Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Imaging Integrin spänningar och cellulära kraft på Submicron upplösning med en integrativ spänningar sensorn

Published: April 25, 2019 doi: 10.3791/59476
Automatic Translation
1, 1, 2
1Department of Physics and Astronomy, Iowa State University, 2Department of Physics and Astronomy, Molecular, Cellular, and Developmental Biology Interdepartmental Program, Iowa State University

Summary

Integrin spänning spelar viktiga roller i olika cellfunktioner. Med en integrativ spänning sensor, är integrin spänning kalibrerad med picoNewton (pN) känslighet och avbildas på submicron upplösning.

Abstract

Molekylär spänning överförs av integrin-ligand obligationer är grundläggande mekaniska signalen i integrin väg som spelar viktiga roller i många cellfunktioner och beteenden. För att kalibrera och bild integrin spänning med hög kraft känslighet och rumslig upplösning, utvecklade vi en integrativ spänningar sensorn (ITS), en DNA-baserad fluorescerande spänningar sensorn. ITS aktiveras så för att fluorescera om upprätthålla en molekylär spänning, således konvertera kraft till fluorescerande signal på molekylär nivå. Spänning tröskelvärdet för ITS aktiveringen är avstämbara i intervallet 10 – 60 pN som väl täcker det dynamiska omfånget av integrin spänningen i cellerna. På ett substrat som ympats med en ITS, är integrin spänningen av vidhäftande celler visualiseras av fluorescens och avbildas på submicron upplösning. ITS är också kompatibel med cell strukturella imaging i både live och fasta celler. ITS har tillämpats framgångsrikt till studien av trombocyter kontraktion och cellmigration. Detta papper specificerar förfarandet för syntes och tillämpningen av ITS i studien av integrin överförbara cellular kraft.

Introduction

Celler är beroende av integriner till följa och utöva cellulära styrkor till extracellulärmatrix. Integrin-medierad cell adhesion och kraft överföring är avgörande för cell spridning1,2, migration3,4och överlevnad5,6,7. På lång sikt influenser integrin biomekaniska signalering också cell spridning8,9,10 och differentiering11,12. Forskare har utvecklat olika metoder för att mäta och karta integrin överförbara cellular styrkor på cell-matrix gränssnittet. Dessa metoder bygger på elastisk underskikt13, array micropost14, eller atomic force microscopy (AFM)15,16. Elastiska underlaget och micropost metoder är beroende av deformationen av substrat att rapportera cellulär stress och har begränsningar när det gäller rumslig upplösning och tvinga känslighet. AFM har hög kraft känslighet, men den kan inte upptäcka kraft på flera ställen samtidigt, vilket gör det svårt att kartlägga cellulära kraft överförs av integriner.

Under de senaste åren utvecklades flera tekniker för att studera cellulära kraft på molekylär nivå. En samling av molekylär spänning sensorer baserat på polyetylenglykol17,18, spider silk peptid19och DNA20,21,22,23 utvecklades till visualisera och övervaka spänningar överförs av molekylära proteiner. Bland dessa tekniker antogs först DNA som syntes materialet i spänningen spårvidd tjuder (TGT), en rupturable länkare som modulerar den övre gränsen för integrin spänningar i levande celler22,24. Senare, kombinerades DNA och fluorescens resonans överföra teknik för att skapa hårnål DNA-baserade fluorescerande spänning sensorer först av Chens grupp23 och Salaitas grupp20. Hårnål DNA-baserade spänningar sensorn rapporterar integrin spänningen i realtid och har tillämpats framgångsrikt till studien av en rad cellulära funktioner21. Efteråt, kombinerat Wang's lab en TGT med fluorophore-törstsläckare paret till rapporten integrin spänning. Denna sensor heter en ITS25,26. ITS är baserad på dubbelsträngat DNA (dsDNA) och har ett bredare dynamiskt omfång (10-60 pN) för integrin spänning kalibrering. I motsats till hårnål DNA-baserade sensorer, ITS redovisar inte cellular kraft i realtid men registrerar alla historiska integrin händelser som fotavtryck av cellulära kraft; Denna signal ackumulationsprocessen förbättrar känsligheten för cellulära kraft imaging, gör det möjligt att bilden cellular kraft även med low-end fluorescens Mikroskop. Syntesen av ITS är relativt mer praktiskt eftersom det är skapat av korsa två enkelsträngade DNAs (ssDNA).

ITS är en 18-base-parat dsDNA konjugerat med biotin, en fluorophore, en törstsläckare (svart hål törstsläckare 2 [BHQ2])27och en cyklisk arginylglycylaspartic syra (RGD) peptid28 som ett integrin peptid ligand (figur 1). Den nedersta delen är konjugerat med fluorophore (Cy3 används i detta manuskript, medan andra färgämnen, såsom Cy5 eller Alexa-serien, har också visat genomförbart i vårt labb) och biotin taggen, som ITS är orörlig på ett substrat av biotin-metoden bond. Den övre delen är konjugerat med RGD peptiden och det svarta hålet törstsläckare, som släcker Cy3 med cirka 98% släcka effektivitet26,27. Med protokollet presenteras i denna uppsats, är beläggning tätheten av ITS på ett substrat runt 1100/µm2. Detta är den täthet som vi tidigare kalibrerade för 18 bp biotinylerade dsDNA belagd på neutrAvidin-functionalized substratet genom att följa samma beläggning protokoll29. När celler följer underlaget belagd med ITS, integrin binder ITS genom RGD och överför spänning till ITS. ITS har en viss spänning tolerans (Ttol) som definieras som tröskeln spänning som mekaniskt skiljer dsDNA av ITS inom 2 s22. DESS bristning av integrin spänning leder till avskiljandet av törstsläckare från färgämnet som därefter avger fluorescens. Som ett resultat, osynliga integrin spänningen omvandlas till en fluorescens signal och den cellulära kraften kan mappas av fluorescens imaging.

För att demonstrera tillämpning av ITS, använder vi fisk keratocyte här, en allmänt använd cell modell för cell migration studie30,31,32, CHO-K1 cell, vanliga nonmotile cellinje och NIH 3T3 fibroblast. Coimaging av integrin spänning och cellen strukturer bedrivs också.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC, 8-16-8333-jag) från Iowa State University.

1. Sammanfattning av integrativ spänningar sensorn

  1. Anpassa och beställa ssDNAs (se Tabell för material).
    Obs: SsDNA sekvenser är följande. Den övre strand är /5ThioMC6-D/GGG AGG ACG CAG CGG GCC/3BHQ_2 /. De nedersta delarna är följande.
    12 pN ITS: GGC CCG CTG CGT CCT CCC /3Bio//5Cy3 /
    23 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG CTG CGT CC /iBiodT/ CCC
    33 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG CTG CG/iBiodT/CCT CCC
    43 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG C/iBiodT/G CGT CCT CCC
    54 pN ITS: /5Biosg / / iCy3/GGC CCG CTG CGT CCT CCC
    Här, /5ThioMC6-D / representerar en tiol modifierare C6 S-S (disulfid) i 5' slutet. /3BHQ_2/ representerar ett svart hål törstsläckare 2 i 3' slutet. / 3Bio / / 5Biosg/och /iBiodT/ är biotinylation i slutet 3', 5' slutet, och på tymin inre DNA, respektive. /iCy3/ representerar en Cy3 infogas ssDNA inre ryggrad. Dessa koder används av särskilda kommersiella leverantören används här och kan vara annorlunda i andra DNA-företag.
  2. Konjugat RGD peptid till SH-ssDNA-törstsläckare.
    Obs: De reagens som används är fosfatbuffrad saltlösning (PBS), sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyklohexan-1-bildas (sulfo-SMCC), RGD peptid och tris-(2-carboxyethyl) fosfin hydroklorid, även känd som TCEP-HCl.
    1. Deprotect thiol modifieraren på övre strand DNA använder TCEP lösning.
      Obs: Thiol-modifierade DNAs beställde från en kommersiell källa levereras i oxiderad form, med svavel atomerna skyddas av en disulfide bond som behöver minskas före RGD-DNA konjugation. TCEP är en luktfri minskning reagens som används för den thiol deprotection.
      1. Lös 14,3 mg TCEP-HCl i 300 µL av vatten. Justera pH av TCEP lösningen på ~7.2–7.4 med 1 M NaOH-lösning (cirka 150 µL), använda pH-test papper. Lägg till rent vatten för att göra en slutlig volym om 0,5 mL. Slutliga TCEP koncentration är 100 mM.
        Obs: Det rekommenderas att göra TCEP lösning färska varje gång för DNA thiol deprotection. Undvik att lagra TCEP lösning för en lång tid.
      2. Tillsätt 100 µL 0,5 M etylendiamintetraättiksyra (EDTA) lösning och 400 µL vatten att TCEP lösningen.
      3. Tillsätt 10 µL av TCEP + EDTA-lösningen till 20 µL av 1 mM thiol-DNA-BHQ2 i PBS. Låt lösningen reagera i 30 min i rumstemperatur.
        Obs: Disulfide band av 5' thiol modifierare C6 S-S konjugation på denna ssDNA kommer vara klyvs av TCEP, lämnar gruppen thiol redo för reaktion med maleimide i nästa steg. TCEP stör inte följande thiol-maleimide reaktion; Det är således inte nödvändigt att passiverande TCEP efter detta steg.
    2. Konjugat RGD-NH2 med sulfo-SMCC.
      1. Lös 5 mg av RGD-NH2 i 100 µL av PBS att erhålla 11 mM RGD-NH2.
      2. Tillsätt 200 µL rent vatten i röret med 2 mg sulfo-SMCC (föruppmätt leverantören). Krossa sulfo-SMCC fast med en pipettspetsen och kraftfullt Pipettera samtidigt att underlätta upplösning av SMCC i vattnet. Koncentrationen av sulfo-SMCC kommer att vara 23 mM.
        Obs: Eftersom NHS ester i sulfo-SMCC är föremål för hydrolys och har en livslängd på några minuter, detta Proteinupplösande steg bör slutföras inom 1 min att undvika överdriven förlust av NHS ester på grund av hydrolys. Använd rent vatten för att upplösa sulfo-SMCC eftersom dess löslighet i PBS eller andra buffertar är dålig.
      3. Tillsätt 40 µL sulfo-SMCC lösning i 100 µL RGD-NH2 lösningen och inkubera det i 20 min.
        Obs: NHS ester i sulfo-SMCC reagerar med gruppen amine i RGD-NH2, bildar en amid bond som länkar RGD och sulfo-SMCC.
    3. Konjugat RGD-SMCC med den SH-ssDNA-törstsläckare.
      1. Blanda de lösningar som förberett i steg 1.2.1 och 1.2.2 och inkubera blandningen för 1 h i rumstemperatur. Flytta lösningen till ett kylskåp vid 4 ° C och låt den ytterligare reagera över natten. Den thiol konjugerat på övre strand DNA reagerar med maleimide på sulfo-SMCC, bildar en thioether grupp som länkar RGD med övre delen DNA.
    4. Utföra etanol nederbörd för att rena RGD-ssDNA-törstsläckare från oreagerad sulfo-SMCC, RGD och TCEP.
      1. Chill 10 mL 100% etanol i en 15 mL koniska rör i frys-20 ° C i minst 30 min.
      2. Blanda en 3 M NaCl-lösning, DNA lösning och kylda etanol i volymförhållandet 1:10:25. Hålla den blanda vätskan i frys-20 ° C i 30 min eller tills DNA fälls ut.
      3. Centrifugera vätskan vid 10 000 x g i 30 min. Tag bort supernatanten.
      4. Lägga till PBS DNA pelleten. Mätning av DNA koncentrationen med en spektrometer.
    5. (Valfritt) Utföra DNA elektrofores för att få en högre RGD-ssDNA renhet.
      Obs: Med ovanstående protokoll, ca 70 – 90 procent av ssDNA kommer vara konjugerat med RGD. Om högre renhet önskas, kan DNA elektrofores också utföras för att separera konjugerade DNA från okonjugerat DNA.
      1. Montera ihop en vertikal elektrofores-systemet.
      2. Bered en 10% Polyakrylamidgelen genom att blanda 50 mL av rent vatten, 20 mL 40% akrylamid gel, 8 mL 10 x tris-Borat-EDTA (TBE) buffert och 800 µL 10% ammonium persulfatoxidation (APS).
      3. Tillsätt 80 µL av tetramethylethylenediamine (TEMED) till gellösningen. Häll över lösningen i glas kammare elektrofores systemet. Infoga en enda-bra kam för att skapa en väl ovanpå gelen. Vänta i 10 min tills gelen är tvärbunden.
      4. Blanda DNA lösningen med 100% glycerol i volymförhållandet 1:1. Ta bort kammen och ladda DNA lösningen till gelen väl.
      5. Kör gelen vid en spänning på 200 V. Observera två DNA band där släpar en är konjugerade DNA.
      6. Avskurna gel bandet med konjugerade DNA och tärna den i små bitar.
      7. Samla de tärnade gel i två 1,5 mL centrifugrör med filter. Tillsätt 500 µL av PBS till varje rör.
      8. Sätta den PBS-indränkt gel i en mörk plats vid rumstemperatur för 1 dag. DNA kommer diffunderar ut ur gel bitarna in PBS.
      9. Samla DNA lösningen genom centrifugering rören vid 1 000 x g i 2 min.
      10. Utföra ytterligare en runda av etanol nederbörd (steg 1.2.4) att samla in DNA.
  3. Syntetisera ITS av korsa RGD-ssDNA-törstsläckare och dye-ssDNA-biotin.
    1. Blanda lösningarna av den övre delen och den lägre strand DNAs på en molar förhållandet av 1.1:1. Hålla blandningen vid 4 ° C över natten för att producera ITS genom DNA hybridisering.
      Obs: En molar förhållandet av 1.1:1 för DNA hybridisering används istället för 1:1. Överdriven RGD-ssDNA-törstsläckare används för att säkerställa att alla dye-ssDNA-biotin kommer hybridisera med RGD-ssDNA-törstsläckare. RGD-ssDNA-törstsläckare utan hybridisering kommer tvättas bort under ytbeläggning, som inte påverkar dess ytbeläggning kvaliteten.
    2. Delprov och store ITS lösningen vid-20 ° C för långtidslagring.
      Obs: Lagring bufferten är PBS och lagring koncentrationen bör generellt vara över 10 µM. För regelbunden användning, kan dess lösning förvaras vid 4 ° C för ett par veckor utan märkbar kvalitetsförsämring.

2. upprättande av dess ytor genom att immobilisera ITS på glasbotten petriskålar

Obs: De reagens som används är biotinylerade bovint serumalbumin (BSA-biotin), avidinen protein och ITS. Chill alla reagenser och PBS-bufferten till omkring 0 ° C på is med en ishink.

  1. Ladda 200 µL 0,1 mg/mL BSA-biotin i PBS på brunnen av en glasbotten petriskål (29 mm i diameter, med en 14 mm väl). Inkubera det i 30 minuter vid 4 ° C i kylskåp. BSA-biotin är fysiskt adsorberat på glasytan.
  2. Suga ut lösningen från den väl med pipett och tillsätt 200 µL av PBS tillbaka till brunnen för att tvätta ytan. Upprepa detta 3 x för att slutföra tvätt.
  3. Inkubera 200 µL av 50 µg/mL avidinen protein i brunnen under 30 minuter vid 4 ° C. Tvätta det 3 x med PBS. Efter detta steg, det avidinen proteinet binder till den BSA-biotin och blir orörlig på glasytan.
  4. Inkubera 200 µL 0,1 µM ITS i brunnen under 30 minuter vid 4 ° C. Tvätta skålen med 3 x med PBS. Lämna PBS i brunnen tills cellen plätering. Efter detta steg, ITS med taggen biotin binder till proteinet avidinen och blir orörlig på ytan.
    Obs: En försiktighetsåtgärd kritiska för dess beläggning kvalitet och homogenitet under ITS immobilisering är att aldrig låta petriskål ytan torka upp. Hålla alla reagenser och PBS på 4 ° C eller runt 0 ° C på is med en ishink hjälper till att minska vatten avdunstning under tvätt stegen, när PBS dras från brunnen.

3. cell plätering på dess ytor

  1. Kultur fisk keratocyter.
    Obs: Guldfisk (Carassius auratus) används här som ett exempel, men andra fiskarter kan också fungera.
    1. Plocka en bit fisk skala från en fisk med en platt-tip pincett. Tryck försiktigt på skalan på brunnen av en glasbotten petriskål, med den inre sidan av skalan att kontakta glaset. Vänta ~ 30 s för fisk skala att följa väl glasytan på skålen.
    2. Tillsätt 1 mL Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) komplett medium för att fullt ut täcka fisken skalan. Förvara petriskål i en mörk och fuktig kartong för 6 – 48 h i rumstemperatur.
      Obs: IMDM komplett medium innehåller 79% IMDM + 20% fetalt bovint serum (FBS) + 1% penicillin. Det behövs ingen extra tillförsel av syre eller CO2 . Några mjukpapper rullar indränkt med vatten kan lämnas i rutan att upprätthålla hög luftfuktighet i rutan. Fisk keratocyter kommer att migrera ur fisk skalan som ett ark av celler efter några timmar. Detta kan observeras med en vävnadskultur Mikroskop. Cellerna är generellt lönsamt på 48 h.
  2. Lossa och tallrik keratocyter cellerna på ITS ytor.
    1. Ta bort mediet från petriskål där fisk skalan var odlade. Tvätta väl 1 x med cell du lossar lösning och lägga till demontering lösning för att täcka fisken skalan och inkubera i 3 min.
      Obs: Receptet för den cell som du lossar EDTA-lösning är följande: 100 mL 10 x Hanks balanserad Salt lösning (HBSS) + 10 mL 1 M HEPES (pH 7,6) + 10 mL av 7,5% natrium bikarbonat + 2,4 mL 500 mM EDTA + 1 L H2O. PH-värdet justeras till 7,4.
    2. Suga ut alla cell du lossar lösning och tillsätt IMDM komplett medium. Skingra keratocyter av mild pipettering. Justera cell lösningens densitet till önskad nivå (1 x 104– 1 x 105/ml). Platta celler på ITS ytan (beredd enligt avsnitt 2). Inkubera cellerna i rumstemperatur i 30 min innan imaging.
      Obs: Cell räknar kan göras med en hemocytometer efter demontering cellerna med demontering lösning. Cellen plätering densitet är relativt låg så att keratocyter har gott om yta att migrera.
  3. Plattan CHO-K1 och NIH 3T3 celler på dess ytor.
    Obs: Medium för CHO-K1 celler är 89% Hams F12 + 10% FBS + 1% penicillin. Mediet för NIH 3T3-celler är 89% Dulbeccos modifierade örnens medium (DMEM) + 10% kalv bovint serum (CBS) + 1% penicillin. Kultur är 37 ° C och 5% CO2.
    1. Kultur CHO-K1 celler eller NIH 3T3-celler till 80 – 100% sammanflödet i en petriskål (eller kultur kolv).
    2. Värma den cell som du lossar lösning och odlingsmedium till 37 ° C.
    3. Ta bort alla odlingsmedium i petriskål med en pipett. Tvätta cellerna 1 x med cell du lossar lösning. Täcka cellerna med demontering lösning och inkubera det vid 37 ° C i 10 min.
    4. Skingra cellerna genom pipettering. Samla den cell lösningen och centrifugera det 300 x g i 3 min.
    5. Suga ut supernatanten och lägga komplett medium eller serumfritt medium.
    6. Justera cell lösningens densitet till önskad nivå (1 x 105 – 1 x 106/ml). Platta celler på ITS ytor (beredd enligt avsnitt 2). Inkubera cellerna vid 37 ° C i 1 – 2 h innan imaging, eller 30 min innan videoinspelning.

4. imaging, videoinspelning och realtid integrin spänning kartläggning

  1. Quasi-Real-Time avbildning av integrin spänningar i levande celler
    1. Inkubera keratocyter på dess ytor (beredd enligt avsnitt 2) under 30 minuter vid rumstemperatur, eller ruva CHO-K1 celler eller NIH 3T3-celler för 1 h på dess ytor i en inkubator vid 37 ° C.
    2. Montera petriskål på en fluorescens Mikroskop scenen. Utföra cellular kraft imaging med en exponeringstid på 1 s. Förstoringen är 40 x eller 100 x.
    3. Ta en video av dess bilder med en ram intervall på 20 s för keratocyter eller 1 – 2 min för CHO-K1 celler eller NIH 3T3-celler.
    4. Använda MATLAB eller en annan bild-analysverktyget för att subtrahera en föregående bildruta av ITS videon från en aktuell bildruta att beräkna ITS signalen nyproducerade i intervallet senaste ram. Nyproducerade ITS signalen representerar integrin spänningen genereras i senaste ram intervall, därmed rapportering den cellulära kraften på ett quasi-real-time sätt.
  2. Coimaging av integrin spänning och cellstruktur i immunostained celler
    1. Efter steg 3.2.2 eller 3.3.6, utföra immunfärgning för att markera målet strukturella proteiner.
      Obs: Använd olika färgämnen för att undvika fluorescens överhörning mellan integrin spänning imaging och cell strukturella imaging. I detta manuskript, Cy5 fluorophore användes för phalloidin och Alexa 488 användes för vinculin färgning. Koncentrationen av både primära och sekundära antikroppar är 2,5 µg/mL. Koncentrationen för phalloidin är 1,5 enheter/µL.
    2. Utföra multifluorescent kanal imaging att förvärva både integrin spänning karta och cell strukturella imaging.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Med ITS tillfångatogs integrin spänning karta över fisk keratocyter. Det visar att en keratocyte migrerar och genererar integrin spänning på två kraft spår (figur 2A). Resolution av kraft karta var kalibrerade för att vara 0,4 µm (figur 2B). Hög integrin spänning koncentrerar sig på den bakre marginalen (figur 3A). ITS visar också olika specifika mönster i olika celler. En nonmotile cell, NIH-3T3, bildar en spänning mönster specifika integrin (figur 3B) ganska annorlunda än den snabbt migrera keratocyte.

Med immunfärgning coimaged fokal sammanväxningar och integrin spänningen av fisk keratocyter var (figur 4A). Relationen mellan integrin spänningar och cellstruktur i keratocyter studerades i detalj av Wang et al.25. Integrin spänningar och stress fibrer CHO-K1 celler var också coimaged (figur 4B). Dessa experiment visar att ITS möjliggör coimaging cell adhesion kraft och cellstrukturer samtidigt under liknande imaging inställningar, därigenom underlätta studiet av cell struktur/kraft samspelet.

Figure 1
Figur 1: scheman över den dess. ITS är en dsDNA dekorerad med en RGD-ligand, en fluorescens törstsläckare, ett färgämne och en biotin tagg. Färgämnet (grön-fylld cirkel) är kylda av törstsläckare. Under integrin spänning, dsDNA är spruckna och Cy3 är befriad från Snabbkylning och avger fluorescens som kan upptäckas med hjälp av fluorescerande mikroskopi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Integrin spänning karta över en fisk keratocyte och submicron resolution av ITS. (A) vid snabb migrering, genererar en keratocyte konsekvent ett integrin spänning karta i två kraft spår. (B), avståndet mellan två kraft spår är vanligtvis 40 µm. Den rumsliga upplösningen i den cellulära kraft karta fotograferad av ITS är runt 0,4 µm. Den linjära profilen av Cy3 fluorescerande intensiteten i området präglas av en kort röd linje i den nedersta vänstra panelen beräknas för kalibrering av upplösningen i cellulära kraft imaging. Resultatet visas i den nedersta högra panelen och försedda med en Gaussisk kurva. Skalstapeln = 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: realtid integrin spänning karta över en fisk keratocyte och NIH-3T3. (A) A fisk keratocyte och dess integrin spänning karta. (Övre vänstra) En motila fisk keratocyte. (Nedre vänstra) Integrin spänning karta över den keratocyte som rapporterats av ITS. (Övre högra) Realtid integrin spänning erhölls genom ram subtraktion. Det visar att den nyligen genererade integrin spänningen är colocalized med cell bakre kant. (Undre högra) Integrin spänning karta (grön) och realtid integrin spänning (magenta) presenteras i en sammanslagen siffra. Skalstapeln = 10 µm. (B) en NIH-3T3 fibroblast och dess integrin spänning karta. (Övre vänstra) En NIH-3T3 fibroblast. (Nedre vänstra) Integrin spänning karta över den NIH-3T3 fibroblast. Integrin spänning genererades i ett randmönster. (Övre högra) Realtid integrin spänning visar att nyligen genererade integrin spänningen främst bildar på cell perifera regionen. (Undre högra) Integrin spänning karta (grön) och realtid integrin spänning (magenta) presenteras i en sammanslagen siffra. Skalstapeln = 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Coimaging av integrin spänningar och cell struktur. (A) Coimaging av integrin spänningar, vinculin och F-aktin i en keratocyte. Keratocyte var fast och immunostained att rapportera vinculin och F-aktin. (B) Coimaging av integrin spänningar, vinculin och F-aktin i en CHO-K1 cell. Skalstapeln = 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ITS är en mycket tillgänglig men ändå kraftfull teknik för cellulära tvinga kartläggning både syntes och ansökan. Med alla material redo, kan ITS syntetiseras inom 1 dag. Under experiment behövs bara tre steg av ytbeläggning före cellen plätering. Nyligen har förenklat vi ytterligare beläggning förfarandet till ett steg genom att direkt länka ITS till bovint serumalbumin, som möjliggör direkt fysiska adsorption av ITS till glas eller polystyren ytor33. ITS ger fluorescerande intensiteten av cellulära kraft signal till en jämförbar cellulära strukturella imaging. Bekväm syntes och Provberedning, blygsamma krav för Mikroskopi och hög känslighet för cellulära kraft göra ITS en robust och pålitlig teknik för studier av cell mekanik. I detta papper presenterade vi ett omfattande förfarande för dess syntes och tillämpning.

Konjugera RGD är ligand med ssDNA det mest kritiska förfarandet i ITS syntesen. Som nämnts i avsnittet protokoll, är NHS ester på sulfo-SMCC inte stabila i vatten. Ju längre det tar för att upplösa sulfo-SMCC i vatten, mer mängden sulfo-SMCC förlorar NHS ester till hydrolys och blir ”blindgångare”, som konjugat med DNA genom maleimide-thiol reaktion men underlåter att konjugat med RGD-NH2. Som ett resultat, en stor portion av DNA molekyler kommer att upptas av den döda sulfo-SMCC och kan inte länka med RGD, leder till en låg avkastning på ssDNA-RGD. Av denna anledning, bör upplösa den sulfo-SMCC i vatten slutföras snabbt, vanligen inom 1 min. Det rekommenderas också att kontrollera avkastningen av ssDNA-RGD med elektrofores. Om avkastningen är högre än 80%, är rening allmänt onödig. Annars rekommenderas DNA rening av Polyakrylamidgelen. Återvinningsgraden av DNA av Polyakrylamidgelen är ca 60 – 80%.

För att syntetisera en rimlig mängd RGD-ssDNA-BHQ2, bör utgångsbeloppet för thiol-ssDNA-BHQ2 minst 20 nmol (1 mM x 20 µL). Observera att ändringar av DNA betydligt minska kvantiteten av den ssDNA beställde från DNA företag. Till exempel om 1000 nmol av ssDNA med två ändringar är beställt, får den garantera avkastningen endast 20 nmol. Om så är fallet, beställa minst 1000 nmol av ssDNA för RGD-ssDNA konjugationen. Forskare kan också designa sin egen sekvenser för dess konstruktioner. Normalt, hålla vi GC innehållet i ITS högre än 70% att förbättra dsDNA termisk stabilitet. DNA-sekvensanalys kan utföras för att minimera sannolikheten för att bilda self-hårnål, själv hybridisering, stabil sekundära struktur, etc. Analysverktyget är tillgänglig online. I manuskript är den övre strand DNA samma för ITSs med olika Ttol. Vi varierar det biotin läget på nedre strand DNA för att uppnå en olika T-tol. Dock kan varierande placeringen av RGD på den övre delen också användas för att finjustera de Ttol av ITS. Beräkning av Ttol för en annan dsDNA geometri tillhandahålls av Wang och Ha22 och Mosayebi et al.34, särskilt för dsDNA i den unzipping läge35,36 och skeva läge 37,38.

Även om dess ytor spela in alla integrin spänningar som har ägt rum tidigare, genom att spela in en video av cellulära kraft karta i följd, kan forskare beräkna integrin spänningen produceras i senaste ram intervall genom att subtrahera föregående bildruta från en aktuell bildruta att generera 'quasi-real-time cellulära kraft karta'. Ram intervall i ITS videon varierar beroende på celltyper men är oftast 20 s för snabb migrering celler och 1 – 2 min för stationära celler. Metoden frame subtraktion rapporterar quasi-real-time integrin spänningen bibehållen hög känslighet för integrin spänning imaging signal anhopning verkställer tack vare. Fotoblekning är minimal mellan två på varandra följande bilder, och därför har ingen observerbar effekt till metoden frame subtraktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av fondens start tillhandahålls av Iowa State University och av National Institute of General Medical Sciences (R35GM128747).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BSA-biotin Sigma-Aldrich A8549
Neutravidin Thermo Fisher Scientific 31000
Streptavidin Thermo Fisher Scientific 434301
upper strand DNA Integrated DNA Technologies N/A Customer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section
lower strand DNA Integrated DNA Technologies N/A Customer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section.
sulfo-SMCC Thermo Fisher Scientific A39268
Cyclic peptide RGD with an amine group Peptides International PCI-3696-PI
IMDM ATCC ‎62996227
FBS ATCC 302020
Penicillin gibco 15140122
TCEP Sigma-Aldrich C4706
200 uL petri dish Cellvis D29-14-1.5-N
NanoDrop 2000 Thermo Scientific N/A spectrometer
SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit Hoefer SE410-15-1.5 Device for electroporesis
CHO-K1 cell line ATCC CCL-61
NIH/3T3 cell line ATCC CRL-1658
Anti-Vinculin Antibody EMD Millipore 90227 Primary antibody for vinculin immunostaining
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A28175 Secondary antibody for vinculin immunostaining
Alexa Fluor 647 Phalloidin Invitrogen A22287
Eclipse Ti Nikon N/A microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Price, L. S., Leng, J., Schwartz, M. A., Bokoch, G. M. Activation of Rac and Cdc42 by Integrins Mediates Cell Spreading. Molecular Biology of the Cell. 9 (7), 1863-1871 (1998).
  2. Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands. Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).
  3. Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. Integrins in cell migration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), a005074 (2011).
  4. Hood, J. D., Cheresh, D. A. Role of integrins in cell invasion and migration. Nature Reviews Cancer. 2 (2), 91-100 (2002).
  5. Giancotti, F. G. Integrin signaling: specificity and control of cell survival and cell cycle progression. Current Opinion in Cell Biology. 9 (5), 691-700 (1997).
  6. Illario, M., et al. Integrin-Dependent Cell Growth and Survival Are Mediated by Different Signals in Thyroid Cells. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 88 (1), 260-269 (2003).
  7. Aoudjit, F., Vuori, K. Integrin Signaling in Cancer Cell Survival and Chemoresistance. Chemotherapy Research and Practice. 2012, 1-16 (2012).
  8. Hou, S., et al. Distinct effects of β1 integrin on cell proliferation and cellular signaling in MDA-MB-231 breast cancer cells. Scientific Reports. 6, 18430 (2016).
  9. Shankar, G., Davison, I., Helfrich, M. H., Mason, W. T., Horton, M. A. Integrin receptor-mediated mobilisation of intranuclear calcium in rat osteoclasts. Journal of Cell Science. 105 (Pt 1) (1), 61-68 (1993).
  10. Moreno-Layseca, P., Streuli, C. H. Signalling pathways linking integrins with cell cycle progression. Matrix Biology. 34, 144-153 (2014).
  11. Gómez-Lamarca, M. J., Cobreros-Reguera, L., Ibáñez-Jiménez, B., Palacios, I. M., Martín-Bermudo, M. D. Integrins regulate epithelial cell differentiation by modulating Notch activity. Journal of Cell Science. 127 (Pt 1), 4667-4678 (2014).
  12. Wang, H., Luo, X., Leighton, J. Extracellular Matrix and Integrins in Embryonic Stem Cell Differentiation. Biochemistry Insights. 8 (Suppl 1), 15-21 (2015).
  13. Schwarz, U. S., Soiné, J. R. D. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1853 (11), 3095-3104 (2015).
  14. Rittié, L. Traction Force Measurement Using Deformable Microposts. Fibrosis. Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. 235-244 (2017).
  15. Radmacher, M. Studying the Mechanics of Cellular Processes by Atomic Force Microscopy. Methods in Cell Biology. 83, 347-372 (2007).
  16. Charras, G. T., Lehenkari, P. P., Horton, M. A. Atomic force microscopy can be used to mechanically stimulate osteoblasts and evaluate cellular strain distributions. Ultramicroscopy. 86 (1-2), 85-95 (2001).
  17. Miller, J. S., et al. Bioactive hydrogels made from step-growth derived PEG-peptide macromers. Biomaterials. 31 (13), 3736-3743 (2010).
  18. Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. Measurement of mechanical tractions exerted by cells within three-dimensional matrices. Nature Methods. 7 (12), 969 (2010).
  19. Brenner, M. D., et al. Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing. Nano Letters. 16 (3), 2096-2102 (2016).
  20. Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion. Nature Communications. 5, 5167 (2014).
  21. Liu, Y., et al. DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5610-5615 (2016).
  22. Wang, X., Ha, T. Defining Single Molecular Forces Required to Activate Integrin and Notch Signaling. Science. 340 (6135), (2013).
  23. Blakely, B. L., et al. A DNA-based molecular probe for optically reporting cellular traction forces. Nature Methods. 11 (12), 1229-1232 (2014).
  24. Wang, Y., Wang, X. Integrins outside focal adhesions transmit tensions during stable cell adhesion. Scientific Reports. 6 (1), 36959 (2016).
  25. Wang, Y., et al. Force-activatable biosensor enables single platelet force mapping directly by fluorescence imaging. Biosensors and Bioelectronics. 100, 192-200 (2018).
  26. Zhao, Y., Wang, Y., Sarkar, A., Wang, X. Keratocytes Generate High Integrin Tension at the Trailing Edge to Mediate Rear De-adhesion during Rapid Cell Migration. iScience. 9, 502-512 (2018).
  27. Crisalli, P., Kool, E. T. Multi-Path Quenchers: Efficient Quenching of Common Fluorophores. Bioconjugate Chemistry. 22 (11), 2345-2354 (2011).
  28. Mondal, G., Barui, S., Chaudhuri, A. The relationship between the cyclic-RGDfK ligand and αvβ3 integrin receptor. Biomaterials. 34 (26), 6249-6260 (2013).
  29. Wang, X., et al. Integrin Molecular Tension within Motile Focal Adhesions. Biophysical Journal. 109 (11), 2259-2267 (2015).
  30. Euteneuer, U., Schliwa, M. Persistent, directional motility of cells and cytoplasmic fragments in the absence of microtubules. Nature. 310 (5972), 58-61 (1984).
  31. Kucik, D. F., Elson, E. L., Sheetz, M. P. Cell migration does not produce membrane flow. The Journal of Cell Biology. 111 (4), 1617-1622 (1990).
  32. Mueller, J., et al. Load Adaptation of Lamellipodial Actin Networks. Cell. , (2017).
  33. Sarkar, A., Zhao, Y., Wang, Y., Wang, X. Force-activatable coating enables high-resolution cellular force imaging directly on regular cell culture surfaces. Physical Biology. 15 (6), 065002 (2018).
  34. Mosayebi, M., Louis, A. A., Doye, J. P. K., Ouldridge, T. E. Force-Induced Rupture of a DNA Duplex: From Fundamentals to Force Sensors. ACS Nano. 9 (12), 11993-12003 (2015).
  35. Bockelmann, U., Essevaz-Roulet, B., Heslot, F. Molecular Stick-Slip Motion Revealed by Opening DNA with Piconewton Forces. Physical Review Letters. 79 (22), 4489-4492 (1997).
  36. Krautbauer, R., Rief, M., Gaub, H. E. Unzipping DNA oligomers. Nano Letters. 3 (4), 493-496 (2003).
  37. de Gennes, P. G. Maximum pull out force on DNA hybrids. Comptes Rendus de l’Académie des Sciences - Series IV - Physics. 2 (10), 1505-1508 (2001).
  38. Hatch, K., Danilowicz, C., Coljee, V., Prentiss, M. Demonstration that the shear force required to separate short double-stranded DNA does not increase significantly with sequence length for sequences longer than 25 base pairs. Physical Review E. 78 (1), 011920 (2008).

Tags

Indragning fråga 146 Cell mekanik Mekanobiologi integrin integrin spänning cellular kraft kartläggning integrin spänningar sensorn
Imaging Integrin spänningar och cellulära kraft på Submicron upplösning med en integrativ spänningar sensorn
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, Y., Wetter, N. M., Wang, X.… More

Zhao, Y., Wetter, N. M., Wang, X. Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor. J. Vis. Exp. (146), e59476, doi:10.3791/59476 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter