Summary
Multi-locus variable-tal tandem-REPEAT analyse (MLVA) assay præsenteret her giver billig, robust og bærbar høj opløsning genotypebestemmelse af den fisk-patogene bakterie Yersinia ruckeri. Med udgangspunkt i rene kulturer anvender analysen multiplex PCR og kapillar elektroforese til at producere ti-loci MLVA-profiler til downstream-applikationer.
Abstract
Yersinia ruckeri er et vigtigt patogen for opdrættede laksefisk på verdensplan, men der mangler enkle værktøjer, som egner sig til epizootiologiske undersøgelser (sporing af infektioner osv.). Der blev derfor udviklet en multi-locus-analyse med variabel nummer tandem-gentagelse (MLVA) som et lettilgængeligt og utvetydigt værktøj til genotypebestemmelse af genvundne isolater med høj opløsning. For den MLVA-analyse, der præsenteres her, udvindes DNA fra dyrkede Y. ruckeri prøver ved kogning af bakterieceller i vand, efterfulgt af brug af supernatanten som skabelon for PCR. Primer-par, der er rettet mod ti variabel-tal tandem-REPEAT (VNTR) loci, afbrudt i hele Y. ruckeri genom, fordeles ligeligt mellem 2 5-plex PCR-reaktioner, der kører under identiske cykelforhold. Forward primere er mærket med enten tre fluorescerende farvestoffer. Efter amplikonen-bekræftelse ved gelelektroforese fortyndes PCR-produkter og udsættes for kapillar elektroforese. Fra de resulterende elektropherogram profiler er toppe, der repræsenterer hver af VNTR loci, størrelse-kaldet og ansat til at beregne VNTR-gentagelses tællinger i silico. De resulterende ti-cifrede MLVA-profiler anvendes derefter til at generere minimums spænder, der muliggør epizootiologisk evaluering ved klynge analyse. De meget bærbare output data, i form af numeriske MLVA profiler, kan hurtigt sammenlignes på tværs af laboratorier og placeres i en temporale kontekst. Hele proceduren fra den dyrkede koloni til en epizootiologisk vurdering kan afsluttes for op til 48 Y. ruckeri isolater inden for en enkelt arbejdsdag.
Introduction
Yersinia ruckeri, en gram-negativ bakterie og medlem af familien yersiniaceae, forårsager yersiniose i opdrættede laksefisk på verdensplan1. Det er let diagnosticeret fra inficerede fisk ved dyrkning på mange typer af agar medier, men indtil for nylig, var lidt kendt med hensyn til befolknings struktur og epizootiologi af Y. ruckeri i hele verden og i forskellige habitater (værtsarter, osv.). Eksisterende serotypesystemer for Y. ruckeri er inkonsekvente, mangler gensidig kompatibilitet og tilbyder lav epidemiologisk opløsning. Nogle molekylære undersøgelser på bakterien er blevet gennemført, beskæftiger teknikker såsom multilocus sekvens Typing (MLST), pulseret-felt gel elektroforese (PFGE) eller hel-genom sekvens (WGS) analyse2,3,4 ,5. Dog giver MLST ikke en tilstrækkelig høj opløsning til rutinemæssig infektion sporing, mens PFGE er arbejdskrævende og producerer resultater, der ikke er let bærbare på tværs af laboratorier. Mens WGS-analysen ville give en nær endelig resolution, ville etableringen og gennemførelsen af sådanne analyser være en forudsætning for tekniske-og bioinformatik kapaciteter, som stadig er begrænset til et relativt lille antal laboratorier.
Multi-locus variable-tal tandem-REPEAT analyse (MLVA) repræsenterer en enkel og let tilgængelig molekyle Typing værktøj, som tilbyder en genetisk opløsning i nogle tilfælde næsten svarer til WGS analyse6,7. Teknikken er baseret på gentagen nummer variation i udvalgte variable-tal tandem-REPEAT (VNTR) loci, hvilket resulterer i output data, der er meget transportable, hvilket gør sammenligning af profilerede isolater mod online databaser og på tværs af laboratorier ligetil. Selvom MLST fortsat er guldstandarden for epidemiologisk typning af mange bakterielle patogener, identificerer et stigende antal undersøgelser en signifikant højere diskriminerende effekt af MLVA8,9,10. Flere protokoller er også blevet offentliggjort rettet mod fisk-patogene bakterier, såsom Francisella noatunensis, edwardsiella picicida og renibacterium salmoninarum11,12, 13.
TEN-loci MLVA-protokollen, der for nylig dannede grundlag for en omfattende Y. ruckeri populationsundersøgelse14, involverer ekstraktion af DNA fra agar-dyrkede KOLONIER, multiplex PCR og kapillær ELEKTROFORESE (CE), efterfulgt af downstream i silico-applikationer. For hvert undersøgt isolat, to multiplex PCRs, der begge indeholder fem fluorescently mærkede primer-par (6FAM, NED eller VIC), der hver især er rettet mod individuelle VNTR-regioner, køres parallelt under identiske betingelser. Efter verifikation af PCR amplikoner ved gel elektroforese (GE) fortyndes PCR-produkter før CE-analyse, og toppe, der repræsenterer de respektive VNTR-loci, er størrelse-kaldet fra de resulterende elektro pherogram filer. Sammen med locus-specifikke formler, der tegner sig for mindre, sekvens specifikke uoverensstemmelser i CE-migrationsmønstrene, anvendes VNTR CE-størrelses kald til beregning af VNTR-gentagelses tællinger, som er sammenkædet med ti-cifrede MLVA-profiler. Disse anvendes som input til epizootiologiske evalueringer (f. eks. ved klynge analyse i et minimum af trædiagrammer (MST)).
Protocol
Forsigtig: for hele protokollen, er det tilrådeligt at gennemføre alle Wet-Lab procedurer sterilely ved brug af Lab frakker, engangshandsker og sterile reagenser og udstyr. Det er også tilrådeligt at forberede PCR-reaktioner i et separat rum (præ-PCR), der ikke anvendes til PCR-forstærkning og/eller håndtering af PCR-produkter (post-PCR). Opbevar alle reagenser som anbefalet af producenten. Se tabel over materialer for yderligere oplysninger om reagenser, udstyr og software, der anvendes.
1. bakteriel dyrkning og udvinding af genomisk DNA
- Sår Y. ruckeri rene kulturer på en hvilken som helst egnet agar type (forfatterne brugte 5% kvæg blod agar) og Inkubér ved 22 °c i 1-2 dage eller 15 °c i 3-4 dage.
- Fra hver agarplade skal du vælge en enkelt repræsentativ koloni med en inokulationsløkke og overføre til 1,5 mL centrifugeglas, der indeholder 50 μL ultrapurificeret vand. Afbryd, vortex kortvarigt, og Inkuber i 7 min på en varmeblok ved 100 °C.
- Centrifugeres ved 16 000 x g i 3 min., og brug en pipette til forsigtigt at overføre supernatanten til et tomt 1,5 ml centrifugeglas. Fortsæt til næste trin ved hjælp af supernatanten som Template DNA eller Opbevar ved-20 °C indtil dette tidspunkt.
2. multiplex PCR setup og cykling betingelser
Bemærk: Hver multiplex PCR-reaktion (to pr . Y. ruckeri -isolat) bør indeholde 12,5 ΜL 2X multiplex PCR plus Master mix, 0,1 til 0,2 μM af hvert passende primer-par (tabel 1) og 3 μl af Template DNA, justeret til en endelig reaktions volumen på 25 μl ved tilsætning af RNase-frit vand. Sigte mod at holde lys eksponering af fluorescently mærkede frem-primere på et minimum (f. eks. ved at indpakke deres opbevarings slanger i aluminiumsfolie).
- For hver af de to multiplex PCR assays (tabel 1), Forbered Master blandinger som beskrevet ovenfor (uden Template DNA) i henhold til antallet af prøver plus en positiv og én negativ kontrol. Derudover tillades 10% overskuds volumen. Vortex de forberedte Master blander forsigtigt ved lav hastighed.
- Der fordeles 22 μL af hver masterblanding separat i individuelle brønde på enten PCR-strimler eller-plader, afhængigt af antallet af prøver, og 3 μL af skabelonen tilsættes til hver brønd (for henholdsvis positive og negative kontroller anvendes DNA fra en verificeret Y. ruckeri og ultrapurificeret vand). Forsegl og centrifugeres kortvarigt.
- Kør alle prøver på en PCR termisk variator med følgende program: (i) 5 min ved 95 °c (II) 30 cyklusser af 0,5 min ved 95 °c, 1,5 min ved 60 °c og 1 min ved 72 °c, og (III) 60 min ved 68 °c, efterfulgt af afkøling til 4 °c på ubestemt tid. Programmet vil fuldføre i mindre end 3 h.
3. PCR Amplicon bekræftelse af gel elektroforese
- Ifølge fabrikantens anvisninger skal der fremstilles et volumen på 1,5% (w/v) agrose gel i 1x Tris-boratedta (TBE)-buffer, der passer til det antal PCR-reaktioner, der skal testes. Før støbning tilsættes 5 μL fluorescerende nukleinsyre farvestof pr. 50 μL gel opløsning og blandes. Brug bakker og kamme, som er passende til støbning, og efterlader et passende antal brønde gratis for DNA-reference stiger.
- Efter indstilling nedsænkes gelen i 1x TBE-buffer i et GE-system. Bland 5 μL PCR-produkt sammen med 2 μL pålæsnings farve og Overfør til gel brønde. Tilsæt 5 μL DNA-stigen i tomme brønde for reference.
- Du skal køre gelen ved 110 V pr. 15 cm i ca. 1 time og bruge et UV-baseret gel Imaging/visualiserings system til at verificere tilstedeværelsen af flere (op til fem) bands, der repræsenterer PCR amplikoner (se eksempel i figur 1). Kassér gelen. Fortsæt til næste trin, eller Opbevar de resterende PCR-produkter ved 4 °C indtil videre behandling.
4. kapillar elektroforese opsætning og kørebetingelser
- Efter bekræftelse af PCR amplicons fortyndes PCR-produkter 1:10 (v/v) i renset vand. Forsegl, bland og centrifuger kortvarigt.
- Arbejde i et stinkskab, forberede en volumen af Master Mix bestående af 9 μL formamid og 0,5 μL af størrelse standard pr PCR produkt (tillade 10% overskuds volumen). Vortex kortvarigt og fordel 9,5 μL i brønde på en plade, der passer til det tilgængelige CE-system, før du tilføjer 0,5 μL fortyndet PCR-produkt. Forsegl, bland og centrifuger kortvarigt.
Forsigtig: Håndtag med omhu. Blande formamid med vand genererer myresyre, som er giftigt. - Ved hjælp af en PCR termisk cycler, denaturere prøverne ved 95 °C i 3 min før afkøling til 4 °C på ubestemt tid. Centrifuger kortvarigt, og læg pladen på et kalibreret CE-system i henhold til producentens anvisninger.
- Kør fragment analyse CE ved hjælp af reagenser, som er relevante for det valgte apparat, og følgende indstillinger: 60 °C; 5 s injektioner ved 1,6 kV (32 V pr cm); 32 min. kørningstid ved 15 kV (300 V pr. cm). CE-fragment analyse af 24 brønde på en 24-kapillar (50 cm) vil typisk tage ca. 50 min.
5. VNTR-størrelse opkald, beregning af gentagelsesantal og MLVA-profilering
Bemærk: Trin 5,1 beskriver Y. ruckeri VNTR CE størrelse opkald fra elektroferogram filer, ved hjælp af den specifikke software, der er opført i tabel over materialer. Se i softwaremanualen for at få yderligere oplysninger og fejlfinding. For brug af anden software skal du konsultere de relevante manualer.
-
Importer CE-resultatfiler (to pr . Y. ruckeri -isolat). Angiv analysemetode til standard for Mikrosatellit, og vælg det relevante produktvalg under størrelses standard, før du trykker på knappen Analysér. Verificer den korrekte identifikation af størrelses standard fragmenter gennem størrelse match editor og korrigere eventuelle synlige fejlagtige tildelinger.
- Når du har valgt de (t) eksempel (r), der skal læses, skal du trykke på knappen Vis plot og tryk på CTRL + A for at aktivere visningen af størrelsestabellen. Mens du er i toppanelet, skal du holde CTRL nede, mens du klikker på de fem toppe, der repræsenterer VNTR-amplikoner (brug zoomværktøjet efter behov).
Bemærk: For hvert af multiplex PCR-produkterne vil elektro pherogrammet vise fem toppe fordelt på de tre anvendte farvestoffer (Se 5 ' farve deklaration af frem priere i tabel 1 og de to eksempler i figur 2). - Tryk på CTRL + G for at filtrere størrelsestabellen, der kun viser egenskaberne for de fem Fremhævede toppe, og Registrer CE-størrelses kald for hver VNTR locus (med henvisning til tabel 1) for downstream-anvendelse.
- Når du har valgt de (t) eksempel (r), der skal læses, skal du trykke på knappen Vis plot og tryk på CTRL + A for at aktivere visningen af størrelsestabellen. Mens du er i toppanelet, skal du holde CTRL nede, mens du klikker på de fem toppe, der repræsenterer VNTR-amplikoner (brug zoomværktøjet efter behov).
- For at kunne regne med partiske amplikonen-mobilitetsmønstre under CE skal der beregnes nøjagtige VNTR-gentagelses tællinger i henhold til nedenstående formel, som anvender VNTR CE-størrelses kald sammen med locus-specifikke variabler (Se tabel 1). For effektivitet er det tilrådeligt at automatisere denne proces (f. eks. ved hjælp af en regnearksskabelon).
- Den runde beregnede VNTR-gentagelse tæller ud til det nærmeste heltal og sammenkædes med ti-cifrede strenge, der hver repræsenterer MLVA-profilen for et enkelt Y. ruckeri -isolat.
6. minimum spænder træ klynge analyse af MLVA data
Bemærk: Trin 6 beskriver oprettelsen af MST-diagrammer fra Y. ruckeri MLVA-data ved hjælp af den specifikke software, der er angivet i tabel over materialer. Se i softwaremanualen for at få yderligere oplysninger og fejlfinding. For brug af anden software skal du konsultere de relevante manualer.
- Opret en ny database, og vælg at aktivere MLVA-plugin'et.
- Importer Y. ruckeri MLVA-profiler og-metadata ved at vælge tegntype data efterfulgt af Importer felter og tegn (yderligere under valg afhængigt af lagringsformat). Når du bliver bedt om det, skal du angive importregler i henhold til indholdet af importfilen: i kolonnen destinationstype skal du klassificere VNTR-gentagelses optællinger som tegnværdi: VNTRog andre metadata som indtastnings oplysninger: indtastnings infofelt .
Bemærk: Til sammenligning og sammenhæng er det også muligt at importere hele det datasæt, der udgives (åben adgang), sammen med det originale papir, der anvender den nuværende MLVA-protokol14. MLVA-profiler og metadata på den forskelligartede samling af Y. ruckeri isolater (n = 484), der er undersøgt i denne undersøgelse, er tilgængelig fra dets supplerende materiale (tabel S1 og S2) gennem følgende link: https://AEM.ASM.org/content/84/16/e00730-18/Figures-only#fig-data-additional-files - Åbn VNTR -posten i panelet eksperimenttype , og Angiv minimum-og maksimumværdier for hver VNTR-locus til henholdsvis 0 og 100. Angiv antallet af decimalcifre til 0 under generelle indstillinger, og vælg tal under data type. Kontroller, at fraværende værdier er nul.
-
Vælg importerede prøver, der er beregnet til MST-klynge analyse, og klik på knappen Opret ny sammenligning (i sammenlignings panel).
- Hvis det ønskes for den visuelle præsentation af MST, allokere prøverne til farvede grupper (f. eks, ifølge en bestemt metadata træk) ved at ansætte de forskellige muligheder i panelet grupper .
Bemærk: Grupper kan også oprettes/ændres retrospektivt, efterfølgende trin. - Vælg Avanceret klynge analyse... og MST for kategoriske data for at generere et MST-diagram baseret på de valgte eksempler.
- Yderligere ændre den visuelle præsentation af MST som foretrukket (f. eks, ved at tilføje partitioneringsparametre, node/filial mærkning, Crosslinks, legender, osv.). Se eksempel i figur 3.
Bemærk: En klynge (klonal kompleks) partitioneringstærskel på ≤ 4/10 ikke-identisk VNTR loci, foruden at skjule forgrenings forbindelser, der repræsenterer > 5/10 ikke-identiske VNTR loci, har tidligere været anvendt til MST-klynge analyse baseret på MLVA-data genereret ved hjælp af denne protokol14. Forudsat at ovennævnte datasæt af 484 Y. ruckeri MLVA-profiler blev importeret, kan disse prøver også INKLUDERES til MST-klynge analyse (som beskrevet ovenfor) for at give en global og historisk kontekst. Dette vil fx gøre det lettere at identificere alle prøver, der er tilknyttet tidligere beskrevne klon komplekser, samt dem, som repræsenterer endnu ubeskrivelsenheder. Afhængigt af tilgængelige metadata kan det resulterende MST-diagram kontrolleres på forskellige måder, fx for at opdage eventuelle klynge mønstre, der er knyttet til særlige træk (geografi, vært, tid osv.). - Hvis det er nødvendigt, skal du eksportere den afsluttede MST i et ønsket format ved at vælge Eksporter billede .
- Hvis det ønskes for den visuelle præsentation af MST, allokere prøverne til farvede grupper (f. eks, ifølge en bestemt metadata træk) ved at ansætte de forskellige muligheder i panelet grupper .
Representative Results
Efter multiplex PCR som beskrevet her, er et typisk ge-billede, der bekræfter tilstedeværelsen af flere amplikoner fra hver PCR-reaktion, vist i figur 1. Downstream-CE-fragment analyse udført på verificerede PCR-produkter vil for hver Y. ruckeri isolat undersøges, resultere i to elektro pherogram filer, der anvendes til størrelses kald af den respektive VNTR loci (figur 2). Fra analyse af 484 forskellige Y. ruckeri isolater blev der ikke observeret nogen overlapning i amplikonen størrelsesintervallet mellem VNTR loci mærket med samme farvestof i samme multiplex-reaktion (tabel 1)14. Hver af de elektroforetiske toppe kan derfor utvetydigt identificeres efter farve.
Efter import af MLVA profiler og relevante metadata i den foretrukne software, kan MST diagrammer konstrueres som beskrevet for kontrol af eventuelle epidemiologiske mønstre af interesse i materialet. Se relevante manualer for yderligere muligheder i den respektive software. Som et eksempel viser figur 3 sammenligning af MLVA profiler for Y. ruckeri isolater genvundet fra fisk i forbindelse med fem forskellige lakseopdræt i Norge.
De konsekvente gentagelses størrelser for TEN VNTR loci samt deres in vitro-og in vivo-stabilitet er tidligere blevet verificeret i den oprindelige undersøgelse baseret på denne protokol14. Kort, dette blev gjort ved hjælp af sanger sekventering (Gentag størrelse), og ved MLVA indtastning af flere isolater efter serielle passager (in vitro) og fra individuelle sygdomsudbrud (in vivo). Desuden blev den miljømæssige stabilitet af loci over tid undersøgt ved at skrive flere ' husstamme ' isolater genvundet over flere år fra vedvarende inficerede ferskvands produktionsanlæg for atlanterhavslaks.
Figur 1 : Gel-elektroforese, som bekræfter tilstedeværelsen af flere PCR-produkter. Billedet bekræfter tilstedeværelsen af flere PCR amplikoner i alle 12 baner, der indeholder prøver, med den første bane, der repræsenterer den anvendte DNA-stigen. Størrelsen af udvalgte stigen fragmenter er blevet indikeret, som har PCR assay og stamme (se tabel S1 i Gulla et al. 201814) tilhørsforhold til hver vognbane. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Elektro pherograms viser toppe svarende til VNTR amplikoner. Navnene på de forskellige VNTR loci er indikeret med farveetiketter (VIC = grøn; NED = sort; 6FAM = blå) i parentes. De to elektro pherograms (PCR assay 1 top; PCR assay 2 bottom) stammer fra at skrive en enkelt Y. ruckeri isolat. Orange Peaks (Dye LIZ) repræsenterer den anvendte størrelse standard. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Eksempel minimum spænder træ til epidemiologisk evaluering. Diagrammet er baseret på MLVA profiler fra Y. ruckeri isolater genvundet fra atlanterhavslaks i fem forskellige norske bedrifter (1-5; Se forklaring) oplever tilbagevendende yerisniose udbrud. Der kan iagttages en klar klynge tendens i forbindelse med bedriftens oprindelse. Kryds links viser alle mulige tilslutninger, der involverer ≤ 1/10 ikke-identiske VNTR loci (Se forklaring). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Elektro Pherogram visualiserer stammen og split toppe. I dette tilfælde forekommer begge samtidigt, hvilket ikke altid er tilfældet. Den længere og højere peak, der repræsenterer YR1070 VNTR locus, kan let skelnes. Displayet forstørres og viser kun blå farve spidser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1: VNTR locus-karakteristika. Relevante karakteristika for de ti Y. ruckeri VNTR-regioner, som er omfattet af den nuværende MLVA-protokol.
Discussion
Begge multiplex PCRs præsenteret her har optrådt relativt robust i lyset af dårlig skabelon DNA-kvalitet, men manglende PCR amplifikation blev alligevel lejlighedsvis observeret, når du bruger skabeloner med ekstremt høje DNA-koncentrationer. Disse problemer blev let løst ved at fortynde skabelonerne før PCR. Andre metoder til DNA-ekstraktion end den, der anvendes her, kan også bruges (f. eks. kommercielle kits).
Selvom der forventes fem amplikoner fra hver multiplex PCR-reaktion, bør der ikke altid forventes fem visuelt skelnelige bånd fra GE, da nogle (forskelligt mærkede) VNTR loci inden for samme reaktion har overlappende størrelsesintervaller. Den endelige PCR-forlængelsesperiode på 60 min kan afkortes, hvis det er nødvendigt, men vil sandsynligvis resultere i øget forekomst af Split toppe i efterfølgende CE-elektropherogrammer (se nedenfor). Da formålet med GE Step udelukkende er for kvalitativ verifikation af PCR amplicons, kan kørselstiden, spændings-og/eller gel-opskriften justeres som foretrukket. Hvis der observeres særligt svage bånd af GE, kan det være tilrådeligt at nedsætte fortyndingsfaktoren for disse prøver inden CE.
Mens den CE-protokol, der er beskrevet her, blev kørt på et specifikt kommercielt kapillær elektroforese apparat (Se tabel over materialer), kan forskellige CE-systemer have forskellige stikprøve krav, hvilket igen kan medføre visse ændringer i protokollen . Se manualen for den pågældende CE-system fabrikant for instruktioner om passende reagenser/udstyr, kalibrering etc. til fragment analyse. Der er også en mulighed for, at partiske amplikonen mobilitetsmønstre observeret under CE kan afvige, relativt, på tværs af CE-systemer og/eller maskiner, som tidligere er blevet dokumenteret for andre MLVA protokoller15,16. Hvis det forekommer i et omfang, hvor det endelige (afrundede) VNTR-gentagelsesantal bliver påvirket, betyder det, at de locus-specifikke variabler s og i (tabel 1), der anvendes til at bestemme VNTR-gentagelses tællinger, skal kalibreres igen. Dette indebærer lineær regression på parceller sammenligne præcise sekvens størrelser versus CE størrelse opkald, som beskrevet af Gulla et al. 201814.
Split toppe og hakker toppe, både velkendte artefakter i CE-baseret MLVA Typing17, kan observeres i elektro pherograms under størrelse opkald (figur 4). Mens der bør ses bort fra hakke toppe, bør den længere spids konstant vælges til downstream-anvendelser i tilfælde af Split toppe adskilt af et enkelt basispar. Desuden er fraværende toppe, der indikerer manglende særlig VNTR loci, sjældne, men kan forekomme, og i så fald bør der tildeles et gentagelsesantal på ' 0 '. Hvis den start kultur, som DNA udvindes fra, ikke er ren (dvs. indeholder mere end én Y. ruckeri -under type), kan der observeres flere høje toppe svarende til forskellige alleler af samme locus/LOCI efter CE. Sekundær dyrkning skal derefter udføres fra enkelt kolonier før ny DNA-ekstraktion til omskrivning.
Som anført i protokollen, bør Template DNA for PCR som standard udvindes fra rene kulturer af Y. ruckeri. I nogle få tilfælde, dog, æg-væskeprøver test positiv for Y. ruckeri af qPCR (CT-værdier < 27) blev med succes MLVA indtastet direkte, uden forudgående culturing, ved hjælp af en øget mængde af GENOMISK DNA (udvundet med kommercielle Kit) som skabelon. Selv om denne fremgangsmåde ikke er blevet grundigt afprøvet eller verificeret, indikerer den potentialet i denne MLVA-analyse til undersøgelse af komplekse biologiske matricer, der indeholder DNA fra en række forskellige organismer ud over Y. ruckeri.
Hele MLVA-skrive proceduren, der er præsenteret her, fra DNA-ekstraktion til epizootiologisk vurdering, kan afsluttes på én arbejdsdag. Antallet af undersøgte prøver er imidlertid i en sublineær sammenhæng med den tid, der kræves til DNA-ekstraktion, PCR og CE, og metoden er derfor meget mere tidsbesparende, når der køres flere prøver samtidigt. Dette er ikke desto mindre tilfældet for de fleste Lab-baserede metoder, og som et redskab til epidemiologisk under skrivning af Y. ruckeri, kombinationen af høj opløsning, enkelhed og bærbarhed gør denne MLVA assay bedre end tidligere udgivne protokoller4 ,5. Det er også blevet anvendt til at verificere den begrænsede epidemiologiske relevans af Y. ruckeri serotypning14.
Gennem en omfattende MLVA-baseret populationsundersøgelse med 484 Y. ruckeri isolater genvundet fra en række spatiotemporale oprindelser og habitater (værts fisk, miljø osv.), vores forståelse for epizootiologi og befolkning struktur af dette vigtige fiske patogen blev væsentligt forøget14. MLVA Typing muliggjorde sporing af kloner formidlet antropogenisk over årtier, formentlig gennem transport af fisk, samt identifikation af lokalt begrænset stammer. Desuden, mens nogle klonale komplekser af bakterien klart kunne være forbundet med sygdom i især fisk værter (regnbueørred og atlanterhavslaks, henholdsvis), andre blev kun genvundet fra miljømæssige kilder og/eller klinisk upåvirket fisk Prøver. Metodens anvendelighed er således ikke kun begrænset til sporing af infektioner, da den også kan give oplysninger af potentiel relevans, f. eks. Det er i øjeblikket i aktiv brug på det norske veterinære Institut som et redskab til at undersøge Y. ruckeri diagnoser i norsk akvakultur.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev finansieret af den norske forskningsfond for fisk og skaldyr, FHF (projekt nr. 901119 og 901505). Vi ønsker at takke alle bidragydere af bakterielle isolater og prøver, der anvendes under metodeudvikling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22°C/15°C incubator | As preferred. | NA | |
| 5' Labeled Primer, 10K PMOL, Desalted, Dry | Thermo Fisher Scientific | 450007 | Sequences and labelling in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer. |
| Agarose, universal, peqGOLD | VWR | 732-2789P/732-2788 | Used during gel electrophoresis. |
| Avant 3500xL Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | A30469 | Used for capillary electrophoresis fragment analysis. |
| BioNumerics7 modules | Applied Maths | NA | Used for generating Minimum spanning trees from MLVA data. |
| Centrifuge(s) | As preferred. | NA | |
| Custom DNA Oligo, 25N, Desalted, Dry | Thermo Fisher Scientific | A15612 | Sequences in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer. |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Loading dye used during gel electrophoresis. |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Centrifuge tubes used during DNA extraction. |
| Freezer | As preferred. | NA | |
| Fume cupboard | As preferred. | NA | |
| Gel electrophoresis system | As preferred. | NA | |
| GelRed Nucleic Acid Stain, 10,000X in water | Biotium | 41003 | Fluorescent nucleic acid dye used during gel electrophoresis. |
| GeneMapper Software 5 | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | Used for reading electropherograms from capillary electrophoresis. |
| GeneRuler 50 bp DNA Ladder, ready-to-use | Thermo Fisher Scientific | SM0373 | DNA ladder used during gel electrophoresis. |
| GeneScan 600 LIZ dye Size Standard v2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4408399 | Size standard used during capillary electrophoresis. |
| Heating block | As preferred. | NA | |
| Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320/4440753 | Deionized formamide used during capillary electrophoresis. Prepare working aliquouts. |
| Milli-Q water | NA | NA | Purified water used during PCR and capillary electrophoresis. Standard recipe; produced in-house. |
| Multiplex PCR Plus Kit | Qiagen | 206151/206152 | |
| PCR thermal cycler | As preferred. | NA | |
| POP-7 Polymer for 3500 Dx/3500xL Dx Genetic Analyzers | Thermo Fisher Scientific | A26077/4393713/4393709 | Separation matrix used during capillary electrophoresis. |
| Pure culture Yersinia ruckeri | NA | NA | E.g. cryopreserved or fresh. |
| RNase-free water | Qiagen | NA | In: Multiplex PCR Plus Kit |
| Tris-borate-EDTA (TBE) buffer | NA | NA | Standard recipe; produced in-house. |
| Trypsine soy agar/bovine blood agar | NA | NA | Standard recipe; produced in-house. |
| UV-based gel imaging/visualisation system | As preferred. | NA | |
| Vortexer | As preferred. | NA |
References
- Barnes, A. C. Enteric redmouth disease (ERM) (Yersinia ruckeri). Fish Diseases and Disorders, Vol 3: Viral, Bacterial and Fungal Infections. 3, 484-511 (2011).
- Barnes, A. C., et al. Whole genome analysis of Yersinia ruckeri isolated over 27 years in Australia and New Zealand reveals geographical endemism over multiple lineages and recent evolution under host selection. Microbial Genomics. 2 (11), 000095 (2016).
- Calvez, S., Mangion, C., Douet, D. G., Daniel, P. Pulsed-field gel electrophoresis and multi locus sequence typing for characterizing genotype variability of Yersinia ruckeri isolated from farmed fish in France. Veterinary Research. 46, 73 (2015).
- Bastardo, A., Ravelo, C., Romalde, J. L. Multilocus sequence typing reveals high genetic diversity and epidemic population structure for the fish pathogen Yersinia ruckeri. Environmental Microbiology. 14 (8), 1888-1897 (2012).
- Wheeler, R. W., et al. Yersinia ruckeri biotype 2 isolates from mainland Europe and the UK likely represent different clonal groups. Diseases of Aquatic Organisms. 84 (1), 25-33 (2009).
- Eyre, D. W., et al. Comparison of multilocus variable-number tandem-repeat analysis and whole-genome sequencing for investigation of Clostridium difficile transmission. Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4141-4149 (2013).
- Sun, M., et al. Multiple Locus Variable-Number Tandem-Repeat and Single-Nucleotide Polymorphism-Based Brucella Typing Reveals Multiple Lineages in Brucella melitensis Currently Endemic in China. Frontiers in Veterinary Science. 4, (2017).
- Bouchouicha, R., et al. Comparison of the performances of MLVA vs. the main other typing techniques for Bartonella henselae. Clinical Microbiology and Infection. 15, SUPPL 2 104-105 (2009).
- Dahyot, S., et al. Multiple-Locus Variable Number Tandem Repeat Analysis (MLVA) and Tandem Repeat Sequence Typing (TRST), helpful tools for subtyping Staphylococcus lugdunensis. Scientific Reports. 8 (1), (2018).
- Elberse, K. E. M., Nunes, S., Sá-Leão, R., van der Heide, H. G. J., Schouls, L. M. Multiple-locus variable number tandem repeat analysis for Streptococcus pneumoniae: Comparison with PFGE and MLST. PLoS ONE. 6 (5), (2011).
- Matejusova, I., et al. Multilocus variable-number tandem-repeat genotyping of Renibacterium salmoninarum, a bacterium causing bacterial kidney disease in salmonid fish. BMC microbiology. 13, 285 (2013).
- Duodu, S., et al. An improved multiple-locus variable-number of tandem repeat analysis (MLVA) for the fish pathogen Francisella noatunensis using capillary electrophoresis. BMC Veterinary Research. 9, 252 (2013).
- Abayneh, T., Colquhoun, D. J., Austin, D., Sørum, H. Multilocus variable number tandem repeat analysis of Edwardsiella piscicida isolates pathogenic to fish. Journal of Fish Diseases. 37 (11), 941-948 (2014).
- Gulla, S., et al. Multilocus variable-number tandem-repeat analysis of Yersinia ruckeri confirms the existence of host specificity, geographic endemism, and anthropogenic dissemination of virulent clones. Applied and Environmental Microbiology. 84 (16), (2018).
- Pasqualotto, A. C., Denning, D. W., Anderson, M. J. A cautionary tale: Lack of consistency in allele sizes between two laboratories for a published multilocus microsatellite typing system. Journal of Clinical Microbiology. 45 (2), 522-528 (2007).
- Lista, F., et al. Genotyping of Bacillus anthracis strains based on automated capillary 25-loci multiple locus variable-number tandem repeats analysis. BMC Microbiology. 6, 33 (2006).
- Thermo Fisher Scientific DNA Fragment Analysis by Capillary Electrophoresis. , Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/fragment-analysis-chemistry-guide.pdf (2014).
