Un modèle avancé de murine pour la stéatohépatite non alcoolisée en association avec le diabète de type 2
Summary
On décrit un modèle d’animal de rongeur simple et fiable pour la stéatohépatite non alcoolisée (NASH), obtenu par le logement non-SPF des animaux et l’administration d’un régime spécifique riche en graisses. Nous décrivons l’identification des sous-ensembles de cellules immunitaires hépatiques et adipeuses pour récapituler les conditions immunologiques humaines en exposant les souris aux germes de l’environnement.
Abstract
L’obésité est associée à une inflammation chronique de bas grade et à une résistance à l’insuline, contribuant à une prévalence croissante des maladies métaboliques chroniques, telles que le diabète de type 2 et la stéatohépatite non alcoolisée (NASH). Des recherches récentes ont établi que les cellules immunitaires pro-inflammatoires infiltrent le tissu adipeux hypertrophique obèse et le foie. Compte tenu de l’importance émergente des cellules immunitaires dans le contexte de l’homéostasie métabolique, il est nécessaire de quantifier et de caractériser leur modification au cours du développement du diabète de type 2 et de la NASH. Cependant, les modèles animaux qui induisent des caractéristiques pathophysiologiques typiques de la NASH humaine sont clairsemés.
Dans cet article, nous fournissons un protocole détaillé pour identifier les sous-ensembles de cellules immunitaires isolés du foie et du tissu adipeux dans un modèle de souris fiable de NASH, établi par le logement des souris de régime riche en graisses (HFD) dans des conditions non-spécifiques sans agent pathogène (SPF) barrière pendant au moins sept semaines. Nous démontrons la manipulation des souris dans des conditions non-SPF, la digestion des tissus et l’identification des macrophages, des cellules tueuses naturelles (NK), des cellules dendritiques, des sous-ensembles de cellules B et T par cytométrie en flux. Des diagrammes de cytométrie de flux représentatifs de souris SPF HFD et de souris non-SPF sont fournis. Pour obtenir des données fiables et interprétables, l’utilisation d’anticorps, de méthodes précises et précises pour la digestion tissulaire et la bonne blocage dans les expériences de cytométrie en flux sont des éléments critiques.
L’intervention pour rétablir l’exposition à l’antigène physiologique chez les souris en les abritant dans des conditions non-SPF et une exposition non spécifique aux antigènes microbiens pourrait fournir un outil pertinent pour étudier le lien entre les altérations immunologiques, l’alimentation induite l’obésité et les complications liées à long terme.
Introduction
L’obésité est un trouble multifactoriel et un facteur de risque majeur pour le développement de maladies cardiaques, accident vasculaire cérébral, stéatohépatite non alcoolisée (NASH), diabète de type 2 (Diabetes) et certains types de cancer. La prévalence de l’obésité augmente rapidement à l’échelle mondiale. Aujourd’hui, 2,1 milliards personnes, soit près de 30% de la population mondiale, sont obèses ou en surpoids1. La résistance à l’insuline associée à l’obésité peut conduire à un diabète, lorsque les cellules bêta des îlots pancréatiques épuisés ne parviennent pas à compenser le besoin accru d’insuline pour maintenir l’homéostasie du glucose2.
Le tissu adipeux est composé de divers types de cellules, y compris les adipocytes, les cellules endothéliales, les fibroblastes et les cellules immunitaires. Pendant la progression de l’obésité, les changements dans le nombre et l’activité des cellules immunitaires peuvent conduire à une inflammation de bas grade du tissu adipeux hypertrophique3,4. Plus précisément, il a été constaté que la consommation excessive d’énergie, accompagnée de niveaux chroniquement élevés de glucose sanguin, de triglycérides et d’acides gras libres, conduit à l’hypoxie adipocytes, au stress du réticulum endoplasmique, à la fonction mitochondriale altérée et sécrétion de cytokine améliorée, entraînant l’activation de cellules immunitaires adipeuses pro-inflammatoires5,6. Les recherches passées ont principalement porté sur l’immunité innée, mais plus récemment, les cellules immunitaires adaptatives (cellules T et B) sont apparues comme des régulateurs importants de l’homéostasie du glucose. Ils possèdent des fonctions inflammatoires (y compris les cellules t+ 1 + t, les cellules r et B) ou principalement des tâches régulatrices (y compris les cellules t (Treg) régulatrices, les cellules de la cellule) et peuvent à la fois exacerber ou protéger contre la résistance à l’insuline7,8 , le 9.
En outre, plusieurs mécanismes ont été proposés pour expliquer comment l’obésité augmente la stéatohépatite, y compris une augmentation de la production de cytokines par le tissu adipeux10. La Nash, la forme progressive de la maladie du foie gras non alcoolisée et une lourde charge sanitaire dans les pays développés, est histologiquement caractérisée par des hépatocytes gonflé, l’accumulation de lipides, la fibrose et l’inflammation péricellulaire et peut progresser vers une cirrhose, une maladie hépatique de stade final ou un carcinome hépatocellulaire. Plusieurs régimes (par exemple le régime de méthionine et de choline déficient11) sont connus pour induire la pathologie hépatique de Nash-like dans des modèles animaux non-humains, mais la plupart de ces approches ne récapitulent pas les conditions humaines de la Nash et de son métabolisme conséquences, car elles nécessitent soit une élimination génique spécifique, des manipulations diététiques non physiologiques, soit un manque de résistance à l’insuline typique de la NASH humaine. En outre, notre compréhension des mécanismes sous-jacents des maladies métaboliques est actuellement basée sur des expériences réalisées avec des souris de laboratoire hébergées dans des conditions spécifiques à l’agent pathogène (SPF) standard. Ces installations barrières sont anormalement hygiéniques et ne considèrent pas la diversité microbienne que les humains doivent rencontrer, ce qui peut expliquer les difficultés du processus de traduction des études animales aux approches cliniques12,13 , le 14.
Pour étudier les différents sous-ensembles de cellules immunitaires dans le tissu adipeux et le foie pendant le développement de la résistance à l’insuline et de la NASH dans un modèle avancé de souris reproduisant des conditions immunologiques humaines, des souris ont été logées dans des cages individuelles en semi stérile conditions sans barrière. Les souris logées dans des conditions exposées à l’antigène ont développé une pathologie hépatique similaire à celle de NASH après 15 semaines d’alimentation en graisses (HFD)13. Comparativement aux souris fps appariées par âge, ils ont développé une stéatose macrovésiculaire, une infiltration hépatique et l’activation des cellules immunitaires.
Ce manuscrit décrit une analyse de cytométrie de flux robuste pour définir et compter les sous-ensembles de cellules immunitaires du tissu adipeux de souris et du foie dans un modèle de NASH. L’analyse de la cytométrie en flux permet la détection simultanée de plusieurs paramètres de cellules individuelles, contrairement aux approches RT-PCR ou immunohistochimie.
En résumé, notre étude offre un modèle de souris de HFD à court terme pour étudier le développement de la résistance à l’insuline et de la NASH et les mécanismes sous-jacents qui présente également la fidélité à la condition humaine.
Protocol
Representative Results
Discussion
La stéatohépatite a une forte association avec des anomalies métaboliques telles que l’obésité, la résistance à l’insuline et la dyslipidémie15. Plusieurs études indiquent que l’inflammation tissulaire adipeuse peut conduire la pathogenèse du diabète de type 2, y compris les niveaux altérés des cellules du système immunitaire inné et adaptatif4,5,16,17 </s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Anke Jurisch, Diana Woellner, Dr. Kathrin Witte et Cornelia Heckmann pour leur aide aux procédures expérimentales et Benjamin tiburzy de biolegend pour des commentaires utiles sur la stratégie de blocage. J.S. a été soutenue par la bourse Helmholtz (ICEMED). Cette étude a été soutenue par des subventions de l’unité de recherche clinique de l’Institut de santé de Berlin (BIH), le «BCRT-Grant» par le ministère fédéral allemand de l’éducation et de la recherche et la Fondation Einstein. KS-B. et H.-D.V. sont financés par FOR2165.
Materials
| 100µm cell strainers | Falcon | 352340 | |
| 1ml syringe | BD | 309659 | |
| 26G x 5/8 needles | BD | 305115 | |
| 35mm Petri Dishes | Falcon | 353001 | |
| 40µm cell strainers | Falcon | 352340 | |
| ACK lysis buffer | GIBCO | A1049201 | |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103127 | AB_493714 (BioLegend Cat. No. 103127) |
| Analysis software | FlowJo 10.0.8 software | ||
| APC anti-mouse CD11c Antibody | Biolegend | 117309 | AB_313778 (BioLegend Cat. No. 117309) |
| APC anti-mouse KLRG1 (MAFA) Antibody | Biolegend | 138411 | AB_10645509 (BioLegend Cat. No. 138411) |
| BV421 anti-mouse CD127 Antibody | Biolegend | 135023 | AB_10897948 (BioLegend Cat. No. 135023) |
| BV421 anti-mouse F4/80 Antibody | Biolegend | 123131 | AB_10901171 (BioLegend Cat. No. 123131) |
| BV605 anti-mouse CD279 (PD-1) Antibody | Biolegend | 135219 | AB_11125371 (BioLegend Cat. No. 135219) |
| BV605 anti-mouse NK-1.1 Antibody | Biolegend | 108739 | AB_2562273 (BioLegend Cat. No. 108739) |
| BV650 anti-mouse/human CD11b Antibody | Biolegend | 101239 | AB_11125575 (BioLegend Cat. No. 101239) |
| BV711 anti-mouse/human B220 Antibody | Biolegend | 103255 | AB_2563491 (BioLegend Cat. No. 103255) |
| BV785 anti-mouse CD8a Antibody | Biolegend | 100749 | AB_11218801 (BioLegend Cat. No. 100749) |
| C57Bl/6J mice, male, 5 weeks old | Forschungseinrichtungen für experimentelle Medizin (FEM) | ||
| CaCl2 | Charité – Universitätsmedizin Berlin | A119.1 | |
| Collagenase NB 4G Proved Grade | SERVA | 11427513 | |
| Collagenase Typ I | Worthington | LS004197 | |
| Conical centrifuge tube 15ml | Falcon | 352096 | |
| Conical centrifuge tube 50ml | Falcon | 352070 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | 4716728001 | |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S0115 | |
| Filter 30µm | Celltrics | 400422316 | |
| FITC anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100203 | AB_312660 (BioLegend Cat. No. 100203) |
| Flow cytometry | BD-LSR Fortessa | ||
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | |
| HBSS | Bioanalytic GmBH | 085021-0500 | |
| High-fat diet | SSNIF | E15741–34 | 60 kJ% from fat, 19 kJ% from proteins, and 21 kJ% from carbohydrates |
| micro dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146 | used for dissection purposes |
| PE anti-mouse CD25 Antibody | Biolegend | 101903 | AB_312846 (BioLegend Cat. No. 101903) |
| PE/Cy7 anti-mouse CD62L Antibody | Biolegend | 104417 | AB_313102 (BioLegend Cat. No. 104417) |
| PE/Cy7 anti-mouse I-A/I-E (MHCII) Antibody | Biolegend | 107629 | AB_2290801 (BioLegend Cat. No. 107629) |
| PE/Dazzle 594 anti-mouse CD4 Antibody | Biolegend | 100565 | AB_2563684 (BioLegend Cat. No. 100565) |
| Percoll solution | Biochrom | L6115 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD44 Antibody | Biolegend | 103031 | AB_2076206 (BioLegend Cat. No. 103031) |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse Gr-1 Antibody | Biolegend | 108427 | AB_893561 (BioLegend Cat. No. 108427) |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 12559069 | |
| Round-Bottom Tubes with cell strainer cap | STEMCELL Technologies | 38030 | |
| TruStain fcX anti-mouse CD16/32 | Biolegend | 101301 | AB_312800 (BioLegend Cat. No. 101301) |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend | 423105 | viablity stain |
References
- Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: A systematic review and meta-analysis. BMC Public Health. 9, 88 (2009).
- Prentki, M. Islet β cell failure in type. J Clin Invest. 116 (7), 1802-1812 (2006).
- Shoelson, S. E., Lee, J., Goldfine, A. B. Inflammation and insulin resistance. Journal of Clinical Investigation. 116 (7), 1793-1801 (2006).
- Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444, 840 (2006).
- Exley, M. A., Hand, L., O’Shea, D., Lynch, L. Interplay between the immune system and adipose tissue in obesity. Journal of Endocrinology. 223 (2), R41-R48 (2014).
- Ferrante, A. W. Macrophages, fat, and the emergence of immunometabolism. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 4992-4993 (2013).
- Winer, D. A., et al. B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies. Nature Medicine. 17, 610 (2011).
- Onodera, T., et al. Adipose tissue macrophages induce PPARγ-high FOXP3(+) regulatory T cells. Scientific Reports. 5, (2015).
- Lackey, D. E., Olefsky, J. M. Regulation of metabolism by the innate immune system. Nature Reviews Endocrinology. 12, 15 (2015).
- Calle, E. E., Kaaks, R. Overweight, obesity and cancer: epidemiological evidence and proposed mechanisms. Nature Reviews Cancer. 4, 579 (2004).
- Ibrahim, S. H., Hirsova, P., Malhi, H., Gores, G. J. Animal Models of Nonalcoholic Steatohepatitis: Eat, Delete, and Inflame. Digestive Diseases and Sciences. 61 (5), 1325-1336 (2016).
- Beura, L. K., et al. Recapitulating adult human immune traits in laboratory mice by normalizing environment. Nature. 532 (7600), 512-516 (2016).
- Sbierski-Kind, J., et al. Distinct Housing Conditions Reveal a Major Impact of Adaptive Immunity on the Course of Obesity-Induced Type 2 Diabetes. Frontiers in Immunology. 9 (1069), (2018).
- Japp, A. S., et al. Wild immunology assessed by multidimensional mass cytometry. Cytometry Part A. 91 (1), 85-95 (2017).
- Benedict, M., Zhang, X. Non-alcoholic fatty liver disease: An expanded review. World Journal of Hepatology. 9 (16), 715-732 (2017).
- McNelis, J. C., Olefsky, J. M. Macrophages, Immunity, and Metabolic Disease. Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).
- Ferrante, A. W. The Immune Cells in Adipose Tissue. Diabetes, Obesity & Metabolism. 15, 34-38 (2013).
- Bertola, A., et al. Hepatic expression patterns of inflammatory and immune response genes associated with obesity and NASH in morbidly obese patients. PloS One. 5 (10), e13577 (2010).
- Turnbaugh, P. J., Bäckhed, F., Fulton, L., Gordon, J. I. Diet-Induced Obesity Is Linked to Marked but Reversible Alterations in the Mouse Distal Gut Microbiome. Cell Host & Microbe. 3 (4), 213-223 (2008).
- Singh, R. K., et al. Influence of diet on the gut microbiome and implications for human health. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 73 (2017).
- Müller, V. M., et al. Gut barrier impairment by high-fat diet in mice depends on housing conditions. Molecular Nutrition & Food Research. 60 (4), 897-908 (2016).
