Summary
Fysiologisk aktiveres odorant reseptorer av odorant molekyler inhalert i damp fase. Men benytter mest i vitro systemer flytende fase odorant stimulering. Her presenterer vi en metode som gjør at sanntid i vitro overvåking av odorant reseptor aktivisering på odorant stimulering i damp fase.
Abstract
Olfactory oppfatning begynner med samspillet av odorants med odorant reseptorer (eller) uttrykt av olfactory sensoriske neurons (OSN). Lukt anerkjennelse følger en kombinasjon koding ordningen, der en eller kan aktiveres ved et sett med odorants og én odorant kan aktivere en kombinasjon av ORs. Gjennom slike kombinasjon koding, kan organismer oppdage og diskriminere imellom en myriade av flyktige lukt molekyler. Dermed kan en lukt i en gitt konsentrasjon beskrives av en aktivisering mønster av ORs, som er spesifikk for hver lukt. I den forstand, sprengning mekanismer som hjernen bruker oppfatter lukt krever forståelse odorant-OR interaksjoner. Det er derfor luktesans samfunnet er forpliktet til "de-orphanize" disse reseptorene. Konvensjonelle i vitro systemer brukes til å identifisere odorant- eller interaksjoner har utnyttet rugende cellen media med odorant, som er forskjellig fra naturlige påvisning av lukt via damp odorants oppløsning i nasal mucosa før samarbeidsstil ORs. Her beskriver vi en ny metode som tillater sanntids overvåking av OR aktivisering via damp-faset odorants. Vår metode er avhengig av måle leiren utgivelsen av luminescence bruker Glosensor analysen. Det bygger gjeldende gapene mellom i vivo og in vitro tilnærminger og gir et grunnlag for en biomimetic flyktige kjemiske sensor.
Introduction
Luktesans kan terrestriske dyr å samhandle med flyktige kjemiske miljøet å kjøre atferd og følelser. Fundamentalt, lukt søkeprosessen starter med første samspillet av odorant molekyler med olfactory system på nivået av odorant reseptorer (ORs)1. I pattedyr uttrykkes individuelt ORs i olfactory sensoriske neurons (OSNs) ligger i olfactory epitel2. De hører til G-protein kombinert reseptor (GPCR) familien og mer presist til rhodopsin-lignende sub familien (også kalt klasse A). ORs par med stimulerende G protein Golf som aktivering fører til leiren produksjon etterfulgt av åpningen av syklisk nukleotid gated kanaler og generering av handlingen potensialer. Det er akseptert som en odor percept er avhengig av et bestemt mønster i aktivert ORs3,4 og derfor lukt anerkjennelse følger en kombinasjon koding ordningen, der en eller kan aktiveres ved et sett med odorants og én odorant kan aktivere en kombinasjonen av ORs. Og gjennom slike kombinasjon koding, er det postulerte at organismer kan oppdage og diskriminere imellom en myriade av flyktige lukt molekyler. En av nøklene til å forstå hvordan lukt oppfattes er å forstå hvordan og som ORs aktiveres en gitt lukt.
Å belyse odorant- eller interaksjoner, in vitro funksjonelle analyser har spilt en viktig rolle. Identifikasjon av Agonistiske illeluktende ligander for frittstående ORs (OR de orphanization) har vært et svært aktivt felt i de siste tyve årene, ved hjelp av ulike i vitro, ex vivo og i vivo funksjonelle analyser5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17.
In vitro analysen systemer er best egnet for detaljert funksjonelle karakterisering av ORs, inkludert identifisering det funksjonelle og kritisk rester av ORs, samt mulige tekniske programmer. Men har videre utvikling av verdifulle i vitro systemer for ORs vært en utfordring, delvis på grunn av problemer med dyrking OSNs og funksjonelle uttrykk for ORs i heterologous celler. Den første utfordringen var å etablere protokoller som tillatt til cellen overflaten uttrykk for funksjonell ORs i tilordningen av odorant-OR interaksjoner. Flere uavhengige grupper har utnyttet ulike tilnærminger5,6,7,8,9,10,11,12, 14,18,19,20. En av de tidligste prestasjonene ble gjort av Krautwurst et al. i merket N-terminus av ORs med en forkortet sekvens av rhodopsin (Rho-koden) og observert forbedret overflaten uttrykk i menneskelige embryonale nyre (HEK) celler13. Variasjoner gjort i koden knyttet til OR sekvensen er fortsatt en bane utforsket for å forbedre OR uttrykk og funksjonalitet19,21. Saito et al. deretter identifisert reseptor-transport protein 1 (RTP1) og RTP2 som letter OR menneskehandel. 22 en kortere versjon av RTP1, kalt RTP1S, har også vist å være enda mer effektiv enn den opprinnelige protein23. Utviklingen av en celle linje (Hana3A) som uttrykker stabilt Golf, REEP1, RTP1 og RTP2 24, kombinert med bruk av syklisk adenosin monofosfat (cAMP) journalister har aktivert identifikasjon av odorant-OR interaksjoner. Mekanismen som RTP familien av proteiner fremmer celle overflaten uttrykk for ORs gjenstår å fastsettes.
En påminnelse av disse etablerte metoder er at de er avhengige av odorant stimulering i flytende fase, betyr at odorants pre oppløst i en stimulering medium og stimulere celler ved å erstatte medium. Dette er svært forskjellig fra de fysiologiske forholdene der odorant molekyler nå olfactory epitel i damp fase og aktivere ORs ved oppløsningen til nasal mucosa. Slik nærmere fysiologisk relevante stimulans eksponering, Sanz et al.20 foreslått en analyse basert på damp stimulering ved å bruke en dråpe odorant løsning å henge under indre overfor en plastfilm på oversiden av cellen brønner. De spilte inn kalsium svar ved å overvåke fluorescens intensitet. Denne metoden var først til å bruke air-fase odorant stimulering, men det gjorde ikke tillate en stor screening av OR aktivisering.
Her utviklet vi en ny metode som gir sanntids overvåking av i vitro OR aktivisering via damp fasen odorant stimulering av Glosensor analysen (figur 1). Denne analysen er brukt tidligere i forbindelse med flytende odorant stimulering18,19,25,26,27,28,29, 30 , 31. overvåking chamber of the luminometer er første equilibrated med fordampede odorant før plate lese (figur 1A). Odorant molekyler er da solvated inn i bufferen, bading Hana3A celler uttrykke eller interesse, RTP1S og Glosensor proteiner (figur 1B). Hvis odorant er en Agonistiske av OR, vil eller bytte til en aktivert konformasjon binde Golf, aktivere adenylyl cyclase (AC) og til slutt føre til leiren nivåer å stige. Denne stigende leiren vil binde til og aktivere Glosensor protein for å generere luminescence utløse luciferin. Denne luminescence deretter spilles av på luminometer og gjør OR aktivisering overvåking. Denne metoden er av høy rente i sammenheng med OR deorphanization som det bringer i vitro systemer nærmere til naturlige oppfatning av lukt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hana3A celler kultur
- Forberede M10 (minst viktig Medium (MEM) pluss 10% v/v fosterets bovin serum (FBS)) og M10PSF (M10 pluss 100 µg/mL penicillin-streptomycin og 1,25 µg/mL amfotericin B).
- Kultur cellene i 10 mL av M10PSF i en 100 mm celle kultur parabol i en inkubator satt på 37 ° C og 5% karbondioksid (CO2).
- Dele cellene hver 2 dager i 20% forholdet: når 100% samløpet av celler (ca 1.1 x 107 celler) er observert under fase kontrast mikroskop, aspire media og vaske cellene forsiktig med 10 mL fosfat-bufret saltoppløsning (PBS).
- Sug opp PBS og legge 3 mL 0,05% trypsin-ethylene diamine tetraacetic syre (EDTA, 0,48 mM). La handle for ca 1 min, til cellene dissociate fra platen.
- Legge til 5 mL M10 å deaktivere trypsin og til slutt ta cellene fortsatt festet til platen av pipettering opp og ned.
- Overføre volumet (8 mL) til en 15 mL tube og sentrifuge 200 x g for 5 min. leveringstanken nedbryting og resuspend cellene i 5 mL av M10PSF av pipettering opp og ned for å bryte en celle masse. Unngå å skape bobler i røret.
- Overføre 1 mL av resuspended celler løsningen i en ny 100 mm celle kultur parabol og legge 9 mL av ferske M10PSF. Ruge på 37 ° C og 5% CO2.
2. forberedelse av cellene til Transfection
- Evaluere samløpet eller antall celler, ved å observere dem under fase kontrast mikroskop. Minst 10% samløpet (ca 1.1 x 106 celler) er nødvendig for en plate.
- Sug opp media og vask cellene forsiktig med 10 mL PBS. Sug opp PBS og legge 3 mL EDTA. La handle for ca 1 min i romtemperatur, til cellene dissociate fra platen.
- Legge til 5 mL M10 å deaktivere trypsin og til slutt ta cellene fortsatt festet til platen av pipettering opp og ned. Overføre volumet (8 mL) 15 mL tube og sentrifuge 200 x g for 5 min.
- Sug opp nedbryting og resuspend cellene i 5 mL av M10PSF av pipettering opp og ned for å bryte en celle masse. Unngå å skape bobler i røret.
- Hvor mange plater å være transfekterte, overføre en passende mengde celler i et reservoar med riktig tilsvarende volumet av M10PSF. En 96-brønns plate bør være belagt med 1/10 av en 100% confluent 100 mm rett (ca 1.1 x 106 celler) fortynnet i M10PSF å nå et samlet volum på 6 mL. For en 96-brønns plate starter med en 100% samløpet 100 mm rett, legge 500 µL fra 5 mL av resuspended celler til 5,5 mL av ferske M10PSF. Bland celler og M10PSF uten å generere luftbobler.
- Pipetter 50 µL suspendert cellene i hver brønn av 96-brønns platen ved hjelp av en flerkanals pipette. Ruge over natten på 37 ° C og 5% CO2.
3. plasmider Transfection
- Observere 96-brønns platen under fase kontrast mikroskop å sikre en celle samløpet mellom 30% og 50%.
- Forberede en første transfection blanding som inneholder plasmider felles for hele platen (RTP1S, eller og Glosensor proteiner, se Tabellen for materiale) etter volumene i tabell 1. Legg merke til at antallet Rho-merket OR skal deles på antall ORs hvis flere ORs.
Merk: Vi sterkt råd å legge til en tom vektor negativ kontroll (her Rho-pCI) og positiv kontroll (OR kjent å svare på de testet odorant) eksperiment planen. - Forberede en andre transfection blanding som inneholder 500 µL av MEM og 20 µL av Lipofectamine 2000 reagensen (gyldig for en 96-brønns plate, se Tabellen for materiale). Legge til andre blandingen for det første, og bland forsiktig av pipettering opp og ned og ruge i 15 min ved romtemperatur. Legg 5 mL M10 og bland forsiktig.
- Erstatte M10PSF i tidligere platted 96-brønns platen ved 50 µL av siste transfection media. Inkuber i en inkubator satt til 37 ° C og 5% CO2 og vakuum chamber of luminometer overnatting følgende fremgangsmåten beskrevet i trinn 6.
4. substrat inkubasjon
- Observere 96-brønns platen under fase kontrast mikroskop å sikre en celle samløpet mellom 60% og 100%. Forberede en stimulering løsning av Hanks balansert Salt løsning (HBSS) som inneholder 10 mM hydroxyethyl piperazineethanesulfonic syre (HEPES) og 5 mM av D-glukose.
- Fortynne 75 µL av leiren reagensen (se tabell for materiale) løsning på 2,75 mL stimulering løsningen. Fjerne hva mediet fra 96-brønns platen og vask cellene ved å legge til 50 µL av fersk stimulering løsning i hver brønn.
- Fjern stimulering løsningen og legge 25 µL av leiren reagens løsning utarbeidet i trinn 4.2 i hver brønn. Inkuber 96-brønns platen ved romtemperatur i en mørk og odor-ledig omgivelsene (for eksempel en feilfri tom emballasje skuff langt fra kjemikalier eller noen odorant kilde) for 2T.
5. Odorant stimulering
- Først equilibrate luminometer kammeret med flyktige odorant molekyler. Fortynn odorant til ønsket konsentrasjonen i 10 mL av mineralolje (figur 2A). Før slutten av leiren reagens inkubasjon tiden, legge 25 µL odorant løsningen i en ny 96-brønns plate (ikke den som inneholder cellene). Inkuber denne odorant platen ved romtemperatur i luminometer kammeret i 5 min (figur 2B) (ingen luminometer opptak er nødvendig her).
- Angi luminometer til posten luminescence med 0 s forsinkelse under 20 sykluser av platen måling av 90 s med 0,7 s intervall mellom sykluser.
- Rett før du leser platen, Fjern odorant platen fra kammeret. Legge til 25 µL av odorant mellom brønnene av 96-brønns plate som inneholder cellene (ikke legge til odorant i brønnene som inneholder cellene) og raskt starte luminescence måling av alle brønner for 20 sykluser innen 30 min (figur 2C).
6. fjerning av gjenværende odorant inne Luminometer
- Åpne døren til luminometer. Sett røret koblet til vakuumpumpe.
- Vakuum odorants i lesing kammer mye (minst 2 h, helst over natten) mellom to odorants å unngå kryss-kontaminering av lukt flyktige fra et eksperiment til en annen. Erstatt med frisk luft ved å sende komprimert luft under 5 minutter før rugende den neste odorant.
7. dataanalyse
- Eksportere data fra luminometer programvare.
- Gjennomsnittlig gjentak av samme eller hver opptakstid. Beregne normalisert OR svaret eventuell kontroll (f.eks tom vektor, Figur 3A og representant resultatinndelingen) ved å dele gjennomsnitt kontrollverdien til eller gjennomsnitt verdi på hver innspillingstid (Figur 3B og representant resultatinndelingen).
- Normalisere hver OR responsen på deres basale aktiviteten ved å dele gjennomsnitt OR svaret på 0 s innspillingen tid svarene (se Figur 3C og representant resultatinndelingen).
- Beregn arealet under kurven på hvert eller hente en enkelt OR svar verdi. For å gjøre så, summere alle luminescence verdiene hver opptakstid for hver eller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi vist responsen av tre mus ORs, Olfr746, Olfr124 og Olfr1093 bruker cinnamaldehyde damp stimulering (Figur 3). Samtidig, vi brukte en tom vektor kontroll (Rho-pCI) for å sikre at odorant-indusert aktiviteter testet ORs var bestemt (Figur 3A). Sanntid aktivering av ORs på damp odorant stimulans var overvåket over 20 målesykluser. Dataene for hver var godt først normalisert tom vektor kontroll gjennomsnitt verdi for hver syklus (Figur 3B). Det er viktig å merke seg at ORs kan vise variable beskyttelsesnivåer basale aktiviteten i denne analysen i en OR-avhengige måte og det kan være viktig å normalisere også sitt svar på denne parameteren (Figur 3C). Gjennomsnittsverdien av en OR kan deles med sitt svar på t = 0 s, slik at for å sammenligne mellom ORs. Enkelt aktivisering verdier for hver OR kan også beregnes ved å beregne området under kurven (AUC) for hver eller ved å summere alle syklus målingsverdiene (Figur 3D).
I tillegg kan doseavhengig svar måles med denne metoden bruker økende odorant doser. Vi presenterer responsen fra Olfr1377 til acetophenone stimulering registrert følge samme fremgangsmåte (Figur 4). Acetophenone volatilitet kan bli vurdert av sin Damptrykk, som er tilsvarende 0.44 mm Hg ved 25 ° C. I en gitt temperatur er en odorant ha en høyere Damptrykk mer volatil enn en odorant med en lavere Damptrykk. Acetophenone er, i følge en middels flyktig odorant og er utsatt for cellen ren og utvannet på 10-2, 10-4, 10-6 og 10-8. Bare de tre høyere konsentrasjonene (ren, 10-2 og 10-4) kan aktivere Olfr1377 (Figur 4A). Vi kan også se at ren sammensatte stimulering viser en tendens til å redusere OR respons samtidig, sannsynligvis på grunn av cellen toksisitet, som det har vært vist for eugenol i en fersk publikasjon32. Likevel, vi kan observere typisk dose avhengighet oppførsel av Olfr1377 (Figur 4B), viser at denne metoden kan også brukes til å bestemme EC50 av eller til flyktige sammensatte.
Merk at når doseavhengig eksperimenter utføres, vi ikke støvsuge luminometer kammeret. Eksperimenter utføres imidlertid alltid fra lav til høy, økende odorant doser å minimere forurensing. Videre, siden den virkelige konsentrasjonen av odorant molekyler i cellen media ikke er kjent, EC50s ved denne metoden er ikke nødvendigvis sammenlignbare med de innhentet av flytende stimulering. EC50 verdiene bestemmes av vår metode ta hensyn odorant volatilitet, the kinetics av odorant oppløsning i mediet, den odorant løselighet og affinitet mellom odorant og OR, som er nærmere den naturlige oppfatningen av lukt. For vårt eksempel av Olfr1377 stimulering av acetophenone er EC50 verdien fra våre damp dose-respons 161 µM (0.001874%), som er rundt 50 brett høyere enn flytende stimulering (3,28 µM Saito et al.6). Denne forskjellen mellom væske og damp stimulations ble også rapportert av Sanz et al.20 i deres damp stimulering analysen der damp stimulering ga 100-1000 ganger lavere EC50 verdier enn flytende stimulering.
Figur 1 : Prinsippet om real-time overvåkning av odorant reseptor aktivering av vapored odorant. (A) 96-brønns platen ble plassert i den allerede equilibrated med lukt (fiolett Sky) luminometer kammer. (B) fordampet odorant molekyler (fiolett) på overflaten av cellen media bufferen oppløst i det til nå OR hulrom, på Hana3A celle membran overflaten. Tilbehør protein RTP1S (grå) var transfekterte i tillegg til fordel cellen overflaten uttrykk for OR. Hvis odorant molekylet var en OR Agonistiske, OR byttet til en aktivert tilstand og bundet Golf, utløser aktivering av adenylyl cyclase (AC) og produksjon av syklisk AMP (leiren, grønt). Glosensor protein (luciferase) har en bindende nettsted for leiren som, en gang bundet, tillater protein binde ligand, luciferin (gul). Siste komplekse Glosensor protein/luciferin/leiren produsert luminescence som ble registrert for å overvåke OR aktiveringen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Skjematisk protokoller for sanntids overvåking av odorant reseptor aktivering av vapored odorant. Odorant (fiolett) ble utvannet på ønsket konsentrasjonen i mineralolje (A). Løsningen var deretter belagt i en ny 96-brønns plate, som ble plassert i luminometer kammeret i 5 min til equilibrate volumet med vapored odorant før overvåking transfekterte 96-brønns platen (B). Odorant løsningen var pipetted i hvert mellomrom mellom brønnene på transfekterte 96-brønns platen (se zoom). Platen ble deretter lese 20 sirkelstrukturer i luminometer kammeret equilibrated damp odorant (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Eksempel på normalisering som kan utføres etter registrering av data. (A) en tom vektor (negativ) kontroll ble satt inn i hva planen skal kunne identifisere noen potensielle ikke-eller bestemt lukt aktiveringer av celler. Det har også gitt informasjon om bakgrunnen luminescence av platen. (B) hver eller ble deretter normalisert ved utslipp verdien av hver brønn gjennomsnittsverdien av kontroll vektoren i hver plate. Luminescence verdiene for hver OR ble deretter gjennomsnitt langs måling sykluser. (C) eller svar kan også deretter normaliseres til deres basale aktiviteten av ytterligere dele hver syklus verdi av gjennomsnittlig verdi av 1st syklusen av måling (t = 0 s). (D) The AUC kan beregnes ved å summere utslippsverdier hver måling syklus. B, C og D, feilfelt representerer standard feil av gjsnitt (SEM, n = 3). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Eksempel på dose avhengige svar innhentet med metoden. (A) svaret av Olfr1377 acetophenone ble registrert for fem ulike fortynninger i mineralolje (100, 10-2, 10-4, 10-6, 10-8), og uten odorant (0), og normalisert etter den normalisering protokoll som vist i Figur 3. (B) data under målingen sykluser ble oversatt til en AUC verdi for hver fortynning. Dette tallet er endret fra Kida et al.32. Dette tallet er lisensiert under en Creative Commons Attribution 4.0 International (kopi av 4.0). Feilfelt representerer standard feil av gjsnitt (SEM, n = 3). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Per 96-brønns plate | |
| MEM | 500 ΜL |
| pGlosensor | 10 ng |
| RTP1S | 5 ng |
| ELLER | 75 ng |
Tabell 1: miks for transfection. Mengder plasmider (Glosensor proteiner, RTP1S og) legge til minne til transfect til en 96-brønns plate.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Oppfatningen av lukt er fundamentalt avhengig aktivering av ORs. Følgelig kreves forståelse av funksjonaliteten å sprekk de komplekse mekanismene som hjernen bruker oppfatter sin flyktige kjemisk miljø. Imidlertid har forståelse av denne prosessen vært hemmet av vanskelighetene med å etablere en robust metode til skjermen OR repertoaret funksjonalitet mot odorants i vitro. Celle overflaten og heterologous uttrykk for ORs har vært delvis løst ved etableringen av merket reseptorer13,19 og oppdagelsen og optimalisering av reseptor-transport proteiner (RTPs) uttrykt i OSNs22 , 23. den første screening studier så dukket opp, å bringe ny innsikt til vår forståelse av eller-funksjonen som deres odorant anerkjennelse mønster6,7,26,33, aktivisering mekanisme34,35, teoretisk tridimensional struktur36,37, evolusjon38,39, lukt plass40,41, 42, og implikasjonene i lukt oppdagelsen43,44,45,46. Vi tror at å forbedre metodene i vitro kan øke tyde lukt koding. Slik utviklet vi her en ny funksjonell analysen for å tillate overvåking av OR aktivisering av fordampede odorant molekyler.
Suksessen til denne metoden avhenger av flere viktige trinn. Selv om forbedret de siste årene, fortsatt heterologous uttrykk for noen ORs vanskelig, som kan påvirke OR respons til odorant. Uttrykket av ORs på cellemembranen kan evalueres i en parallell eksperimentere med flyt cytometri19,24. Legg merke til at lave nivåer av overflaten uttrykk kan fremdeles robust svar i heterologous celle systemer35. En annen kritisk punkt er å unngå odorant forurensning. Gitt sensitiviteten av denne analysen, kan odorant molekyler parfyme, mat, eller tidligere analysen forurenser eksperimentet ved å fremkalle ukontrollert OR svar. Det er derfor vi anbefaler for å støvsuge chamber of luminometer minst 2 h, helst over natten, før du utfører analysen med en annen odorant. Det er også viktig å vurdere en potensiell cytotoksisitet av odorant brukes i eksperimentet. En potensiell nedgang på svar eller under 30 min overvåking kan vise at odorant selv har en negativ effekt på cell helse. Odorant cytotoksisitet kan evalueres ved å utføre en celle levedyktighet analysen etter utsette cellene til odorant. For å løse dette problemet, er det mulig å bare de første 10 min tid for analyse av data, beskjæring slutten. Vi la merke til at odorant toksisitet oppstår hovedsakelig når odorant testes ren eller på svært høye konsentrasjoner. Følsomheten til analysen vår tillater påvisning av odorant fortynnet i mineralolje. Optimal konsentrasjon for å lokke fram maksimal svar varierer fra én odorant til en annen, men vi observerte at en 1% fortynning er nok til å lokke fram en metning av en OR svar32. Men noen odorant molekyler kan ha lav Damptrykk (og derfor lav volatilitet) og kan trenge noen justeringer for presentert protokollen. Inkubasjon da odorant i det luminometer kammeret her er satt til 5 minutter. Vi antatt at denne tidsperioden er tilstrekkelig til å equilibrate til kammeret odorant flyktige molekyler, men lav volatilitet odorants kan kreve lengre inkubasjon ganger.
Bortsett fra disse kritiske punkter, denne metoden bringer mange nye muligheter til å utforske struktur-funksjon forholdet mellom odorant-OR interaksjoner. Sanntids overvåking aspekt av denne metoden tillater også for forståelsen av the kinetics av hendelser som oppstår under en lukt oppfatning. Som et eksempel brukte vi protokollen for å utforske funksjonaliteten til en metabolitten enzym, carboxyl esterase 1d (Ces1d), fant skal uttrykkes i olfactory mucosa i pattedyr47. Dette enzymet er kjent for å konvertere estere til karboksylsyre og alkohol48. Den co transfection av Ces1d viste en moduleringshjul i vitro OR svar til ester forbindelser,32 viser at denne nye protokollen er effektivt i å utforske betydningen av metabolske enzymer i odorant gjenkjenning. Videre kan bruker denne plattformen for å undersøke odorant blandinger og måten lukt presenteres i innstillinger som er mer naturlig, fremtidige studie forstå mer komplekse odorant vekselsvirkningene. Til slutt, oppdagelsen av odorant molekyler av ORs er også høy interesse for utvikling av en lukt sensor. Denne metoden har vist at systemet vårt kan oppdage odorant molekyler presentert i en damp fase, og er første trinn i utviklingsprosessen til en miniatyriserte biosensor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Y.F., H. K og H.M. arkivert en patent relevant for dette arbeidet på 27 oktober 2016.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra NIH (DC014423 og DC016224) og Defense Advanced Research Project Agency RealNose prosjektet. YF bodde ved Duke University med finansiell støtte fra JSP Program for fremme strategiske internasjonale nettverk å akselerere sirkulasjon av dyktige forskere (R2801). Vi takker Sahar Kaleem for redigering av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05 % trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | 0.05% Trypsin - EDTA (1x), phenol red - store at 4°C |
| 100 mm cell culture dish | BD Falcon | 353003 | 100 mm x 20 mm cell culture dish |
| 15 mL tube | BD Falcon | 352099 | 17 mm x 120 mm conical tubes |
| 96-well plate | Corning | 3843 | 96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | Amphotericin B 250 µg/mL - store at 4 °C |
| centrifuge machine | Jouan | C312 | Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL |
| Class II Type A/B3 fumehood | NUAIRE | NU-407-500 | fumehood for cell culturing |
| FBS | Gibco | 16000-044 | Fetal Bovine Serum - store at -20 °C |
| GloSensor cAMP Reagent | Promega | E1290 | GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate - store at -20 °C |
| Incubator 37 °C; 5 % CO2 | Fisher Scientific | 11-676-604 | Incubator for cell culturing |
| Lipofectamine 2000 reagent | Invitrogen | 11668-019 | Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent - store at 4 °C |
| Luminometer POLARstar OPTIMA | BMG LABTECH | discontinued | 96 well plate reader for luminescence |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | Solvent for odorants - store at room temperature |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Corning cellgro | 10-010-CV | Minimum Essential Medium Eagle with Earle’s salts & L-glutamine - store at 4 °C |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin - store at -20 °C |
| pGlosensor | Promega | E2301 | pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid - store at 4 °C |
| Phase contrast microscope | Leica | 090-131.001 | phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives |
| RTP1S | H. Matsunami lab | - | 100 ng/µL plasmid - store at 4 °C |
References
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Serizawa, S., Miyamichi, K., Sakano, H. One neuron-one receptor rule in the mouse olfactory system. Trends in Genetics. 20 (12), 648-653 (2004).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
- Peterlin, Z., Firestein, S., Rogers, M. E. The state of the art of odorant receptor deorphanization: a report from the orphanage. The Journal of General Physiology. 143 (5), 527-542 (2014).
- Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Science Signal. 2 (60), (2009).
- Geithe, C., Noe, F., Kreissl, J., Krautwurst, D. The broadly tuned odorant receptor OR1A1 is highly selective for 3-methyl-2, 4-nonanedione, a key food odorant in aged wines, tea, and other foods. Chemical Senses. 42 (3), 181-193 (2017).
- Nishizumi, H., Sakano, H. Decoding and deorphanizing an olfactory map. Nature Neuroscience. 18 (10), 1432 (2015).
- Wetzel, C. H., et al. Functional expression and characterization of a Drosophila odorant receptor in a heterologous cell system. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (16), 9377-9380 (2001).
- Touhara, K., et al. Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (7), 4040-4045 (1999).
- Levasseur, G., et al. Ligand-specific dose-response of heterologously expressed olfactory receptors. European Journal Of Biochemistry. 270 (13), 2905-2912 (2003).
- Zhao, H., et al. Functional expression of a mammalian odorant receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
- Krautwurst, D., Yau, K. -W., Reed, R. R. Identification of ligands for olfactory receptors by functional expression of a receptor library. Cell. 95 (7), 917-926 (1998).
- Wetzel, C. H., et al. Specificity and Sensitivity of a Human Olfactory Receptor Functionally Expressed in Human Embryonic Kidney 293 Cells andXenopus Laevis Oocytes. Journal of Neuroscience. 19 (17), 7426-7433 (1999).
- Kajiya, K., et al. Molecular bases of odor discrimination: reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. Journal of Neuroscience. 21 (16), 6018-6025 (2001).
- Jiang, Y., et al. Molecular profiling of activated olfactory neurons identifies odorant receptors for odors in vivo. Nature Neuroscience. 18 (10), 1446 (2015).
- Von Der Weid, B., et al. Large-scale transcriptional profiling of chemosensory neurons identifies receptor-ligand pairs in vivo. Nature Neuroscience. 18 (10), 1455 (2015).
- Geithe, C., Andersen, G., Malki, A., Krautwurst, D. A butter aroma recombinate activates human class-I odorant receptors. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (43), 9410-9420 (2015).
- Noe, F., et al. IL-6-HaloTag® enables live-cell plasma membrane staining, flow cytometry, functional expression, and de-orphaning of recombinant odorant receptors. Journal of Biological Methods. 4 (4), 81 (2017).
- Sanz, G., Schlegel, C., Pernollet, J. -C., Briand, L. Comparison of odorant specificity of two human olfactory receptors from different phylogenetic classes and evidence for antagonism. Chemical Senses. 30 (1), 69-80 (2005).
- Shepard, B. D., Natarajan, N., Protzko, R. J., Acres, O. W., Pluznick, J. L. A cleavable N-terminal signal peptide promotes widespread olfactory receptor surface expression in HEK293T cells. PLoS One. 8 (7), 68758 (2013).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119 (5), 679-691 (2004).
- Wu, L., Pan, Y., Chen, G. -Q., Matsunami, H., Zhuang, H. Receptor-Transporting Protein 1 Short (RTP1S) Mediates the Translocation and Activation of Odorant Receptors by Acting through Multiple Steps. Journal of Biological Chemistry. , (2012).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nature Protocols. 3 (9), 1402 (2008).
- Zhang, Y., Pan, Y., Matsunami, H., Zhuang, H. Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay. Journal of Visualized Experiments. (128), e55831 (2017).
- Li, S., et al. Smelling sulfur: Copper and silver regulate the response of human odorant receptor OR2T11 to low-molecular-weight thiols. Journal of the American Chemical Society. 138 (40), 13281-13288 (2016).
- Ahmed, L., et al. Molecular mechanism of activation of human musk receptors OR5AN1 and OR1A1 by (R)-muscone and diverse other musk-smelling compounds. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (17), 3950-3958 (2018).
- Duan, X., et al. Crucial role of copper in detection of metal-coordinating odorants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (9), 3492-3497 (2012).
- Sekharan, S., et al. QM/MM model of the mouse olfactory receptor MOR244-3 validated by site-directed mutagenesis experiments. Biophysical journal. 107 (5), 5-8 (2014).
- Liu, M. T., et al. Carbon chain shape selectivity by the mouse olfactory receptor OR-I7. Organic & Biomolecular Chemistry. 16 (14), 2541-2548 (2018).
- Li, Y., et al. Aldehyde Recognition and Discrimination by Mammalian Odorant Receptors via Functional Group-Specific Hydration Chemistry. ACS Chemical Biology. 9 (11), 2563-2571 (2014).
- Kida, H., et al. Vapor detection and discrimination with a panel of odorant receptors. Nature Communications. 9 (1), 4556 (2018).
- Yu, Y., et al. Responsiveness of G protein-coupled odorant receptors is partially attributed to the activation mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (48), 14966-14971 (2015).
- de March, C. A., et al. Conserved residues control Activation of mammalian G protein-coupled odorant receptors. Journal of the American Chemical Society. 137 (26), 8611-8616 (2015).
- de March, C. A., et al. Odorant receptor 7D4 activation dynamics. Angewandte Chemie. 130 (17), 4644-4648 (2018).
- Kim, S. -K., Goddard, W. A. Predicted 3D structures of olfactory receptors with details of odorant binding to OR1G1. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 28 (12), 1175-1190 (2014).
- de March, C. A., Kim, S. K., Antonczak, S., Goddard, W. A., Golebiowski, J. G protein-coupled odorant receptors: From sequence to structure. Protein Science. 24 (9), 1543-1548 (2015).
- Adipietro, K. A., Mainland, J. D., Matsunami, H. Functional evolution of mammalian odorant receptors. PLoS Genetics. 8 (7), 1002821 (2012).
- Mainland, J. D., et al. The missense of smell: functional variability in the human odorant receptor repertoire. Nature Neuroscience. 17 (1), 114 (2014).
- Meister, M.
- Bushdid, C., Magnasco, M. O., Vosshall, L. B., Keller, A. Humans can discriminate more than 1 trillion olfactory stimuli. Science. 343 (6177), 1370-1372 (2014).
- Gerkin, R. C., Castro, J. B. The number of olfactory stimuli that humans can discriminate is still unknown. Elife. 4, 08127 (2015).
- Shirasu, M., et al. Olfactory receptor and neural pathway responsible for highly selective sensing of musk odors. Neuron. 81 (1), 165-178 (2014).
- Keller, A., Zhuang, H., Chi, Q., Vosshall, L. B., Matsunami, H. Genetic variation in a human odorant receptor alters odour perception. Nature. 449 (7161), 468 (2007).
- McRae, J. F., et al. Genetic variation in the odorant receptor OR2J3 is associated with the ability to detect the "grassy" smelling odor, cis-3-hexen-1-ol. Chemical Senses. 37 (7), 585-593 (2012).
- de March, C. A., Ryu, S., Sicard, G., Moon, C., Golebiowski, J. Structure-odour relationships reviewed in the postgenomic era. Flavour and Fragrance Journal. 30 (5), 342-361 (2015).
- Olson, M. J., Martin, J. L., LaRosa, A. C., Brady, A. N., Pohl, L. R. Immunohistochemical localization of carboxylesterase in the nasal mucosa of rats. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 41 (2), 307-311 (1993).
- Nagashima, A., Touhara, K. Enzymatic conversion of odorants in nasal mucus affects olfactory glomerular activation patterns and odor perception. Journal of Neuroscience. 30 (48), 16391-16398 (2010).
