Summary
Multi-Locus variabel-nummer tandem-REPEAT analys (MLVA) analysen presenteras här möjliggör billig, robust och bärbar högupplöst genotypning av den fisk-patogena bakterien yersinia ruckeri. Med utgångspunkt från rena kulturer använder analysen Multiplex PCR och kapillärelektrofores för att producera tio loci MLVA-profiler för nedströms applikationer.
Abstract
Yersinia ruckeri är en viktig patogen av odlade laxfiskar över hela världen, men enkla verktyg som lämpar sig för epizootiologiska undersökningar (infektions spårning, etc.) av denna bakterie har saknats. En multi-Locus variabel-nummer tandem-REPEAT analys (MLVA) analysen utvecklades därför som ett lätt åtkomligt och entydigt verktyg för högupplöst genotypning av återvunna isolat. För MLVA analysen presenteras här, är DNA utvinns ur odlade Y. ruckeri prover genom att koka bakterieceller i vatten, följt av användning av supernatanten som mall för PCR. Primer-par inriktning tio variabel-nummer tandem-REPEAT (VNTR) loci, varvad i hela Y. ruckeri arvsmassan, fördelas lika mellan 2 5-Plex PCR-reaktioner som körs under identiska cyklings förhållanden. Framåtprimers är märkta med antingen tre fluorescerande färgämnen. Efter amplikon bekräftelse av gel elektrofores, PCR-produkter späds ut och utsätts för kapillärelektrofores. Från de resulterande elektropherogramprofilerna, toppar som representerar var och en av VNTR loci är storlek-kallas och används för att beräkna VNTR upprepa räknas i silico. Resulterande tiosiffriga MLVA-profiler används sedan för att generera minsta Spanning träd som möjliggör epizootiologisk utvärdering genom klusteranalys. Den mycket portabla utgångsinformationen, i form av numeriska MLVA-profiler, kan snabbt jämföras mellan labb och placeras i en spatiotemporal kontext. Hela förfarandet från odlade kolonin till epizootiologisk utvärdering kan slutföras för upp till 48 Y. ruckeri isolat inom en enda arbetsdag.
Introduction
Yersinia ruckeri, en gramnegativ bakterie och medlem av familjen yersiniaceae, orsakar yersinios i odlad laxfisk i hela världen1. Det är lätt diagnostiseras från smittade fiskar genom odling på många typer av agar media, men tills nyligen, föga var känt om befolkningsstrukturen och epizootiologi av Y. ruckeri över hela världen och i olika livsmiljöer (värdarter, etc.). Befintliga serotypningssystem för Y. ruckeri är oförenliga, saknar ömsesidig kompatibilitet och erbjuder låg epidemiologisk upplösning. Vissa molekylära studier på bakterien har utförts, med tekniker som multilocus sekvens Typing (mlst), pulsad-fält gel elektrofores (PFGE) eller hela-genomsekvens (WGS) analys2,3,4 ,5. Men MLST ger inte en tillräckligt hög upplösning för rutinmässig infektions spårning, medan PFGE är arbetskrävande och ger resultat som inte är lätt bärbara över Labs. Även om WGS-analysen skulle ge en nära slutlig upplösning skulle inrättandet och genomförandet av sådana analyser vara en nödvändig teknisk-och bioinformatikkapacitet som ännu är begränsad till ett relativt litet antal laboratorier.
Multi-Locus variabel-nummer tandem-REPEAT analys (MLVA) representerar ett enkelt och lättillgängligt molekylära skrivverktyg, som erbjuder en genetisk upplösning i vissa fall nästan matchning av WGS analys6,7. Tekniken bygger på upprepad variation i vald variabel-nummer tandem-REPEAT (VNTR) loci, vilket resulterar i utdata som är mycket transportabla, vilket gör jämförelsen av profilerade isolat mot online-databaser och över Labs okomplicerat. Även om mlst förblir guldmyntfot för epidemiologisk typning av många bakteriella patogener, ett ökande antal studier identifiera en betydligt högre diskriminerande effekt av MLVA8,9,10. Flera protokoll har också publicerats med inriktning på fisk-patogena bakterier, såsom Francisella noatunensis, edwardsiella piscicida och renibacterium salmoninarum11,12, 13.
Den ten-loci MLVA protokoll som presenteras här, som nyligen utgjorde grunden för en omfattande Y. ruckeri befolkning studie14, innebär utvinning av DNA från agar-odlade KOLONIER, Multiplex PCR och kapillär ELEKTROFORES (CE), följas av nedströms i silico-tillämpningar. För varje undersökt isolat, två multiplex-PCRs, som båda innehåller fem fluorescerande märkta primer-par (6FAM, NED eller VIC) som vardera riktar sig till enskilda VNTR-regioner, körs parallellt under identiska förhållanden. Efter verifiering av PCR-amplikoner genom gelelektrofores (GE) späds PCR-produkter ut före CE-analysen, och toppar som representerar respektive VNTR loci är storleks kallade från de resulterande elektrofonigramfilerna. Tillsammans med Locus-specifika formler som står för mindre sekvensspecifika avvikelser i CE-migrationsmönster används sedan VNTR CE-anrop för att beräkna VNTR-upprepningsantal som sammanfoges till tiosiffriga MLVA-profiler. Dessa används som indata för epizootiologiska utvärderingar (t. ex. genom klusteranalys i minimala spanning tree-diagram (MST)).
Protocol
FÖRSIKTIGHET: för hela protokollet, är det tillrådligt att genomföra alla våt-Lab förfaranden sterilely med hjälp av Lab kappor, engångshandskar och sterila reagenser och utrustning. Det är också tillrådligt att förbereda PCR-reaktioner i ett separat rum (pre-PCR) som inte används för PCR-amplifiering och/eller hantering av PCR-produkter (post-PCR). Förvara alla reagenser som rekommenderas av tillverkaren. Se tabell över material för mer information om reagenser, utrustning och programvara som används.
1. bakterieodling och extraktion av genomiskt DNA
- Så ut Y. ruckeri rena kulturer på någon lämplig agar typ (författarna använt 5% nötkreatur blod agar) och inkubera vid 22 ° c för 1-2 dagar, eller 15 ° c för 3-4 dagar.
- Från varje agarplatta, Välj en enda representativ koloni med inympningstropp och överför till 1,5 mL centrifugrör som innehåller 50 μL ultrapurified vatten. Suspendera, Vortex kort och inkubera i 7 minuter på ett värmeblock vid 100 ° c.
- Centrifugera vid 16 000 x g i 3 minuter och Använd en pipett för att försiktigt överföra supernatanten till ett tomt 1,5 ml centrifugrör. Fortsätt till nästa steg med hjälp av supernatanten som mall-DNA eller lagra vid-20 ° c till en sådan tidpunkt.
2. Multiplex PCR-installation och cykel förhållanden
Anmärkning: Varje Multiplex PCR-reaktion (två per Y. ruckeri -isolat) ska innehålla 12,5 μl 2X Multiplex PCR plus Master mix, 0,1 till 0,2 μm av varje lämpligt primer-par (tabell 1) och 3 μl mallDNA, justerat till en slutlig reaktions volym av 25 μl tillsats av RNase-fritt vatten. Sträva efter att hålla ljusexponeringen av fluorescerande märkta framåtprimers på ett minimum (t. ex. genom att linda in deras förvarings rör i aluminiumfolie).
- För var och en av de två Multiplex PCR-analyserna (tabell 1), Förbered Master mixar enligt beskrivningen ovan (utan mallDNA) enligt antalet prover plus en positiv och en negativ kontroll. Dessutom tillåter 10% överskottsvolym. Vortex den förberedda mästaren blandar försiktigt vid låg hastighet.
- Fördela 22 μL av varje masterblandning separat i enskilda brunnar på antingen PCR-remsor eller-plattor, beroende på antalet prover, och tillsätt 3 μL mall till varje brunn (för positiva respektive negativa kontroller, Använd DNA från en verifierad Y. ruckeri och ultrapurified vatten). Försegla och centrifugera kort.
- Kör alla prover på en PCR-termisk apparat med följande program: (i) 5 min vid 95 ° c (II) 30 cykler av 0,5 min vid 95 ° c, 1,5 min vid 60 ° c och 1 min vid 72 ° c, och (III) 60 min vid 68 ° c, följt av kylning till 4 ° c på obestämd tid. Programmet kommer att slutföras på mindre än 3 h.
3. PCR-amplicon bekräftelse av gel elektrofores
- Enligt tillverkarens rekommendationer, Bered en volym på 1,5% (w/v) agarat gel i 1x Tris-borate-EDTA (TBE) buffert lämplig för antalet PCR-reaktioner som skall testas. Tillsätt 5 μL fluorescerande nukleinsyra färg per 50 μL gel lösning och blanda före gjutning. Använd brickor och kammar som lämpar sig för gjutning och lämna ett lämpligt antal brunnar fria för DNA-referensstegar.
- Efter inställning, dränera gelen i 1x TBE-buffert i ett GE-system. Blanda 5 μL PCR-produkt tillsammans med 2 μL lastfärg och överför till gelbrunnar. Tillsätt 5 μL DNA-stege i tomma brunnar för referens.
- Kör gelen vid 110 V per 15 cm i ca 1 h och Använd en UV-baserad gel avbildning/visualisering system för att kontrollera närvaron av flera (upp till fem) band som representerar PCR amplikonerna (se exempel i figur 1). Kassera gelen. Fortsätt till nästa steg eller förvara kvarvarande PCR-produkter vid 4 ° c tills vidare bearbetning.
4. kapillärelektrofores setup och kör villkor
- Efter bekräftelse av PCR-amplikoner, späd PCR-produkter 1:10 (v/v) i renat vatten. Försegla, blanda och centrifugera kort.
- Arbeta i ett dragskåp, Förbered en volym av Master Mix bestående av 9 μL formamid och 0,5 μL av storleks standard per PCR-produkt (Tillåt 10% överskottsvolym). Vortex kort och fördela 9,5 μL i brunnar på en platta som är lämplig för det tillgängliga CE-systemet, innan du lägger till 0,5 μL utspädd PCR-produkt. Försegla, blanda och centrifugera kort.
Försiktighet: Hantera med försiktighet. Blandning formamid med vatten genererar myrsyra, vilket är giftigt. - Använd en PCR-termisk Cycler, denaturera proverna vid 95 ° c i 3 min före kylning till 4 ° c på obestämd tid. Centrifugera kort och fyll på plattan på ett kalibrerat CE-system enligt tillverkarens anvisningar.
- Kör fragmentanalys CE med reagenser som lämpar sig för den apparat du väljer och följande inställningar: 60 ° c; 5 s injektioner vid 1,6 kV (32 V per cm); 32 min körtid vid 15 kV (300 V per cm). CE fragmentanalys av 24 brunnar på en 24-kapillär (50 cm) tar normalt cirka 50 min.
5. VNTR storlek ringer, upprepa räkna beräkning och MLVA profilering
Anmärkning: Steg 5,1 beskriver Y. ruckeri vntr CE storlek ringer från elektroferogram filer, med hjälp av den specifika programvara som anges i tabell över material. Mer information och felsökning finns i programvaruhandboken. För användning av annan programvara, konsultera lämpliga handböcker.
-
Importera CE-resultatfiler (två per Y. ruckeri -isolat). Ställ in analysmetod till Microsatellite standard och välj lämpligt produktval under storlek standard, innan du trycker på knappen analysera. Kontrollera korrekt identifiering av storlek standard fragment genom storleks matchning redaktör och åtgärda eventuella synligt Felaktiga tilldelningar.
- När du har valt de prov (er) som ska läsas trycker du på knappen Visa diagram och tryck på CTRL + A för att aktivera visning av storlekstabellen. Medan du är i den övre panelen håller du ned CTRL medan du klickar på de fem topparna som representerar vntr amplikonerna (Använd zoomverktyget efter behov).
Anmärkning: För var och en av Multiplex PCR-produkterna kommer elektropherogrammet att Visa fem toppar fördelade på de tre färger som används (se 5 ' färgmärkning av framåtprimers i tabell 1 och de två exemplen i figur 2). - Tryck på CTRL + G för att filtrera storlekstabellen, som endast visar egenskaperna för de fem markerade topparna, och registrera CE-storlek-anrop för varje vntr-Locus (med hänvisning till tabell 1) för nedströmsanvändning.
- När du har valt de prov (er) som ska läsas trycker du på knappen Visa diagram och tryck på CTRL + A för att aktivera visning av storlekstabellen. Medan du är i den övre panelen håller du ned CTRL medan du klickar på de fem topparna som representerar vntr amplikonerna (Använd zoomverktyget efter behov).
- För att redogöra för partiska amplikon rörlighet mönster under CE, beräkna korrekta vntr upprepa räknas enligt formeln nedan, anställa vntr CE storlek samtal tillsammans med Locus-specifika variabler (se tabell 1). För effektivitet är det tillrådligt att automatisera den här processen (t. ex. genom att använda en kalkylbladsmall).
- Avrunda beräknade VNTR-upprepningar räknas av till närmaste heltal och sammanfogar till tiosiffriga strängar som representerar MLVA-profilen för ett enda Y. ruckeri -isolat.
6. minsta Spanning träd klusteranalys av MLVA data
Anmärkning: Steg 6 beskriver skapandet av MST-diagram från Y. ruckeri MLVA data, med hjälp av den specifika programvara som anges i tabell över material. Mer information och felsökning finns i programvaruhandboken. För användning av annan programvara, konsultera lämpliga handböcker.
- Skapa en ny databas och välja att aktivera MLVA plugin.
- Importera Y. ruckeri MLVA profiler och metadata genom att välja teckentyp data följt av import fält och tecken (ytterligare sub-val beroende på lagringsformat). Ange importregler i enlighet med innehållet i importfilen när du uppmanas att göra det: klassificera VNTR upprepa antal i kolumnen måltyp som teckenvärde: vntroch diverse metadata som post information: fältet inmatningsinformation .
Anmärkning: För jämförelse och kontext är det också möjligt att importera hela den publicerade datauppsättningen (Open Access) tillsammans med original papperet som använder det nuvarande MLVA-protokollet14. MLVA-profiler och metadata om den mångsidiga samlingen av Y. ruckeri -isolat (n = 484) som granskas i denna studie finns tillgänglig från dess kompletterande material (tabellerna S1 och S2) via följande länk: https://AEM.ASM.org/content/84/16/e00730-18/Figures-Only#fig-data-additional-files - Öppna Vntr -posten i panelen experiment typ och ange minimi-och maximivärden för varje vntr-locus till 0 respektive 100. Ange antalet decimaler till 0 under allmänna inställningaroch välj tal under datatyp. Kontrollera att det saknas värden som noll.
-
Välj importerade exempel som är avsedda för MST-klusteranalyser och klicka på knappen Skapa ny jämförelse (i jämförelsepanelen).
- Om så önskas för den visuella presentationen av MST, fördela proverna till färgade grupper (t. ex. enligt en viss metadataegenskap) genom att använda de olika alternativen som finns på panelen grupper .
Anmärkning: Grupper kan också skapas/ändras retroaktivt, följande steg. - Välj Avancerad klusteranalys... och MST för kategoriska data för att generera ett MST-diagram baserat på de valda exemplen.
- Ytterligare ändra den visuella presentationen av MST som önskat (t. ex. genom att lägga till partitionerings parametrar, nod/gren märkning, crosslinks, Legends, etc). Se exempel i figur 3.
Anmärkning: Ett kluster (klon komplex) partitionerings tröskel på ≤ 4/10 icke-identiska VNTR loci, förutom att dölja gren anslutningar som representerar > 5/10 icke-identiska VNTR loci, har tidigare varit anställd för MST-klusteranalyser baserat på MLVA-data som genererats med hjälp av detta protokoll14. Förutsatt att ovannämnda datauppsättning 484 Y. ruckeri MLVA-profiler har importerats, kan dessa exempel också inkluderas för MST-klusteranalyser (enligt beskrivningen ovan) för att ge en global och historisk kontext. Detta kommer t ex att underlätta identifieringen av prover som hör till tidigare beskrivna klonala komplex, liksom de som representerar ännu ej beskrivna linjer. Beroende på tillgängliga metadata kan det resulterande MST-diagrammet granskas på olika sätt, till exempel för att identifiera eventuella kluster mönster som är kopplade till särskilda egenskaper (geografi, värd, tid osv.). - Om det behövs exporterar du den slutförda MST-filen i ett önskat format med hjälp av Exportera bild markering.
- Om så önskas för den visuella presentationen av MST, fördela proverna till färgade grupper (t. ex. enligt en viss metadataegenskap) genom att använda de olika alternativen som finns på panelen grupper .
Representative Results
Efter Multiplex PCR, som beskrivs här, visas en typisk GE-bild som verifierar närvaron av multipla amplikoner från varje PCR-reaktion i figur 1. Nedströms CE-fragmentanalys utförd på kontrollerade PCR-produkter kommer, för varje Y. ruckeri -isoleringsundersökning, resultera i två elektrofonigramfiler som används för storleks anrop av respektive VNTR loci (figur 2). Från analys av 484 olika Y. ruckeri isolat observerades ingen överlappning i amplikon storleksintervall mellan vntr loci märkt med samma färg i samma multiplex reaktion (tabell 1)14. Var och en av de elektroforetiska topparna kan därför entydigt identifieras med färg.
Efter import av MLVA-profiler och relevanta metadata till den föredragna programvaran kan MST-diagram konstrueras enligt beskrivningen för granskning av eventuella epidemiologiska mönster av intresse för materialet. Konsultera lämpliga handböcker för ytterligare alternativ som finns i respektive programvara. Som ett exempel visar bild 3 jämförelse av MST av MLVA profiler för Y. ruckeri isolat återvinns från fisk i samband med fem olika laxodlingar i Norge.
De konsekventa upprepnings storlekarna för de tio VNTR loci, liksom deras stabilitet in vitro och in vivo, har tidigare verifierats i den ursprungliga studien baserad på detta protokoll14. Kortfattat, detta gjordes med hjälp av sanger sekvensering (upprepa storlek), och av MLVA typning av flera isolat efter seriella passager (in vitro) och inifrån enskilda sjukdomsutbrott (in vivo). Dessutom undersöktes miljö stabiliteten i loci över tiden genom att skriva flera "hus stammar" isolat återvinns under flera år från ihållande smittade sötvatten produktionsanläggningar för atlantlax.
Figur 1 : Gel elektrofores som verifierar närvaron av multipla PCR-produkter. Bilden bekräftar närvaron av flera PCR-amplikoner i alla 12 banor som innehåller prover, med den första körfält som representerar den DNA-stege som används. Storleken på de utvalda stegen fragment har angivits, liksom PCR-analys och stam (se tabell S1 i gulla et al. 201814) anslutning av varje körfält. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Elektropherograms visar toppar som motsvarar vntr amplikonerna. Namnger av de olika VNTR loci indikeras, med färgämnen etiketter (VIC = gräsplan; NED = svart; 6FAM = blå) inom parentes. De två elektroftalogram (PCR-analys 1 topp; PCR-analysen 2 botten) kommer från att skriva ett enda Y. ruckeri -isolat. Orange toppar (färg LIZ) representerar storleken standard används. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Exempel på minsta spanning tree för epidemiologisk utvärdering. Diagrammet är baserat på MLVA profiler från Y. ruckeri isolat återvinns från atlantlax i fem olika norska gårdar (1-5; Se Legend) upplever återkommande yerisniosis utbrott. En tydlig kluster tendens kopplad till jordbrukar ursprung kan observeras. Crosslinks visar alla möjliga anslutningar med ≤ 1/10 icke-identiska VNTR loci (se förklaring). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Electropherogram visualisera stamare och Split toppar. I detta fall båda inträffar samtidigt, vilket inte alltid är fallet. Den längre och högre topp, som representerar YR1070 VNTR Locus, kan lätt särskiljas. Displayen är förstorad och visar endast blå färg toppar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: VNTR-Locus-egenskaper. Relevanta egenskaperna hos de tio Y. ruckeri vntr-regioner som är riktade till det nuvarande MLVA-protokollet.
Discussion
Både multiplex PCRs presenteras här har dykt upp relativt robust i ansiktet av dålig mall DNA-kvalitet, men avsaknaden av PCR amplifiering var ändå ibland observerats vid användning av mallar med extremt höga DNA-koncentrationer. Dessa frågor löstes lätt genom att späda mallarna före PCR. Andra metoder för DNA-extraktion än den som används här kan också användas (t. ex. kommersiella Kit).
Även om fem amplikonerna förväntas från varje Multiplex PCR-reaktion, fem visuellt distinguishable band bör inte alltid förväntas från ge, som vissa (annorlunda märkta) vntr loci inom samma reaktion har överlappande storleksintervall. Den slutliga PCR-förlängningstid på 60 min kan förkortas om så krävs, men kommer sannolikt att resultera i ökad förekomst av Split toppar i efterföljande CE-elektroftalogram (se nedan). Särskilt, eftersom syftet med GE-steget är enbart för kvalitativ verifiering av PCR-amplikoner, kan bearbetningstiden, spänningen och/eller gel-receptet justeras som önskat. Om särskilt svaga band observeras av GE kan det vara tillrådligt att reducera utspädningsfaktorn för dessa prover före CE.
Medan CE-protokollet som beskrivs här kördes på en särskild kommersiell kapillär elektrofores apparat (se tabell över material), olika CE-system kan ha olika prov krav, som i sin tur kan uppmana några ändringar av protokollet . Se bruksanvisningen för respektive CE-systemtillverkare för anvisningar om lämpliga reagenser/utrustningar, kalibrering etc. för fragmentanalys. Det finns också en möjlighet att de partiska amplikon mobilitets mönstren observerade under CE kan skilja sig, relativt, mellan CE-system och/eller maskiner, som tidigare har dokumenterats för andra MLVA protokoll15,16. Om det sker i en omfattning där slutgiltiga (avrundade) VNTR-repeteringsvärden påverkas, innebär detta att de Locus-specifika variablerna s och i (tabell 1), som används för att bestämma upprepningsantalet för vntr, måste kalibreras om. Detta innebär linjär regression på tomter jämföra exakta sekvens storlekar kontra CE storlek samtal, som beskrivs av gulla et al. 201814.
Split toppar och stammar toppar, både kända artefakter i CE-baserade MLVA skriva17, kan observeras i elektropherograms under storlek ringer (figur 4). Även om stammar toppar bör ignoreras, bör den längre topp konsekvent väljas för nedströms program när det gäller Split toppar åtskilda av ett enda bas par. Dessutom är frånvarande toppar som indikerar brist på särskilt VNTR loci sällsynta, men kan förekomma, i vilket fall en upprepad räkning av "0" bör tilldelas. Om den startkultur från vilken DNA utvinns inte är ren (dvs. innehåller mer än en Y. ruckeri -undertyp), kan flera höga toppar som motsvarar olika alleler av samma Locus/loci OBSERVERAS efter CE. Sekundära odlingar måste sedan utföras från enstaka kolonier före ny DNA-extraktion för omskrivning.
Som anges i protokollet, bör mall DNA för PCR som standard extraheras från rena kulturer av Y. ruckeri. I ett fåtal fall, dock, ägg-vätska prover testa positivt för Y. ruckeri av qPCR (CT-värden < 27) framgångsrikt MLVA skrivit direkt, utan föregående odling, med hjälp av en ökad mängd genomisk DNA (extraheras med kommersiell Kit) som mall. Även om detta tillvägagångssätt inte har testats i stor utsträckning eller verifierats, visar det potentialen för denna MLVA-analys för undersökning av komplexa biologiska matriser som innehåller DNA från en rad olika organismer förutom Y. ruckeri.
Hela MLVA-typförfarandet som presenteras här, från DNA-extraktion till epizootiologisk utvärdering, kan slutföras under en enda arbetsdag. Antalet undersökta prover är dock i ett sublinjärt förhållande med den tid som krävs för DNA-extraktion, PCR och CE, och metoden är därför mycket mer tidseffektiv när flera prover körs samtidigt. Detta är dock fallet för de flesta Lab-baserade metoder, och som ett verktyg för epidemiologisk subtypning av Y. ruckeri, kombinationen av hög upplösning, enkelhet och bärbarhet gör detta MLVA assay överlägsen tidigare publicerade protokoll4 ,5. Det har också använts för att kontrollera den begränsade epidemiologiska relevansen av Y. ruckeri serotypning14.
Genom en omfattande MLVA-baserad populationsstudie med 484 Y. ruckeri isolat återhämtade sig från en rad spatiotemporal ursprung och livsmiljöer (värd fisk, miljö, etc.), vår förståelse om epizootiologi och befolknings strukturera av denna viktiga fiskpathogen ökades väsentligen14. MLVA skriva möjliggjorde spårning av kloner sprids antropogent under årtionden, förmodligen genom transport av fisk, samt identifiering av lokalt slutna stammar. Även om vissa klonala komplex av bakterien uppenbarligen skulle kunna associeras med sjukdomen i synnerhet fisk värdar (regnbåge och atlantlax), återhämtade sig andra endast från miljö källor och/eller kliniskt opåverkade fisk Exemplar. Metodens tillämplighet är således inte bara begränsad till infektions spårning, eftersom den också kan ge information om potentiell relevans, till exempel för vaccinutveckling, riskbedömning och upprätthållande av nationell biosäkerhet. Det är för närvarande i aktiv användning vid det norska Veterinärinstitutet som ett verktyg för att undersöka Y. ruckeri diagnoser i norsk vattenbruk.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Den nuvarande studien finansierades av norska skaldjurs forskningsfonden, FHF (projekt nr 901119 och 901505). Vi vill tacka alla bidragsgivare av bakteriella isolat och prover som används under metodutveckling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22°C/15°C incubator | As preferred. | NA | |
| 5' Labeled Primer, 10K PMOL, Desalted, Dry | Thermo Fisher Scientific | 450007 | Sequences and labelling in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer. |
| Agarose, universal, peqGOLD | VWR | 732-2789P/732-2788 | Used during gel electrophoresis. |
| Avant 3500xL Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | A30469 | Used for capillary electrophoresis fragment analysis. |
| BioNumerics7 modules | Applied Maths | NA | Used for generating Minimum spanning trees from MLVA data. |
| Centrifuge(s) | As preferred. | NA | |
| Custom DNA Oligo, 25N, Desalted, Dry | Thermo Fisher Scientific | A15612 | Sequences in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer. |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Loading dye used during gel electrophoresis. |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Centrifuge tubes used during DNA extraction. |
| Freezer | As preferred. | NA | |
| Fume cupboard | As preferred. | NA | |
| Gel electrophoresis system | As preferred. | NA | |
| GelRed Nucleic Acid Stain, 10,000X in water | Biotium | 41003 | Fluorescent nucleic acid dye used during gel electrophoresis. |
| GeneMapper Software 5 | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | Used for reading electropherograms from capillary electrophoresis. |
| GeneRuler 50 bp DNA Ladder, ready-to-use | Thermo Fisher Scientific | SM0373 | DNA ladder used during gel electrophoresis. |
| GeneScan 600 LIZ dye Size Standard v2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4408399 | Size standard used during capillary electrophoresis. |
| Heating block | As preferred. | NA | |
| Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320/4440753 | Deionized formamide used during capillary electrophoresis. Prepare working aliquouts. |
| Milli-Q water | NA | NA | Purified water used during PCR and capillary electrophoresis. Standard recipe; produced in-house. |
| Multiplex PCR Plus Kit | Qiagen | 206151/206152 | |
| PCR thermal cycler | As preferred. | NA | |
| POP-7 Polymer for 3500 Dx/3500xL Dx Genetic Analyzers | Thermo Fisher Scientific | A26077/4393713/4393709 | Separation matrix used during capillary electrophoresis. |
| Pure culture Yersinia ruckeri | NA | NA | E.g. cryopreserved or fresh. |
| RNase-free water | Qiagen | NA | In: Multiplex PCR Plus Kit |
| Tris-borate-EDTA (TBE) buffer | NA | NA | Standard recipe; produced in-house. |
| Trypsine soy agar/bovine blood agar | NA | NA | Standard recipe; produced in-house. |
| UV-based gel imaging/visualisation system | As preferred. | NA | |
| Vortexer | As preferred. | NA |
References
- Barnes, A. C. Enteric redmouth disease (ERM) (Yersinia ruckeri). Fish Diseases and Disorders, Vol 3: Viral, Bacterial and Fungal Infections. 3, 484-511 (2011).
- Barnes, A. C., et al. Whole genome analysis of Yersinia ruckeri isolated over 27 years in Australia and New Zealand reveals geographical endemism over multiple lineages and recent evolution under host selection. Microbial Genomics. 2 (11), 000095 (2016).
- Calvez, S., Mangion, C., Douet, D. G., Daniel, P. Pulsed-field gel electrophoresis and multi locus sequence typing for characterizing genotype variability of Yersinia ruckeri isolated from farmed fish in France. Veterinary Research. 46, 73 (2015).
- Bastardo, A., Ravelo, C., Romalde, J. L. Multilocus sequence typing reveals high genetic diversity and epidemic population structure for the fish pathogen Yersinia ruckeri. Environmental Microbiology. 14 (8), 1888-1897 (2012).
- Wheeler, R. W., et al. Yersinia ruckeri biotype 2 isolates from mainland Europe and the UK likely represent different clonal groups. Diseases of Aquatic Organisms. 84 (1), 25-33 (2009).
- Eyre, D. W., et al. Comparison of multilocus variable-number tandem-repeat analysis and whole-genome sequencing for investigation of Clostridium difficile transmission. Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4141-4149 (2013).
- Sun, M., et al. Multiple Locus Variable-Number Tandem-Repeat and Single-Nucleotide Polymorphism-Based Brucella Typing Reveals Multiple Lineages in Brucella melitensis Currently Endemic in China. Frontiers in Veterinary Science. 4, (2017).
- Bouchouicha, R., et al. Comparison of the performances of MLVA vs. the main other typing techniques for Bartonella henselae. Clinical Microbiology and Infection. 15, SUPPL 2 104-105 (2009).
- Dahyot, S., et al. Multiple-Locus Variable Number Tandem Repeat Analysis (MLVA) and Tandem Repeat Sequence Typing (TRST), helpful tools for subtyping Staphylococcus lugdunensis. Scientific Reports. 8 (1), (2018).
- Elberse, K. E. M., Nunes, S., Sá-Leão, R., van der Heide, H. G. J., Schouls, L. M. Multiple-locus variable number tandem repeat analysis for Streptococcus pneumoniae: Comparison with PFGE and MLST. PLoS ONE. 6 (5), (2011).
- Matejusova, I., et al. Multilocus variable-number tandem-repeat genotyping of Renibacterium salmoninarum, a bacterium causing bacterial kidney disease in salmonid fish. BMC microbiology. 13, 285 (2013).
- Duodu, S., et al. An improved multiple-locus variable-number of tandem repeat analysis (MLVA) for the fish pathogen Francisella noatunensis using capillary electrophoresis. BMC Veterinary Research. 9, 252 (2013).
- Abayneh, T., Colquhoun, D. J., Austin, D., Sørum, H. Multilocus variable number tandem repeat analysis of Edwardsiella piscicida isolates pathogenic to fish. Journal of Fish Diseases. 37 (11), 941-948 (2014).
- Gulla, S., et al. Multilocus variable-number tandem-repeat analysis of Yersinia ruckeri confirms the existence of host specificity, geographic endemism, and anthropogenic dissemination of virulent clones. Applied and Environmental Microbiology. 84 (16), (2018).
- Pasqualotto, A. C., Denning, D. W., Anderson, M. J. A cautionary tale: Lack of consistency in allele sizes between two laboratories for a published multilocus microsatellite typing system. Journal of Clinical Microbiology. 45 (2), 522-528 (2007).
- Lista, F., et al. Genotyping of Bacillus anthracis strains based on automated capillary 25-loci multiple locus variable-number tandem repeats analysis. BMC Microbiology. 6, 33 (2006).
- Thermo Fisher Scientific DNA Fragment Analysis by Capillary Electrophoresis. , Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/fragment-analysis-chemistry-guide.pdf (2014).
