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Neuroscience

全細胞パッチク電気生理学を用いたシナプスの多様性の評価

doi: 10.3791/59461 Published: April 23, 2019

Summary

ここでは、急性脳スライスにおける全細胞パッチ クランプ電気生理学を使用して機能的なシナプスの多様性を評価するためのプロトコルを提案する.

Abstract

中枢神経系のニューロンのペアはしばしば複数のシナプスの連絡先および/または機能神経伝達物質のリリース サイト (シナプス多重度) を形成します。シナプスの多様性は開発中とされているシナプス伝達の有効性の重要な決定要因、さまざまな生理的条件で変化とプラスチック。ここでは、我々 は終了急性脳スライスにおける全細胞パッチ クランプ電気生理学を使用して指定されたシナプス後ニューロンにシナプスの多様性の程度を推定するための実験を概説します。具体的には、自発性興奮性シナプス電流 (sEPSCs) の振幅とミニチュア興奮性シナプス電流 (mEPSCs) の違いを比較する電圧クランプ記録がされます。このメソッドの背後にある理論は、多様性を示す求心性入力は各シナプスの接触時に発生する同期のリリースのための大きい、電位依存性 sEPSCs を表示すること。対照的に、活動電位に依存しないリリース (これは非同期) 小さい振幅 mEPSCs が生成されます。この記事は一連の実験とシナプスの多様性の存在を特徴付けるための分析の概要し、要件と技術の限界について説明します。この手法は、生体に影響を与える異なった頭脳区域でシナプスの連絡先の組織でどのように異なる行動、薬理学的または環境介入を調査に適用できます。

Introduction

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シナプス伝達機構はニューロン間のコミュニケーションのため、したがって、脳の機能。シナプス伝達は、不安定なも、変調信号1への応答ようにも活動に依存した方法でその効果を変更できます。したがって、シナプス機能を調べると、神経科学研究の主要な焦点がされています。全細胞パッチ クランプ電気生理学は私たちを案出する実験デザインとデータ解析によるシナプス伝達の詳細な生物物理・分子機構を理解することができる汎用性の高いテクニックです。一般的なアプローチ、おそらく技術とコンセプトのシンプルさ、ためにミニチュア興奮性/抑制性シナプス後電流の測定は (私/Ips) 電圧クランプ構成2,3,4,5,6個々 Mpsc は、それぞれ神経伝達物質シナプス前ターミナル7 から解放の結合への応答のイオン型シナプス後受容体 (例えば AMPA とギャバA受容体) を介してイオンの流れを表す。.電位依存性 Na+チャネル ブロッカー テトロドトキシン (TTX) の存在下で記録を取得するとため、リリースの活動電位非依存および通常単一シナプス小胞神経伝達物質が含まれているが含まれます。この仮定に基づいて、Mpsc の平均振幅広くとして粗見積もり素量のサイズは、数と反対のシングル リリース サイト シナプス後受容体の機能を表します。その一方で、Mpsc の周波数は、シナプス シナプス後細胞とその平均放出確率に終了の合計数の組合せを表すと見なされます。ただし、これらのパラメーターは、シナプスのシナプスの多様性別変数 multiplicativity を測定しない-シナプス伝達の有効性のために重要であります。

シナプス伝達7,8,9の量子理論に基づく、ニューロンのペア間の特定の接続の強さは 3 つの要因に依存している: 機能性シナプス (N) の数、単一シナプス小胞 (量子サイズのリリースにシナプス応答Q) および神経伝達物質のリリース (Pr) の確率。シナプスの多様性は、 Nと同じです。乗法性シナプスの刈り込みやシナプスの多様性の開発は、開発全体と別の病気の状態3,4,6,10にプラスチックです。このため、健康と病気におけるシナプス伝達の有効性を理解するための重要な含意をシナプスの多様性を特徴付けます。電子顕微鏡などの手法は、同じシナプス後ニューロン11,12、上に同じ軸索からシナプスの複数の連絡先を検出することによりシナプスの多様性の構造的な証拠を識別できます。 13,14。しかし、これらの構造的に識別された multisynapses は機能的サイレント15,16をすることができます。指定された接続は、複数の機能リリース サイトかどうかを識別することができます対の全体セルの録音などの電気生理学的アプローチを技術的に困難なNの精密機能検査が必要最小限と単一推定軸索を募集することを目指す刺激アプローチ。

このプロトコルではもともと夏ら2によって開発された方法を採用することによりシナプスの多様性を推定するための簡単な方法をについて説明します。この手法には、自発の Psc (sPSCs) ・ Mpsc 全体細胞のパッチ クランプ電気生理学、特定のニューロンに対するすべての入力間シナプスの多様性の程度を推定することができますを使用しての測定が含まれます。 以前に定義した、シナプスの多様性は、与えられた前及びシナプス後ニューロン間のシナプスの数を反映します。複数のシナプス活動電位によって同調で募集、大きい振幅 PSC を生成する個々 の (すなわち素量) Psc の時間加算の高確率になります。 MPSC 録音で (どの活動電位 TTX によってブロックされる) で個々 の (非同期) Mpsc の時間加算の確率は低い。この原理を使用して、mPSC 振幅に (活動電位依存型リリース) 用の振幅を比較することによってシナプスの多様性を推定できます。

多様性の存在を確認するには、は、4 つの実験とその解析例としてグルタミン酸作動性工を使用してについて説明します。高速の同じ方法を使用することができますただし、gaba 作動性/グリシン作動性神経伝達 (Ips)。各実験のための簡単な理論的根拠を説明します。まず、前述のように、シナプスの多様性は mEPSCs に sEPSCs の振幅を比較することによって推定できます。このアプローチの 2 つの要件があります。1) シナプス前の軸索は、録音中は、活動電位の十分な数を発火しなければならないし、複数のシナプス活動電位の到着時に神経伝達物質を解放するように、2) Prが高くなる必要があります。これらの要件を満たすために sEPSCs を最初低 Ca2 +人工髄液 (アプライド) に記録された、K+のチャネル拮抗薬 4 アミノピリジン (4 AP) を行動を高めるための低濃度存在下で記録されます。潜在的な発砲と Pr。その後、活動電位発火は TTX と電位依存性 Ca2 +チャネル ブロッカー Cd2 +減 Pr によってブロックされます。MEPSC の sEPSCs (4AP) での振幅を比較 (4AP、TTX、Cd と2 +)。2 番目の実験では、Ca2 +に置換されますモル Sr2 + desynchronize 小胞の放出にアプライドで。Ca2 +は小胞の同期のリリースに必要な Sr2 +交換多重度を示している大振幅 sEPSCs を削除してください。第三に、機械論的に、多様性起因できるいずれかの複数のシナプス連絡先同じシナプス後ニューロンまたは多胞性のリリース (すなわち複数小胞の放出単一シナプスの接触内)17,18。多様性の 2 つのタイプを区別するために第 3 実験使用低親和性、高速分離競争力の拮抗薬 AMPA 受容体 γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)17,18大きいかどうかを決定するにはsEPSC は、独立したシナプスのシナプス後受容器の重なり人口に作用する多胞性のリリース時間の加算の結果です。多胞性のリリースから大振幅イベントが発生した場合、複数のシナプスの接触の時間の総和から生じる大規模な sEPSCs によって同様に影響されるに対し γ-DGG は大きいのより小さいのに比べて sEPSCs を抑制することで有効性が低くなりますΓ-武神。4 番目の実験より生理学的方法を使用して、活動電位発火、すなわち求心性のシナプス刺激を強化します。シナプスのバーストは、刺激の求心性神経の自発性活動電位発火と放出確率を促進/増加できる一過性。したがって、このアプローチはより生理的な方法でマニフェストに多様性をことができます。

次のプロトコルは、マウス視床下部組織のこれらの実験を行う方法を説明します。具体的には、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン (CRH) (PVN) 視床下部の室傍核ニューロンが使用されます。全体細胞のパッチ クランプ電気生理学を実施するための手順について説明し、シナプスの多様性をテストする特定の実験を説明します。

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Protocol

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すべての動物実験は、動物のケア委員会のウェスタン オンタリオ大学動物ケアのガイドライン (AUP #2014-031) のカナダの評議会に従ってによって承認されます。

1. ソリューション

  1. ソリューションをスライス
    1. スライスの溶液組成は表 1を参照してください。
    2. 20 x の原液を事前に準備、4 ° C で 1 ヶ月保存できます。
    3. 1 x スライス ソリューション NaHCO3, グルコースおよびスクロースを ddH2O を溶解し、20 x の在庫を追加します。浸透圧は 315 320 mOsm の間を確保し、4 ° C で 1 週間以上のソリューションを保存
    4. 100 ml のソリューションをスライスの 2 つのビーカーを記入し、パラフィルムで覆います。ソリューションは部分的 (-80 ° C のフリーザーで約 20 分) をフリーズになるまで冷凍庫でソリューションを冷やします。氷の上の 95% O25% CO2 20 分のソリューションをスライスの両方のビーカーをバブル ガス分散管を用いたします。
液濃度 (mM)
スライス 通常アプライド 低 Ca2 +アプライド Sr+アプライド ピペット/内部
塩化ナトリウム 87 126 126 126 -
KCl 2.5 2.5 2.5 2.5 8
CaCl2 0.5 2.5 0.5 - -
SrCl2 - - - 2.5 -
MgCl2 7 1.5 2.5 1.5 2
NaH2PO4 1.25 1.25 1.25 1.25 -
NaHCO3 25 26 26 26 -
グルコース 25 10 10 10 -
ショ糖 75 - - - -
K グルコン酸 - - - - 116
-グルコン酸 Na - - - - 12
HEPES - - - - 10
K2 グリコールエーテルジアミン四酢酸 - - - - 1
K2ATP - - - - 4
Na3GTP - - - - 0.3

表 1: 様々 な溶液の組成。

  1. (スライス回復およびメンテナンス) のアプライド
    1. アプライドの組成は表 1を参照してください。
    2. 20 x の原液を事前に準備、4 ° C で 1 ヶ月保存できます。
    3. 1 x アプライド NaHCO3と ddH2O 中のブドウ糖を溶解し、20 x の在庫を追加します。298 300 mOsm の間、浸透圧の変化を確認します。1 日以内のソリューションを使用します。
  2. アプライド (低 Ca2 +のための記録)
    1. 低 Ca2 +アプライドの組成は表 1を参照してください。
    2. 20 x の原液を事前に準備、4 ° C で 1 ヶ月保存できます。
    3. 低 Ca2 +アプライド x 1、溶かし NaHCO3と ddH2O のグルコース (CaCl2と MgCl2無料) x 20 を追加して株式、CaCl2 MgCl2濃度を指定します。浸透圧は、298-300 の間を確認します。1 日以内のソリューションを使用します。
  3. アプライド (Sr2 +のための記録)
    1. Sr2 +アプライドの組成は表 1を参照してください。
    2. 20 x の原液を事前に準備、4 ° C で 1 ヶ月保存できます。
    3. Sr2 +アプライド x 1、溶かし NaHCO3と ddH2O にグルコース (CaCl2と MgCl2無料) x 20 を追加して株式、SrCl2 MgCl2濃度を指定します。浸透圧は、298-300 の間を確認します。1 日以内のソリューションを使用します。
  4. 内部ソリューション
    1. K グルコン酸ベースの内部液の組成は表 1を参照してください。
    2. 内部溶液 20 mL をするためには、50 mL のチューブに 15 mL の分子生物学グレードの水を追加します。氷の上の後続の手順を実行します。
    3. グレード水早めに分子生物学の 1 M ストック濃度以下のソリューションを準備します。(ML) 追加: 2.32 K グルコン酸、グルコン酸 Na 0.24-0.16 0.20 HEPES KCl、0.05 K2-グリコールエーテルジアミン四酢酸、0.04 MgCl2 50 mL のチューブ。
    4. 0.3 M Na3GTP の 100 μ L を追加します。
    5. K22 mL 遠心チューブ ATP 44.08 mg の重量を量ると分子生物学グレードの水の 1 つの mL を追加し、50 mL のチューブ追加。
    6. 1 M コで 7.2 7.4 に pH を調整します。283-289 mOsm の間、浸透圧の変化を確認します。

2. スライス標本

  1. ツールを準備します。
    1. (4 井戸とネッティング 250 mL ビーカーから構築) 回復室にアプライドの 200 mL を追加し、水浴 (35 ° C) の回復室を配置します。
    2. パラフィン フィルム室をカバーし、常にバブル、アプライドの 95% O25% CO2を少なくとも 20 分間ガラス拡散管を使用します。
    3. 郭清を準備するには、ツール (メス、角度のついた高級ハサミ、鉗子、細かいペイント ブラシ、プラスチック スプーン) を設定します。
    4. 1.1.4 のステップから冷たいスライス溶液約 15 mL と 60 mL の注射器を入力します。
    5. 郭清のプラットフォームを準備するには、ウェル プレートの蓋のフィルター ペーパーを配置します。
    6. スライスの商工会議所を準備するには、製氷皿にそれを置くと氷のトレイを充填します。
    7. ブレード ホルダーに替刃を確保することにより、vibratome を設定します。
    8. パスツール ピペットの先端を破り、壊れた終わりゴム球を置くことによって転送ピペットを作る。
  2. マウスの脳を解剖します。
    1. 4% イソフルランで飽和状態に脊髄反射が欠席になるまで室内で動物を麻酔します。
    2. ギロチンを使用して動物の首をはねるし、脳をすぐに削除します。
      1. 尾側吻側から第 22 メス刃で正中切開を行います。
      2. 横方向に頭の両側に頭皮の皮をむきます。
      3. 尾から一側吻側 (を含むを頭骨の側面)、頭蓋骨を切るに使用高級はさみは、脳に損傷を与えないように注意を使用してください。
      4. 頭蓋骨部分を解除する使用鉗子脳と 15 ml の冷たいスライス ソリューション ステップ 2.1.4 から注射器を使用しての脳はすぐに冷却します。
      5. 頭蓋骨から脳を持ち上げます。
      6. 場所 (ステップ 1.1.4) から冷たいスライス液でいっぱいビーカーの一つで脳は 95% O25% CO2バブル。
  3. マウス視床下部のスライスを準備します。
    1. 必要な脳領域の脳をブロックし、角をカット (視床下部辺縁系の視交叉に吻側と尾側橋のブレードを使用する組織を切り落とすし、仙骨ブロックは脳の基底に平面の垂直を確保するなど)。
    2. フィルター ペーパーのカット部分を使用して、前面側から脳を拾う、瞬間接着剤を使用して固定プレートを後方側を接着します。
    3. すぐにスライスの室に保持プレートを置き、1.1.4 の手順で 2 つ目のビーカーからソリューションをスライスとチャンバーします。
    4. Vibratome のスライス商工会議所と氷のトレイを保護します。
    5. (前部と後部脳) のスライス領域を定義し、250 μ m 厚コロナ スライスをスライスを開始します。推奨パラメーター: 0.10 mm/s、振幅を高速化 2 mm。
    6. 必要な脳領域の適切なサイズにスライスをトリムします。
    7. 30-45 分の 35 ° C でスライスを回復します。地球温暖化のお風呂から回復室を削除回復追加 30 分常温で日の残りのための部屋の温度で保つスライス スライスを許可し、25% 95 %o で常にバブルバスに引き続き CO2.

3. 全体細胞のパッチ ClampRecording

  1. パッチ ピペットをプルします。
    1. ピペットの引き手のマニュアルから記録全体セルの推奨パラメーターを使用して、厚い壁に囲まれたガラスからパッチ ピペット ピペット抵抗 3 5 MΩ を引き出します。
    2. フィルタ リングの内部ソリューションと変らずの商業 (自家製)、塗りつぶしのピペット チップを使用してください。変らず、1 mL の注射器の先端を書き込むし、落ちる作成ヒントを許可するのには、長い罰金がヒントします。
  2. 全体セル構成を取得します。
    1. 電圧クランプ モードで現在スライスのオフセット ピペット上だけ記録ピペットを配置します。ピペットにわずかな肯定的な圧力を適用し、活栓をロックします。
    2. そのまま膜を健全なセルを選択し、ピペットで細胞にアプローチします。肯定的な圧力は、組織 (すなわち組織を入力するときに低速波) のわずかな障害を引き起こす必要があります。
    3. ゆっくりとピペットを形成する細胞の表面の小さなくぼみまで斜めのモーションを使用してセルに近いピペットをもたらし続けます。
    4. 陽圧ロックを解放します。セルは、シールを形成する開始され、1 GΩ 上抵抗が増加します。電圧クランプで-68 でセルを押しながら mV。
    5. 少し斜めに細胞から過剰な圧力を削除するセルから引き抜きます。
    6. 高速と低速のピペット容量を補正します。
    7. ピペット ホルダーのセルを突破し、全細胞構成を取得するに接続されている管を通して簡単な吸引を適用します。
    8. セルモードへの切り替えは、ウィンドウ電気生理学データ集録と解析ソフトウェア (例えば、Clampex) をテストします。
    9. 記録それぞれの電圧クランプ、前に同じソフトウェアを使用して膜テストを実行し、演習帳 (膜抵抗、アクセス抵抗と静電容量) に関連するパラメーターを記録します。
    10. 27 ~ 30 ° C で録音お風呂とその後の実験のため 1.5-2.0 mL/min で流量の温度を維持します。

4. 多様性実験

  1. 実験 1: 推定 4 ap の多重度
    1. 電圧クランプで-68 でセルを押しながら mV。同じソフトウェアを使用して、低 Ca2 +アプライドと一緒にお風呂を灌中に、sEPSCs を記録します。シナプスの活性は、膜の画期的な直後後高可能性があります安定基準記録を確保するため全体セル構成の開始後、少なくとも 5 分の記録。
    2. 4 AP をアプライド、マイクロ ピペットを使用して追加し、風呂は 30 μ M 4 参加レコード sEPSCs における薬物効果が得られる少なくとも 10 分を適用します。
    3. 4 AP とアプライドに 0.5 の TTX μ M と 10 μ M Cd2 +を追加し、少なくとも 10 分間 mEPSCs を記録します。
    4. オフライン解析、ベースライン (低 Ca2 +アプライド) で 4 AP、4 AP アプリケーションの 10 分、TTX アプリケーションの 10 日分の適用直前の最後の 1 分を使用します。
  2. 実験 2: desynchronize 小胞の放出 Sr2 +を使用して
    1. 通常 Ca2 + (風呂アプライドと同じ) アプライド レコード sEPSCs 少なくとも 5 分と一緒にお風呂を灌中。
    2. 通常の Ca2 +アプライドから切り替え、灌 Sr2 +アプライド (から手順 1.4) とレコードの sEPSCs を開始します。
    3. オフライン解析のための小胞同期の放出による大振幅 sEPSCs かどうかをベースライン (通常アプライド) で Sr2 +アプライド アプリケーションの 10分の最後の 1 分を比較します。
  3. 実験 3: 多胞性のリリースを使用してのテストΓ-武神
    1. 低 Ca2 +アプライド レコード sEPSCs 少なくとも 5 分。
    2. 灌流システムを介してアプライドに 30 μ M 4 AP を追加します。少なくとも 10 分のためのレコード sEPSCs。
    3. 4 AP とアプライドに 200 μ M γ-DGG を追加し、少なくとも 10 分間 sEPSCs を記録します。
    4. 別のセル制御実験の手順 1-3 が適用低濃度 (125 nM) γ 武神ではなく DNQX の。
    5. オフライン解析、各薬物のアプリケーションの最後の分を分析します。
  4. 実験 4: 活動電位発火の増加への求心性入力を刺激します。
    1. 通常 Ca2 +アプライドでレコード sEPSCs。
    2. 10 倍の 20 秒間バースト間隔の 2 s と繰り返しの 20 Hz のレートでアプライドでいっぱいモノポーラ ガラス電極を用いた求心性神経を刺激します。
    3. 分析のため基準として最初の刺激の前に 5,000 の ms を使用、最後の刺激後 10 300 ms と比較し、平均振幅と周波数変動以上 10 試験。

5. 分析

  1. SEPSCs と mEPSCs のプログラムを検出し、分析し、シナプス電流 (例えば、ミニ解析ソフトウェア) を使用して分析します。
    1. このソフトウェアを使用して、AMPA 受容体工 (または抑制電流を記録する場合の GABA 受容体工) を検出するため推奨される検出パラメーターを使用します。
    2. ノンストップの解析関数を使用して、録音に工を検出します。
    3. プログラムは正確に各イベントの検出を確実に各記録を手動でスキャン (例えば、イベントがされていないことを確認逃したまたは 2 回カウント)。
    4. クリップボードにコピーすることによってイベント データをエクスポートし、データ管理ソフトウェア (Excel など) に貼り付けること
    5. 平均周波数/振幅各薬物治療のための計算し、関連性の高い統計解析の実行します。

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Representative Results

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上記のプロトコルでは、例としてマウス視床下部ニューロンを用いたシナプスの多様性の度合いを調べる細胞パッチ クランプ電気生理学を使用する方法について説明します。このスライスの準備方法は、腫れ膜または核 (図 1) を持っていない健康な生菌を得られるはず。プロトコルの各ステップは組織や録音の質の健康のために重要です。

Figure 1
図 1: 次の正常および異常な組織スライスの準備。40 倍の倍率で差動干渉の対照の光学 [PVN の電気生理学の準備にスライスします。健康な細胞を示す赤い矢印と黒い矢印は、不健康な細胞を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

図 2は、パッチ クランプ電気生理学を用いたシナプスの多様性を識別するための理論的根拠を示しています。多様性シナプスはニューロン (図 2 a 左)、または特定のシナプス サイト (図 2 a ) で多リリースでペアの間いずれか複数のシナプス接触に起因できます。このような状況の両方で、シナプス前ニューロンの活動電位は、複数のシナプス イベントの時間加算による大きなシナプス応答 (sEPSC) を引き出すだろうと。ただし、シナプス前の活動電位の不在で (例えば存在 TTX と Cd2 + Na+をブロックする-依存と Ca2 +-依存の活動電位発火)、小胞神経伝達物質のリリースでは、非同期。その結果、シナプス応答が小さくなる (図 2 b: AP に依存しない)。2 つのニューロンは、多様性を示さない場合 (すなわち 1 つだけシナプスの接触/いいえ多リリースがある) の電位依存性および活動電位に依存しないリリース間シナプス応答に差がないこと神経伝達物質 (図 2)。

Figure 2
図 2:シナプス電流の異なるシナプス組織の結果を示す図。(A, B)多様性、活動電位とその後の Ca のシナプスでは、2 +流入は大きい、multiquantal 工は、複数のシナプス小胞の融合を同期をトリガーします。Multisynapse 接触または多胞性リリース (A) 単一シナプスのシナプスの多様性が発生します。TTX と Cd2 +の存在下で活動電位非依存の小胞の融合が非同期で、小さな uniquantal 工 (B) が発生します。(C) 多様性なくシナプス、両方活動電位依存性および非依存の小胞の融合の結果 uniquantal 工。この図は、私たちの以前のレポート6図 1 aから変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

実験 1 では 4 AP は活動電位発火確率をリリースしてバスに適用されます。その 4 AP は自発的な活動電位発火を増加するには、sEPSCs と mEPSCs (図 3 a, C) と工の周波数を比較できます。SEPSCs は両方活動電位依存性および非依存のイベントの組み合わせなので、sEPSC と mEPSC の頻度の違いは自発的な活動電位発火シナプス前の軸索でのプロキシとして機能します。電位依存的事象の十分な数の多様性の分析の存在を確実に mEPSC に sEPSC の周波数で > 15% 差のオフ任意のカットを使用します。低 Ca2 +の状態で TTX (mEPSC) 条件工周波数と振幅 (すなわちない自発的な活動電位発火低 Ca2 +の状態で)、低 Ca2 +基準 sEPSC と 4 の違いに類似している場合-Ap 通信は、多様性の分析の使用もできます。

例では、4 AP を図 3に示す結果は、sEPSCs の周波数と振幅を増加します。TTX と Cd2 +の後続のアプリケーションには、振幅と周波数の両方が減少します。前述のように、sEPSCs と mEPSCs の間の振幅の差はシナプスの多様性を示します。ここで調べた視床下部ニューロン、振幅基準と TTX 条件の頻度で (図 3D)、同じは、基準 sEPSCs に非常に少数の電位依存型工が含まれていることを示唆しています。したがって、その後の実験は、ベースラインと多様性を測定する 4 AP の違いを比較できます。

Figure 3
図 3:. 4 AP アプリケーションはシナプスの多様性を明らかにします。(A) サンプルのベースライン中、および後 4 AP (30 μ M) のアプリケーション、および後続の TTX 低 Ca2 +アプライドに記録された sEPSCs のトレース (0.5 μ M) と Cd2 + (10 μ M) アプリケーション。(B) (A) に示すように録音から sEPSC 振幅の分布。(CD)(C) 平均周波数の概要と基準 (グレー)、4 AP (赤) TTX の振幅 (D) + Cd2 + (青)。P < 0.005、* * P < 0.01。この図は、私たちの以前のレポート6図 2から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

上記推定シナプス シナプス後ニューロンに終了の平均の多様性: 多様性シナプスの小さな割合で発生した変更を検出可能性があります。それにもかかわらず、最近の研究では、このメソッドでは、通常間、慢性視床下部ニューロンのグルタミン酸シナプスの多様性の変化は、条件6を強調した明らかにしました。

Ca2 +と等モル Sr2 +アプライドの置換では、神経伝達物質の小胞19、20の電位依存型リリース反連動させます。このため、大振幅 sEPSCs、電位依存性同期小胞性伝達物質の放出 (すなわち、多重度) Sr と Ca2 +交換の合計2 +減らされます工の振幅。見られる図 4 Sr2 +アプライド大振幅イベント (図 4 b) の割合が減少し、結果として平均振幅 (図 4) を低下します。細胞が多様性を示さないとき小胞の放出をずらしてはありません EPSC の振幅に及ぼす影響。

Figure 4
大規模な multiquantal イベントを図 4: Sr2 +反連動させます。(A) 通常の Ca2 +アプライドと Sr2 +アプライドの代表的なトレース比較。Sr2 +アプライド小胞の放出を反連動させます、代表的な振幅分布 (B) と (C) のすべてのセルのための振幅の変化に見られるように multiquantal の同期イベントの振幅が減少 * P < 0.05。この図は、私たちの以前のレポート6図 3から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Γ-DGG、競争力のある AMPA 受容体の拮抗薬の高速分離は、多重度が多のリリースまたは複数のシナプス連絡先のためかどうかを決定する使用できます。多胞性のリリースは、シナプス後受容器の重なり人口の行為、大振幅工を含むシナプス間隙のグルタミン酸のプールします。言い換えれば、シナプス間隙のグルタミン酸濃度は uniquantal リリースに起因するよりも高いです。その一方で、海馬の連絡先は、各シナプス サイトで uniquantal 工をでしょう。大振幅工は、多胞性のリリースから生じる、γ-DGG 拮抗作用 (グルタミン酸濃度が高い) のために小さい振幅工 (図 5 a 、B ~ D) と比較して、大きい工が少ない損なわれます。大振幅工は同期 uniquantal 工 (multisynapse 連絡先) の総和により、γ-DGG を影響、すべて工 (図 5 a 左、E G) の振幅を同様に与えます。Γ-DGG、親和性の高いである DNQX と対照をなして遅い分離 AMPA/カイニン酸受容体拮抗薬はすべて大と小振幅工(図 5 Hで制服減少を引き起こすJ)。Γ-DGG や DNQX に感度を最大値 (最大 20 工の平均) で割った平均 EPSC の振幅の比として示すことができる EPSC 振幅(図 5 K、L)

Figure 5
図 5: γ-DGG を使って多リリースを調べる。(A) 回路図は多様性の 2 つのモデルを示します。左: シナプス後受容体の独立した個体群を対象とする uniquantal 伝送の時間の合計。大小工、シナプス間隙での同様のグルタミン酸濃度によって達成される、したがって γ-DGG に均等に敏感であります。右: multiquantal 伝送シナプス後受容器の重なり人口を対象とします。大工はより小さい sEPSCs 以上の溝にグルタミン酸濃度によって引き起こされる、したがって γ-DGG に敏感。モデルの下部に示されている値は、仮説の相対的な振幅です。(B) 試料を申請 4 AP 平均 sEPSC 振幅の増加があった記録からトレース (4 AP レスポンダー)。(C) (B) に示すように録音の EPSC 振幅の累積的なプロット。(D) 正規化された EPSC 振幅 (EPSC/EPSCMAX) (B) に示すように録音から γ-DGG の適用前後の累積的なプロット。(E) サンプル トレースがなかった次の平均 sEPSC 振幅変動 4 AP の記録からアプリケーション (4 AP ノン レスポンダー)。累積 EPSC (F) (E) に示すように記録の振幅です。(G) 累積 EPSC EPSC最大プロット (E) に示すように録音。(H) サンプルを録音と同様、ベースラインから 4 AP や DNQX アプリケーションからトレースします。() 累積 EPSC (H) に示すように記録の振幅です。(J) 累積 EPSC EPSC最大プロット (H) に示すように録音。(K) (4 AP レスポンダーおよびレスポンダー非グループ) の γ-DGG や DNQX アプリケーション後平均最大EPSC/EPSC の概要は、pre-γ-武神/DNQX (すなわちポスト-4-AP) に正規化します。ポスト 4 AP の (L) プロットは、ポスト-γ-武神/DNQX 平均 EPSC/EPSCMAX (ポスト 4 AP に正規化) に対して EPSC 振幅 (pre 4 AP に正規化) を意味します。P < 0.005。この図は、私たちの以前のレポート6図 4から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

シナプス伝達の強度は、シナプス活動のバーストによって一時的増加できます。多くの生理学的条件下での多様性を調べるためには、確率をリリースして活動電位発火の求心性刺激を使用できます。多様性が存在する場合、求心性刺激は EPSC 振幅 (図 6A-D) の簡単な増加を引き起こす必要があります。多様性が存在しない場合、活動電位発火の増加を駆動は EPSC の振幅を増加しません。

Figure 6
図 6: 高頻度刺激はシナプスの多様性を明らかにします。(A) サンプルは、求心性のシナプス刺激前後 sEPSCs のトレースします。(B) sEPSC 振幅シナプス刺激前後のプロット (20 Hz、2 s) (A) に示すように録音から。(CD)SEPSC 周波数 (C) とシナプスの刺激振幅 (D) 変更の概要。P < 0.001、* P < 0.05。この図は、私たちの以前のレポート6図 5から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

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成功したパッチ クランプ電気生理学実験のための重要な要件の 1 つが健康的なスライス/セルを取得します。ご説明されているプロトコルは、PVN ニューロンを含む視床下部のスライスに最適です。他の脳領域が必要があります変更・ スライス方法21,22,23,24。録音だけ膜抵抗などセルのプロパティを常に監視することにより安定した録音を受け入れることが重要です容量とアクセス抵抗。抵抗の増加する EPSC 振幅が低下し、したがって振幅測定を混同します。したがって、20 MΩ を超えると、録画中に 20% 以上増加するアクセス抵抗値を持つセルは破棄されます。同様の減少 (または低い) の膜抵抗は貧しい空間クランプにつながるし、したがって、振幅を減少させることができます。ターゲット システム (併せもつ PVN ニューロン) ニューロン 500 MΩ と 1 GΩ の高い膜抵抗、500 MΩ の下の膜抵抗と細胞を破棄します。品質管理カットオフの確立研究の下でニューロンの特定の種類。このプロトコルは、医薬品申請の前後に振幅の差に依存している薬物のアプリケーションのため、膜抵抗と抵抗の変化の振幅の変化であることを確認することが重要です。我々 はこのプロトコルにおける視床下部ニューロンは、サイズが小さい (セル容量はマウスで約 15 pF と膜抵抗は約 1 GΩ) と K グルコン酸ベース内部ソリューション作品も高品質工/Ips6,25 を入手するには.大きなセル サイズと低入力抵抗ニューロンのセシウムによる内部ソリューションは良い空間クランプ2を確保するため使用できます。

このメソッドを使用して多様性を測定する 1 つの特定の要件は、セルが mEPSCs に活動電位依存的事象を比較するために自発的な活動電位の十分な数を火です。これは、不在と TTX と Cd2 +の存在下で工の頻度の違いを比較することで確保できます。器官を含む視床下部のスライス、4 AP のアプリケーションが活動電位発火を引き出すために効果的なことがわかりました。夏と同僚2、によって開拓された別の方法では、高い Ca2 +アプライドを使用して、活動電位 4 AP ではなく、発射を増やします。一方、このメソッドは、海馬スライスで成功した、我々 わかった高 Ca2+ 4-AP 視床下部スライス6発射活動電位を促進する上でよりより少なく有効だった。確かに、高い、細胞外の Ca2 +濃度が+ Na コンダクタンス26,27を変えることによって本質的な興奮性ニューロンの軸索を減少させることが示されています。これは、なぜいくつかのスライスの高い Ca2 +アプライドに効果がない EPSC 周波数の増加を説明するかもしれない。

すべてスライス パッチ クランプ電気生理学に固有のものです、このメソッドの 1 つの制限はシナプス後ニューロンに投射する多く、長距離がスライスにカットされます。活動電位を観察するために、シナプス前の軸索と細胞体はスライスで保持する必要がある可能性が高いです。したがって、多様性の測定はスライス内で保持するシナプスの接続性に偏っています。同じラインに沿って、スライスの方向は切断28他が保持する投影法の特定の集団を引き起こす可能性があります。これらの制限は、求心性入力の多様性を過小評価しているの一般的な効果を持っています。

記述のプロトコルは、特定のニューロンに対するすべての入力間シナプスの多様性の度合いを推定する方法を提供します。ペア録音または単一の軸索の刺激が少ないなどの他の電気生理学技術は、特定の接続が複数の連絡先が、これらの実験はしばしば困難で、すべてのシステムで可能ではないかどうかを識別できます。さらに、彼らはニューロンの 1 つのペアを孤立させるだけで特定ニューロンへの入力のすべての組織の全体的な表示を与えることはできません。現在のプロトコルは、特定のニューロンに対するすべての入力の間で多様性の度合いを評価するのに基本的なパッチ ・ クランプの電気生理学の方法を使用します。

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Disclosures

著者がある何も開示するには

Acknowledgments

J. s. は、オンタリオ州の大学院の奨学金を受け取った。ウィスコンシン. は、精神的な健康の研究のカナダから新しい研究者フェローシップを受けた。この作品は、健康の研究 (PJT 148707) 自然科学と工学研究会のカナダ (06106-2015 RGPIN) およびカナダの研究所から W.I に運営費交付金によってサポートされます。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe BD 309659
10 blade Fisher Scientific/others 35698
22 blade VWR/others 21909-626
22 μM syringe filters Milipore 09-719-000
Adson foreceps Harvard Instruments 72-8547
Angled sharp scissors Harvard Instruments 72-8437
Clampex Molecular Devices pClamp 10
Double edge blade VWR 74-0002
Filter paper Sigma/others 1001090
Fine paintbrush Fisher/various 15-183-35/various
Gas Dispersion Tube VWR LG-8680-120
Isoflurane Fresenius Kabi/others M60303
Krazy glue various various
Mini analysis Synaptosoft MiniAnalysis 6
Osmomoter Wescor Inc Model 5600
Parafilm Sigma PM-996
Pasteur pipette VWR 14672-200
ph meter Mettler Toledo FE20-ATC
Rubber bulb VWR 82024-550
Scalpel handle No. 3 Harvard Instruments 72-8350
Scalpel handle No. 4 Harvard Instruments 72-8356
Single edge blade VWR 55411-050
Vibratome slicer Leica VT1200S
Water Purification System Millipore Milli-Q Academic A10
Well plate lid Fisher/various 07-201-590/various
Chemicals/reagents
4-AP Sigma 275875
BAPTA molecular probes B1204
CaCl2*2H2O Sigma C7902
CdCl2 sigma 202908
DNQX Tocris 189
EGTA Sigma E3889
glucose Sigma G5767
HEPES Sigma H3375
K2-ATP Sigma A8937
KCl Sigma P9333
K-gluconate Sigma G4500
MgCl2*6H2O Sigma M2670
Molecular biology grade water Sigma W4502-1L
Na3GTP Sigma G8877
NaCl Bioshop SOD001.1
Na-gluconate Sigma S2054
NaH2PO4 Sigma 71504
NaHCO3 Sigma S6014
Picrotoxin sigma P1675
SrCl Sigma 255521
sucrose Bioshop SUC507.1
TTX Alamone Labs T-550
yDGG Tocris 6729-55-1

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References

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全細胞パッチク電気生理学を用いたシナプスの多様性の評価
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Sunstrum, J. K., Inoue, W. Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology. J. Vis. Exp. (146), e59461, doi:10.3791/59461 (2019).More

Sunstrum, J. K., Inoue, W. Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology. J. Vis. Exp. (146), e59461, doi:10.3791/59461 (2019).

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