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Neuroscience

전기 생리학 전체 셀 패치 클램프를 사용 하 여 시 냅 스 다양성의 평가

doi: 10.3791/59461 Published: April 23, 2019

Summary

여기, 선물이 급성 뇌 조각에 전체 셀 패치 클램프 전기 생리학을 사용 하 여 기능 시 냅 스 다양성을 평가 하기 위한 프로토콜.

Abstract

중앙 신경 조직에서 뉴런의 쌍 종종 여러 개의 시 냅 스 연락처 및/또는 기능 신경 전달 물질 방출 사이트 (synaptic 다양성)를 형성 한다. 시 냅 스 다 플라스틱 이며 개발에 걸쳐 변화와 다른 생리 적인 조건에서 시 냅 시스 전송의 효능에 대 한 중요 한 결정 되 고. 여기, 우리는 실험 종료 급성 뇌 조각에 전체 셀 패치 클램프 전기 생리학을 사용 하 여 주어진된 postsynaptic 신경에 시 냅 스의 복합성의 정도 추정에 대 한 개요. 특히, 전압 클램프 녹음 자발적인 흥분 성의 postsynaptic 전류 (sEPSCs)의 진폭 및 미니어처 흥분 성의 postsynaptic 전류 (mEPSCs)의 차이 비교 하는 데 사용 됩니다. 이 방법의 뒤에 이론은 이다 다양성을 전시 하는 구심 성 입력 큰, 활동 전위 종속 sEPSCs 각 시 냅 스 접촉에서 발생 하는 동기식 릴리스 때문에 표시 됩니다. 반면에, 활동 전위 독립적인 릴리스 (비동기) 인 작은 진폭 mEPSCs를 생성 합니다. 이 문서는 실험 및 분석 시 냅 스 다양성의 존재의 특성의 집합을 설명 하 고 요구 사항 및 기술의 한계에 설명 합니다. 이 기술은 vivo 영향 서로 다른 뇌 영역에 시 냅 스 연락처의 조직에에서 어떻게 다른 행동, 약리학 또는 환경적 개입 조사에 적용할 수 있습니다.

Introduction

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시 냅 스 전송 뉴런 간의 통신에 대 한 근본적인 메커니즘 이며 따라서, 두뇌 기능. 시 냅 스 전송 또한 불안정 하 고 방식 활동-종속 뿐만 modulatory 신호1응답에서 그 효능을 변경할 수 있습니다. 따라서, 시 냅 스 기능 검사 신경 과학 연구의 주요 초점 되었습니다. 전체 셀 패치 클램프 전기 생리학 있도록 고안 실험적인 디자인 및 데이터 분석, 시 냅 시스 전송의 깊이 있는 생물 및 분자 메커니즘을 이해 하는 다양 한 기술입니다. 일반적으로 사용 되, 아마도 때문에 기술과 개념의 단순 방식은 미니어처 흥분 성의/금지 postsynaptic 전류 측정 (나 / Ipsc) 전압 아래 클램프 구성2,3, 4 , 5 , 6. 개별 mPSCs 연 접 터미널 7에서에서 발표 했다 그들의 각각 신경 전달 물질의 바인딩에 응 postsynaptic ionotropic 수용 체 (예: AMPA 및 GABAA 수용 체)를 통해 이온의 흐름을 나타내는 . 전압 개폐 나+ 채널 차단제 테트로도톡신 (TTX) 존재 녹음을 얻을 있기 때문에 릴리스 활동 전위 독립적 이며 일반적으로 신경 전달 물질을 포함 하는 단일 시 냅 스 소포를 포함 한다. 이 가정에 기초를 두어, mPSCs의 평균 진폭 널리 이용 된다 원유 견적으로 수와 단일 릴리스 사이트를 반대 하는 postsynaptic 수용 체의 기능을 나타내는 quantal 크기에 대 한. 다른 한편으로, mPSCs의 주파수 대표 postsynaptic 세포 그리고 그들의 평균 출시 확률에 종료 시 냅 스의 총 수의 조합으로 간주 됩니다. 그러나, 이러한 매개 변수는 시 냅 스, 또는 시 냅 스 다양성의 또 다른 변수 multiplicativity 측정 하지 않습니다-시 냅 시스 전송의 효능에 대 한 중요 하다.

시 냅 스 전송7,,89의 quantal 이론에 따라, 신경 세포의 쌍 사이 지정된 된 연결의 힘은 세 가지 요소에 따라 달라 집니다: 기능 시 냅 스 (N)의 수는 단일 시 냅 스 소포 (quantal 크기;의 출시에 postsynaptic 응답 Q)와 신경 전달 물질 방출 (Pr)의 확률. 시 냅 스 다양성은 n과 같습니다. 시 냅 스 다양성의 개발 또는 곱셈 시 냅 스의 가지 치기는 플라스틱 개발에 걸쳐 및 다른 질병 국가3,4,,610에. 이러한 이유로, 건강 및 질병에 시 냅 시스 전송의 효능을 이해 하기 위한 중요 한 의미는 다양성을 시 냅 스 특성화. 기법, 전자 현미경 등 여러 시 냅 스 연락처는 동일한 postsynaptic 신경11,12, 이전에 동일한 축 삭에서 발생을 감지 하 여 다양성을 시 냅 스의 구조적 증거를 확인할 수 있습니다. 13,14. 그러나, 이러한 구조적으로 확인 된 multisynapses 기능 자동15,16수 있습니다. N 의 정확한 기능 시험 주어진된 연결에 여러 기능 릴리스 사이트를 식별할 수 있는 짝된 전체 셀 녹음 등 electrophysiological 방법을 기술적으로 도전적인 필요 최소한의 단일 putative 축 삭을 모집을 목표로 하는 자극 접근.

이 프로토콜에서 우리 Hsia 외2에 의해 원래 개발 방법을 채택 하 여 시 냅 스 다양성을 추정을 위한 간단한 방법을 설명 합니다. 이 기술은 자연 Psc (sPSCs) 및 전체 셀 패치 클램프 전기 생리학, 특정된 뉴런에 대 한 모든 입력에 걸쳐 시냅틱 복합성의 정도 예측할 수 있는 사용 하 여 mPSCs의 측정을 포함 한다.  로 이전에 정의 된, 시 냅 스 다양성 주어진된 사전 및 postsynaptic 신경 세포 사이의 시 냅 스의 수를 반영 합니다. 여러 개의 시 냅 스는 활동 전위에 의해 synchrony에서 모집 하 고, 큰 진폭 PSC를 생성 하는 개별 (즉, quantal) Psc의 일시적인 합계의 확률이 매우 높은 있을 것입니다.  MPSC 기록에서 (에 있는 활동 전위는에 의해 차단 TTX), 개인 (비 동기) mPSCs의 일시적인 합계의 확률은 낮습니다. 이 논리를 사용 하 여, 시 냅 스 다양성 sPSC 진폭 (활동 전위 종속 자료)와 mPSC 진폭을 비교 하 여 추정 수 있습니다.

다중성의 존재를 검사 4 개의 실험 및 예를 들어 glutamatergic EPSCs를 사용 하 여 그들의 분석을 설명 합니다. 그러나, 동일한 접근 방식을 사용할 수 있습니다 빠른 GABAergic/glycinergic 전송 (Ipsc). 각 실험에 대 한 간략 한 근거 아래 설명 되어 있습니다. 첫째, 위에서 설명한 mEPSCs에 sEPSCs의 진폭을 비교 하 여 시 냅 스 다를 추정 수 있습니다. 이 접근;에 대 한 두 가지 요구 사항이 있습니다. 1) 연 접 축 삭 한다 활동 전위의 충분 한 수 기록, 중 고 2) Pr 수 있어야 합니다 높은 여러 시 냅 스 신경 활동 전위의 도착 시 해제. 이러한 요구 사항을 충족, sEPSCs는 낮은 Ca2 + 인공 뇌 척수 (실제)에 처음 기록 된 고 K+ 채널 길 항 제, 행동 증가 4-Aminopyridine (4-AP)의 낮은 농도의 기록 잠재적인 발사 하 고 Pr. 다음 발사 하는 활동 전위는 TTX 및 홍보 전압-문이 캘리포니아2 + 채널 차단 Cd2 +감소에 의해 차단 됩니다. MEPSC의 sEPSCs (4AP)와 비교 (4AP, TTX와 Cd2 +). 두 번째 실험에서 캘리포니아2 + 아데닌 Sr2 + 기 출시 desynchronize를 실제에 의해 대체 됩니다. 캘리포니아2 + vesicles의 동기 릴리스에 대 한 필요는, Sr2 + 교체 다양성을 나타내는 큰 진폭 sEPSCs를 제거 한다. 셋째, mechanistically, 다양성에 발생할 수 있습니다 여러 개의 시 냅 스 연락처 중에서 동일한 postsynaptic 신경 또는 multivesicular 릴리스 (즉, 단일 시 냅 스 접촉 내 발표는 여러 vesicles)17,18. 다양성의 두 종류를 구분 하는 세 번째 실험 사용 하 여 낮은 선호도, 빠른 출신과 경쟁 길 항 근 AMPA 수용 체, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)17,18 큰 있는지 여부를 확인 하 sEPSC 독립 시 냅 스의 multivesicular 릴리스 postsynaptic 수용 체의 겹치는 인구에 일시적인 합계의 결과입니다. 큰 진폭 이벤트 multivesicular 방출에서 발생 하는 경우 γ-DGG 효과가 있을 것입니다 덜 큰 작은에 비해 sEPSCs 억제에 큰 sEPSCs 여러 개의 시 냅 스 연락처의 일시적인 합계에서 발생 하는 것입니다 마찬가지로 영향을 받을 반면 Γ-DGG입니다. 4 실험에서 더 생리 메서드는 활동 전위 발사, 즉 입성 시 냅 시스 자극을 향상 시키기 위해 사용 됩니다. 시 냅 스 활동의 파열 수 뚜렷이 증가/촉진 자극된 afferents의 자발적인 활동 전위 발생 및 릴리스 확률. 따라서,이 이렇게 다양성이 더 생리 적인 방법으로 매니 페스트 수 있습니다.

다음 프로토콜 마우스 hypothalamic 조직에 이러한 실험을 수행 하는 방법을 설명 합니다. 특히, corticotropin 공개 호르몬 (CRH) 신경 시상 하 부 (PVN)의 paraventricular 핵의 사용 됩니다. 우리는 전체 셀 패치 클램프 전기 생리학을 실시 하기 위한 절차를 설명 하 고 시냅틱 다양성에 대 한 테스트를 특정 실험을 설명.

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Protocol

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모든 동물 실험 동물 관리 위원회의는 웨스턴 온타리오 대학 동물 관리 지침 (AUP #2014-031)에 캐나다 위원회에 의해 승인 됩니다.

1입니다. 솔루션

  1. 조각화 솔루션
    1. 조각화 솔루션의 구성 표 1 을 참조 하십시오.
    2. 20 x 재고 솔루션을 사전에 준비 하 고 최대 1 개월 4 ° C에서 그것을 저장.
    3. 1 x 조각화 솔루션, NaHCO3, 포도 당 및 자당 ddH2O, 해산 하 고 20 배 재고를 추가 합니다. 315-320 mOsm 사이 osmolarity 확인 하 고 더 이상 1 주 4 ° c.에 대 한 솔루션을 저장
    4. 솔루션을 조각화의 100 mL와 함께 두 개의 비 커와 parafilm으로 그들을 커버. 솔루션 (-80 ° C 냉동 고에서 약 20 분) 냉동 부분적으로 된다 때까지 솔루션을 냉장고에 침착 해. 얼음에 95% O2/5% CO2 20 분에 대 한 솔루션을 조각화의 두 비 커를 거품 가스 분산 관을 사용 하 여.
해결책 농도 (mM)
슬 라이 싱 보통 실제 낮은 Ca2 + 실제 Sr+ 실제 피 펫/내부
NaCl 87 126 126 126 -
KCl 2.5 2.5 2.5 2.5 8
CaCl2 0.5 2.5 0.5 - -
SrCl2 - - - 2.5 -
MgCl2 7 1.5 2.5 1.5 2
NaH24 1.25 1.25 1.25 1.25 -
NaHCO3 25 26 26 26 -
포도 당 25 10 10 10 -
자당 75 - - - -
K-글 루 콘 산 - - - - 116
나 글 루 콘 산 - - - - 12
HEPES - - - - 10
K2 EGTA - - - - 1
K2ATP - - - - 4
3GTP - - - - 0.3

표 1: 다양 한 솔루션의 구성입니다.

  1. (슬라이스 복구 및 유지 관리)에 대 한 실제
    1. 실제의 구성 표 1 을 참조 하십시오.
    2. 20 x 재고 솔루션을 사전에 준비 하 고 최대 1 개월 4 ° C에서 그것을 저장.
    3. 1 x 실제 NaHCO3 및 ddH2O에서에서 포도 당을 분해 하 고 20 x 주식을 추가. 298-300 mOsm 사이 osmolarity가 확인 합니다. 솔루션을 사용 하 여 1 일 이내.
  2. 실제 (낮은 Ca2 + 녹음)
    1. 낮은 Ca2 + 실제의 구성 표 1 을 참조 하십시오.
    2. 20 x 재고 솔루션을 사전에 준비 하 고 최대 1 개월 4 ° C에서 그것을 저장.
    3. 낮은 Ca2 + 실제 x 1, NaHCO3 및 ddH2O에서 포도 당을 녹이 고 (CaCl2 와 MgCl2 무료) x 20을 추가 주식, CaCl2 , MgCl2 를 지정 농도. 298-300 사이 osmolarity가 확인 합니다. 솔루션을 사용 하 여 1 일 이내.
  3. 실제 (Sr2 + 녹음)
    1. Sr2 + 실제의 구성 표 1 을 참조 하십시오.
    2. 20 x 재고 솔루션을 사전에 준비 하 고 최대 1 개월 4 ° C에서 그것을 저장.
    3. Sr2 + 실제 x 1, NaHCO3 및 ddH2O 포도 당을 해산 하 고 추가 (CaCl2 및 MgCl2 무료) 20 주식, SrCl2 , MgCl2 를 지정 농도. 298-300 사이 osmolarity가 확인 합니다. 솔루션을 사용 하 여 1 일 이내.
  4. 내부 솔루션
    1. K-글 루 콘 산 기반 내부 솔루션의 구성 표 1 을 참조 하십시오.
    2. 하기 위해 내부 솔루션의 20 mL, 50 mL 튜브에 분자 생물학 학년 물 15 mL를 추가 합니다. 얼음에 다음 단계를 수행 합니다.
    3. 분자 생물학에서 1 M 재고 농도에 미리 다음 솔루션 학년 물 준비. (ML)에 추가: 2.32 K-구 루 콘, 0.24 나 구 루 콘, 0.20 HEPES, 0.16 KCl, 0.05 k 2-EGTA, 50 mL 튜브에 0.04 MgCl2 .
    4. 0.3 M 나3GTP의 100 µ L를 추가 합니다.
    5. 44.08 mg K2ATP 2 mL microcentrifuge 튜브에서의 무게 및 분자 생물학 학년 물의 1 mL을 추가 다음 50 mL 튜브에 추가 합니다.
    6. PH 7.2-7.4 1 m 코를 조정 합니다. 283-289 mOsm 사이 osmolarity가 확인 합니다.

2. 슬라이스 준비

  1. 도구 준비
    1. 복구 챔버 (250 mL 비 커 4 웰 스와 그물에서에서 생성)을 실제의 200 mL를 추가 하 고 복구 챔버 물 목욕 (35 ° C)에 배치.
    2. 파라핀 영화와 챔버 커버 하 고 지속적으로 95% O2/5% CO2 적어도 20 분 동안 유리 분산 튜브를 사용 하는 실제 거품.
    3. (메스, 각도 잘가 위, 집게, 벌금 페인트 브러시, 플라스틱 숟가락) 도구를 설정 하 여 해 부에 대 한 준비.
    4. 단계 1.1.4에서에서 얼음 처럼 차가운 조각화 솔루션의 약 15 mL에 60 mL 주사기를 채우십시오.
    5. 잘 접시의 뚜껑에 필터 종이 배치 하 여 절 개 플랫폼을 준비 합니다.
    6. 얼음 트레이 여 얼음 트레이에 배치 조각화 챔버를 준비 합니다.
    7. 보호 하는 블레이드 홀더에서 일회용 블레이드는 vibratome를 설정 합니다.
    8. 전송 피 펫 파스퇴르 피 펫의 끝 고 깨진된 끝에 고무 전구를 배치 하 여 확인 합니다.
  2. 쥐의 뇌를 해 부
    1. 척수 반사는 결 석까지 4 %isoflurane 포화 챔버에 동물 anesthetize
    2. 단두대를 사용 하 여 동물을 목을 벨 하 고 신속 하 게 뇌를 제거 합니다.
      1. 꼬리를 rostral에서 번호 22 메스 블레이드와 중간 절 개를 확인 합니다.
      2. 옆 머리의 양쪽에 두 피를 껍질.
      3. Rostral (포함 하는 정면 뼈의 측면), 꼬리에서 한쪽에 두개골을 잘라 사용 좋은 위 사용 하 여 주의 하지 뇌 손상.
      4. 두개골 조각 리프트를 사용 하 여 집게 두뇌와 빨리 단계의 2.1.4 주사기를 사용 하 여 차가운 조각화 솔루션의 15 mL와 함께 두뇌 냉각.
      5. 두개골에서 뇌를 들어올립니다.
      6. 장소 (1.1.4 단계)에서 얼음 처럼 차가운 조각화 솔루션으로 가득 비 커 중에서 뇌 95% O2/5% CO2버블링.
  3. 마우스 시상 하 부의 조각 준비
    1. 원하는 뇌 영역에 대 한 뇌를 차단 하 고 각도 잘라 (예를 들어, 코로나 hypothalamic 슬라이스 조직 시 chiasm rostral와 블레이드를 사용 하 여 폰에 꼬리에서 손질과 꼬리 블록에 두뇌의 기지에 플랫 서피스 수직).
    2. 앞쪽 측면에서 머리를 선택 하 고 인스턴트 접착제를 사용 하 여 지주 접시에 후부 측을 접착제를 사용 하 여 필터 종이의 잘라 조각.
    3. 빨리 들고 접시 조각화 챔버로 놓고 솔루션 단계 1.1.4에서에서 두 번째 비 커에서 조각화와 챔버를 입력 합니다.
    4. vibratome에 조각화 상공과 얼음 트레이 보호 합니다.
    5. 조각화 지역 (앞쪽에 및 사후 뇌)를 정의 하 고 250 µ m 두께 코로나 조각 자르는 시작. 권장 매개 변수: 0.10 m m/s, 진폭 속도 2 m m.
    6. 원하는 뇌 영역에 대 한 적절 한 크기를 조각을 잘라.
    7. 30-45 분 동안 35 ° C에서 분할 영역을 복구 합니다. 온난 한 목욕에서 복구 챔버를 제거 하 고 복구 추가 30 분에 대 한 실 온에서 하루 중 나머지에 대 한 실 온에서 계속 조각 조각 허용 그리고 거품 목욕 95% O2/5 %로 지속적으로 계속 CO2 .

3. 전체 셀 패치 ClampRecording

  1. 패치 펫을 당겨
    1. 전체 셀 피 펫 끌어당기는 설명서에서 기록에 대 한 제안된 매개 변수를 사용 하 여, 3-5 m ω의 저항을 피 펫을 패치 펫 두꺼운 벽으로 둘러싸인된 유리에서 당겨.
    2. Microsyringe 상업 (수 제), 칠 피 펫 팁을 사용 하 여 필터링 된 내부 솔루션. microsyringe, 만들고, 1 mL 주사기의 팁을 구울가 만드는 팁을 수 있도록 긴 좋은 팁.
  2. 전체 셀 구성 얻기
    1. 전압 클램프 모드에서 현재 기록 피 펫을 슬라이스 및 오프셋 피펫으로 바로 위에 놓습니다. 피펫으로에 약간의 긍정적인 압력을 적용 하 고는 자 지를 잠금.
    2. 그대로 막으로 건강 한 셀을 선택 하 고 셀을 피펫으로 접근. 조직 (즉, 입력할 때 조직에 느린 파도)에 약간의 소요를 일으킬 해야 긍정적인 압력.
    3. 피펫으로 세포 표면에 작은 보조 개 형성 될 때까지 대각선 모션을 사용 하 여 셀을 가까이 피 펫을가지고 천천히 계속.
    4. 긍정적인 압력 잠금을 해제 됩니다. 셀 물개를 형성 하기 위하여 시작 되 고 저항 1 GΩ 위에 증가 합니다. 전압 클램프에서-68 셀을 잡고 mV.
    5. 약간 대각선 셀에서 초과 압력을 제거 하려면 셀에서 당겨.
    6. 빠르고 느린 피 펫 용량에 대 한 보상.
    7. 셀 통해 휴식과 얻을 전체 셀 구성 피 펫 소유자에 연결 하는 튜브를 통해 간단한 흡입을 적용 합니다.
    8. 멤브레인에 모드 전환 테스트는 전기 생리학 데이터 수집에서에서 창 및 분석 소프트웨어 (예: Clampex).
    9. 녹음 각 전압 클램프, 전에 동일한 소프트웨어를 사용 하 여 막 테스트를 수행 하 고 실험실 책 (막 저항, 액세스 저항 및 커패시턴스)에 관련 매개 변수를 기록 합니다.
    10. 27-30 ° C에서 녹음 목욕 및 후속 실험에 대 한 1.5-2.0 mL/min 유량의 온도 유지 합니다.

4. 다양성 실험

  1. 실험 1: 다중성 4 AP를 사용 하 여 추정
    1. 전압 클램프에서-68 셀을 잡고 mV. 동일한 소프트웨어를 사용 하 여 perfusing 낮은 Ca2 + 실제와 목욕 하는 동안에 sEPSCs를 기록 합니다. 시 냅 스 활동 막의 돌파구 후에 높은 될 수 있습니다 안정적인 초기 녹음을 보장 하기 위해 전체 셀 구성의 시작 후 5 분 이상에 대 한 레코드입니다.
    2. 실제 4 AP는 micropipette를 사용 하 여 추가 하 고 목욕 적용 30 µ M 4-AP. 기록 sEPSCs 전체 약물 효과 얻으려면 적어도 10 분.
    3. 4 AP와 실제를 0.5 µ M TTX 및 10 µ M Cd2 + 를 추가 하 고 10 분 이상에 대 한 mEPSCs을 기록.
    4. 오프 라인 분석을 위해 기준선 (낮은 Ca2 + 실제)에서 4-ap 통신, 4 AP 응용 프로그램의 10 분 및 TTX 응용 프로그램의 10 분의 적용 직전의 마지막 1 분을 사용 합니다.
  2. 실험 2: desynchronize 사용 하 여 Sr2 + 소포 자료
    1. Perfusing 일반 캘리포니아2 + (목욕 실제와 같은) 실제 레코드 sEPSCs 적어도 5 분 동안 함께 목욕 하는 동안.
    2. Sr2 + (1.4 단계)에서 실제와 레코드 sEPSCs perfusing 시작 하 고 정상적인 Ca2 + 실제에서 전환.
    3. 오프 라인 분석을 위해 큰 진폭 sEPSCs vesicles의 동기 출시 때문 인지를 결정 하려면 기준선 (정상적인 실제) Sr2 + 실제 응용 프로그램의 10 분의 마지막 1 분 비교 합니다.
  3. 실험 3: multivesicular 릴리스를 사용 하 여 테스트 Γ- DGG
    1. 낮은 Ca2 + 실제 레코드 sEPSCs 적어도 5 분 동안.
    2. 관류 시스템을 통해 실제를 30 µ M 4-AP를 추가 합니다. 적어도 10 분에 대 한 sEPSCs를 기록입니다.
    3. 200 µ M γ-DGG 4 AP와 실제를 추가 하 고 10 분 이상에 대 한 sEPSCs을 기록.
    4. 단계를 수행 하는 별도 셀에 컨트롤 실험 1-3 하지만 적용 낮은 농도 (125 nM) γ-DGG 대신 DNQX의.
    5. 오프 라인 분석을 위해 각 약물 응용 프로그램의 마지막 분 분석.
  4. 실험 4: 구심 성 입력을 활동 전위 발생을 증가 자극.
    1. 일반 캘리포니아2 + 실제에서 기록 sEPSCs.
    2. Afferents를 사용 하 여 실제의 속도로 20 Hz 2 s 및 반복에 대 한 10 시간 20 초 간 버스트 간격으로 가득 monopolar 유리 전극 자극.
    3. 분석을 위해 하는 기준으로 사용 하는 첫 번째 자극 전에 5000 ms 한 최종 자극 후 10-300 ms를 비교 하 고 걸릴 평균 진폭과 주파수 변경 10 재판.

5입니다. 분석

  1. SEPSCs 및 mEPSCs 프로그램을 감지 하 고 분석 하 여 시 냅 스 전류 (예를 들어, 미니 분석 소프트웨어)를 사용 하 여 분석 합니다.
    1. 이 소프트웨어를 사용 하 여 감지 AMPA 수용 체 EPSCs (또는 GABA 수용 체 EPSCs 억제 전류를 기록 하는 경우)에 대 한 제안 된 검색 매개 변수를 사용 합니다.
    2. 논 스톱 분석 함수 를 사용 하 여 녹음에 EPSCs를 감지.
    3. 수동으로 검색 프로그램은 각 이벤트를 탐지 정확 하 게 되도록 각 기록 (예: 이벤트 되지 않습니다 확인 놓친 또는 두 번 계산).
    4. 클립보드에 복사 하 여 이벤트 데이터를 내보내고 데이터 관리 소프트웨어 (예: Excel)에 붙여 넣습니다
    5. 평균 주파수 또는 진폭 각 약물 치료에 대 한 계산 하 고 관련 통계 분석을 수행.

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Representative Results

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위의 프로토콜 전체 셀 패치 클램프 전기 생리학을 사용 하 여 예를 들어 마우스 hypothalamic 뉴런을 사용 하 여 시 냅 스 복합성의 정도 검사 하는 방법을 설명 합니다. 이 슬라이스 준비 기술은 건강 한 가능한 세포가 없는 부 어 막 또는 핵 (그림 1) 항복 한다. 프로토콜의 각 단계 조직 및 녹음의 품질의 건강을 위해 중요 하다.

Figure 1
그림 1: 건강 하 고 건강에 해로운 조직 다음 슬라이스 준비. 40 x 확대 차동 간섭 콘트라스트 광학 아래 PVN의 전기 생리학 준비를 슬라이스. 빨간 화살촉 건강 한 세포를 나타내고 검은 화살촉 건강에 해로운 셀 표시 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2 는 시 냅 스 다 패치 클램프 전기 생리학을 사용 하 여 식별에 대 한 근거를 보여 줍니다. 시 냅 스 복합성 신경 (그림 2A 왼쪽), 또는 특정된 시 냅 스 사이트 (그림 2A 오른쪽)에서 multivesicular 출시 한 쌍 사이 여러 시 냅 스 접촉 중 하나에서 발생할 수 있습니다. 모두 이러한 상황에서 연 접 신경에 활동 전위 여러 개의 시 냅 스 이벤트의 임시 합계 때문 큰 postsynaptic 응답 (sEPSC)를 이끌어내는 것 이다. 그러나, 연 접 활동 전위의 부재에서에서 (예: 존재 TTX와 Cd2 + Na+를 차단 하-종속 및 캘리포니아2 +-종속 활동 전위 발생), 기공을 신경 전달 물질 방출은 비동기. 그 결과, postsynaptic 응답 작아집니다 (그림 2B: AP 독립적인). 두 개의 뉴런 다양성을 전시 하지 않는 경우 (즉, 하나의 시 냅 스 접촉/no multivesicular 릴리스는)의 활동 전위-종속 및 독립 활동 전위 릴리스 사이 postsynaptic 응답에 차이가 있을 것입니다 신경 전달 물질 (그림 2C)입니다.

Figure 2
그림 2: 의 postsynaptic 현재에 다른 시 냅 스 조직 결과 보여주는 회로도. (A, B) 냅 다, 활동 전위와 이어지는 Ca2 + 유입 여러 개의 시 냅 스 소포는 큰, multiquantal EPSCs의 동기 융합을 트리거합니다. 시 냅 스 다양성 multisynapse 연락처 또는 단일 시 냅 스 (A)에서 multivesicular 버전에서 발생할 수 있습니다. 존재 TTX와 Cd2 +, 활동 전위 독립적인 소포 융해 비동기 이며 작은 uniquantal EPSCs (B) 발생. (C) 복합성 없이 시 냅 스, 활동 전위 따라와-독립적인 소포 융해 uniquantal EPSCs에서에서 결과. 이 그림 우리의 이전 보고서6 그림 1A 에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

실험 1, 4-AP 목욕을 발사 하는 활동 전위를 증가 하 고 확률을 공개에 적용 됩니다. 그 4 AP는 발사 하는 자발적인 활동 전위 증가 되도록 EPSCs의 주파수는 sEPSCs와 mEPSCs (그림 3A, C) 사이 비교할 수 있습니다. SEPSCs 활동 전위 따라와-독립적인 이벤트의 조합 때문에, sEPSC 및 mEPSC의 주파수에서 차이 연 접 축 삭에서 발사 하는 자발적인 활동 전위에 대 한 프록시 역할. 우리 > 15% 차이의 주파수에 다양성의 분석에 대 한 충분 한 활동 전위 종속적 이벤트 수 있는지 되도록 mEPSC sEPSC에서 임의의 컷을 사용 하 여. 낮은 Ca2 + 상태와 TTX (mEPSC) 상태에서 EPSCs는 주파수와 진폭 (즉 자발적 행동 잠재력 낮은 Ca2 + 상태에서 발사)는 낮은 Ca2 + 기준 sEPSC와 4의 차이에 유사한 경우 -AP 또한 다양성의 분석을 위해 사용할 수 있습니다.

예를 들어 결과 그림 3, 4 AP과 sEPSCs의 주파수와 진폭 증가 합니다. TTX와 Cd2 + 의 후속 응용 프로그램 진폭과 주파수를 감소합니다. 위에서 설명한 sEPSCs와 mEPSCs는 진폭에 차이 시 냅 스 복합성을 나타냅니다. 우리 여기 검사 hypothalamic 뉴런, 진폭 및 주파수 기준 조건과 TTX의 동일 (그림 3C, D), 초기 sEPSCs 거의 활동 전위 종속 EPSCs 포함 제안는. 따라서, 후속 실험 기준선과 다양성을 측정 하기 위해 4 AP의 차이점을 비교할 수 있습니다.

Figure 3
그림 3:. 4-ap 통신 응용 프로그램 보여 시 냅 스 다. (A) 샘플 sEPSCs 낮은 Ca2 + 실제에 기록 하는 초기, 중 고 후 4-AP (30 μ M) 응용 프로그램, 그리고 후속 TTX의 흔적 (0.5 μ M) 및 Cd2 + (10 μ M) 응용 프로그램. (B) (A)에 표시 된 기록에서 sEPSC 진폭의 분포. (C, D) (C)의 평균 주파수의 요약 및 기준선 (회색), 4-AP (레드)와 TTX 사이 진폭 (D) + Cd2 + (블루). P < 0.005, * * P < 0.01. 이 그림 우리의 이전 보고서6 그림 2 에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

위에서 설명한 방법을 견적 종료 postsynaptic 신경에 시 냅 스의 평균 다양성: 시 냅 스의 작은 비율에 발생 하는 복합성에서 변화를 감지 하지 않을 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 우리의 최근 연구에서이 방법은 정상과 만성 hypothalamic 신경에서 글루타민 산 염 시 냅 스의 복합성에서 변화 스트레스 조건6밝혔다.

대체 Ca2 + 아데닌 Sr2 + 는 실제에서의 신경 전달 물질 소포 19, 20의 활동 전위 종속 릴리스 desynchronizes. 따라서, 만약 큰 진폭 sEPSCs 활동 전위-종속 동기화 기공을 신경 전달 물질 방출 (즉, 다양성), 대체 Ca2 + Sr의 합계2 + 줄일 것 이다 EPSCs의 진폭. 보듯이 그림 4, Sr2 + 실제 큰 진폭 이벤트 (그림 4B)의 비율을 감소 하 고 결과적으로 평균 진폭 (그림 4C) 감소. 세포는 다양성을 전시 하지 않습니다, 기 출시 desynchronizing 있을 것 이다 EPSC 진폭에 영향을 주지 않습니다.

Figure 4
그림 4: Sr2 + 대형 multiquantal 이벤트 desynchronizes. (A) 정상적인 Ca2 + 실제와 Sr2 + 실제 사이 대표 추적 비교. Sr2 + 실제 기 출시 desynchronizes 및 대표 진폭 분포 (B)와 (C)의 모든 셀에 대 한 진폭 변화에서 보듯이 multiquantal 동기 이벤트의 진폭을 감소 * P < 0.05. 이 그림 우리의 이전 보고서6그림 3 에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Γ-DGG, AMPA 수용 체의 빠른 출신과 경쟁 적 다양성 multivesicular 릴리스 또는 여러 개의 시 냅 스 연락처 인지 확인 하 사용할 수 있습니다. Multivesicular 릴리스 조가 postsynaptic 수용 체의 겹치는 인구에, 큰 진폭 EPSCs 포함 한다 시 냅 스 갈라진 틈에 조미료의 풀링. 즉, 시 냅 스 갈라진 틈에 조미료의 농도가 uniquantal 방출에서 결과 보다 높은 수준 이다. 다른 한편으로, multisynaptic 연락처 각 시 냅 스 사이트에서 uniquantal EPSCs을 할 것입니다. 큰 진폭 EPSCs, multivesicular 버전에서 발생 하는 경우 작은 진폭 EPSCs (그림 5A B-D)에 비해 (때문에 높은 조미료 농도) γ-DGG 적개심에 의해 더 큰 EPSCs는 덜 영향 것입니다. 경우 큰 진폭 EPSCs 동기 uniquantal EPSCs (multisynapse 연락처)의 합계는, γ-DGG 것입니다 마찬가지로 모든 EPSCs (그림 5A 왼쪽, E-G)의 진폭에 영향을. Γ-DGG, DNQX 높은 선호도 달리 모든 크고 작은 진폭 EPSCs (그림 5 H에걸쳐 균일 한 감소 하면 느린 출신과 AMPA/kainate 수용 체 길 항 제-J). Γ-DGG와 DNQX 감도 최대 (최대 20 EPSCs의 평균)로 나눈 평균 EPSC 진폭의 비율으로 정해질 수 EPSC 진폭 (그림 5 K, L).

Figure 5
그림 5: γ-DGG multivesicular 버전을 사용 하 여. 다양성의 두 가지 모델을 설명 하는 (A) 회로도. 왼쪽: postsynaptic 수용 체의 독립적인 인구는 uniquantal 전송 시간 합계 크고 작은 EPSCs 비슷한 조미료 농도 시 냅 스 갈라진 틈에 의해 달성 하 고 따라서 γ-DGG에 동등 하 게 과민 하다. 오른쪽: postsynaptic 수용 체의 겹치는 인구를 대상으로 하는 multiquantal 전송. 큰 EPSCs는 작은 sEPSCs 보다 높은 조미료 농도 분열에 의해 발생 하 고 그러므로 γ-DGG에 덜 민감한. 모델의 하단에 표시 된 값에는 가상 상대 진폭입니다. (B) 샘플 녹음 했다 4-ap 통신 응용 프로그램을 다음과 같은 의미 sEPSC 진폭 증가에서 추적 (응답자 4 AP). (C) (B)에 표시 된 녹음/녹화에 대 한 EPSC 진폭에 대 한 누적 줄거리. (D) 정규화 된 EPSC 진폭 (EPSC/EPSC최대) 전후에 (B)에 표시 된 기록에서 γ-DGG의 응용 프로그램에 대 한 누적 줄거리. 거기 있던 다음 평균 sEPSC 진폭에 변화가 4 AP 기록에서 추적 (E) 샘플 응용 프로그램 (응답자 4 AP 비-). (F) 누적 EPSC 진폭 (E)에 표시 된 녹음/녹화에 대 한. (G) 누적 EPSC/EPSC맥스 (E)에 표시 된 녹음/녹화에 대 한 플롯. (H) 샘플 4-AP 및 DNQX 응용 프로그램 후 기준선에서 기록에서 추적 한다. () 누적 EPSC (H)에 표시 된 녹음/녹화에 대 한 진폭. (J) 누적 EPSC/EPSC맥스 (H)에 표시 된 녹음/녹화에 대 한 플롯. Γ-DGG (4 AP 응답자 및 비 응답자 그룹)에서 또는 DNQX 응용 프로그램 후 EPSC/EPSC최대 의 (K) 요약 사전-γ-DGG/DNQX (즉, 포스트-4-ap 통신)로 정규화. (L) 플롯 게시물-4-AP의 게시물-γ-DGG/DNQX 의미 EPSC/EPSC최대 (게시물 4 AP에 정규화)에 EPSC 진폭 (pre-4-AP에 정규화) 의미. P < 0.005. 이 그림 우리의 이전 보고서6그림 4 에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

시 냅 시스 전송의 강도 시 냅 스 활동의 파열에 의해 뚜렷이 증가 수 있습니다. 더 많은 생리 적 조건 하에서 다양성 조사, 구심 성 자극 활동 전위 발생을 증가 하 고 확률을 릴리스를 사용할 수 있습니다. 다양성이 있으면 구심 성 자극 해야 일으킬 간단한 증가 EPSC 진폭 (그림 6A-D). 다 없으면 활동 활동 전위 발생의 증가 구동 EPSC 진폭을 증가 되지 않습니다.

Figure 6
그림 6:-고주파 자극 시 냅 스 다양성 보여준다. (A) 샘플 입성 시 냅 시스 자극 전후 sEPSCs의 흔적. 시 냅 시스 자극 전후 sEPSC 진폭의 (B) 줄거리 (20 Hz, 2 s) (A)에 표시 된 기록에서. (C, D) (C) sEPSC 주파수 및 진폭 (D) 변경 시 냅 시스 자극을 다음의 요약. P < 0.001, * P < 0.05. 이 그림 우리의 이전 보고서6 그림 5 에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

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성공적인 패치 클램프 전기 생리학 실험에 대 한 한 가지 중요 한 요구 건강 한 조각/셀을 얻는 이다. 우리의 설명된 프로토콜 hypothalamic 조각 PVN의 뉴런을 포함 하는 최적화 되어 있습니다. 다른 뇌 영역 해야 수정 솔루션 및 조각화 방법21,22,,2324. 기록, 그것은 막 저항 등 셀 속성을 지속적으로 모니터링 하 여 안정적인 녹음을 허용 하도록 중요 한 커패시턴스 및 액세스 저항. 액세스 저항 증가 EPSC 진폭을 감소 하 고 따라서 진폭 측정을 혼동 수 있습니다. 따라서, 20 m ω를 초과 하거나 녹음 하는 동안 20% 이상 증가 액세스 저항 값으로 셀이 삭제 됩니다. 유사 하 게, 감소에 (또는 낮은) 막 저항 가난한 공간-클램프 될 수 있습니다 하 고, 따라서, 진폭을 줄일 수 있다. 우리의 대상 시스템 (parvocellular PVN 신경) 신경 500 m ω 및 1 GΩ, 사이 높은 막 저항 그리고 우리 막 저항 500 ω 아래 셀 삭제. 연구에서 뉴런의 특정 유형에 대 한 품질 관리 컷-오프를 설립 해야한다. 이 프로토콜 약물 응용 프로그램 전후에 진폭 차이 의존, 진폭 변화 약물 응용 프로그램으로 인해 고 막 저항 및 액세스 저항 변화에 안 되도록 중요 하다. 우리가이 프로토콜에 공부 hypothalamic 뉴런은 크기에서 작은 (셀 커패시턴스 쥐에 약 15 pF 이며 막 저항 1 GΩ), K-글 루 콘 산 기반 내부 솔루션 작동 고품질 EPSCs/Ipsc6,25 잘 . 큰 셀 크기와 낮은 입력된 저항 뉴런에 대 한 좋은 공간-클램프2되도록 세 슘 기반 내부 솔루션을 사용할 수 있습니다.

다양성을 측정 하기 위해이 메서드를 사용 하 여 하나의 특정 셀 활동 전위 종속적 이벤트 mEPSCs 비교 하기 위해 자발적인 활동 전위의 충분 한 수를 화재입니다. 이 부재와 존재의 TTX와 Cd2 +EPSCs의 주파수에서 차이 비교 하 여 보장 수 있습니다. Hypothalamic 슬라이스는 PVN 포함 하는에 우리 4-ap 통신의 응용 프로그램은 활동 전위 발생을 이끌어내는 효율적인 것으로 나타났습니다. Hsia, 동료2, 개척 다른 방법을 높은 캘리포니아2 + 실제 사용 하 여 4 AP 대신 발사 하는 활동 전위를 증가. 이 방법은 hippocampal 조각에 성공 했지만, 우리 발견 높은 캘리포니아2+ 4-AP hypothalamic 조각6에서 발사 하는 활동 전위를 촉진에 보다는. 실제로, 그것은 높은, extracellular 캘리포니아2 + 농도 Na+ 계수26,27을 변경 하 여 신경 세포와 axons의 내장 흥분을 감소 표시 되었습니다. 이 왜 일부 조각에 높은 캘리포니아2 + 실제 아니다 EPSC 주파수 증가에 효과가 설명 할지도 모른다.

모든 조각 패치 클램프 전기 생리학에 내재 되어,이 방법의 한 가지 한계는 postsynaptic 신경에 많은, 장거리 계획 슬라이스 준비에 잘립니다입니다. 활동 전위를 관찰 하기 위해 연 접 축 삭과 세포 시체 조각에 보존 해야 가능성이 높습니다. 따라서, 복합성 측정은 조각 내 보존 하는 시 냅 스 연결을 비뚤어진 다. 같은 라인을 따라 조각화의 방향 절단된28는 보존 계획의 특정 인구를 발생할 수 있습니다. 이러한 제한 구심 성 입력의 복합성을 과소평가의 일반적인 영향을 미칠.

설명된 프로토콜 특정된 뉴런에 대 한 모든 입력에 걸쳐 시냅틱 복합성의 정도 추정 하는 방법을 제공 합니다. 짝된 녹음 또는 단일 축 삭의 최소한의 자극 등 다른 전기 생리학 기술, 주어진된 연결에 여러 연락처, 하지만 이러한 실험 들은 어렵고 모든 시스템에서 가능 하지 여부를 확인할 수 있습니다. 그들은 단지 한 쌍의 신경 분리 또한, 그들은 주어진된 신경에 대 한 입력의 모든 조직의 전반적인 표시를 줄 수 없습니다. 현재 프로토콜 특정된 뉴런에 대 한 모든 입력에 걸쳐 복합성의 정도 평가 하기 위해 기본 패치 클램프 전기 생리학 방법을 사용 합니다.

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Disclosures

저자 공개할 게 없다

Acknowledgments

제는 온타리오 대학원 장학금을 받았다. W.I. 정신 건강 연구의 캐나다에서 새로운 탐정 친교를 받았다. 이 작품은 건강 연구 (PJT 148707) 자연과학 및 공학 연구 위원회의 캐나다 (06106-2015 RGPIN)와 캐나다 연구소에서 W.I 보조금 운영 지원.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe BD 309659
10 blade Fisher Scientific/others 35698
22 blade VWR/others 21909-626
22 μM syringe filters Milipore 09-719-000
Adson foreceps Harvard Instruments 72-8547
Angled sharp scissors Harvard Instruments 72-8437
Clampex Molecular Devices pClamp 10
Double edge blade VWR 74-0002
Filter paper Sigma/others 1001090
Fine paintbrush Fisher/various 15-183-35/various
Gas Dispersion Tube VWR LG-8680-120
Isoflurane Fresenius Kabi/others M60303
Krazy glue various various
Mini analysis Synaptosoft MiniAnalysis 6
Osmomoter Wescor Inc Model 5600
Parafilm Sigma PM-996
Pasteur pipette VWR 14672-200
ph meter Mettler Toledo FE20-ATC
Rubber bulb VWR 82024-550
Scalpel handle No. 3 Harvard Instruments 72-8350
Scalpel handle No. 4 Harvard Instruments 72-8356
Single edge blade VWR 55411-050
Vibratome slicer Leica VT1200S
Water Purification System Millipore Milli-Q Academic A10
Well plate lid Fisher/various 07-201-590/various
Chemicals/reagents
4-AP Sigma 275875
BAPTA molecular probes B1204
CaCl2*2H2O Sigma C7902
CdCl2 sigma 202908
DNQX Tocris 189
EGTA Sigma E3889
glucose Sigma G5767
HEPES Sigma H3375
K2-ATP Sigma A8937
KCl Sigma P9333
K-gluconate Sigma G4500
MgCl2*6H2O Sigma M2670
Molecular biology grade water Sigma W4502-1L
Na3GTP Sigma G8877
NaCl Bioshop SOD001.1
Na-gluconate Sigma S2054
NaH2PO4 Sigma 71504
NaHCO3 Sigma S6014
Picrotoxin sigma P1675
SrCl Sigma 255521
sucrose Bioshop SUC507.1
TTX Alamone Labs T-550
yDGG Tocris 6729-55-1

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References

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전기 생리학 전체 셀 패치 클램프를 사용 하 여 시 냅 스 다양성의 평가
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Sunstrum, J. K., Inoue, W. Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology. J. Vis. Exp. (146), e59461, doi:10.3791/59461 (2019).More

Sunstrum, J. K., Inoue, W. Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology. J. Vis. Exp. (146), e59461, doi:10.3791/59461 (2019).

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