 수치는 크리에이 티브 코몬즈 저작자 표시 4.0 국제 (4.0에 의해 참조) 아래의 라이센스입니다. 오차 막대를 나타내는 의미의 표준 오차 (SEM, n = 3). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 96 잘 접시 당 | |
| MEM | 500 Μ L |
| pGlosensor | 10 기 |
| RTP1S | 5 기 |
| 또는 | 75 기 |
표 1: transfection에 대 한 믹스. 플라스 미드의 수량 (Glosensor 단백질, RTP1S 및 또는) 한 96 잘 접시에 transfect에 메모리를 추가 하.
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Discussion
냄새의 인식을 근본적으로 ORs의 활성화에 따라 달라 집니다. 따라서, 그들의 기능에 대 한 이해는 뇌의 휘발성 화학 환경 인식에 사용 하는 복잡 한 메커니즘을 깰 필요 합니다. 그러나,이 과정의 이해는 생체 외에서 odorants. 에 대 한 기능 또는 레 퍼 토리에 강력한 방법 수립에 어려움에 의해 방해 되었습니다. 셀 태그 수용 체13,19 의 창조와 발견과 OSNs22 에 표현 된 수용 체 수송 단백질 (RTPs)의 최적화 ORs의 표면과 분리 식 부분적으로 해결 되었습니다 , 23. 첫 번째 심사 연구 다음 등장, 자신의 odorant 인식 패턴6,7,,2633, 활성화 등의 OR 함수에 대 한 우리의 이해에 새로운 통찰력을 가져다 메커니즘34,35, 이론적인 유행 구조36,37, 진화38,39, 냄새 공간40,41, 42, 그리고 냄새 탐지43,44,,4546의미. 우리는 냄새 코딩의 해독 높일 수 체 외 방법 개선 믿습니다. 이와 같이, 우리 여기 증발된 odorant 분자 또는 활성화의 모니터링 수 있도록 분석 결과 새로운 기능을 개발 했다.
이 방법의 성공은 몇 가지 중요 한 단계에 따라 달라 집니다. 비록 최근 몇 년 동안에서 개선, 일부 ORs의 분리 식 남아 어려운, 있는 odorant 또는 응답에 영향을 미칠 수 있습니다. 세포 막에서 ORs 표현의 교류 cytometry19,24를 사용 하 여 병렬 실험에서 평가할 수 있습니다. 표면 식의 저급 분리 셀 시스템35에 여전히 강력한 응답 수를 확인 합니다. 또 다른 중요 한 요점은 odorant 오염을 피하기 위하여입니다. 이 분석 결과의 감도 감안할 때, 향수, 음식, 또는 이전 분석 결과 odorant 분자 통제 또는 응답을 유도 하 여 실험을 오염 수 있습니다. 이 때문에 선호 하룻밤 다른 odorant와 분석 결과 수행 하기 전에 적어도 2 시간을 위한 루미 노의 챔버를 진공 하는 것이 좋습니다. 그것은 또한 실험에 사용 된 odorant의 잠재적인 세포 독성을 고려 하는 것이 중요입니다. 30 분 모니터링 하는 동안 잠재적인 감소 or 응답 자체 odorant 셀 건강에 부정적인 영향을가지고 표시할 수 있습니다. Odorant 세포 독성 세포는 odorant 노출 후 세포 생존 능력 분석 실험을 수행 하 여 평가할 수 있습니다. 이 문제를 줄이기 위해 데이터를 끝을 자르기의 분석에 대 한 녹음 시간의 처음 10 분만을 고려 하는 것이 가능 하다. odorant 순수 테스트 하는 경우 또는 매우 높은 농도에서 odorant 독성 주로 발생 하는 것으로 나타났습니다. 우리의 분석 결과의 감도 odorant 미네랄 오일에 희석의 탐지를 허용 한다. 최대 응답을 유도 하는 최적의 농도, 다른 하나의 odorant에서 다르지만 우리가 관찰 하는 1%의 희석 또는 응답32의 채도 유도 충분 하다. 그러나, 일부 odorant 분자 낮은 증기 압력 (그리고 따라서 낮은 휘발성)를 소유할 수 있다 고 제시 프로토콜에 몇 가지 조정을 할 수 있습니다. 루미 노 챔버 여기에 odorant의 외피 시간 5 분으로 설정 됩니다. 우리 가정 시간의이 양을 odorant 휘발성 분자와 챔버 equilibrate 충분 하지만 낮은 휘발성 odorants 부 화 시간 더 필요할 수 있습니다.
이러한 중요 한 포인트를 제외 하 고이 메서드 odorant의 구조-기능 관계를 탐구 하는 많은 새로운 가능성을 제공-또는 상호 작용. 이 방법의 실시간 모니터링 측면 또한 냄새 인식 하는 동안 발생 하는 이벤트의 활동의 이해에 대 한 수 있습니다. 예를 들어, 우리 carboxyl esterase 포유류47의 후 각 점 막에 표현 될 발견 1 d (Ces1d), 대사 산물 효소의 기능을 탐구 하는 프로토콜을 사용. 이 효소는 carboxylic 산 및 알코올48에스테 르의 변환으로 알려져 있다. Ces1d의 공동 transfection 에스테 르 화합물, 생체 외에서 또는 응답의 변조32 이 새로운 프로토콜은 odorant 탐지에 대사 효소의 중요성을 탐험에 효율적입니다 시연 했다. 또한, odorant 혼합물, 그리고 냄새는 더 자연 스러운 설정에서 제시 하는 방법 조사 하이 플랫폼을 사용 하 여 더 복잡 한 odorant 상호 작용 이해에 미래 연구를 활성화 됩니다. 마지막으로, ORs 여 odorant 분자의 탐지는 냄새 센서의 개발에 높은 관심의 이기도합니다. 우리의 시스템 odorant 분자 수증기 단계에서 제시를 검색할 수 있습니다 표시 하는 데이 방법은 소형된 바이오 센서의 개발 과정에서 첫 번째 단계입니다.
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Disclosures
Y.F., H. K와의 HM 특허 출원 27 10 월 2016에이 작품에 관련 된 신청.
Acknowledgments
이 작품은 NIH (DC014423 및 DC016224)와 방위 고급 연구 프로젝트 기관 RealNose 프로젝트에서 교부 금에 의해 지원 되었다. YF 순환 재능 있는 연구원 (R2801)를 가속 화 하기 위해 전략적인 국제 네트워크 발전 위한 JSP 프로그램에서 재정 지원을 가진 듀크 대학에 머물렀다. 우리 감사 Sahar Kaleem 원고 편집.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05 % trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | 0.05% Trypsin - EDTA (1x), phenol red - store at 4°C |
| 100 mm cell culture dish | BD Falcon | 353003 | 100 mm x 20 mm cell culture dish |
| 15 mL tube | BD Falcon | 352099 | 17 mm x 120 mm conical tubes |
| 96-well plate | Corning | 3843 | 96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | Amphotericin B 250 µg/mL - store at 4 °C |
| centrifuge machine | Jouan | C312 | Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL |
| Class II Type A/B3 fumehood | NUAIRE | NU-407-500 | fumehood for cell culturing |
| FBS | Gibco | 16000-044 | Fetal Bovine Serum - store at -20 °C |
| GloSensor cAMP Reagent | Promega | E1290 | GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate - store at -20 °C |
| Incubator 37 °C; 5 % CO2 | Fisher Scientific | 11-676-604 | Incubator for cell culturing |
| Lipofectamine 2000 reagent | Invitrogen | 11668-019 | Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent - store at 4 °C |
| Luminometer POLARstar OPTIMA | BMG LABTECH | discontinued | 96 well plate reader for luminescence |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | Solvent for odorants - store at room temperature |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Corning cellgro | 10-010-CV | Minimum Essential Medium Eagle with Earle’s salts & L-glutamine - store at 4 °C |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin - store at -20 °C |
| pGlosensor | Promega | E2301 | pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid - store at 4 °C |
| Phase contrast microscope | Leica | 090-131.001 | phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives |
| RTP1S | H. Matsunami lab | - | 100 ng/µL plasmid - store at 4 °C |
References
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