Multi-locus variable-tal tandem-REPEAT analyse (MLVA) assay præsenteret her giver billig, robust og bærbar høj opløsning genotypebestemmelse af den fisk-patogene bakterie Yersinia ruckeri. Med udgangspunkt i rene kulturer anvender analysen multiplex PCR og kapillar elektroforese til at producere ti-loci MLVA-profiler til downstream-applikationer.
Yersinia ruckeri er et vigtigt patogen for opdrættede laksefisk på verdensplan, men der mangler enkle værktøjer, som egner sig til epizootiologiske undersøgelser (sporing af infektioner osv.). Der blev derfor udviklet en multi-locus-analyse med variabel nummer tandem-gentagelse (MLVA) som et lettilgængeligt og utvetydigt værktøj til genotypebestemmelse af genvundne isolater med høj opløsning. For den MLVA-analyse, der præsenteres her, udvindes DNA fra dyrkede Y. ruckeri prøver ved kogning af bakterieceller i vand, efterfulgt af brug af supernatanten som skabelon for PCR. Primer-par, der er rettet mod ti variabel-tal tandem-REPEAT (VNTR) loci, afbrudt i hele Y. ruckeri genom, fordeles ligeligt mellem 2 5-plex PCR-reaktioner, der kører under identiske cykelforhold. Forward primere er mærket med enten tre fluorescerende farvestoffer. Efter amplikonen-bekræftelse ved gelelektroforese fortyndes PCR-produkter og udsættes for kapillar elektroforese. Fra de resulterende elektropherogram profiler er toppe, der repræsenterer hver af VNTR loci, størrelse-kaldet og ansat til at beregne VNTR-gentagelses tællinger i silico. De resulterende ti-cifrede MLVA-profiler anvendes derefter til at generere minimums spænder, der muliggør epizootiologisk evaluering ved klynge analyse. De meget bærbare output data, i form af numeriske MLVA profiler, kan hurtigt sammenlignes på tværs af laboratorier og placeres i en temporale kontekst. Hele proceduren fra den dyrkede koloni til en epizootiologisk vurdering kan afsluttes for op til 48 Y. ruckeri isolater inden for en enkelt arbejdsdag.
Yersinia ruckeri, en gram-negativ bakterie og medlem af familien yersiniaceae, forårsager yersiniose i opdrættede laksefisk på verdensplan1. Det er let diagnosticeret fra inficerede fisk ved dyrkning på mange typer af agar medier, men indtil for nylig, var lidt kendt med hensyn til befolknings struktur og epizootiologi af Y. ruckeri i hele verden og i forskellige habitater (værtsarter, osv.). Eksisterende serotypesystemer for Y. ruckeri er inkonsekvente, mangler gensidig kompatibilitet og tilbyder lav epidemiologisk opløsning. Nogle molekylære undersøgelser på bakterien er blevet gennemført, beskæftiger teknikker såsom multilocus sekvens Typing (MLST), pulseret-felt gel elektroforese (PFGE) eller hel-genom sekvens (WGS) analyse2,3,4 ,5. Dog giver MLST ikke en tilstrækkelig høj opløsning til rutinemæssig infektion sporing, mens PFGE er arbejdskrævende og producerer resultater, der ikke er let bærbare på tværs af laboratorier. Mens WGS-analysen ville give en nær endelig resolution, ville etableringen og gennemførelsen af sådanne analyser være en forudsætning for tekniske-og bioinformatik kapaciteter, som stadig er begrænset til et relativt lille antal laboratorier.
Multi-locus variable-tal tandem-REPEAT analyse (MLVA) repræsenterer en enkel og let tilgængelig molekyle Typing værktøj, som tilbyder en genetisk opløsning i nogle tilfælde næsten svarer til WGS analyse6,7. Teknikken er baseret på gentagen nummer variation i udvalgte variable-tal tandem-REPEAT (VNTR) loci, hvilket resulterer i output data, der er meget transportable, hvilket gør sammenligning af profilerede isolater mod online databaser og på tværs af laboratorier ligetil. Selvom MLST fortsat er guldstandarden for epidemiologisk typning af mange bakterielle patogener, identificerer et stigende antal undersøgelser en signifikant højere diskriminerende effekt af MLVA8,9,10. Flere protokoller er også blevet offentliggjort rettet mod fisk-patogene bakterier, såsom Francisella noatunensis, edwardsiella picicida og renibacterium salmoninarum11,12, 13.
TEN-loci MLVA-protokollen, der for nylig dannede grundlag for en omfattende Y. ruckeri populationsundersøgelse14, involverer ekstraktion af DNA fra agar-dyrkede KOLONIER, multiplex PCR og kapillær ELEKTROFORESE (CE), efterfulgt af downstream i silico-applikationer. For hvert undersøgt isolat, to multiplex PCRs, der begge indeholder fem fluorescently mærkede primer-par (6FAM, NED eller VIC), der hver især er rettet mod individuelle VNTR-regioner, køres parallelt under identiske betingelser. Efter verifikation af PCR amplikoner ved gel elektroforese (GE) fortyndes PCR-produkter før CE-analyse, og toppe, der repræsenterer de respektive VNTR-loci, er størrelse-kaldet fra de resulterende elektro pherogram filer. Sammen med locus-specifikke formler, der tegner sig for mindre, sekvens specifikke uoverensstemmelser i CE-migrationsmønstrene, anvendes VNTR CE-størrelses kald til beregning af VNTR-gentagelses tællinger, som er sammenkædet med ti-cifrede MLVA-profiler. Disse anvendes som input til epizootiologiske evalueringer (f. eks. ved klynge analyse i et minimum af trædiagrammer (MST)).
Begge multiplex PCRs præsenteret her har optrådt relativt robust i lyset af dårlig skabelon DNA-kvalitet, men manglende PCR amplifikation blev alligevel lejlighedsvis observeret, når du bruger skabeloner med ekstremt høje DNA-koncentrationer. Disse problemer blev let løst ved at fortynde skabelonerne før PCR. Andre metoder til DNA-ekstraktion end den, der anvendes her, kan også bruges (f. eks. kommercielle kits).
Selvom der forventes fem amplikoner fra hver multiplex PCR-reaktion, bør der ikke altid forventes fem visuelt skelnelige bånd fra GE, da nogle (forskelligt mærkede) VNTR loci inden for samme reaktion har overlappende størrelsesintervaller. Den endelige PCR-forlængelsesperiode på 60 min kan afkortes, hvis det er nødvendigt, men vil sandsynligvis resultere i øget forekomst af Split toppe i efterfølgende CE-elektropherogrammer (se nedenfor). Da formålet med GE Step udelukkende er for kvalitativ verifikation af PCR amplicons, kan kørselstiden, spændings-og/eller gel-opskriften justeres som foretrukket. Hvis der observeres særligt svage bånd af GE, kan det være tilrådeligt at nedsætte fortyndingsfaktoren for disse prøver inden CE.
Mens den CE-protokol, der er beskrevet her, blev kørt på et specifikt kommercielt kapillær elektroforese apparat (Se tabel over materialer), kan forskellige CE-systemer have forskellige stikprøve krav, hvilket igen kan medføre visse ændringer i protokollen . Se manualen for den pågældende CE-system fabrikant for instruktioner om passende reagenser/udstyr, kalibrering etc. til fragment analyse. Der er også en mulighed for, at partiske amplikonen mobilitetsmønstre observeret under CE kan afvige, relativt, på tværs af CE-systemer og/eller maskiner, som tidligere er blevet dokumenteret for andre MLVA protokoller15,16. Hvis det forekommer i et omfang, hvor det endelige (afrundede) VNTR-gentagelsesantal bliver påvirket, betyder det, at de locus-specifikke variabler s og i (tabel 1), der anvendes til at bestemme VNTR-gentagelses tællinger, skal kalibreres igen. Dette indebærer lineær regression på parceller sammenligne præcise sekvens størrelser versus CE størrelse opkald, som beskrevet af Gulla et al. 201814.
Split toppe og hakker toppe, både velkendte artefakter i CE-baseret MLVA Typing17, kan observeres i elektro pherograms under størrelse opkald (figur 4). Mens der bør ses bort fra hakke toppe, bør den længere spids konstant vælges til downstream-anvendelser i tilfælde af Split toppe adskilt af et enkelt basispar. Desuden er fraværende toppe, der indikerer manglende særlig VNTR loci, sjældne, men kan forekomme, og i så fald bør der tildeles et gentagelsesantal på ‘ 0 ‘. Hvis den start kultur, som DNA udvindes fra, ikke er ren (dvs. indeholder mere end én Y. ruckeri -under type), kan der observeres flere høje toppe svarende til forskellige alleler af samme locus/LOCI efter CE. Sekundær dyrkning skal derefter udføres fra enkelt kolonier før ny DNA-ekstraktion til omskrivning.
Som anført i protokollen, bør Template DNA for PCR som standard udvindes fra rene kulturer af Y. ruckeri. I nogle få tilfælde, dog, æg-væskeprøver test positiv for Y. ruckeri af qPCR (CT-værdier < 27) blev med succes MLVA indtastet direkte, uden forudgående culturing, ved hjælp af en øget mængde af GENOMISK DNA (udvundet med kommercielle Kit) som skabelon. Selv om denne fremgangsmåde ikke er blevet grundigt afprøvet eller verificeret, indikerer den potentialet i denne MLVA-analyse til undersøgelse af komplekse biologiske matricer, der indeholder DNA fra en række forskellige organismer ud over Y. ruckeri.
Hele MLVA-skrive proceduren, der er præsenteret her, fra DNA-ekstraktion til epizootiologisk vurdering, kan afsluttes på én arbejdsdag. Antallet af undersøgte prøver er imidlertid i en sublineær sammenhæng med den tid, der kræves til DNA-ekstraktion, PCR og CE, og metoden er derfor meget mere tidsbesparende, når der køres flere prøver samtidigt. Dette er ikke desto mindre tilfældet for de fleste Lab-baserede metoder, og som et redskab til epidemiologisk under skrivning af Y. ruckeri, kombinationen af høj opløsning, enkelhed og bærbarhed gør denne MLVA assay bedre end tidligere udgivne protokoller4 ,5. Det er også blevet anvendt til at verificere den begrænsede epidemiologiske relevans af Y. ruckeri serotypning14.
Gennem en omfattende MLVA-baseret populationsundersøgelse med 484 Y. ruckeri isolater genvundet fra en række spatiotemporale oprindelser og habitater (værts fisk, miljø osv.), vores forståelse for epizootiologi og befolkning struktur af dette vigtige fiske patogen blev væsentligt forøget14. MLVA Typing muliggjorde sporing af kloner formidlet antropogenisk over årtier, formentlig gennem transport af fisk, samt identifikation af lokalt begrænset stammer. Desuden, mens nogle klonale komplekser af bakterien klart kunne være forbundet med sygdom i især fisk værter (regnbueørred og atlanterhavslaks, henholdsvis), andre blev kun genvundet fra miljømæssige kilder og/eller klinisk upåvirket fisk Prøver. Metodens anvendelighed er således ikke kun begrænset til sporing af infektioner, da den også kan give oplysninger af potentiel relevans, f. eks. Det er i øjeblikket i aktiv brug på det norske veterinære Institut som et redskab til at undersøge Y. ruckeri diagnoser i norsk akvakultur.
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev finansieret af den norske forskningsfond for fisk og skaldyr, FHF (projekt nr. 901119 og 901505). Vi ønsker at takke alle bidragydere af bakterielle isolater og prøver, der anvendes under metodeudvikling.
22°C/15°C incubator | As preferred. | NA | |
5' Labeled Primer, 10K PMOL, Desalted, Dry | Thermo Fisher Scientific | 450007 | Sequences and labelling in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer. |
Agarose, universal, peqGOLD | VWR | 732-2789P/732-2788 | Used during gel electrophoresis. |
Avant 3500xL Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | A30469 | Used for capillary electrophoresis fragment analysis. |
BioNumerics7 modules | Applied Maths | NA | Used for generating Minimum spanning trees from MLVA data. |
Centrifuge(s) | As preferred. | NA | |
Custom DNA Oligo, 25N, Desalted, Dry | Thermo Fisher Scientific | A15612 | Sequences in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer. |
DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Loading dye used during gel electrophoresis. |
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Centrifuge tubes used during DNA extraction. |
Freezer | As preferred. | NA | |
Fume cupboard | As preferred. | NA | |
Gel electrophoresis system | As preferred. | NA | |
GelRed Nucleic Acid Stain, 10,000X in water | Biotium | 41003 | Fluorescent nucleic acid dye used during gel electrophoresis. |
GeneMapper Software 5 | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | Used for reading electropherograms from capillary electrophoresis. |
GeneRuler 50 bp DNA Ladder, ready-to-use | Thermo Fisher Scientific | SM0373 | DNA ladder used during gel electrophoresis. |
GeneScan 600 LIZ dye Size Standard v2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4408399 | Size standard used during capillary electrophoresis. |
Heating block | As preferred. | NA | |
Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320/4440753 | Deionized formamide used during capillary electrophoresis. Prepare working aliquouts. |
Milli-Q water | NA | NA | Purified water used during PCR and capillary electrophoresis. Standard recipe; produced in-house. |
Multiplex PCR Plus Kit | Qiagen | 206151/206152 | |
PCR thermal cycler | As preferred. | NA | |
POP-7 Polymer for 3500 Dx/3500xL Dx Genetic Analyzers | Thermo Fisher Scientific | A26077/4393713/4393709 | Separation matrix used during capillary electrophoresis. |
Pure culture Yersinia ruckeri | NA | NA | E.g. cryopreserved or fresh. |
RNase-free water | Qiagen | NA | In: Multiplex PCR Plus Kit |
Tris-borate-EDTA (TBE) buffer | NA | NA | Standard recipe; produced in-house. |
Trypsine soy agar/bovine blood agar | NA | NA | Standard recipe; produced in-house. |
UV-based gel imaging/visualisation system | As preferred. | NA | |
Vortexer | As preferred. | NA |