Summary
Il saggio MLVA (Multi-Locus Variable-number tandem-repeat Analysis) qui presentato consente una genotipizzazione ad alta risoluzione poco costosa, robusta e portatile del batterio patogeno del pesce Yersinia ruckeri. Partendo da colture pure, il saggio impiega la PCR multiplex e l'elettroforesi capillare per produrre profili MLVA a dieci loci per applicazioni a valle.
Abstract
Yersinia ruckeri è un importante agente patogeno dei salmonidi d'allevamento in tutto il mondo, ma sono mancati semplici strumenti adatti per indagini epizooziologiche (tracciamento delle infezioni, ecc.) di questo batterio. Un'analisi mandem-repeat multi-Locus Variable-number (MLVA) è stata quindi sviluppata come uno strumento facilmente accessibile e inequivocabile per la genotipizzazione ad alta risoluzione degli isolati recuperati. Per il saggio MLVA qui presentato, il DNA viene estratto da campioni di Y. ruckeri coltivati da cellule batteriche bollenti nell'acqua, seguiti dall'uso di supernatante come modello per la PCR. Le coppie di Primer che puntano a dieci loci tandem-repeat a numero variabile (VNTR), intervallati in tutto il genoma di Y. ruckeri, sono distribuiti equamente tra due reazioni PCR a cinque plex che corrono in condizioni di ciclismo identiche. I primer in avanti sono etichettati con uno dei tre coloranti fluorescenti. In seguito alla conferma dell'amplicono da parte dell'elettroforesi gel, i prodotti PCR vengono diluiti e sottoposti a elettroforesi capillare. Dai profili di elettroferigramma risultanti, i picchi che rappresentano ciascuno dei loci VNTR sono chiamati in base alle dimensioni e utilizzati per il calcolo del numero di ripetizioni VNTR in silico. I profili MLVA a dieci cifre risultanti vengono quindi utilizzati per generare alberi con spanning minimo, consentendo la valutazione epizoologica tramite l'analisi dei cluster. I dati di uscita altamente portatili, sotto forma di profili MLVA numerici, possono essere rapidamente confrontati tra laboratori e collocati in un contesto spatiotemporale. L'intera procedura dalla colonia colta alla valutazione epizoologica può essere completata fino a 48 Y. ruckeri isolati in un solo giorno lavorativo.
Introduction
Yersinia ruckeri, un batterio Gram-negativo e membro della famiglia Yersiniaceae, provoca yersiniosis nel pesce salmonidico d'allevamento in tutto il mondo1. È facilmente diagnosticato dai pesci infetti dalla coltivazione su molti tipi di media agar, ma fino a poco tempo fa, si sapeva poco per quanto riguarda la struttura della popolazione e l'epizootiologia di Y. ruckeri in tutto il mondo e in diversi habitat (specie ospiti, ecc.). I sistemi di serotipizzazione esistenti per Y. ruckeri sono incoerenti, mancano di compatibilità reciproca e offrono una bassa risoluzione epidemiologica. Sono stati condotti alcuni studi molecolari sul batterio, impiegando tecniche come la digitazione di sequenze Multilocus (MLST), l'elettroforesi gel a campo pulsato (PFGE) o l'analisi della sequenza dell'intero genoma (WGS)2,3,4 ,5. Tuttavia, MLST non fornisce una risoluzione sufficientemente elevata per il tracciamento delle infezioni di routine, mentre PFGE è laborioso e produce risultati che non sono facilmente portabili tra i laboratori. Mentre l'analisi wGS fornirebbe una risoluzione quasi definitiva, l'istituzione e l'attuazione di tali analisi premerebbero capacità tecniche e bioinformatiche che ancora rimangono limitate a un numero relativamente ridotto di laboratori.
Multi-locus Numero variabile tandem-ripetizione Analysis (MLVA) rappresenta uno strumento di tipizzazione molecolare semplice e facilmente accessibile, che offre una risoluzione genetica in alcuni casi quasi corrispondente a quella dell'analisi WGS6,7. La tecnica si basa sulla variazione del numero ripetuto nei loci tandem-repeat a numero variabile (VNTR) selezionato, con dati di output altamente trasportabili, rendendo semplice il confronto degli isolati profilati verso database online e tra laboratori. Sebbene l'MLST rimanga il gold standard per la tipizzazione epidemiologica di molti patogeni batterici, un numero crescente di studi identifica un potere discriminatorio significativamente più elevato di MLVA8,9,10. Diversi protocolli sono stati pubblicati anche prendendo di mira i batteri patogeni del pesce, come Francisella noatunensis, Edwardsiella piscicida e Renibacterium salmoninarum11,12, 13.
Il protocollo MLVA a dieci loci qui presentato, che ha recentemente costituito la base per un ampio studio sulla popolazione Y. ruckeri 14, prevede l'estrazione di DNA da colonie coltivate dall'agar, PCR multiplex ed elettroforesi capillare (CE), seguito da a valle nelle applicazioni in silico. Per ogni isolato esaminato, due PCR multiplex, entrambi contenenti cinque coppie di primer fluorescenti (6FAM, NED o VIC) ciascuna indirizzata a singole regioni VNTR, vengono eseguite in parallelo in condizioni identiche. Dopo la verifica degli amplificatori PCR da parte dell'elettroforesi gel (GE), i prodotti PCR vengono diluiti prima dell'analisi CE e i picchi che rappresentano i rispettivi loci VNTR sono chiamati in grande dai file di elettroferografia risultanti. Insieme alle formule specifiche del locus che tengono conto di discrepanze minori specifiche della sequenza nei modelli migratori CE, le chiamate di dimensioni VNTR CE vengono quindi utilizzate per il calcolo dei conteggi di ripetizione VNTR che vengono concatenati in profili MLVA a dieci cifre. Questi vengono utilizzati come input per le valutazioni epizooziologiche (ad esempio, per analisi cluster nei diagrammi di struttura con spanning minimo (MST).
Protocol
AVVISO: Per l'intero protocollo, si consiglia di condurre tutte le procedure di laboratorio bagnato sterilmente utilizzando cappotti da laboratorio, guanti usa e getta e reagenti sterili e attrezzature. Si consiglia inoltre di preparare le reazioni PCR in una stanza separata (pre-PCR) non utilizzata per l'amplificazione PCR e/o la movimentazione dei prodotti PCR (post-PCR). Conservare tutti i reagenti come raccomandato dal produttore. Vedere la Tabella dei materiali per ulteriori dettagli su reagenti, attrezzature e software utilizzati.
1. Coltivazione batterica ed estrazione del DNA genomico
- Semina le colture pure Y. ruckeri su qualsiasi tipo di agar adatto (gli autori usavano il 5% di agar bovino) e incubava a 22 gradi centigradi per 1-2 giorni, o 15 gradi centigradi per 3-4 giorni.
- Da ogni piastra di agar, scegliere una singola colonia rappresentativa con un anello di inoculazione e trasferire a tubi di centrifuga 1,5 mL contenenti 50 .L di acqua ultrapurificata. Sospendere, vortice brevemente, e incubare per 7 min su un blocco di riscaldamento a 100 gradi centigradi.
- Centrifuga a 16 000 x g per 3 min e utilizzare una pipetta per trasferire attentamente il supernatante in un tubo di centrifuga vuoto di 1,5 ml. Procedere al passo successivo utilizzando il supernatante come modello DNA o memorizzare a -20 gradi centigradi fino a quel momento.
2. Configurazione PCR Multiplex e condizioni di ciclismo
NOT: Ogni reazione multiplex PCR (due per isolare di Y. ruckeri) deve contenere 12,5 loff di 2x multiplex PCR Plus master mix, da 0,1 a 0,2 M di ogni coppia di primer appropriata (Tabella 1) e 3 L di DNA del modello, regolato a un volume di reazione finale di 25 aggiunta di acqua senza RNase. Mira a mantenere al minimo l'esposizione alla luce dei primer fluorescenti etichettati in avanti (ad esempio, avvolgendo i loro tubi di stoccaggio in un foglio di alluminio).
- Per ciascuno dei due saggi PCR multiplex (Tabella 1), preparare le miscele master come descritto sopra (senza DNA del modello) in base al numero di campioni più un controllo positivo e uno negativo. Inoltre, consentire il 10% di volume in eccesso. Vortice il maestro preparato mescola delicatamente a bassa velocità.
- Distribuire 22 ll di ogni miscela master separatamente in singoli pozze su strisce PCR o piastre, a seconda del numero di campioni, e aggiungere 3 l di modello ad ogni pozzo (per i controlli positivi e negativi, rispettivamente, utilizzare il DNA da un Y. ruckeri verificato e l'acqua ultrapurificata). Sigillare e centrifugare brevemente.
- Eseguire tutti i campioni su un ciclore termico PCR con il seguente programma: (i) 5 min a 95 s (ii) 30 cicli di 0,5 min a 95 , 1,5 min a 60 s e 1 min a 72 s e (iii) 60 min a 68 , seguito dal raffreddamento a 4 gradi centigradi. Il programma verrà completato in meno di 3 h.
3. Conferma amplicon PCR di Gel Electrophoresis
- Secondo le raccomandazioni del produttore, preparare un volume di 1.5% (w/v) gel di agarose in 1x tris-borate-EDTA (TBE) buffer appropriato per il numero di reazioni PCR da testare. Prima della colata, aggiungere 5 -L di colorante acido nucleico fluorescente per 50 - L di soluzione gel e mescolare. Utilizzare vassoi e pettini a seconda dei casi per la colata, lasciando un numero adeguato di pozze libere per le scale di riferimento del DNA.
- Dopo l'impostazione, immergere il gel in 1x TBE-buffer in un sistema GE. Mescolare 5 l di prodotto PCR con 2 - L di tintura di carico e trasferire in pozzi di gel. Aggiungere 5 gradi di scala del DNA in pozze vuote per riferimento.
- Eseguire il gel a 110 V per 15 cm per circa 1 h e utilizzare un sistema di imaging/visualizzazione gel basato su UV per verificare la presenza di più (fino a cinque) bande che rappresentano amplificatori PCR (vedere l'esempio nella Figura 1). Scartare il gel. Procedere al passo successivo o conservare i restanti prodotti PCR a 4 gradi centigradi fino a un'ulteriore lavorazione.
4. Condizioni di impostazione ed esecuzione dell'elettroforesi capillare
- Dopo la conferma degli amplificatori PCR, diluire i prodotti PCR 1:10 (v/v) in acqua purificata. Sigillare, mescolare e centrifugare brevemente.
- Lavorando in un armadio a fumi, preparare un volume di miscela master composto da 9 : L di formamide e 0,5 l di dimensioni standard per prodotto PCR (consentire il 10% di volume in eccesso). Vortex in breve e distribuire brevemente 9,5 gradi l in pozze su una piastra appropriata per il sistema CE disponibile, prima di aggiungere 0,5 gradi l di prodotto PCR diluito. Sigillare, mescolare e centrifugare brevemente.
ATTENZIONE: Maneggiare con cura. La miscelazione di formamide con acqua genera acido formico, che è tossico. - Utilizzando un ciclore termico PCR, denaturare i campioni a 95 gradi centigradi per 3 min prima del raffreddamento a 4 gradi centigradi a tempo indeterminato. Centrifuga brevemente e caricare la piastra su un sistema CE calibrato secondo le istruzioni del produttore.
- Eseguire l'analisi dei frammenti CE utilizzando i reagenti a seconda dell'apparato di scelta e le seguenti impostazioni: 60 . iniezioni 5 s a 1,6 kV (32 V per cm); 32 min di esecuzione a 15 kV (300 V per cm). L'analisi del frammento CE di 24 pozzi su un 24-capillary (50 cm) in genere richiede circa 50 min.
5. Chiamata di dimensioni VNTR, calcolo del conteggio ripetute e profilatura MLVA
NOT: Il passaggio 5.1 descrive la dimensione Y. ruckeri VNTR CE chiamando da file di elettropherogram, utilizzando il software specifico elencato nella tabella dei materiali. Consultare il manuale del software per ulteriori dettagli e la risoluzione dei problemi. Per l'uso di altri software, consultare i manuali appropriati.
-
Importare i file dei risultati CE (due per Y. ruckeri isolate). Impostare Metodo di analisi su Microsatellite Default e selezionare la scelta del prodotto appropriata in Size Standard, prima di premere il pulsante Analizza. Verificare la corretta identificazione dei frammenti standard di dimensione tramite l'Editor corrispondenza dimensioni e correggere eventuali allocazioni visibilmente errate.
- Dopo aver selezionato i campioni da leggere, premere il pulsante Visualizza grafici e premere CTRL -A per attivare la visualizzazione della tabella di ridimensionamento. Nel pannello superiore, tenere premuto CTRL mentre si fa clic sui cinque picchi che rappresentano gli amplificatori VNTR (utilizzare lo strumento di zoom in base alle esigenze).
NOT: Per ciascuno dei prodotti multiplex PCR, l'elettroferogramma mostrerà cinque picchi distribuiti tra i tre coloranti impiegati (cfr. etichettatura da 5' di colorante dei primer di inoltro nella tabella 1 e nei due esempi nella Figura 2). - Premete Ctrl-G per filtrare la Tabella di dimensionamento, mostrando solo le caratteristiche dei cinque picchi evidenziati e registrando le chiamate alle dimensioni CE per ogni locus VNTR (con riferimento alla tabella 1) per l'applicazione a valle.
- Dopo aver selezionato i campioni da leggere, premere il pulsante Visualizza grafici e premere CTRL -A per attivare la visualizzazione della tabella di ridimensionamento. Nel pannello superiore, tenere premuto CTRL mentre si fa clic sui cinque picchi che rappresentano gli amplificatori VNTR (utilizzare lo strumento di zoom in base alle esigenze).
- Per tenere conto dei modelli di mobilità degli amplicon di parte durante la CE, calcolare i conteggi di ripetizione VNTR accurati in base alla formula fornita di seguito, utilizzando le chiamate di dimensione VNTR CE insieme a variabili specifiche del locus (vedere la tabella 1). Per migliorare l'efficienza, è consigliabile automatizzare questo processo (ad esempio, utilizzando un modello di foglio di calcolo).
- Le ripetizioni VNTR calcolate arrotondate vengono conteggiate all'intero più vicino e concatenate in stringhe di dieci cifre, ognuna delle quali rappresenta il profilo MLVA di un singolo isolare Y. ruckeri.
6. Analisi minima del cluster di spanning dei dati MLVA
NOT: Il passaggio 6 descrive la creazione di diagrammi MST dai dati MLVA di Y. ruckeri, utilizzando il software specifico elencato nella Tabella dei materiali. Consultare il manuale del software per ulteriori dettagli e la risoluzione dei problemi. Per l'uso di altri software, consultare i manuali appropriati.
- Creare un nuovo database e scegliere di attivare il plug-in MLVA.
- Importare i profili e i metadati di Y. ruckeri MLVA selezionando Dati del tipo di carattere seguiti da Importa campi e caratteri (ulteriore sottoselezione a seconda del formato di archiviazione). Quando richiesto, specificare le regole di importazione in base al contenuto del file di importazione: nella colonna Tipo di destinazione, classificare i conteggi delle ripetizioni VNTR come Valore carattere: VNTRe i metadati vari come Informazioni di immissione: campo Informazioni di immissione .
NOT: Per il confronto e il contesto, è anche possibile importare l'intero set di dati pubblicato (accesso aperto) insieme al documento originale che impiega l'attuale protocollo MLVA14. I profili e i metadati di MLVA sulla variegata raccolta di y. ruckeri isola (n - 484) esaminati in tale studio sono disponibili dal suo materiale supplementare (tabelle S1 e S2) attraverso il seguente link: https://aem.asm.org/content/84/16/e00730-18/figures-only#fig-data-additional-files - Nel pannello Tipo di esperimento, aprire la voce VNTR e impostare i valori minimo e massimo per ogni locus VNTR rispettivamente su 0 e 100. In Impostazioni generaliimpostare il numero di cifre decimali su 0 e selezionare Numeri in Tipo didati. Controllare per considerare i valori assenti come zero.
-
Selezionare i campioni importati destinati all'analisi del cluster MST e fare clic sul pulsante Crea nuovo confronto (nel pannello Confronto).
- Se lo si desidera per la presentazione visiva dell'MST, allocare i campioni a gruppi colorati (ad esempio, in base a un particolare tratto di metadati) utilizzando le varie opzioni disponibili nel pannello Gruppi.
NOT: I gruppi possono anche essere creati/modificati retrospettivamente, successivamente ai seguenti passaggi. - Selezionare Analisi cluster avanzata... e MST per i dati di categoria per generare un diagramma MST basato sui campioni scelti.
- Modificare ulteriormente la presentazione visiva dell'MST come preferito (ad esempio, aggiungendo parametri di partizionamento, etichettatura nodo/ramo, collegamenti incrociati, legende e così via). Vedere l'esempio nella Figura 3.
NOT: Una soglia di partizionamento del cluster (complesso clonale) di 4/10 loci VNTR non identici, oltre a nascondere le connessioni di succursale che rappresentano >5/10 VNTR loci non identici, è stata precedentemente utilizzata per l'analisi del cluster MST basata sui dati MLVA generati utilizzando questo protocollo14. A condizione che sia stato importato il set di dati di cui sopra di 484 profili MLVA Y. ruckeri, tali campioni possono anche essere inclusi per l'analisi del cluster MST (come descritto in precedenza) per fornire un contesto globale e cronologico. Ciò, ad esempio, faciliterà l'identificazione di eventuali campioni affiliati a complessi clonali descritti in precedenza, nonché di quelli che rappresentano lignaggi non ancora descritti. A seconda dei metadati disponibili, il diagramma MST risultante può essere esaminato in modi diversi, ad esempio per scoprire eventuali modelli di clustering collegati a particolari caratteristiche (geografia, host, tempo, ecc.). - Se necessario, esportare l'MST finalizzato nel formato desiderato utilizzando la selezione Esporta immagine.
- Se lo si desidera per la presentazione visiva dell'MST, allocare i campioni a gruppi colorati (ad esempio, in base a un particolare tratto di metadati) utilizzando le varie opzioni disponibili nel pannello Gruppi.
Representative Results
Dopo la PCR multiplex come descritto di seguito, una tipica immagine GE che verifica la presenza di più amplificatori da ogni reazione PCR è illustrata nella Figura 1. L'analisi dei frammenti CE a valle eseguita su prodotti PCR verificati, per ogni Y. ruckeri isolato esaminato, comporterà due file di elettroferigramma utilizzati per la chiamata di dimensioni dei rispettivi loci VNTR (Figura 2). Dall'analisi di 484 diversi isolati di Y. ruckeri, non è stata osservata alcuna sovrapposizione nella gamma di dimensioni dell'ampiezza tra VNTR loci etichettato con lo stesso tintura nella stessa reazione multiplex (Tabella 1)14. Ciascuno dei picchi elettroforetici può, quindi, essere identificato in modo inequivocabile dal colore.
In seguito all'importazione dei profili MLVA e dei relativi metadati nel software preferito, i diagrammi MST possono essere costruiti come descritto per il controllo di eventuali modelli epidemiologici di interesse per il materiale. Consultare i manuali appropriati per ulteriori opzioni disponibili nel rispettivo software. Ad esempio, la figura 3 mostra il confronto da MST dei profili MSt di MLVA per Y. ruckeri isolati recuperati dal pesce associato a cinque diversi allevamenti di salmone in Norvegia.
Le dimensioni di ripetizione coerenti dei dieci loci VNTR, così come la loro stabilità in vitro e in vivo, sono state precedentemente verificate nello studio originale sulla base di questo protocollo14. In breve, questo è stato fatto utilizzando il sequenziamento di Sanger (dimensione ripetizione), e dalla digitazione MLVA di più isolati in seguito a passaggi seriali (in vitro) e dall'interno di singoli focolai di malattia (in vivo). Inoltre, la stabilità ambientale dei loci nel tempo è stata esaminata digitando più isolati di "ceppo domestica" recuperati nel corso di diversi anni da siti di produzione di acqua dolce persistentemente infetti per il salmone atlantico.
Figura 1 : elettroforesi gel verificando la presenza di più prodotti PCR. L'immagine conferma la presenza di più amplificatori PCR in tutte le 12 corsie contenenti campioni, con la prima corsia che rappresenta la scala del DNA utilizzata. Sono state indicate le dimensioni dei frammenti di scala selezionati, così come il saggio e la deformazione pcR (vedi tabella S1 a Gulla et al. 201814) di affiliazione di ogni corsia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : elettroferigrammi che mostrano picchi corrispondenti agli amplificatori VNTR. Sono indicati i nomi dei diversi loci VNTR, con etichette di coloranti (VIC - verde; NED - nero; 6FAM - blu) tra parentesi. I due elettroferici (ansay PCR 1 top; IL secondo rinnovi PCR 2 in basso) provengono dalla digitazione di un singolo isolare Y. ruckeri. I picchi di arancio (tine LU) rappresentano le dimensioni standard impiegate. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Esempio Albero spanning minimo per la valutazione epidemiologica. Il diagramma si basa sui profili MLVA di Y. ruckeri isolati recuperati dal salmone atlantico in cinque diverse aziende agricole norvegesi (1-5; vedi leggenda) che sperimentano epidemie ricorrenti di esimmetria. Si può osservare una chiara tendenza al raggruppamento legata all'origine dell'azienda agricola. I collegamenti incrociati mostrano tutte le connessioni possibili che coinvolgono loci VNTR non identici (vedere legenda). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Elettropherogram che visualizza balbuzie e picchi divisi. In questo caso, entrambi si verificano contemporaneamente, che non è sempre il caso. Il picco più lungo e più alto, che rappresenta il locus YR1070 VNTR, può essere facilmente distinto. Il display è ingrandito e mostra solo picchi di coloranti blu. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Caratteristiche del locus VNTR. Caratteristiche rilevanti delle dieci regioni Y. ruckeri VNTR prese di mira nell'attuale protocollo MLVA.
Discussion
Entrambi i PCR multiplex qui presentati sono apparsi relativamente robusti di fronte alla scarsa qualità del DNA del modello, ma la mancanza di amplificazione PCR è stata comunque occasionalmente osservata quando si utilizzano modelli con concentrazioni di DNA estremamente elevate. Questi problemi sono stati facilmente risolti diluindo i modelli prima di PCR. Possono essere utilizzati anche altri metodi per l'estrazione del DNA rispetto a quello qui impiegato (ad esempio, kit commerciali).
Anche se ci si aspetta cinque amplificatori da ogni reazione PCR multiplex, cinque bande visivamente distinguibili non dovrebbero sempre essere previste da GE, poiché alcuni loci VNTR (etichettati in modo diverso) all'interno della stessa reazione hanno intervalli di dimensioni sovrapposti. Il tempo di estensione finale della PCR di 60 min può essere ridotto se necessario, ma probabilmente si tradurrà in un aumento dell'insorgenza di picchi divisi nei successivi elettroperoigrammi CE (vedi sotto). In particolare, poiché lo scopo del passo GE è puramente per la verifica qualitativa degli amplificatori PCR, il tempo di esecuzione, la tensione e/o la ricetta del gel possono essere regolati come preferito. Se le bande particolarmente deboli sono osservate da GE, può essere consigliabile ridurre il fattore di diluizione di tali campioni prima della CE.
Mentre il protocollo CE qui descritto è stato eseguito su uno specifico apparato commerciale di elettroforesi capillare (cfr. tabella deimateriali), diversi sistemi CE possono avere requisiti di esempio diversi, che a loro volta possono richiedere alcune modifiche al protocollo . Fare riferimento al manuale del rispettivo produttore del sistema CE per istruzioni sui reagenti/attrezzature appropriati, sulla calibrazione ecc. per l'analisi dei frammenti. Esiste anche la possibilità che i modelli di mobilità degli amplificatori distorti osservati durante la CE possano differire, relativamente, tra i sistemi e/o le macchine CE, come è stato precedentemente documentato per altri protocolli MLVA15,16. Se si verifica noto in un'estensione in cui i conteggi delle ripetizioni VNTR finali (arrotondati) vengono influenzati, significa che le variabili specifiche del locus s e i (Tabella 1), utilizzate per determinare i conteggi ripetizioni VNTR, devono essere ri-calibrate. Ciò comporta la regressione lineare su grafici che confrontano dimensioni di sequenza accurate con chiamate di dimensioni CE, come descritto da Gulla et al. 201814.
I picchi divisi e i picchi di balbuzie, entrambi artefatti noti nella digitazione MLVA basata su CE17, possono essere osservati negli elettroferigrammi durante la chiamata delle dimensioni (Figura 4). Mentre i picchi di balbuzie devono essere ignorati, il picco più lungo deve essere selezionato in modo coerente per le applicazioni a valle nel caso di picchi divisi separati da una singola coppia di base. Inoltre, i picchi assenti che indicano la mancanza di particolari loci VNTR sono rari, ma possono verificarsi, nel qual caso dovrebbe essere assegnato un conteggio ripetuto di '0'. Se la coltura di partenza da cui viene estratto il DNA non è pura (cioè contiene più di un sottotipo Y. ruckeri), più picchi alti corrispondenti a diversi alleli dello stesso locus/loci possono essere osservati dopo CE. Le coltivazioni secondarie devono quindi essere eseguite da singole colonie prima dell'estrazione di nuovo DNA per la ridigitazione.
Come indicato nel protocollo, il DNA modello per PCR deve essere estratto per impostazione predefinita dalle colture pure di Y. ruckeri. In alcuni casi, tuttavia, i campioni di acqua-fluido risultato positivo per Y. ruckeri by qPCR (Ct-values < 27) sono stati digitati direttamente MLVA, senza coltura preventiva, utilizzando una maggiore quantità di DNA genomico (estratto con kit commerciale) come modello. Anche se questo approccio non è stato ampiamente testato né verificato, indica il potenziale di questo saggio MLVA per l'esame di complesse matrici biologiche contenenti DNA da una serie di organismi diversi oltre a Y. ruckeri.
L'intera procedura di digitazione MLVA qui presentata, dall'estrazione del DNA alla valutazione epizoologica, può essere completata in un'unica giornata lavorativa. Tuttavia, il numero di campioni esaminati è in una relazione sublineare con il tempo necessario per l'estrazione del DNA, la PCR e la CE, e il metodo è quindi molto più efficiente in termini di tempo durante l'esecuzione di più campioni contemporaneamente. Questo è tuttavia il caso per la maggior parte dei metodi di laboratorio, e come strumento per la sottotipizzazione epidemiologica di Y. ruckeri, la combinazione di alta risoluzione, semplicità e portabilità rende questo saggio MLVA superiore ai protocolli pubblicati in precedenza4 ,5. È stato utilizzato anche per verificare la limitata rilevanza epidemiologica di Y. ruckeri serotyping14.
Attraverso uno studio completo sulla popolazione basato su MLVA che ha coinvolto 484 isolati Y. ruckeri recuperati da una serie di origini e habitat spatiotemporali (pesce ospite, ambiente, ecc.), la nostra comprensione dell'epizoopatologia e della popolazione struttura di questo importante patogeno pesce è stato notevolmente aumentato14. La tipizzazione MLVA ha permesso la tracciabilità dei cloni diffusi antropogenicamente nel corso dei decenni, presumibilmente attraverso il trasporto di pesci, così come l'identificazione di ceppi confinati localmente. Inoltre, mentre alcuni complessi clonali del batterio potrebbero essere chiaramente associati alla malattia in particolari ospiti di pesci (rispettivamente trota arcobaleno e salmone atlantico), altri sono stati recuperati solo da fonti ambientali e/o pesci clinicamente non colpiti Esemplari. L'applicabilità del metodo non si limita quindi solo al tracciamento delle infezioni, in quanto può anche fornire informazioni di potenziale rilevanza, ad esempio per lo sviluppo del vaccino, la valutazione del rischio e il mantenimento della biosicurezza nazionale. Attualmente è in uso attivo presso l'Istituto Veterinario Norvegese come strumento per studiare le diagnosi di Y. ruckeri nell'acquacoltura norvegese.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Il presente studio è stato finanziato dal Norwegian Seafood Research Fund, FHF (progetto n. 901119 e 901505). Desideriamo ringraziare tutti i contributori di isolati batterici e campioni utilizzati durante lo sviluppo del metodo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22°C/15°C incubator | As preferred. | NA | |
| 5' Labeled Primer, 10K PMOL, Desalted, Dry | Thermo Fisher Scientific | 450007 | Sequences and labelling in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer. |
| Agarose, universal, peqGOLD | VWR | 732-2789P/732-2788 | Used during gel electrophoresis. |
| Avant 3500xL Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | A30469 | Used for capillary electrophoresis fragment analysis. |
| BioNumerics7 modules | Applied Maths | NA | Used for generating Minimum spanning trees from MLVA data. |
| Centrifuge(s) | As preferred. | NA | |
| Custom DNA Oligo, 25N, Desalted, Dry | Thermo Fisher Scientific | A15612 | Sequences in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer. |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Loading dye used during gel electrophoresis. |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Centrifuge tubes used during DNA extraction. |
| Freezer | As preferred. | NA | |
| Fume cupboard | As preferred. | NA | |
| Gel electrophoresis system | As preferred. | NA | |
| GelRed Nucleic Acid Stain, 10,000X in water | Biotium | 41003 | Fluorescent nucleic acid dye used during gel electrophoresis. |
| GeneMapper Software 5 | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | Used for reading electropherograms from capillary electrophoresis. |
| GeneRuler 50 bp DNA Ladder, ready-to-use | Thermo Fisher Scientific | SM0373 | DNA ladder used during gel electrophoresis. |
| GeneScan 600 LIZ dye Size Standard v2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4408399 | Size standard used during capillary electrophoresis. |
| Heating block | As preferred. | NA | |
| Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320/4440753 | Deionized formamide used during capillary electrophoresis. Prepare working aliquouts. |
| Milli-Q water | NA | NA | Purified water used during PCR and capillary electrophoresis. Standard recipe; produced in-house. |
| Multiplex PCR Plus Kit | Qiagen | 206151/206152 | |
| PCR thermal cycler | As preferred. | NA | |
| POP-7 Polymer for 3500 Dx/3500xL Dx Genetic Analyzers | Thermo Fisher Scientific | A26077/4393713/4393709 | Separation matrix used during capillary electrophoresis. |
| Pure culture Yersinia ruckeri | NA | NA | E.g. cryopreserved or fresh. |
| RNase-free water | Qiagen | NA | In: Multiplex PCR Plus Kit |
| Tris-borate-EDTA (TBE) buffer | NA | NA | Standard recipe; produced in-house. |
| Trypsine soy agar/bovine blood agar | NA | NA | Standard recipe; produced in-house. |
| UV-based gel imaging/visualisation system | As preferred. | NA | |
| Vortexer | As preferred. | NA |
References
- Barnes, A. C. Enteric redmouth disease (ERM) (Yersinia ruckeri). Fish Diseases and Disorders, Vol 3: Viral, Bacterial and Fungal Infections. 3, 484-511 (2011).
- Barnes, A. C., et al. Whole genome analysis of Yersinia ruckeri isolated over 27 years in Australia and New Zealand reveals geographical endemism over multiple lineages and recent evolution under host selection. Microbial Genomics. 2 (11), 000095 (2016).
- Calvez, S., Mangion, C., Douet, D. G., Daniel, P. Pulsed-field gel electrophoresis and multi locus sequence typing for characterizing genotype variability of Yersinia ruckeri isolated from farmed fish in France. Veterinary Research. 46, 73 (2015).
- Bastardo, A., Ravelo, C., Romalde, J. L. Multilocus sequence typing reveals high genetic diversity and epidemic population structure for the fish pathogen Yersinia ruckeri. Environmental Microbiology. 14 (8), 1888-1897 (2012).
- Wheeler, R. W., et al. Yersinia ruckeri biotype 2 isolates from mainland Europe and the UK likely represent different clonal groups. Diseases of Aquatic Organisms. 84 (1), 25-33 (2009).
- Eyre, D. W., et al. Comparison of multilocus variable-number tandem-repeat analysis and whole-genome sequencing for investigation of Clostridium difficile transmission. Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4141-4149 (2013).
- Sun, M., et al. Multiple Locus Variable-Number Tandem-Repeat and Single-Nucleotide Polymorphism-Based Brucella Typing Reveals Multiple Lineages in Brucella melitensis Currently Endemic in China. Frontiers in Veterinary Science. 4, (2017).
- Bouchouicha, R., et al. Comparison of the performances of MLVA vs. the main other typing techniques for Bartonella henselae. Clinical Microbiology and Infection. 15, SUPPL 2 104-105 (2009).
- Dahyot, S., et al. Multiple-Locus Variable Number Tandem Repeat Analysis (MLVA) and Tandem Repeat Sequence Typing (TRST), helpful tools for subtyping Staphylococcus lugdunensis. Scientific Reports. 8 (1), (2018).
- Elberse, K. E. M., Nunes, S., Sá-Leão, R., van der Heide, H. G. J., Schouls, L. M. Multiple-locus variable number tandem repeat analysis for Streptococcus pneumoniae: Comparison with PFGE and MLST. PLoS ONE. 6 (5), (2011).
- Matejusova, I., et al. Multilocus variable-number tandem-repeat genotyping of Renibacterium salmoninarum, a bacterium causing bacterial kidney disease in salmonid fish. BMC microbiology. 13, 285 (2013).
- Duodu, S., et al. An improved multiple-locus variable-number of tandem repeat analysis (MLVA) for the fish pathogen Francisella noatunensis using capillary electrophoresis. BMC Veterinary Research. 9, 252 (2013).
- Abayneh, T., Colquhoun, D. J., Austin, D., Sørum, H. Multilocus variable number tandem repeat analysis of Edwardsiella piscicida isolates pathogenic to fish. Journal of Fish Diseases. 37 (11), 941-948 (2014).
- Gulla, S., et al. Multilocus variable-number tandem-repeat analysis of Yersinia ruckeri confirms the existence of host specificity, geographic endemism, and anthropogenic dissemination of virulent clones. Applied and Environmental Microbiology. 84 (16), (2018).
- Pasqualotto, A. C., Denning, D. W., Anderson, M. J. A cautionary tale: Lack of consistency in allele sizes between two laboratories for a published multilocus microsatellite typing system. Journal of Clinical Microbiology. 45 (2), 522-528 (2007).
- Lista, F., et al. Genotyping of Bacillus anthracis strains based on automated capillary 25-loci multiple locus variable-number tandem repeats analysis. BMC Microbiology. 6, 33 (2006).
- Thermo Fisher Scientific DNA Fragment Analysis by Capillary Electrophoresis. , Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/fragment-analysis-chemistry-guide.pdf (2014).
