Summary
El ensayo Multi-Locus Variable-number tandem-repeat Analysis (MLVA) presentado aquí permite el genotipado económico, robusto y portátil de alta resolución de la bacteria patógena de peces Yersinia ruckeri. A partir de cultivos puros, el ensayo emplea PCR multiplex y electroforesis capilar para producir perfiles MLVA de diez loci para aplicaciones posteriores.
Abstract
Yersinia ruckeri es un patógeno importante de los salmónidos cultivados en todo el mundo, pero faltan herramientas simples adecuadas para investigaciones epizootiológicas (localización de infecciones, etc.) de esta bacteria. Por lo tanto, se desarrolló un ensayo de análisis de repetición en tándem (MLVA) de número variable de varios lóbulos como una herramienta de fácil acceso e inequívoca para el genotipado de alta resolución de aislados recuperados. Para el ensayo MLVA presentado aquí, el ADN se extrae de muestras de Y. ruckeri cultivadas hirviendo por células bacterianas hirviendo en agua, seguido por el uso de sobrenadante como plantilla para PCR. Los pares de imprimación dirigidos a diez loci de repetición en tándem de número variable (VNTR), intercalados a lo largo del genoma de Y. ruckeri, se distribuyen equitativamente entre dos reacciones de PCR de cinco plántulas que se ejecutan en condiciones de ciclo idénticas. Las imprimaciones delanteras están etiquetadas con cualquiera de los tres colorantes fluorescentes. Tras la confirmación de amplicon por electroforesis de gel, los productos de PCR se diluyen y se someten a electroforesis capilar. A partir de los perfiles de electroferograma resultantes, los picos que representan cada uno de los loci VNTR se llaman al tamaño y se emplean para calcular los recuentos de repetición de VNTR en silico. Los perfiles MLVA resultantes de diez dígitos se utilizan para generar árboles de expansión mínimos que permiten la evaluación epizootiológica mediante análisis de clústeres. Los datos de salida altamente portátiles, en forma de perfiles numéricos de MLVA, se pueden comparar rápidamente entre laboratorios y colocarse en un contexto espaciotemporal. Todo el procedimiento, desde la colonia cultivada hasta la evaluación epizootiológica, puede completarse hasta 48 aislados de Ruckeri en un solo día laborable.
Introduction
Yersinia ruckeri, una bacteria Gram-negativa y miembro de la familia Yersiniaceae, causa yersiniosis en peces salmónidos cultivados en todo el mundo1. Se diagnostica fácilmente a partir de peces infectados por el cultivo en muchos tipos de medios de agar, pero hasta hace poco, poco se sabía sobre la estructura de la población y epizootiología de Y. ruckeri en todo el mundo y en diferentes hábitats (especies anfitrionas, etc.). Los sistemas de serotipado existentes para Y. ruckeri son inconsistentes, carecen de compatibilidad mutua y ofrecen una baja resolución epidemiológica. Se han realizado algunos estudios moleculares sobre la bacteria, empleando técnicas como la tipificación por secuencia multilocus (MLST), la electroforesis de gel de campo pulsado (PFGE) o el análisis de secuencia de genoma completo (WGS)2,3,4 ,5. Sin embargo, MLST no proporciona una resolución suficientemente alta para el rastreo rutinario de infecciones, mientras que PFGE es exigente con mano de obra y produce resultados que no son fácilmente portátiles entre los laboratorios. Si bien el análisis del WGS proporcionaría una resolución casi definitiva, el establecimiento y la aplicación de esos análisis preestablecerían capacidades técnicas y bioinformáticas que, sin embargo, se limitarían a un número relativamente pequeño de laboratorios.
Multi-locus Análisis de repetición en tándem de número variable (MLVA) representa una herramienta de tipificación molecular simple y de fácil acceso, que ofrece una resolución genética en algunos casos casi igualada a la del análisis WGS6,7. La técnica se basa en la variación de números de repetición en loci seleccionados de repetición en tándem de número variable (VNTR), lo que resulta en datos de salida que son altamente transportables, haciendo la comparación de aislados perfilados hacia bases de datos en línea y a través de laboratorios sencillo. Aunque el MLST sigue siendo el estándar de oro para la tipificación epidemiológica de muchos patógenos bacterianos, un número creciente de estudios identifican una potencia discriminatoria significativamente mayor de MLVA8,9,10. También se han publicado varios protocolos dirigidos a bacterias patógenas de peces, como Francisella noatunensis, Edwardsiella piscicida y Renibacterium salmoninarum11,12, 13.
El protocolo MLVA de diez loci presentado aquí, que recientemente formó la base para un extenso estudio de población de Y. ruckeri 14,implica la extracción de ADN de colonias cultivadas en agar, PCR multiplex y electroforesis capilar (CE), seguido de las aplicaciones de silico aguas abajo. Para cada aislado examinado, dos PCR multiplex, ambos que contienen cinco pares de imprimación etiquetados fluorescentemente (6FAM, NED o VIC) cada una de las regiones VNTR individuales, se ejecutan en paralelo en condiciones idénticas. Tras la verificación de los amplicons de PCR por electroforesis de gel (GE), los productos de PCR se diluyen antes del análisis CE, y los picos que representan los respectivos loci de VNTR son llamados de tamaño a partir de los archivos de electroferograma resultantes. Junto con las fórmulas específicas del locus que que representan las discrepancias menores, específicas de la secuencia en los patrones migratorios CE, las llamadas del tamaño CE VNTR entonces se emplean para calcular los recuentos de repetición VNTR que se concatenan en los perfiles MLVA de diez dígitos. Estos se utilizan como entrada para evaluaciones epizootiológicas (por ejemplo, mediante análisis de clústeres en diagramas de árbol de expansión mínimo (MST).
Protocol
ADVERTENCIA: Para la totalidad del protocolo, es aconsejable llevar a cabo todos los procedimientos de laboratorio húmedo de forma estéril mediante el uso de capas de laboratorio, guantes desechables y reactivos y equipos estériles. También es aconsejable preparar reacciones de PCR en una sala separada (pre-PCR) no utilizada para la amplificación de PCR y/o la manipulación de productos de PCR (post-PCR). Almacene todos los reactivos según lo recomendado por el fabricante. Consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles sobre los reactivos, equipos y software utilizados.
1. Cultivo y extracción bacteriana del ADN genómico
- Sembrar cultivos puros de Y. ruckeri en cualquier tipo de agar adecuado (los autores utilizaron 5% agar de sangre bovina) e incubar a 22 oC durante 1-2 días, o 15 oC durante 3-4 días.
- De cada placa de agar, escoja una colonia representativa única con un bucle de inoculación y transfiera a tubos centrífugos de 1,5 ml que contengan 50 ml de agua ultrapurificada. Suspenda, vórtice brevemente e incubar durante 7 minutos en un bloque de calefacción a 100 oC.
- Centrifugar a 16 000 x g durante 3 min y utilizar una pipeta para transferir cuidadosamente el sobrenadante en un tubo de centrífuga vacío de 1,5 ml. Continúe con el siguiente paso utilizando el sobrenadante como ADN de plantilla o almacene a -20 oC hasta ese momento.
2. Configuración de PCR multiplex y condiciones de ciclismo
NOTA: Cada reacción de PCR multiplex (dos por aislado de Y. ruckeri) debe contener 12,5 l de mezcla maestra de PCR Plus de 2 x multiplex, de 0,1 a 0,2 m de cada par de imprimación apropiado (Tabla1) y 3 l de ADN de plantilla, ajustado a un volumen de reacción final de 25 adición de agua libre de RNase. Intenta mantener la exposición a la luz de las imprimaciones delanteras con etiqueta fluorescente al mínimo (por ejemplo, envolviendo sus tubos de almacenamiento en papel de aluminio).
- Para cada uno de los dosensayos multiplex de PCR (Tabla 1), prepare mezclas maestras como se ha descrito anteriormente (sin ADN de plantilla) de acuerdo con el número de muestras más un control positivo y un control negativo. Además, permita un volumen de superávit del 10%. Vortex el maestro preparado se mezcla suavemente a baja velocidad.
- Distribuya 22 ml de cada mezcla maestra por separado en pozos individuales en tiras o placas de PCR, según corresponda para el número de muestras, y agregue 3 s l de plantilla a cada poca (para controles positivos y negativos, respectivamente, utilice el ADN de un Y. ruckeri verificado agua ultrapurificada). Selle y centrífuga brevemente.
- Ejecutar todas las muestras en un ciclor térmico de PCR con el siguiente programa: (i) 5 min a 95 oC (ii) 30 ciclos de 0,5 min a 95 oC, 1,5 min a 60 oC y 1 min a 72 oC, y (iii) 60 min a 68 oC, seguido de refrigeración a 4 oC indefinidamente. El programa se completará en menos de 3 h.
3. PCR Amplicon Confirmación por Gel Electroforesis
- De acuerdo con las recomendaciones del fabricante, preparar un volumen de 1,5% (p/v) gel de agarosa en 1x tris-borato-EDTA (TBE) tampón apropiado para el número de reacciones de PCR que se probarán. Antes de la fundición, añadir 5 l de tinte ácido nucleico fluorescente por 50 l de solución de gel y mezclar. Utilice bandejas y peines según corresponda para la fundición, dejando un número adecuado de pozos libres para las escaleras de referencia de ADN.
- Después de la configuración, sumerja el gel en 1 x TBE-buffer en un sistema GE. Mezclar 5 l de producto PCR junto con 2 l de tinte de carga y transferir a pozos de gel. Añadir 5 l de escalera de ADN en pozos vacíos como referencia.
- Ejecute el gel a 110 V por 15 cm durante aproximadamente 1 h y utilice un sistema de imágenes/visualización de gel a base de UV para verificar la presencia de múltiples (hasta cinco) bandas que representan los amplicons de PCR (véase el ejemplo de la Figura1). Deseche el gel. Continúe con el siguiente paso o almacene los productos de PCR restantes a 4 oC hasta su posterior procesamiento.
4. Configuración de la electroforesis capilar y condiciones de funcionamiento
- Tras la confirmación de los amplicons de PCR, diluir los productos de PCR 1:10 (v/v) en agua purificada. Selle, mezcle y centrífuga brevemente.
- Trabajando en un armario de humos, prepare un volumen de mezcla maestra que consista en 9 l de formamida y 0,5 l de tamaño estándar por producto PCR (permitir un volumen excedente del 10%). Vortex distribuye brevemente y distribuye 9,5 l en pozos en una placa apropiada para el sistema CE disponible, antes de añadir 0,5 ml de producto PCR diluido. Selle, mezcle y centrífuga brevemente.
PRECAUCION: Maneje con cuidado. La mezcla de formamida con agua genera ácido fórmico, que es tóxico. - Usando un ciclor térmico PCR, desnaturaliza las muestras a 95 oC durante 3 minutos antes de enfriara a 4 oC indefinidamente. Centrifugar brevemente y cargar la placa en un sistema CE calibrado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Ejecutar el análisis de fragmentos CE utilizando reactivos según corresponda para el aparato de elección y los siguientes ajustes: 60 oC; Inyecciones de 5 s a 1,6 kV (32 V por cm); 32 min de funcionamiento a 15 kV (300 V por cm). El análisis de fragmentos CE de 24 pozos en un 24-capilar (50 cm) típicamente tomará aproximadamente 50 min.
5. Llamadas de tamaño VNTR, cálculo de recuento de repetición y generación de perfiles MLVA
NOTA: Paso 5.1 describe Y. ruckeri VNTR CE tamaño llamando desde archivos de electroferograma, utilizando el software específico enumerado en la tabla de materiales. Consulte el manual del software para obtener más detalles y solución de problemas. Para el uso de otro software, consulte los manuales apropiados.
-
Importe los archivos de resultados CE (dos por aislado de Y. ruckeri). Establezca Método de análisis en Predeterminado de microsatélite y seleccione la opción de producto adecuada en Estándar de tamaño, antes de pulsar el botón Analizar. Verifique la identificación correcta de los fragmentos estándar de tamaño a través del Editor de coincidencias de tamaño y rectifique cualquier asignación visiblemente errónea.
- Después de seleccionar los ejemplos que desea leer, pulse el botón Mostrar trazados y pulse Ctrl+A para habilitar la vista de la tablade tamaños . Mientras esté en el panel superior, mantenga pulsada la tecla Ctrl mientras hace clic en los cinco picos que representan los amplificadores VNTR (utilice la herramienta de zoom según sea necesario).
NOTA: Para cada uno de los productos de PCR multiplex, el electroferograma mostrará cinco picos distribuidos entre los tres tintes empleados (véase el etiquetado de 5' tinte de las imprimaciones delanteras en el Cuadro 1 y los dos ejemplos de la Figura 2). - Presione Ctrl+G para filtrar la tabla de tamaño, mostrando solamente las características de los cinco picos resaltados, y registre las llamadas del tamaño CE para cada locus VNTR (con referencia al cuadro1) para la aplicación descendente.
- Después de seleccionar los ejemplos que desea leer, pulse el botón Mostrar trazados y pulse Ctrl+A para habilitar la vista de la tablade tamaños . Mientras esté en el panel superior, mantenga pulsada la tecla Ctrl mientras hace clic en los cinco picos que representan los amplificadores VNTR (utilice la herramienta de zoom según sea necesario).
- Para tener en cuenta los patrones de movilidad del amplicon sesgado durante el CE, calcule los recuentos exactos de la repetición del VNTR de acuerdo con la fórmula proporcionada abajo, empleando las llamadas del tamaño CE del VNTR junto con las variables específicas del locus (véase el cuadro1). Para mayor eficiencia, es aconsejable automatizar este proceso (por ejemplo, mediante el uso de una plantilla de hoja de cálculo).
- La repetición de VNTR calculada redonda cuenta al entero más cercano y se concatena en cadenas de diez dígitos, cada una de las cuales representa el perfil MLVA de un único aislado de Y. ruckeri.
6. Análisis mínimo del cluster del árbol de expansión de los datos MLVA
NOTA: El paso 6 describe la creación de diagramas MST a partir de datos de Y. ruckeri MLVA, utilizando el software específico enumerado en la Tabla de Materiales. Consulte el manual del software para obtener más detalles y solución de problemas. Para el uso de otro software, consulte los manuales apropiados.
- Crea una nueva base de datos y opta por activar el plugin MLVA.
- Importe perfiles y metadatos de Y. ruckeri MLVA seleccionando Datos de tipo de carácter seguidos de Importar campos y caracteres (subselección adicional en función del formato de almacenamiento). Cuando se le solicite, especifique las reglas de importación según el contenido del archivo de importación: en la columna Tipo de destino, clasifique los recuentos de repetición de VNTR como Valor de carácter: VNTRy los metadatos varios como Información de entrada: campo Información de entrada: Campo de información de entrada .
NOTA: Para la comparación y el contexto, también es posible importar todo el conjunto de datos publicado (acceso abierto) junto con el documento original que emplea el actual protocolo MLVA14. Los perfiles y metadatos de MLVA sobre la diversa colección de aislados de Y. ruckeri (n x 484) examinados en ese estudio están disponibles a partir de su material suplementario (Tablas S1 y S2) a través del siguiente enlace: https://aem.asm.org/content/84/16/e00730-18/figures-only#fig-data-additional-files - En el panel Tipo de experimento, abra la entrada VNTR y establezca los valores mínimo y máximo para cada locus VNTR en 0 y 100, respectivamente. En Configuración general, establezca el número de dígitos decimales en 0 y seleccione Números en Tipo de datos. Marque para considerar los valores ausentes como cero.
-
Seleccione muestras importadas destinadas al análisis de clústeres MST y haga clic en el botón Crear nueva comparación (en el panel Comparación).
- Si lo desea para la presentación visual del MST, asigne las muestras a grupos de colores (por ejemplo, de acuerdo con un rasgo de metadatos determinado) empleando las diversas opciones disponibles en el panel Grupos.
NOTA: Los grupos también se pueden crear/alterar retrospectivamente, después de los siguientes pasos. - Seleccione Análisis de clúster avanzado... y MST para obtener datos categóricos para generar un diagrama MST basado en las muestras elegidas.
- Modificar aún más la presentación visual del MST como prefiera (por ejemplo, añadiendo parámetros de partición, etiquetado de nodo/rama, enlaces cruzados, leyendas, etc.). Vea el ejemplo en la Figura3.
NOTA: Un umbral de particionamiento de clúster (complejo clónico) de loci VNTR no idéntico 4/10, además de ocultar conexiones de rama que representan loci VNTR >5/10, se ha empleado previamente para el análisis de clústeres MST basado en datos MLVA generados utilizando este protocolo14. Siempre que se importara el conjunto de datos antes mencionado de 484 perfiles de Y. ruckeri MLVA, esas muestras también se pueden incluir para el análisis de clústeres de MST (como se describió anteriormente) para proporcionar un contexto global e histórico. Esto facilitará, por ejemplo, la identificación de cualquier muestra afiliada a complejos clonales descritos anteriormente, así como aquellas que representen linajes aún no descritos. Dependiendo de los metadatos disponibles, el diagrama MST resultante se puede examinar de diferentes maneras, por ejemplo, para descubrir patrones de agrupación en clústeres eventuales vinculados a rasgos particulares (geografía, host, hora, etc.). - Si es necesario, exporte el MST finalizado en el formato deseado mediante la selección Exportar imagen.
- Si lo desea para la presentación visual del MST, asigne las muestras a grupos de colores (por ejemplo, de acuerdo con un rasgo de metadatos determinado) empleando las diversas opciones disponibles en el panel Grupos.
Representative Results
Siguiendo el PCR multiplex como se describe aquí, una imagen típica DE GE que verifica la presencia de los amplicons múltiples de cada reacción PCR se muestra en el cuadro1. El análisis del fragmento CE aguas abajo realizado en productos PCR verificados, por cada aislado de Y. ruckeri examinado, dará lugar a dos archivos de electroferograma utilizados para la llamada de tamaño de los loci VNTR respectivos (Figura2). A partir del análisis de 484 diversos aislados de Y. ruckeri, no se observó superposición en el rango de tamaño de amplificador entre loci VNTR etiquetado con el mismo tinte en la misma reacción multiplex (Tabla 1)14. Por lo tanto, cada uno de los picos electroforéticos puede identificarse inequívocamente por color.
Después de la importación de perfiles MLVA y metadatos relevantes en el software preferido, los diagramas MST se pueden construir como se describe para el escrutinio de cualquier patrón epidemiológico de interés en el material. Consulte los manuales adecuados para conocer las opciones adicionales disponibles en el software respectivo. Por ejemplo, la Figura 3 muestra la comparación por MST de perfiles MLVA para aislados de Y. ruckeri recuperados de peces asociados con cinco granjas de salmón diferentes en Noruega.
Los tamaños de repetición consistentes de los diez loci VNTR, así como su estabilidad in vitro e in vivo, se han verificado previamente en el estudio original basado en este protocolo14. Brevemente, esto se hizo utilizando la secuenciación de Sanger (tamaño de repetición), y por mlVA escribiendo múltiples aislados después de pasajes en serie (in vitro) y dentro de brotes de enfermedades individuales (in vivo). Además, la estabilidad ambiental de los loci a lo largo del tiempo se examinó escribiendo múltiples aislados de "tensión doméstica" recuperados a lo largo de varios años de sitios de producción de agua dulce infectados persistentemente para el salmón del Atlántico.
Figura 1 : Electroforesis de gel que verifica la presencia de múltiples productos de PCR. La imagen confirma la presencia de múltiples amplicons PCR en los 12 carriles que contienen muestras, con el primer carril representando la escalera de ADN utilizada. Se han indicado los tamaños de los fragmentos de escalera seleccionados, al igual que el ensayo y la tensión del ITP (véase el cuadro S1 de Gulla et al. 201814) de cada carril. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Electroferogramas que muestran picos correspondientes a los amplificadores VNTR. Se indican los nombres de los diferentes loci VNTR, con etiquetas de tinte (VIC - verde; NED - negro; 6FAM a azul) entre paréntesis. Los dos electroferogramas (ensayo PCR 1 superior; El ensayo PCR 2 inferior) se origina a partir de la escritura de un solo aislado de Y. ruckeri. Los picos naranjas (teñido LIZ) representan el tamaño estándar empleado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 Ejemplo de árbol de expansión mínimo para la evaluación epidemiológica. El diagrama se basa en perfiles MLVA de aislados de Y. ruckeri recuperados del salmón del Atlántico en cinco granjas noruegas diferentes (1-5; ver leyenda) experimentando brotes recurrentes de yerisniosis. Se puede observar una clara tendencia de agrupación en clústeres vinculada al origen de la granja. Los enlaces cruzados muestran todas las conexiones posibles que implican loci VNTR no idénticos de 1/10 (véase la leyenda). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Electroferograma visualizando tartamudeo y picos divididos. En este caso, ambos se producen simultáneamente, lo que no siempre es el caso. El pico más largo y más alto, que representa el locus YR1070 VNTR, se puede distinguir fácilmente. La pantalla se magnifica y muestra sólo picos de tinte azul. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Características del locus VNTR. Características relevantes de las diez regiones VNTR de Y. ruckeri a las que se dirige el actual protocolo MLVA.
Discussion
Ambos PCR multiplex presentados aquí han aparecido relativamente robustos frente a la mala calidad del ADN de la plantilla, pero la falta de amplificación de PCR se observó sin embargo ocasionalmente cuando se utilizan plantillas con concentraciones de ADN extremadamente altas. Estos problemas se resolvieron fácilmente diluyendo las plantillas antes de la PCR. También se pueden utilizar otros métodos para la extracción de ADN distintos del que se emplea aquí (por ejemplo, kits comerciales).
Aunque se esperan cinco amplicons de cada reacción PCR multiplex, no siempre se deben esperar cinco bandas visualmente distinguibles de GE, ya que algunos loci VNTR (etiquetados de forma diferente) dentro de la misma reacción tienen rangos de tamaño superpuestos. El tiempo final de extensión de PCR de 60 min puede acortarse si es necesario, pero probablemente dará lugar a la mayor ocurrencia de picos divididos en los electroferogramas CE posteriores (ver más abajo). En particular, como el propósito del paso GE es puramente para la verificación cualitativa de los amplicons de PCR, el tiempo de ejecución, el voltaje y /o la receta de gel pueden ajustarse como se prefiera. Si GE observa bandas particularmente débiles, puede ser aconsejable reducir el factor de dilución de esas muestras antes de la CE.
Mientras que el protocolo CE descrito aquí se ejecutó en un aparato de electroforesis capilar comercial específico (ver Tabla de Materiales),diferentes sistemas CE pueden tener diferentes requisitos de muestra, lo que a su vez puede provocar algunas modificaciones en el protocolo . Consulte el manual del fabricante del sistema CE respectivo para obtener instrucciones sobre los reactivos/equipos apropiados, calibración, etc. para el análisis de fragmentos. También existe la posibilidad de que los patrones de movilidad de amplificación sesgados observados durante el CE puedan diferir, relativamente, entre los sistemas CE y/o las máquinas, como se ha documentado previamente para otros protocolos MLVA15,16. Si ocurre en una medida en la que los recuentos finales (redondeados) de repetición de VNTR se ven afectados, esto significa que las variables específicas del locus s e i (Tabla1), utilizadas para determinar los recuentos de repetición de VNTR, deben ser recalibradas. Esto implica la regresión lineal en las gráficas que comparan los tamaños de secuencia precisos con las llamadas de tamaño CE, como se describe en Gulla et al. 201814.
Los picos divididos y los picos de tartamudeo, ambos artefactos conocidos en la escritura17de MLVA basada en CE, se pueden observar en electroferogramas durante las llamadas de tamaño (Figura4). Mientras que los picos de tartamudeo deben ser ignorados, el pico más largo debe seleccionarse constantemente para las aplicaciones aguas abajo en el caso de picos divididos separados por un solo par base. Además, los picos ausentes que indican la falta de loci VNTR particulares son raros, pero pueden ocurrir, en cuyo caso se debe asignar un recuento repetido de '0'. Si el cultivo inicial del que se extrae el ADN no es puro (es decir, contiene más de un subtipo Y. ruckeri), se pueden observar varios picos altos correspondientes a diferentes alelos del mismo locus/loci después de la CE. Los cultivos secundarios deben realizarse desde colonias individuales antes de la nueva extracción de ADN para volver a escribir.
Como se indica en el protocolo, el ADN de la plantilla para PCR debe extraerse por defecto de los cultivos puros de Y. ruckeri. En algunos casos, sin embargo, las muestras de líquido de huevo según resultado de Y. ruckeri por qPCR (Ct-values < 27) se mecanografiaron con éxito MLVA directamente, sin cultivo previo, utilizando una mayor cantidad de ADN genómico (extraído con kit comercial) como plantilla. Aunque este enfoque no ha sido ampliamente probado ni verificado, sí indica el potencial de este ensayo MLVA para el examen de matrices biológicas complejas que contienen ADN de una gama de diferentes organismos además de Y. ruckeri.
Todo el procedimiento de mecanografía MLVA presentado aquí, desde la extracción de ADN hasta la evaluación epizootiológica, puede completarse en un solo día laborable. Sin embargo, el número de muestras examinadas está en una relación sublineal con el tiempo necesario para la extracción de ADN, PCR y CE, y por lo tanto el método es mucho más eficiente en el tiempo cuando se ejecutan varias muestras simultáneamente. Este es sin embargo el caso de la mayoría de los métodos basados en laboratorio, y como una herramienta para la subtipificación epidemiológica de Y. ruckeri, la combinación de alta resolución, simplicidad y portabilidad hace que este ensayo MLVA superior a los protocolos publicados anteriormente4 ,5. También se ha utilizado para verificar la relevancia epidemiológica limitada de Y. ruckeri serotipado14.
A través de un estudio integral de la población basado en MLVA que involucra 484 aislados de Y. ruckeri recuperados de una gama de orígenes y hábitats espaciotemporales (peces huésped, medio ambiente, etc.), nuestra comprensión con respecto a la epizootiología y la población estructura de este importante patógeno de peces se incrementó sustancialmente14. La mecanografía MLVA permitió el rastreo de clones diseminados antropogénicamente durante décadas, presumiblemente a través del transporte de peces, así como la identificación de cepas confinadas localmente. Además, si bien algunos complejos clonales de la bacteria podrían estar claramente asociados con enfermedades en particular de los huéspedes de peces (trucha arco iris y salmón del Atlántico, respectivamente), otros sólo se recuperaron de fuentes ambientales y/o peces clínicamente no afectados Especímenes. Por lo tanto, la aplicabilidad del método no sólo se limita al rastreo de la infección, ya que también puede proporcionar información de relevancia potencial, por ejemplo, para el desarrollo de vacunas, la evaluación del riesgo y el mantenimiento de la bioseguridad nacional. Actualmente está en uso activo en el Instituto Veterinario Noruego como herramienta para investigar los diagnósticos de Y. ruckeri en la acuicultura noruega.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El presente estudio fue financiado por el Fondo Noruego de Investigación de Mariscos, FHF (proyecto nos. 901119 y 901505). Deseamos dar las gracias a todos los contribuyentes de aislados bacterianos y muestras utilizadas durante el desarrollo del método.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22°C/15°C incubator | As preferred. | NA | |
| 5' Labeled Primer, 10K PMOL, Desalted, Dry | Thermo Fisher Scientific | 450007 | Sequences and labelling in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer. |
| Agarose, universal, peqGOLD | VWR | 732-2789P/732-2788 | Used during gel electrophoresis. |
| Avant 3500xL Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | A30469 | Used for capillary electrophoresis fragment analysis. |
| BioNumerics7 modules | Applied Maths | NA | Used for generating Minimum spanning trees from MLVA data. |
| Centrifuge(s) | As preferred. | NA | |
| Custom DNA Oligo, 25N, Desalted, Dry | Thermo Fisher Scientific | A15612 | Sequences in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer. |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Loading dye used during gel electrophoresis. |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Centrifuge tubes used during DNA extraction. |
| Freezer | As preferred. | NA | |
| Fume cupboard | As preferred. | NA | |
| Gel electrophoresis system | As preferred. | NA | |
| GelRed Nucleic Acid Stain, 10,000X in water | Biotium | 41003 | Fluorescent nucleic acid dye used during gel electrophoresis. |
| GeneMapper Software 5 | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | Used for reading electropherograms from capillary electrophoresis. |
| GeneRuler 50 bp DNA Ladder, ready-to-use | Thermo Fisher Scientific | SM0373 | DNA ladder used during gel electrophoresis. |
| GeneScan 600 LIZ dye Size Standard v2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4408399 | Size standard used during capillary electrophoresis. |
| Heating block | As preferred. | NA | |
| Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320/4440753 | Deionized formamide used during capillary electrophoresis. Prepare working aliquouts. |
| Milli-Q water | NA | NA | Purified water used during PCR and capillary electrophoresis. Standard recipe; produced in-house. |
| Multiplex PCR Plus Kit | Qiagen | 206151/206152 | |
| PCR thermal cycler | As preferred. | NA | |
| POP-7 Polymer for 3500 Dx/3500xL Dx Genetic Analyzers | Thermo Fisher Scientific | A26077/4393713/4393709 | Separation matrix used during capillary electrophoresis. |
| Pure culture Yersinia ruckeri | NA | NA | E.g. cryopreserved or fresh. |
| RNase-free water | Qiagen | NA | In: Multiplex PCR Plus Kit |
| Tris-borate-EDTA (TBE) buffer | NA | NA | Standard recipe; produced in-house. |
| Trypsine soy agar/bovine blood agar | NA | NA | Standard recipe; produced in-house. |
| UV-based gel imaging/visualisation system | As preferred. | NA | |
| Vortexer | As preferred. | NA |
References
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