Summary
मल्टी-लोकस चर-संख्या अग्रानुक्रम-पुनरावृत्ति विश्लेषण (एमएलवीए) परख यहाँ प्रस्तुत मछली-रोगजनक जीवाणु Yersinia ruckeriकी सस्ती, मजबूत और पोर्टेबल उच्च संकल्प जीनोटाइपिंग सक्षम बनाता है। शुद्ध संस्कृतियों से शुरू, परख डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए दस-लोकी MLVA प्रोफाइल का उत्पादन करने के लिए मल्टीप्लेक्स पीसीआर और केशिका इलेक्ट्रोफोरोसिस कार्यरत हैं।
Abstract
Yersinia ruckeri दुनिया भर में खेती salmonids का एक महत्वपूर्ण रोगज़नक़ है, लेकिन इस जीवाणु के epizootiological जांच (संक्रमण अनुरेखण, आदि) के लिए उपयुक्त सरल उपकरण की कमी रही है. एक बहु-लोकस चर संख्या अग्रानुक्रम-पुनरावृत्ति विश्लेषण (MLVA) परख इसलिए बरामद अलग के उच्च संकल्प जीनोटाइपिंग के लिए एक आसानी से सुलभ और स्पष्ट उपकरण के रूप में विकसित किया गया था. MLVA परख यहाँ प्रस्तुत के लिए, डीएनए पानी में जीवाणु कोशिकाओं को उबालने से सुसंस्कृत वाई ruckeri नमूने से निकाला जाता है, पीसीआर के लिए टेम्पलेट के रूप में supernatant के उपयोग के बाद. प्राइमर-नेल्स दस चर-संख्या अग्रानुक्रम-पुनरावृत्ति (VNTR) loci को लक्षित करते हैं, वाई ruckeri जीनोम भर interspersed, समान साइकिल की स्थिति के तहत चल रहे दो पांच-plex पीसीआर प्रतिक्रियाओं के बीच समान रूप से वितरित कर रहे हैं। फॉरवर्ड प्राइमर को तीन फ्लोरोसेंट रंगों में से किसी के साथ लेबल किया गया है। जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस द्वारा amplicon पुष्टि के बाद, पीसीआर उत्पादों पतला कर रहे हैं और केशिका इलेक्ट्रोफोरोसिस के अधीन. परिणामस्वरूप इलेक्ट्रोफेरोग्राम प्रोफाइल से, प्रत्येक VNTR loci का प्रतिनिधित्व चोटियों आकार कहा जाता है और silico में VNTR दोहराने मायने रखता है की गणना के लिए कार्यरत हैं. परिणामस्वरूप दस अंकों MLVA प्रोफाइल तो क्लस्टर विश्लेषण द्वारा epizootiological मूल्यांकन को सक्षम करने के न्यूनतम फैले पेड़ उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जाता है. उच्च पोर्टेबल उत्पादन डेटा, संख्यात्मक MLVA प्रोफाइल के रूप में, तेजी से प्रयोगशालाओं भर में तुलना की जा सकती है और एक spatiotemporal संदर्भ में रखा. सुसंस्कृत कॉलोनी से epizootiological मूल्यांकन करने के लिए पूरी प्रक्रिया के लिए पूरा किया जा सकता है 48 Y. ruckeri एक ही काम के दिन के भीतर अलग.
Introduction
Yersinia ruckeri,एक ग्राम नकारात्मक जीवाणु और Yersiniaceae परिवार के सदस्य, दुनिया भर में खेती salmonid मछली में yersiniosis का कारण बनताहै 1. यह आसानी से agar मीडिया के कई प्रकार पर खेती से संक्रमित मछली से निदान किया है, लेकिन हाल ही में जब तक, थोड़ा जनसंख्या संरचना और Y ruckeri के epizootiology के बारे में दुनिया भर में और विभिन्न निवास स्थानों (होस्ट प्रजातियों, आदि) के बारे में जाना जाता था. वाई ruckeri के लिए मौजूदा serotyping प्रणाली असंगत हैं, आपसी संगतता की कमी है और कम महामारी विज्ञान संकल्प की पेशकश. जीवाणु पर कुछ आणविक अध्ययन किए गए हैं, मल्टीलोकस अनुक्रम टाइपिंग (एमएलएसटी), स्पंदित क्षेत्र जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस (पीएफजीई) या पूरे जीनोम अनुक्रम (डब्ल्यूजीएस) विश्लेषण2,3,4 जैसी तकनीकों को रोजगार देते हुए ,5. हालांकि, MLST नियमित संक्रमण अनुरेखण के लिए एक पर्याप्त उच्च संकल्प प्रदान नहीं करता है, जबकि PFGE श्रम की मांग है और परिणाम है कि प्रयोगशालाओं में आसानी से पोर्टेबल नहीं हैं पैदा करता है. जबकि WGS विश्लेषण एक निकट अंतिम संकल्प प्रदान करेगा, स्थापना और इस तरह के विश्लेषण के कार्यान्वयन के लिए आवश्यक तकनीकी और bioinformatics क्षमताओं है कि अभी तक प्रयोगशालाओं की एक अपेक्षाकृत छोटी संख्या तक ही सीमित रहना होगा.
मल्टी-लोक्स चर-संख्या अग्रानुक्रम-पुनरावृत्ति विश्लेषण (एमएलवीए) एक सरल और आसानी से सुलभ आणविक टाइपिंग उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है, जो कुछ मामलों में आनुवंशिक संकल्प प्रदान करता है जो लगभग WGS विश्लेषण6,7के मिलान करता है। तकनीक चयनित चर संख्या अग्रानुक्रम-पुनरावृत्ति (VNTR) loci में दोहराने संख्या भिन्नता पर आधारित है, उत्पादन डेटा है कि अत्यधिक परिवहनीय है में जिसके परिणामस्वरूप, ऑनलाइन डेटाबेस की ओर profiled isolates की तुलना कर रही है और प्रयोगशालाओं में सीधा. यद्यपि एमएलएसटी कई जीवाणु रोगजनकों के महामारी विज्ञान के लिए स्वर्ण मानक बना हुआ है , फिर भी अध्ययनों की बढ़ती संख्या एमएलवीए8,9,10की काफी अधिक भेदभावपूर्ण शक्ति की पहचान करती है . कई प्रोटोकॉल भी मछली-रोगजनक बैक्टीरिया को लक्षित प्रकाशित किया गया है, जैसे फ्रांसिसेला नोटानुनेन्सिस, एडवर्ड्सीला पिसिसिडा और रेनीबैक्टीरियम सैल्मोनिनेरम11,12, 13.
दस-लोकी MLVA प्रोटोकॉल यहाँ प्रस्तुत किया है, जो हाल ही में एक व्यापक वाई ruckeri जनसंख्या अध्ययन14के लिए आधार का गठन, agar-कृषि कालोनियों, मल्टीप्लेक्स पीसीआर और केशिका इलेक्ट्रोफोरोसिस (सीई) से डीएनए की निकासी शामिल है, silico अनुप्रयोगों में बहाव के बाद. प्रत्येक जांचे गए अलग-अलग के लिए, दो मल्टीप्लेक्स पीसीआर, जिनमें पांच फ्लोरोसेंट लेबल प्राइमर जोड़े (6FAM, NED या VIC) शामिल हैं, प्रत्येक लक्षित अलग-अलग VNTR क्षेत्र, समान परिस्थितियों में समानांतर में चलाए जाते हैं। जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस (जीई) द्वारा पीसीआर amplicons के सत्यापन के बाद, पीसीआर उत्पादों CE विश्लेषण से पहले पतला कर रहे हैं, और संबंधित VNTR loci का प्रतिनिधित्व चोटियों आकार जिसके परिणामस्वरूप इलेक्ट्रोफेरोग्राम फ़ाइलों से कहा जाता है। सीई प्रवासी पैटर्न में लघु, अनुक्रम-विशिष्ट विसंगतियों के लिए लेखांकन टिड्डी-विशिष्ट सूत्रों के साथ, VNTR CE आकार कॉल तो VNTR दोहराने की गणना के लिए नियोजित कर रहे हैं जो दस अंकों MLVA प्रोफाइल में concatenated हैं. ये epizootiological मूल्यांकन के लिए इनपुट के रूप में उपयोग किया जाता है (उदाहरण के लिए, न्यूनतम फैले पेड़ (एमएसटी) आरेख में क्लस्टर विश्लेषण द्वारा).
Protocol
चेतावनी: प्रोटोकॉल की संपूर्णता के लिए, प्रयोगशाला कोट, डिस्पोजेबल दस्ताने और बाँझ अभिकर्मकों और उपकरणों के उपयोग से सभी गीला-लैब प्रक्रियाओं को बाँझ करने की सलाह दी जाती है। यह भी एक अलग कमरे में पीसीआर प्रतिक्रियाओं को तैयार करने के लिए सलाह दी जाती है (पूर्व पीसीआर) पीसीआर प्रवर्धन और / निर्माता द्वारा अनुशंसित सभी अभिकर्मकों को संग्रहीत करें. अभिकर्मकों, उपकरणऔर इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर पर अधिक जानकारी के लिए सामग्री की तालिका देखें.
1. जीवाणु खेती और जीनोमिक डीएनए के निष्कर्षण
- किसी भी उपयुक्त agar प्रकार पर वाई ruckeri शुद्ध संस्कृतियों बाहर बोना (लेखकों 5% गोजातीय रक्त agar इस्तेमाल किया) और 1-2 दिनों के लिए 22 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, या 3-4 दिनों के लिए 15 डिग्री सेल्सियस.
- प्रत्येक आगर प्लेट से, एक टीका पाश के साथ एक एकल प्रतिनिधि कॉलोनी लेने और अल्ट्राप्यूल्यूड पानी के 50 डिग्री एल युक्त 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों को स्थानांतरित करें। निलंबित, भंवर संक्षेप में, और 100 डिग्री सेल्सियस पर एक हीटिंग ब्लॉक पर 7 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
- 3 मिनट के लिए 16 000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज और ध्यान से एक खाली 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में supernatant हस्तांतरण करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें। इस तरह के समय तक -20 डिग्री सेल्सियस पर टेम्पलेट डीएनए या स्टोर के रूप में supernatant का उपयोग कर अगले कदम के लिए आगे बढ़ें।
2. मल्टीप्लेक्स पीसीआर सेटअप और साइकल चलाना शर्तों
नोट: प्रत्येक मल्टीप्लेक्स पीसीआर प्रतिक्रिया (प्रति वाई ruckeri अलग) 2x मल्टीप्लेक्स पीसीआर प्लस मास्टर मिश्रण के 12.5 $L, प्रत्येक उपयुक्त प्राइमर जोड़ी के 0.1 से 0.2 $M (तालिका 1) और डीएनए के 3 डिग्री एल, द्वारा 25 डिग्री सेल्सियस की एक अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा में समायोजित होना चाहिए RNase मुक्त पानी के अलावा. एक न्यूनतम पर फ्लोरोसेंट लेबल आगे-प्राइमर्स के प्रकाश जोखिम रखने के उद्देश्य (उदा., एल्यूमीनियम पन्नी में उनके भंडारण ट्यूब लपेटकर).
- दो मल्टीप्लेक्स पीसीआर assays में से प्रत्येक के लिए (तालिका1), नमूने की संख्या के अनुसार ऊपर वर्णित के रूप में मास्टर घोला जा सकता है तैयार (टेम्पलेट डीएनए के बिना) प्लस एक सकारात्मक और एक नकारात्मक नियंत्रण. इसके अतिरिक्त, 10% अधिशेष मात्रा की अनुमति दें. तैयार मास्टर भंवर कम गति से धीरे घोला जा सकता है.
- प्रत्येक मास्टर मिश्रण के 22 $L या तो पीसीआर स्ट्रिप्स या प्लेटों पर अलग-अलग कुओं में अलग-अलग वितरित करें, नमूनों की संख्या के लिए उपयुक्त के रूप में, और प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए टेम्पलेट के 3 $L जोड़ें (सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के लिए, क्रमशः, एक सत्यापित वाई ruckeri से डीएनए का उपयोग करें तनाव और ultrapurified पानी). सील और अपकेंद्रण संक्षेप में.
- निम्नलिखित कार्यक्रम के साथ एक पीसीआर थर्मल साइकिलर पर सभी नमूने चलाएँ: (i) 95 डिग्री सेल्सियस (ii) 95 डिग्री सेल्सियस पर 0.5 मिनट के 30 चक्र, 60 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 मिनट, और 72 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट, और (iii) 68 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट, इसके बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा किया जाता है। कार्यक्रम कम से कम 3 एच में पूरा हो जाएगा.
3. जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस द्वारा पीसीआर एम्प्लिचन पुष्टि
- निर्माता की सिफारिशों के अनुसार, परीक्षण किया जा करने के लिए पीसीआर प्रतिक्रियाओं की संख्या के लिए उपयुक्त 1x tris-borate-EDTA (TBE) बफर में 1.5% (w/v) agarose जेल की एक मात्रा तैयार करते हैं। कास्टिंग से पहले, 50 डिग्री सेल्सियस जेल समाधान और मिश्रण के प्रति फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड डाई के 5 डिग्री एल जोड़ें। कास्टिंग के लिए उपयुक्त ट्रे और कंघी का उपयोग करें, डीएनए संदर्भ सीढ़ी के लिए मुक्त कुओं की एक उचित संख्या छोड़ने.
- सेटिंग के बाद, एक जीई प्रणाली में 1x TBE-बफर में जेल डूब. पीसीआर उत्पाद के 5 डिग्री एल को 2 डिग्री सेल्सियस लोड करने वाले डाई के साथ मिलाएं और जेल कुओं में स्थानांतरित करें। संदर्भ के लिए खाली कुओं में डीएनए सीढ़ी के 5 $L जोड़ें.
- लगभग 1 h के लिए 110 V प्रति 15 सेमी पर जेल चलाएँ और पीसीआर एम्प्लिकॉन्स का प्रतिनिधित्व करने वाले एकाधिक (अप करने के लिए पांच) बैंड की उपस्थिति को सत्यापित करने के लिए एक यूवी-आधारित जेल इमेजिंग/विजुअलाइजेशन सिस्टम का उपयोग करें (चित्र 1में उदाहरण देखें)। जेल छोड़ दें. अगले कदम के लिए आगे बढ़ें या आगे प्रसंस्करण तक 4 डिग्री सेल्सियस पर शेष पीसीआर उत्पादों की दुकान।
4. कैपिलरी इलेक्ट्रोफोरोसिस सेटअप और रन शर्तें
- पीसीआर amplicons की पुष्टि के बाद, पीसीआर उत्पादों को पतला 1:10 (v/v) शुद्ध पानी में. सील, मिश्रण और अपकेंद्रण संक्षेप में.
- धूआं की अलमारी में कार्य करते हुए, मास्टर मिश्रण की एक मात्रा तैयार करें जिसमें 9 डिग्री सेल्सियस फार्मामाइड और 0.5 डिग्री सेल्सियस प्रति पीसीआर उत्पाद (10% अधिशेष मात्रा) के आकार मानक शामिल हैं। भंवर संक्षेप में और उपलब्ध CE प्रणाली के लिए उपयुक्त एक थाली पर कुओं में 9.5 $L वितरित, पतला पीसीआर उत्पाद के 0.5 $L जोड़ने से पहले. सील, मिश्रण और अपकेंद्रण संक्षेप में.
चेतावनी: सावधानी से संभालें। पानी के साथ formamide मिश्रण formic एसिड उत्पन्न करता है, जो विषाक्त है. - एक पीसीआर थर्मल साइकिलर का उपयोग करना, 3 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर नमूने को निष्क्रिय करने से पहले 4 डिग्री सेल्सियस अनिश्चित काल के लिए denature. सेंट्रीफ्यूज संक्षेप में और निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक calibrated CE प्रणाली पर थाली लोड.
- पसंद के उपकरण और निम्न सेटिंग्स के लिए उपयुक्त के रूप में अभिकर्मकों का उपयोग कर टुकड़ा विश्लेषण CE चलाएँ: 60 डिग्री सेल्सियस; 1.6 केवी (32 वी प्रति सेमी) पर 5 एस इंजेक्शन; 15 केवी (300 वी प्रति सेमी) पर 32 मिनट रन समय। एक 24-कैपिलरी (50 सेमी) पर 24 कुओं के CE टुकड़ा विश्लेषण आम तौर पर लगभग 50 मिनट लगेंगे.
5. VNTR आकार कॉलिंग, दोहराएँ गणना गणना और MLVA प्रोफ़ेशनल
नोट: चरण 5-1 का वर्णन करता है Y. ruckeri VNTR CE आकार इलेक्ट्रोफेरोग्राम फ़ाइलों से बुला, सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध विशिष्ट सॉफ्टवेयर का उपयोग कर. अतिरिक्त विवरण और समस्या निवारण के लिए सॉफ़्टवेयर मैन्युअल से परामर्श करें. अन्य सॉफ़्टवेयर के उपयोग के लिए, उपयुक्त मैनुअल से परामर्श करें.
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आयात CE परिणाम फ़ाइलें (प्रति Y ruckeri अलग दो). विश्लेषण विधि को माइक्रोसैटेलाइट डिफ़ॉल्ट पर सेट करें और विश्लेषण बटन दबाने से पहले, आकार मानक के अंतर्गत उपयुक्त उत्पाद पसंद का चयन करें. आकार मिलान संपादक के माध्यम से आकार मानक टुकड़े की सही पहचान सत्यापित करें और किसी भी visibly गलत आवंटन को सुधारने.
- पढ़ने के लिए नमूना (ओं) का चयन करने के बाद, प्रदर्शन प्लॉट्स बटन को दबाएं और आकार तालिकाका दृश्य सक्षम करने के लिए Ctrl+A दबाएँ. जबकि शीर्ष पैनल में, नीचे Ctrl पकड़ जबकि VNTR amplicons का प्रतिनिधित्व पांच चोटियों पर क्लिक करते हुए (की जरूरत के रूप में जूमिंग उपकरण का उपयोग करें).
नोट: मल्टीप्लेक्स पीसीआर उत्पादों में से प्रत्येक के लिए, इलेक्ट्रोफेरोग्राम तीन रंगों के बीच वितरित पांच चोटियों दिखाएगा (देखें 5' तालिका 1 में आगे प्राइमर के डाई लेबलिंग और चित्र 2में दो उदाहरण)। - आकार तालिकाको फ़िल्टर करने के लिए Ctrl+G दबाएँ, पाँच हाइलाइट की गई चोटियों की केवल विशेषताएँ दिखाते हैं, और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोग के लिए प्रत्येक VNTR टिड्डी के लिए CE आकार कॉल रिकॉर्ड करते हैं.
- पढ़ने के लिए नमूना (ओं) का चयन करने के बाद, प्रदर्शन प्लॉट्स बटन को दबाएं और आकार तालिकाका दृश्य सक्षम करने के लिए Ctrl+A दबाएँ. जबकि शीर्ष पैनल में, नीचे Ctrl पकड़ जबकि VNTR amplicons का प्रतिनिधित्व पांच चोटियों पर क्लिक करते हुए (की जरूरत के रूप में जूमिंग उपकरण का उपयोग करें).
- CE के दौरान पक्षपाती एम्प्लिकॉन गतिशीलता पैटर्न के लिए खाते में, नीचे दिए गए सूत्र के अनुसार सटीक VNTR दोहराने की गणना की गणना, टिड्डी-विशिष्ट चर के साथ VNTR CE आकार कॉल को रोजगार (तालिका 1देखें)। दक्षता के लिए, इस प्रक्रिया को स्वचालित करने की सलाह दी जाती है (उदाहरण के लिए, एक स्प्रेडशीट टेम्पलेट का उपयोग करके).।
- दौर गणना VNTR दोहराने निकटतम पूर्णांक के लिए बंद मायने रखता है और दस अंकों की स्ट्रिंग में concatenate, प्रत्येक एक Y. ruckeri अलग के MLVA प्रोफ़ाइल का प्रतिनिधित्व.
6. MLVA डेटा के न्यूनतम स्पैनिंग ट्री क्लस्टर विश्लेषण
नोट: चरण 6 सामग्री तालिका में सूचीबद्ध विशिष्ट सॉफ्टवेयर का उपयोग करते हुए Y. ruckeri MLVA डेटा से एमएसटी आरेखों के निर्माण कावर्णन करता है। अतिरिक्त विवरण और समस्या निवारण के लिए सॉफ़्टवेयर मैन्युअल से परामर्श करें. अन्य सॉफ़्टवेयर के उपयोग के लिए, उपयुक्त मैनुअल से परामर्श करें.
- एक नया डेटाबेस बनाएँ और MLVA प्लगइन को सक्रिय करने के लिए चुनते हैं.
- चरित्र प्रकार डेटा आयात क्षेत्रों और वर्णों (भंडारण प्रारूप के आधार पर आगे उप चयन) के बाद का चयन करके Y. ruckeri MLVA प्रोफाइल और मेटाडेटा आयात करें। जब संकेत मिले, तो आयात फ़ाइल की सामग्री के अनुसार आयात नियम निर्दिष्ट करें: गंतव्य प्रकार स्तंभ में, VNTR दोहराएँ गणना वर्ण मान के रूप में वर्गीकृत करें: VNTR,और विविध मेटाडेटा प्रविष्टि जानकारी के रूप में: प्रविष्टि जानकारी फ़ील्ड .
नोट: तुलना और संदर्भ के लिए, यह भी संभव है कि वर्तमान MLVA प्रोटोकॉल14को रोजगार मूल कागज के साथ प्रकाशित पूरे डेटासेट (खुला पहुँच) आयात करने के लिए. MLVA प्रोफाइल और Y. ruckeri isolates के विविध संग्रह पर मेटाडेटा (एन $ 484) उस अध्ययन में छानबीन की अपनी पूरक सामग्री से उपलब्ध है (टेबल्स S1 और S2) निम्न लिंक के माध्यम से: https://aem.asm.org/content/84/16/e00730-18/figures-only#fig-data-additional-files - प्रयोग प्रकार फलक में, VNTR प्रविष्टि खोलें और प्रत्येक VNTR टिड्डी के लिए न्यूनतम और अधिकतम मान क्रमशः 0 और 100पर सेट करें. सामान्य सेटिंग्सके अंतर्गत, दशमलव अंकों की संख्या को 0 पर सेट करें और डेटा प्रकारके अंतर्गत संख्याओं का चयन करें . अनुपस्थित मानों को शून्य के रूप में विचार करने के लिए जाँचें.
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MST क्लस्टर विश्लेषण के लिए नियत आयातित नमूनों का चयन करें और नई तुलना बनाएँ बटन (तुलना फलक में) क्लिक करें.
- यदि MST के दृश्य प्रस्तुति के लिए वांछित है, तो समूह पैनल में उपलब्ध विभिन्न विकल्पों को रोजगार द्वारा रंगीन समूहों (उदाहरण के लिए, एक विशेष मेटाडेटा विशेषता के अनुसार) के लिए नमूने आवंटित.
नोट: समूह भी बनाया जा सकता है / पूर्वव्यापी, निम्नलिखित चरणों के बाद. - चुने गए नमूनों के आधार पर MST आरेख जनरेट करने के लिए सुस्पष्ट डेटा के लिए उन्नत क्लस्टर विश्लेषण का चयन करें... और MST.
- इसके अलावा पसंद के रूप में एमएसटी के दृश्य प्रस्तुति को संशोधित (जैसे, विभाजन पैरामीटर, नोड/शाखा लेबलिंग, crosslinks, किंवदंतियों, आदि) जोड़कर। चित्र 3में उदाहरण देखें.
नोट: $ 4/10 गैर-पहचान VNTR loci के विभाजन सीमा एक क्लस्टर (क्लोनल जटिल) का प्रतिनिधित्व शाखा कनेक्शन छुपाने के अलावा, पहले उत्पन्न MLVA डेटा के आधार पर MST क्लस्टर विश्लेषण के लिए नियोजित किया गया है इस प्रोटोकॉल का उपयोगकर 14. बशर्ते 484 वाई ruckeri MLVA प्रोफाइल के ऊपर उल्लिखित डेटासेट आयात किया गया था, उन नमूनों को भी एमएसटी क्लस्टर विश्लेषण के लिए शामिल किया जा सकता है (जैसा कि ऊपर वर्णित है) एक वैश्विक और ऐतिहासिक संदर्भ प्रदान करने के लिए. यह उदा. पूर्व में वर्णित क्लोनल परिसरों के साथ संबद्ध किसी भी नमूने की पहचान की सुविधा होगी, साथ ही साथ अभी तक निर्धारित वंश का प्रतिनिधित्व करने वालों के रूप में. उपलब्ध मेटाडेटा के आधार पर, परिणामी MST आरेख की विभिन्न तरीकों से जांच की जा सकती है, उदा. विशेष लक्षणों (भूगोल, होस्ट, समय आदि) से जुड़े अंतिम क्लस्टरिंग पैटर्न की खोज करने के लिए। - यदि आवश्यक हो, तो अंतिम रूप से निर्यात छवि चयन का उपयोग करकिसी इच्छित स्वरूप में निर्यात करें.
- यदि MST के दृश्य प्रस्तुति के लिए वांछित है, तो समूह पैनल में उपलब्ध विभिन्न विकल्पों को रोजगार द्वारा रंगीन समूहों (उदाहरण के लिए, एक विशेष मेटाडेटा विशेषता के अनुसार) के लिए नमूने आवंटित.
Representative Results
यहाँ वर्णित के रूप में बहुसंकेतपीसीके बाद, एक ठेठ जीई छवि प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया से कई amplicons की उपस्थिति की पुष्टि चित्र 1में दिखाया गया है. डाउनस्ट्रीम CE टुकड़ा विश्लेषण सत्यापित PCR उत्पादों पर प्रदर्शन किया जाएगा, प्रत्येक वाई ruckeri अलग के लिए जांच की, दो इलेक्ट्रोफेरोग्राम फ़ाइलों में परिणाम संबंधित VNTR loci के आकार बुला के लिए इस्तेमाल किया (चित्र 2). 484 विविध वाई रूकरी आइसोलेट के विश्लेषण से, एक ही मल्टीप्लेक्स प्रतिक्रिया (तालिका 1)14में एक ही डाई के साथ लेबल VNTR loci के बीच amplicon आकार रेंज में कोई ओवरलैप नहीं देखा गया था। विद्युत-उच्मुख चोटियों में से प्रत्येक, इसलिए, स्पष्ट रूप से रंग से पहचाना जा सकता है।
MLVA प्रोफाइल और पसंदीदा सॉफ्टवेयर में प्रासंगिक मेटाडाटा के आयात के बाद, एमएसटी आरेख सामग्री में ब्याज की किसी भी महामारी विज्ञान पैटर्न की जांच के लिए वर्णित के रूप में निर्माण किया जा सकता है. संबंधित सॉफ्टवेयर में उपलब्ध अतिरिक्त विकल्पों के लिए उपयुक्त मैनुअल से परामर्श करें. एक उदाहरण के रूप में, चित्रा 3 Y. ruckeri अलग नॉर्वे में पांच अलग सामन खेतों के साथ जुड़े मछली से बरामद के लिए MLVA प्रोफाइल के MST द्वारा तुलना से पता चलता है.
दस VNTR loci के लगातार दोहराने आकार, साथ ही उनके इन विट्रो में और विवो स्थिरता में, पहले इस प्रोटोकॉल14पर आधारित मूल अध्ययन में सत्यापित किया गया है. संक्षेप में, यह Sanger अनुक्रमण (पुनरावृत्ति आकार) का उपयोग कर किया गया था, और कई अलग-अलग की MLVA टाइपिंग द्वारा सीरियल मार्ग के बाद (विट्रो में) और व्यक्तिगत रोग प्रकोप के भीतर से (विवो में). इसके अलावा, समय के साथ loci के पर्यावरण स्थिरता अटलांटिक सामन के लिए लगातार संक्रमित मीठे पानी के उत्पादन साइटों से कई वर्षों में बरामद कई 'घर तनाव' अलग टाइप करके जांच की गई थी.
चित्र 1 : कई पीसीआर उत्पादों की उपस्थिति की पुष्टि करने वाले जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस। छवि डीएनए सीढ़ी का प्रतिनिधित्व करने वाले डीएनए सीढ़ी का प्रतिनिधित्व करने वाली पहली लेन के साथ, नमूनों युक्त सभी 12 गलियों में कई पीसीआर amplicons की उपस्थिति की पुष्टि करता है। चयनित सीढ़ी टुकड़े के आकार संकेत दिया गया है, के रूप में पीसीआर परख और तनाव है (Gulla एट अल में तालिका S1 देखें 201814) प्रत्येक लेन की संबद्धता. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2 : VNTR amplicons के लिए इसी चोटियों दिखा इलेक्ट्रोफेरोग्राम| विभिन्न VNTR loci के नाम, डाई लेबल के साथ संकेत दिए हैं (वीआईसी ] हरे; NED ] काला; 6FAM [ नीले) कोष्ठक में. दो इलेक्ट्रोफेरोग्राम (पीसीआर परख 1 शीर्ष; पीसीआर परख 2 नीचे) एक एकल वाई ruckeri अलग टाइप करने से उत्पन्न. ऑरेंज चोटियों (डीई लिज़) कार्यरत आकार मानक का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3 : उदाहरण न्यूनतम महामारी विज्ञान मूल्यांकन के लिए फैले पेड़. आरेख Y. ruckeri से MLVA प्रोफाइल पर आधारित है पांच अलग नार्वे खेतों में अटलांटिक सामन से बरामद (1-5; किंवदंती देखें) आवर्तक Yerisniosis प्रकोप का अनुभव. कृषि मूल से जुड़ी एक स्पष्ट गुच्छन प्रवृत्ति देखी जा सकती है। क्रॉसलिंक सभी संभव कनेक्शन दिखाते हैं, जिसमें $1/10 गैर-पहचानवाले VNTR loci (कथा देखें) शामिल हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4 : इलेक्ट्रोफेरोग्राम हकलाना और विभाजित चोटियों visualizing। इस मामले में, दोनों एक साथ होते हैं, जो हमेशा मामला नहीं होता है। अब और लम्बे शिखर, YR1070 VNTR टिड्डी का प्रतिनिधित्व, आसानी से प्रतिष्ठित किया जा सकता है. प्रदर्शन बढ़ाया है और केवल नीले रंग चोटियों से पता चलता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
तालिका 1: VNTR टिड्डी विशेषताओं. वर्तमान MLVA प्रोटोकॉल में लक्षित दस वाई ruckeri VNTR क्षेत्रों की प्रासंगिक विशेषताओं.
Discussion
यहाँ प्रस्तुत दोनों मल्टीप्लेक्स पीसीआर गरीब टेम्पलेट डीएनए गुणवत्ता के चेहरे में अपेक्षाकृत मजबूत दिखाई दिया है, लेकिन पीसीआर प्रवर्धन की कमी फिर भी कभी कभी जब अत्यंत उच्च डीएनए सांद्रता के साथ टेम्पलेट्स का उपयोग कर मनाया गया था. इन मुद्दों को आसानी से पीसीआर से पहले टेम्पलेट्स diluting द्वारा हल किया गया. डीएनए निष्कर्षण के लिए अन्य तरीकों से एक यहाँ कार्यरत भी इस्तेमाल किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, वाणिज्यिक किट).
हालांकि पांच amplicons प्रत्येक मल्टीप्लेक्स पीसीआर प्रतिक्रिया से उम्मीद कर रहे हैं, पांच नेत्रहीन भेद करने योग्य बैंड हमेशा जीई से उम्मीद नहीं की जानी चाहिए, के रूप में कुछ (अलग लेबल) एक ही प्रतिक्रिया के भीतर VNTR loci आकार पर्वतमाला ओवरलैपिंग है. अंतिम पीसीआर विस्तार समय 60 मिनट के यदि आवश्यक हो तो छोटा किया जा सकता है, लेकिन संभावना बाद CE electropherograms में विभाजन चोटियों की वृद्धि हुई घटना में परिणाम होगा (नीचे देखें). विशेष रूप से, जीई कदम के उद्देश्य के रूप में पीसीआर amplicons के गुणात्मक सत्यापन के लिए विशुद्ध रूप से है, चलाने के समय, वोल्टेज और / यदि विशेष रूप से कमजोर बैंड जीई द्वारा मनाया जाता है, यह CE से पहले उन नमूनों के कमजोर पड़ने कारक को कम करने के लिए सलाह दी जा सकती है.
जबकि CE प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित एक विशिष्ट वाणिज्यिक केशिका इलेक्ट्रोफोरोसिस उपकरण पर चलाया गया था (सामग्री की तालिकादेखें), विभिन्न CE सिस्टम अलग नमूना आवश्यकताओं है, जो बारी में प्रोटोकॉल के लिए कुछ संशोधनों का संकेत हो सकता है हो सकता है . टुकड़ा विश्लेषण के लिए उपयुक्त अभिकर्मकों/उपकरण, अंशांकन आदि पर निर्देशों के लिए संबंधित सीई प्रणाली निर्माता के मैनुअल को देखें। यह भी संभावना है कि CE के दौरान मनाया पक्षपाती amplicon गतिशीलता पैटर्न अलग हो सकता है, अपेक्षाकृत, CE प्रणालियों और / यदि किसी सीमा तक होने वाली है जहाँ अंतिम (गोल) VNTR दोहराने की गणना प्रभावित हो जाती है, तो इसका अर्थ है कि टिड्डी-विशिष्ट चर s और I (तालिका1), VNTR दोहराने की गणना निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है, फिर से कैलिब्रेट किया जाना चाहिए। यह गुगल एट अल द्वारा वर्णित के रूप में सटीक अनुक्रम आकार बनाम CE आकार कॉलकी तुलना भूखंडों पर रैखिक प्रतिगमन शामिल है।
विभाजन चोटियों और हकलाना चोटियों, CE आधारित MLVA टाइपिंग17में दोनों प्रसिद्ध कलाकृतियों, आकार बुला के दौरान इलेक्ट्रोफेरोग्राम में मनाया जा सकता है (चित्र 4)। जबकि हकलाना चोटियों उपेक्षा की जानी चाहिए, लंबे समय तक चोटी लगातार एक एकल आधार जोड़ी द्वारा अलग विभाजित चोटियों के मामले में बहाव अनुप्रयोगों के लिए चुना जाना चाहिए. इसके अलावा, अनुपस्थित चोटियों विशेष VNTR loci की कमी का संकेत दुर्लभ हैं, लेकिन हो सकता है, जो मामले में '0' की एक दोहराने गिनती सौंपा जाना चाहिए. यदि प्रारंभिक संस्कृति जिससे डीएनए निकाला जाता है शुद्ध नहीं है (यानी, एक से अधिक वाई ruckeri उप-प्रकार शामिल हैं), कई लंबा चोटियों एक ही टिड्डी के विभिन्न alleles के लिए इसी / माध्यमिक खेती तो फिर पुन: टाइपिंग के लिए नए डीएनए निष्कर्षण से पहले एकल कालोनियों से किया जाना चाहिए.
जैसा कि प्रोटोकॉल में कहा गया है, पीसीआर के लिए टेम्पलेट डीएनए डिफ़ॉल्ट रूप से वाई ruckeriकी शुद्ध संस्कृतियों से निकाला जाना चाहिए। कुछ मामलों में, तथापि, अंडे तरल नमूने QPCR द्वारा वाई ruckeri के लिए सकारात्मक परीक्षण (Ct-values और lt; 27) सफलतापूर्वक MLVA सीधे टाइप किया गया, पूर्व culturing के बिना, जीनोमिक डीएनए की एक बढ़ी हुई राशि का उपयोग कर (वाणिज्यिक किट के साथ निकाला) टेम्पलेट के रूप में. हालांकि इस दृष्टिकोण का व्यापक रूप से परीक्षण नहीं किया गया है और न ही सत्यापित किया गया है, यह वाई ruckeriके अलावा विभिन्न जीवों की एक श्रृंखला से डीएनए युक्त जटिल जैविक matrices की परीक्षा के लिए इस MLVA परख की क्षमता का संकेत देता है.
डीएनए निष्कर्षण से एपिजोटोलॉजिकल मूल्यांकन के लिए यहां प्रस्तुत पूरे MLVA टाइपिंग प्रक्रिया, एक ही कार्य दिवस में पूरा किया जा सकता है। हालांकि, जांच नमूनों की संख्या डीएनए निष्कर्षण, पीसीआर और CE के लिए आवश्यक समय के साथ एक sublinear संबंध में है, और विधि इसलिए बहुत अधिक समय कुशल है जब एक साथ कई नमूने चल रहा है. यह फिर भी सबसे प्रयोगशाला आधारित तरीकों के लिए मामला है, और वाई ruckeriके महामारी विज्ञान subtyping के लिए एक उपकरण के रूप में, उच्च संकल्प, सादगी और पोर्टेबिलिटी के संयोजन इस MLVA परख पहले से प्रकाशित प्रोटोकॉल से बेहतर बनाता है4 ,5. यह भी वाई ruckeri serotyping14की सीमित महामारी विज्ञान प्रासंगिकता को सत्यापित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है.
एक व्यापक MLVA आधारित जनसंख्या अध्ययन के माध्यम से 484 Y. ruckeri अलग spatiotemporal मूल और निवास (होस्ट मछली, पर्यावरण, आदि) की एक श्रृंखला से बरामद, epizootiology और जनसंख्या के बारे में हमारी समझ इस महत्वपूर्ण मछली रोगजनक की संरचना में काफी वृद्धिहुईथी . MLVA टाइपिंग क्लोन के अनुरेखण सक्षम दशकों में मानववंशी प्रसारित, शायद मछली के परिवहन के माध्यम से, साथ ही स्थानीय रूप से सीमित उपभेदों की पहचान. इसके अलावा, जबकि जीवाणु के कुछ क्लोनल परिसरों स्पष्ट रूप से विशेष रूप से मछली मेजबान में रोग के साथ जुड़ा हो सकता है (रेनबो ट्राउट और अटलांटिक सामन, क्रमशः), दूसरों को केवल पर्यावरण ीय स्रोतों से बरामद किया गया और / नमूनों. इस विधि की प्रयोज्यता न केवल संक्रमण अनुरेखण तक ही सीमित है, क्योंकि यह वैक्सीन के विकास, जोखिम मूल्यांकन, और राष्ट्रीय जैव सुरक्षा के रखरखाव के लिए संभावित प्रासंगिकता जैसे की जानकारी भी प्रदान कर सकती है। यह वर्तमान में नार्वे जलकृषि में वाई ruckeri निदान की जांच के लिए एक उपकरण के रूप में नार्वे पशु चिकित्सा संस्थान में सक्रिय उपयोग में है.
Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
वर्तमान अध्ययन नार्वे समुद्री भोजन अनुसंधान कोष, FHF (परियोजना nos. 901119 और 901505) द्वारा वित्त पोषित किया गया था. हम जीवाणु अलग और विधि विकास के दौरान इस्तेमाल नमूने के सभी योगदानकर्ताओं का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22°C/15°C incubator | As preferred. | NA | |
| 5' Labeled Primer, 10K PMOL, Desalted, Dry | Thermo Fisher Scientific | 450007 | Sequences and labelling in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer. |
| Agarose, universal, peqGOLD | VWR | 732-2789P/732-2788 | Used during gel electrophoresis. |
| Avant 3500xL Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | A30469 | Used for capillary electrophoresis fragment analysis. |
| BioNumerics7 modules | Applied Maths | NA | Used for generating Minimum spanning trees from MLVA data. |
| Centrifuge(s) | As preferred. | NA | |
| Custom DNA Oligo, 25N, Desalted, Dry | Thermo Fisher Scientific | A15612 | Sequences in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer. |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Loading dye used during gel electrophoresis. |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Centrifuge tubes used during DNA extraction. |
| Freezer | As preferred. | NA | |
| Fume cupboard | As preferred. | NA | |
| Gel electrophoresis system | As preferred. | NA | |
| GelRed Nucleic Acid Stain, 10,000X in water | Biotium | 41003 | Fluorescent nucleic acid dye used during gel electrophoresis. |
| GeneMapper Software 5 | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | Used for reading electropherograms from capillary electrophoresis. |
| GeneRuler 50 bp DNA Ladder, ready-to-use | Thermo Fisher Scientific | SM0373 | DNA ladder used during gel electrophoresis. |
| GeneScan 600 LIZ dye Size Standard v2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4408399 | Size standard used during capillary electrophoresis. |
| Heating block | As preferred. | NA | |
| Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320/4440753 | Deionized formamide used during capillary electrophoresis. Prepare working aliquouts. |
| Milli-Q water | NA | NA | Purified water used during PCR and capillary electrophoresis. Standard recipe; produced in-house. |
| Multiplex PCR Plus Kit | Qiagen | 206151/206152 | |
| PCR thermal cycler | As preferred. | NA | |
| POP-7 Polymer for 3500 Dx/3500xL Dx Genetic Analyzers | Thermo Fisher Scientific | A26077/4393713/4393709 | Separation matrix used during capillary electrophoresis. |
| Pure culture Yersinia ruckeri | NA | NA | E.g. cryopreserved or fresh. |
| RNase-free water | Qiagen | NA | In: Multiplex PCR Plus Kit |
| Tris-borate-EDTA (TBE) buffer | NA | NA | Standard recipe; produced in-house. |
| Trypsine soy agar/bovine blood agar | NA | NA | Standard recipe; produced in-house. |
| UV-based gel imaging/visualisation system | As preferred. | NA | |
| Vortexer | As preferred. | NA |
References
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