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अवअधोहनुज और Parotid लार ग्रंथियों मॉडल में से Organotypic संस्कृतियों के विकिरण उपचार Vivo में विशेषताएं

Published: May 17, 2019 doi: 10.3791/59484
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 1,2
1Department of Nutritional Sciences, University of Arizona, 2Cancer Biology Graduate Interdisciplinary Program, University of Arizona, 3Department of Chemical Engineering, University of Arizona

Summary

आकारिकी और लार ग्रंथियों के कार्यात्मक मार्कर कल्पना करने के लिए तीन आयामी organotypic संस्कृतियों का उपयोग कर विकिरण के बाद ऊतक क्षति के तंत्र में उपंयास अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं । यहां वर्णित खंड के लिए एक प्रोटोकॉल है, संस्कृति, irradiate, दाग, और छवि 50-90 μm मोटी लार ग्रंथि वर्गों से पहले और निंनलिखित ionizing विकिरण के लिए जोखिम ।

Abstract

हाइपोलिवेशन और ज़ेरोस्टोमिया पुरानी मौखिक जटिलताओं को पैदा करते हैं जो रेडियोथेरेपी से इलाज करने वाले सिर और गर्दन के कैंसर रोगियों में जीवन की गुणवत्ता को घटाते हैं । लार ग्रंथि में शिथिलता और बहाली के तंत्र को समझने के लिए प्रयोगात्मक दृष्टिकोण vivo मॉडल है, जो योजनाबद्ध रूप से चिकित्सकीय उंमीदवारों और अभिकर्मक में दक्षता स्क्रीन करने के लिए असमर्थता से विकलांग है पर ध्यान केंद्रित किया है विशिष्ट जीन में हेरफेर करने की क्षमता. इस लार ग्रंथि organotypic संस्कृति प्रोटोकॉल का उद्देश्य संस्कृति व्यवहार्यता के अधिकतम समय का मूल्यांकन और पूर्व vivo विकिरण उपचार के बाद सेलुलर परिवर्तन विशेषता है । हम immunoफ्लोरोसेंट धुंधला और संनाभि माइक्रोस्कोपी का उपयोग जब विशिष्ट सेल आबादी और मार्कर एक 30 दिन की संस्कृति की अवधि के दौरान मौजूद हैं निर्धारित करने के लिए । इसके अलावा, सेलुलर मार्कर पहले में vivo में विकिरण मॉडल में रिपोर्ट की संस्कृतियों में मूल्यांकन कर रहे हैं कि पूर्व vivo विकिरणित कर रहे हैं. आगे चल रहा है, इस विधि murine और मानव लार ग्रंथि ऊतक प्रतिक्रियाओं के चिकित्सकीय एजेंटों कि लार समारोह में सुधार करने के लिए रैपिड ex vivo के मूल्यांकन के लिए एक आकर्षक मंच है ।

Introduction

उचित लार ग्रंथि समारोह मौखिक स्वास्थ्य के लिए आवश्यक है और1रेडियोथेरेपी के साथ सिर और गर्दन के कैंसर के इलाज के बाद बदल दिया है । २०१७ में, संयुक्त राज्य अमेरिका2में सिर और गर्दन के कैंसर के लगभग ५०,००० नए मामलों की सूचना दी गई थी । ऊतक के कारण-इस तरह लार ग्रंथियों के रूप में आसपास के सामान्य ऊतकों पर विकिरण चिकित्सा के हानिकारक और अक्सर अपरिवर्तनीय प्रभाव, रोगियों अक्सर गंभीर साइड इफेक्ट के साथ छोड़ दिया जाता है और जीवन की गुणवत्ता कम2,3, ४। आम जटिलताओं के कारण विकिरण नुकसान प्रकट होता है जैसे लक्षण में xerostomia (शुष्क मुँह की व्यक्तिपरक भावना), दंत क्षय, चबाने और निगलने के लिए बिगड़ा क्षमता, भाषण impairments, और मौखिक microbiomes से समझौता2, 3 । , 4. इन लक्षणों को सामूहिक रूप से प्रभावित व्यक्तियों में कुपोषण और बिगड़ा जीवित रहने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं5. जबकि इस जनसंख्या में लार ग्रंथि में शिथिलता अच्छी तरह से प्रलेखित किया गया है, कोष्ठकी कोशिकाओं को नुकसान की अंतर्निहित तंत्र विवादित किया गया है, और वहां विभिंन पशु मॉडल6,7के बीच थोड़ा एकीकरण है ।

लार ग्रंथि समारोह और विकिरण प्रेरित नुकसान का अध्ययन करने के वर्तमान तरीकों vivo मॉडल में का उपयोग शामिल, अमर सेल लाइनों, दो आयामी (2 डी) प्राथमिक कोशिका संस्कृतियों, और तीन आयामी (3 डी) salisphere संस्कृतियों8, 9,10,11,12। परंपरागत रूप से, कोशिका सांस्कृतिक मॉडल से अमर सेल लाइनों और 2-डी संस्कृतियों एक स्तरित फ्लैट सतहों पर सभ्य कोशिकाओं को शामिल करने और तेजी से, आसान है, और लागत प्रभावी प्रयोग के लिए मूल्यवान हैं । हालांकि, कृत्रिम कोशिका संस्कृति की स्थिति भेदभाव की स्थिति और विभिन्न स्थितियों को उजागर कोशिकाओं की शारीरिक प्रतिक्रियाओं को बदल सकते हैं, और परिणाम अक्सर पूरे जीव मॉडल के लिए अनुवाद करने में विफल14,15. इसके अलावा, अमर सेल संस्कृतियों डीएनए क्षति के लिए लार ग्रंथि प्रतिक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है, जो p53 गतिविधि के मॉडुलन की आवश्यकता होती है16,17.

3-डी salisphere संस्कृतियों के लिए समृद्ध कर रहे हैं स्टेम और प्रजनक कोशिकाओं में प्रारंभिक समय बिंदुओं पर संस्कृति में और लार ग्रंथि कोशिकाओं के इस सबसेट की रेडियोसंवेदनशीलता को समझने के लिए उपयोगी किया गया है9,18. इन सभी संस्कृति मॉडल का एक महत्वपूर्ण सीमा है कि वे लार ग्रंथि के 3-डी संरचना visualizing में अप्रभावी कर रहे हैं, extracellular मैट्रिक्स सहित (ecm) और सेल सेल बातचीत विभिंन परतों पर, जो नियमन में महत्वपूर्ण है लार स्राव15। एक तरीका है कि एक पूरे के रूप में ऊतक के व्यवहार शामिल है लेकिन यह भी प्रयोगशाला की स्थिति में हेरफेर किया जा सकता है उपचार के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए और अधिक विकिरण प्रेरित लार ग्रंथि के अंतर्निहित तंत्र की खोज के लिए आवश्यक है के लिए की जरूरत रोग.

लाइव ऊतक परिच्छेदन और संस्कृति पहले19,20 प्रलेखित किया गया है और अक्सर मस्तिष्क ऊतक बातचीत21अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है । पिछले अध्ययनों में, कर्णमूलीय (PAR) लार ग्रंथि ऊतक चूहों से लगभग ५० μm पर sectioned था और ४८ एच के लिए सुसंस्कृत, और व्यवहार्यता का विश्लेषण, सेल मौत, और समारोह के बाद19प्रदर्शन किया गया था । सु एट अल। (२०१६) इस पद्धति पर विस्तारित मानव अवअधोहनुज ग्रंथियों (SMGs) को ३५ μm या ५० μm पर 14 दिनों के लिए sectioned। प्रस्तावित विधि में एक उंनति है कि यह दोनों कर्णमूलीय और अवअधोहनुज लार ग्रंथियों ५० μm और ९० μm और संस्कृतियों के मूल्यांकन में 30 दिनों के लिए sectioned शामिल है । ऊतक मोटाई की एक सीमा में कटौती करने की क्षमता सेल सेल और सेल-ecm बातचीत है कि सेलुलर प्रक्रियाओं के लिए प्रासंगिक है के मूल्यांकन में महत्वपूर्ण है सहित apical-basolateral polarity और स्राव के लिए इन्नेर्वतिओन । इसके अलावा, लार ग्रंथि स्लाइसें जबकि संस्कृति में विकिरण प्रेरित लार ग्रंथि क्षति का अध्ययन करने के लिए इस संस्कृति मॉडल की व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए किरणित थे ।

इस लार ग्रंथि organotypic संस्कृति प्रोटोकॉल का उद्देश्य संस्कृति व्यवहार्यता के अधिकतम समय का मूल्यांकन और पूर्व vivo विकिरण उपचार के बाद सेलुलर परिवर्तन विशेषता है । अधिकतम समय वर्गों है कि पोस्ट-विच्छेदन व्यवहार्य है निर्धारित करने के लिए, trypan नीला धुंधला, जीवित कोशिका धुंधला, और कोशिका मृत्यु के लिए immunohistochemical धुंधला प्रदर्शन किया गया । Confocal माइक्रोस्कोपी और immunoफ्लोरोसेंट धुंधला विशिष्ट सेल आबादी, रूपात्मक संरचनाओं, और प्रसार के स्तर का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया गया । ऊतक अनुभाग संस्कृतियों भी ionizing विकिरण को उजागर करने के लिए इस 3-डी मॉडल में विभिंन मार्कर पर विकिरण के प्रभाव का निर्धारण किया गया । सेल डेथ, साइकास्केलेटल व्यवधान, विभेदन मार्करों की हानि, और किरणित पूर्व vivo में संस्कृतियों में प्रतिपूरक प्रसार के प्रेरण विवो मॉडल में पिछले अध्ययनों की तुलना में थे । यह पद्धति विकिरण क्षति के बाद कोशिका-कोशिका अन्योन्यक्रिया की भूमिका की जांच करने का साधन प्रदान करती है और चिकित्सीय हस्तक्षेपों की प्रभावकारिता का कुशलतापूर्वक मूल्यांकन करने के लिए एक प्रायोगिक मॉडल प्रदान करती है (जीन जोड़तोड़ या औषधीय कारक ) कि कम वीवो मॉडल के लिए उपयुक्त हो सकता है ।

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Protocol

1. वाइटोडोम की तैयारी

  1. बफर ट्रे, ब्लेड लगाव, agarose ब्लॉक मोल्ड, और ७०% इथेनॉल के साथ प्रयोगशाला फिल्म सहित vibratome का स्प्रे detachable घटकों, तो कम से कम 30 मिनट के लिए यूवी जीवाणुरहित ।
  2. प्लेस और सुरक्षित बफर ट्रे पर प्रयोगशाला फिल्म के एक अतिरिक्त पत्र में गिरने से बर्फ को रोकने के ।
  3. बर्फ के चैंबर को कुचल बर्फ के साथ भरें, बफर ट्रे से प्रयोगशाला फिल्म निकालें, और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन-एम्पीसिलीन (PSA) के साथ पूरक बर्फ-ठंडा 1x फॉस्फेट buffered खारा (PBS) समाधान के १०० मिलीलीटर के साथ बफर ट्रे भरें ।
  4. ब्लेड धारक में एक स्टेनलेस स्टील रेज़र ब्लेड प्लेस । का प्रयोग करें पेचकश को कसने/ढीला और ब्लेड के कोण बदल जाते हैं ।

2. एगरोस ब्लॉक में ऊतक के नमूने की तैयारी और vibratome का उपयोग कर परिच्छेदन

  1. Autoclave सभी आवश्यक विच्छेदन और संदंश, कैंची, और paintbrushes सहित परिच्छेदन उपकरण ।
  2. बाँझ 1x PBS और माइक्रोवेव में 3% कम पिघलने बिंदु agarose तैयार जब तक agarose समाधान में घुल । सुनिश्चित करें कि समाधान पर फोड़ा नहीं करता है और समय के साथ मिश्रण करने के लिए बोतल भंवर ।
    नोट: कम पिघलने agarose से एक गर्म पानी के स्नान में रखकर solidifying से रोकें । कम पिघल agarose ३७ डिग्री सेल्सियस पर तरल पदार्थ है और 25 डिग्री सेल्सियस पर सेट । हालांकि, जल स्नान ४० डिग्री सेल्सियस से नीचे होना चाहिए ताकि शारीरिक तापमान पर ऊतक के आसपास agarose डालना ।
  3. 2 मिलीलीटर बर्फ-ठंड 1x pbs में लार ग्रंथियों और जगह विच्छेदित ऊतक अलग एक बाँझ, 30 मिमी संस्कृति पकवान में 1% पीएसए के साथ पूरक ।
  4. Autoclaved forceps का प्रयोग, 1x PBS + 1% PSA समाधान और एक embedding मोल्ड के तल पर स्थिति से लार ग्रंथियों को हटा दें । तरल के साथ मोल्ड भरें 3% कम पिघलने बिंदु agarose ऊतक कवर करने के लिए ।
  5. संदंश का उपयोग करना, ऊतक ब्लॉक के बीच में समायोजित करने और उचित विमान में लार ग्रंथि की स्थिति । अवअधोहनुज और कर्णमूलीय ग्रंथियों के लिए सबसे अच्छा पार वर्गों ऊर्ध्वाधर विमान में हैं ।
  6. जगह 10 मिनट के लिए बर्फ पर agarose ब्लॉक कठोर ।
  7. ध्यान से agarose के बाहरी छोर के आसपास एक उस्तरा ब्लेड चलाने के लिए ढीला और चलो ब्लॉक कदम १.१ से यूवी निष्फल प्रयोगशाला फिल्म पर बाहर स्लाइड ।
  8. लार ग्रंथि युक्त एक एगरोस बॉक्स को काटने के लिए एक रेज़र ब्लेड का उपयोग करें । सुनिश्चित करें कि खंड के तल सीधे और ब्लॉक के विपरीत पक्ष के समांतर है (सतह कि नीचे चिपके हो जाएगा) । के बाद से agarose ऊतक घुसपैठ नहीं करता है, बंद भी ऊतक के आसपास बहुत अधिक agarose ट्रिम नहीं है तो ऊतक अच्छी तरह से समर्थन किया जाएगा ।
  9. काटने की सतह के लिए ब्लॉक संलग्न करने के लिए superglue का प्रयोग करें ।
  10. खंड ५० μm या ९० μm मोटाई में vibratome द्वारा ०.०७५ mm/s और १०० हर्ट्ज की आवृत्ति की गति से ।
    नोट: उच्चतम आवृत्ति और सबसे कम ब्लेड गति पर vibratome की स्थापना सबसे इष्टतम स्लाइस प्रदान करता है ।
  11. एक 24-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति में वर्गों लीजिए एक अच्छी तरह से एक autoclaved, प्राकृतिक बाल तूलिका का उपयोग कर प्रति ~ 1 मिलीलीटर बर्फ ठंडा PBS युक्त पकवान, टुकड़ा संग्रह के बीच ७०% इथेनॉल में ब्रश रखने के लिए बाँझपन बनाए रखने के ।

3. culturing वर्गों

  1. आटोक्लेव एक माइक्रो स्पैटुला और संदंश.
  2. भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ या बिना स्टॉक vibratome संस्कृति मीडिया बनाओ: DMEM/F12 मीडिया 1% पीएसए, 5 μg/एमएल transferrin, १.१ μM हाइड्रोकॉर्टिएक, ०.१ μM रेटिनोइक एसिड, 5 μg/एमएल इंसुलिन, ८० एनजी/एमएल एपिडर्मल वृद्धि कारक, 5 मिमी एल-ग्लूटामीन, ५० μg/एमएल के साथ पूरक जेंटॅमाइकिन सल्फेट, और 10 μL/एमएल ट्रेस तत्व मिश्रण । 0%, २.५%, ५.०%, या 10% समाधान बनाने के लिए FBS की एक उपयुक्त राशि जोड़ें ।
  3. Sectioning करने से पहले, पूर्व गर्म मीडिया के ३०० μL जोड़ें और एक 24-well ऊतक संस्कृति प्लेट के प्रत्येक कुएं में एक 12 मिमी व्यास, ०.४ μm ताकना-आकार झिल्ली डालने जगह है । संस्कृति के लिए लिक्विड-एयर इंटरफेस बनाने के लिए मीडिया को मेंब्रेन बॉटम तक पहुंचना चाहिए ।
  4. धीरे झिल्ली डालने के शीर्ष पर लार वर्गों ३७ डिग्री सेल्सियस पर माइक्रो स्पैटुला और संस्कृति का उपयोग कर humidified 5% सीओ2 और ९५% हवा वातावरण इनक्यूबेटर में रखना ।
    1. अच्छी तरह से में लगभग ३०० μL प्राथमिक संस्कृति मीडिया जोड़ें और झिल्ली आवेषण (लगभग ४० μL) हर दूसरे दिन में या जरूरत के रूप में कुछ बूंदें । उचित मुर्गियों को मारने से पता चला कि सेल जीवित रहने में सक्षम है और 30 दिनों तक पूर्व vivo के लिए बनाए रखा जा सकता है ।

4. लार ग्रंथि वर्गों के विकिरण

  1. विकिरण की एक खुराक (5 Gy) कोबाल्ट-६० (या समकक्ष) विकिरक का उपयोग करने के साथ वर्गों का इलाज ।
    1. तापमान में उतार चढ़ाव से बचने के लिए एक कवर स्टायरोफोम कंटेनर का उपयोग कर विकिरक सुविधा के लिए परिवहन अनुभाग । इसके अलावा, यह सुनिश्चित करने के लिए कि मीडिया संस्कृति के ढक्कन पर न छप सके और संदूषण को प्रेरित करने के लिए प्रयोगशाला इनक्यूबेटर को वापस परिवहन के दौरान देखभाल की जरूरत है ।
    2. 24-अच्छी तरह से लार ग्रंथि वर्गों ८० सेमी युक्त प्लेट विकिरण स्रोत से प्लेस, एक ३२ के केंद्र में "x ३२" विकिरण क्षेत्र । विकिरण खुराक गणना और irradiator में इसी समय साधन और कोबाल्ट-६० क्षय द्वारा भिन्न होगा ।
  2. धारा 3 में बताए गए अनुसार इन अनुभागों की निगरानी और कल्टीरण जारी रखें ।

5. व्यवहार्यता धुंधला

  1. महाप्राण पुराने मीडिया और धो बाँझ के साथ दो बार स्लाइस, पूर्व गरम 1x PBS ।
  2. Trypan नीले रंग के साथ दाग वर्गों ।
    1. एक सूक्ष्म spatula का उपयोग करने के लिए संस्कृति से एक गिलास स्लाइड टुकड़ा ले जाएं ।
    2. (10-20 μL) ऊतक को कवर करने के लिए पर्याप्त मात्रा के साथ vibratome टुकड़ा करने के लिए ०.४% trypan ब्लू समाधान जोड़ें ।
    3. कमरे के तापमान (आरटी) में trypan नीले रंग के लिए 1-2 मिनट के लिए ऊतक घुसना करने के लिए में स्लाइस सेटे । Nonviable कोशिकाओं नीले दाग हो जाएगा, और व्यवहार्य कोशिकाओं को दाग नहीं होगा ।
  3. Calcein के साथ दाग वर्गों, लाइव सेल डाई हूं ।
    1. एक 24 अच्छी थाली (200-300 μL) के एक अच्छी तरह से अनुभाग को कवर करने के लिए दाग की पर्याप्त मात्रा जोड़ें ।
    2. डाई प्रवेश की अनुमति देने के लिए 15 मिनट के लिए आरटी पर स्लाइस सेबेट ।
    3. सावधानीपूर्वक खंड को अच्छी तरह से और एक गिलास स्लाइड पर जगह से हटा दें । बढ़ते मीडिया के 1 बूंद के साथ स्लाइसें माउंट ।
    4. ४८८ एनएम और ५१५ एनएम के उत्तेजन/उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य पर एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर छवि वर्गों ।

6. एंटीबॉडी धुंधला vibratome वर्गों

नोट: निम्नलिखित एक सामान्य एंटीबॉडी धुंधला प्रोटोकॉल Ki-६७ के लिए विशिष्ट प्रदान करता है; हालांकि, इस प्रोटोकॉल का उपयोग किसी भी एंटीबॉडी के साथ किया जा सकता है । सभी washes जब तक अंयथा नोट आर टी पर आयोजित की जाती हैं ।

  1. बहु में अच्छी तरह ऊतक संस्कृति पकवान, मीडिया से महाप्राण और धोने के साथ 1x pbs के साथ कम 2x ।
  2. 4% पैराफार्मलेडिहाइड (पीएफए) का उपयोग कर वर्गों को चार डिग्री सेल्सियस पर रात भर फिक्स करें ।
  3. बंद महाप्राण 4% पीएफए और धो 3x साथ pbt [1x pbt, 1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (BSA), ०.१% ट्राइटन एक्स-१००] ।
    नोट: वर्गों 1x PBS में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और एक बाद में समय पर दाग । अधिकतम भंडारण समय इस पांडुलिपि में परीक्षण किया गया था 3 सप्ताह । अब भंडारण समय के लिए व्यक्तिगत उपयोगकर्ता द्वारा अनुकूलित है कि अगर वांछित है की आवश्यकता होगी ।
  4. ०.३% ट्राइटन एक्स-१०० 1x PBS में 30 मिनट के लिए उपयोग कर वर्गों permeabilize ।
    नोट: इस कदम को संशोधित किया जा सकता है और विशिष्ट एंटीबॉडी धुंधला और permeabilization के लिए अनुकूलित ।
  5. बंद पाइपेट पारभयीकरण समाधान ।
  6. धो 1x PBS, 1% BSA के साथ 5 मिनट के लिए स्लाइस 3x, और ०.१% ट्राइटन एक्स-१०० (PBS) ।
  7. 1 h के लिए सामांय बकरी सीरम 1% के साथ ब्लॉकिंग एजेंट के साथ स्लाइस ब्लॉक ।
  8. 5 मिनट के लिए स्लाइस 3x को पीबीटी के साथ धोएं ।
  9. ५०० μL विरोधी Ki67 खरगोश मोनोक्लोनल एंटीबॉडी 1x PBS में 1% BSA में पतला के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर स्लाइस सेते ।
    नोट: phalloidin धुंधला के लिए, कदम ६.९ छोड़ और विशिष्ट phalloidin इस्तेमाल के लिए प्रोटोकॉल का उपयोग कर आगे बढ़ें । डीएनए प्रतिदाग के लिए, कदम ६.१५ को छोड़ दें ।
  10. महाप्राण विरोधी Ki67 खरगोश मोनोक्लोनल एंटीबॉडी ।
  11. 1x PBS में 5 मिनट के लिए स्लाइस 6x धो लें ।
  12. एंटी-Ki67 एंटीबॉडी के साथ संगत प्रतिपिंड के ५०० μL में स्लाइसों को सेते १.५ के लिए आर टी में 1x PBS में 1% BSA में पतला
    नोट: उपयोग द्वितीयक एंटीबॉडी के आधार पर, द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन समय और व्यक्तिगत उपयोगकर्ता द्वारा अनुकूलित किया जा सकता है । इसके अलावा सेकेंडरी एंटीबॉडी हल्की सेंसिटिव होती है । बाद के सभी washes अंधेरे में किया जाना चाहिए ।
  13. महाप्राण द्वितीयक प्रतिपिंड
  14. 1x PBS के साथ 5 मिनट के लिए 3x के लिए स्लाइस धो लें ।
  15. विआयनीकृत पानी में 5 मिनट के लिए धो स्लाइस ।
  16. DAPI (1 μg/mL) के साथ 20 मिनट के लिए आरटी पर प्रतिदाग स्लाइस ।
  17. धोने के स्लाइस (एक बार) 5 मिनट के लिए विआयनीकृत पानी में ।
  18. बढ़ते मीडिया की एक बूंद (~ ४० μL) के साथ स्लाइसें माउंट । अतिरिक्त बुलबुले से बचने के लिए, धीरे से स्लाइड पर बढ़ते मीडिया पर coverslip जगह, एक ४५ ° कोण के साथ शुरू.
    1. Coverslip के साथ मोटी वर्गों को कुचलने को रोकने के लिए, एक स्पेसर के साथ प्रत्येक टुकड़ा माउंट । एक स्पेसर ऊतक अनुभाग के चारों ओर एक वर्ग में वैक्यूम चर्बी का एक रिम रखकर बनाया जा सकता है ।
    2. जब coverslip बिछाने, coverslip के किनारों वैक्यूम चर्बी के साथ बंद किया जा सकता है । स्लाइड पर दृढ़ता से इसका पालन करने के लिए अपने अंगूठे के साथ coverslip के किनारों पर नीचे दबाएं । वैकल्पिक रूप से, स्पष्ट नेल पॉलिश का उपयोग माइक्रोस्कोप स्लाइड पर coverslip सील.

7. इमेजिंग vibratome वर्गों

  1. छवि धुंधला के 5 दिनों के भीतर दाग स्लाइड ।
  2. एक संनाभि माइक्रोस्कोप का उपयोग दाग vibratome स्लाइसें के ऑप्टिकल वर्गों प्राप्त करें । एक संनाभि माइक्रोस्कोप के साथ, एक परिभाषित कदम आकार में एक जेड स्टैक प्राप्त या उपयोगकर्ता के प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर व्यक्तिगत छवियों को ले । संनाभि संग्रह के बाद किसी भी कंप्यूटर स्क्रीन पर छवियां जांची जा सकती हैं ।
    नोट: vibratome स्लाइस की मोटाई के कारण, यह सिफारिश की है कि एक संनाभि माइक्रोस्कोप या जेड स्टैक क्षमता के साथ एक गुंजाइश नमूनों के भीतर विवरण कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है । इस पांडुलिपि में इस्तेमाल छवियों के लिए, एक 63x तेल उद्देश्य इस्तेमाल किया गया था; हालांकि, यह और आगे अलग उपयोगकर्ता और विशिष्ट उपयोग किया क्षेत्र द्वारा संशोधित किया जा सकता है । प्रत्येक उद्देश्य और एक्स और वाई में सबसे छोटी ऑप्टिकली resolvable संरचना के लिए २.५ पिक्सल के ग्रहण Nyquist नमूने के साथ ज़ूम फैक्टर के लिए अनुशंसित पिक्सेल संकल्प का इस्तेमाल किया गया था । हालांकि, कुछ टिप्पणीकारों सुझाव २.३ पिक्सल, जबकि अंय २.८ पिक्सल सुझाव देते हैं । कैसे इन गणना करने के लिए पर अधिक जानकारी के लिए जैविक Confocal माइक्रोस्कोपी22 की हैंडबुक करने के लिए कृपया देखें ।

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Representative Results

प्राथमिक 2-डी संस्कृतियों भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) पूरक मीडिया में बड़े हो रहे हैं, जबकि प्राथमिक 3-डी salisphere संस्कृति सीरम में आम तौर पर सभ्य हैं-मुक्त10,11की स्थिति. इसके अलावा, पिछले दो अध्ययन लार ग्रंथियों से vibratome संस्कृतियों का उपयोग 0% या 10% fbs संपूरक मीडिया19,20में अपने वर्गों को सभ्य । माउस अवअधोहनुज स्लाइस एक vibratome और इष्टतम संस्कृति की स्थिति का उपयोग ५० μm की मोटाई पर sectioned थे FBS सांद्रता (0%, २.५%, ५.०% की एक श्रृंखला का उपयोग कर निर्धारित किया गया है, और 10%) । अस्तित्व की विशेषताओं का निर्धारण करने के लिए, उज्ज्वल-क्षेत्र माइक्रोस्कोप छवियों संस्कृति दिन 1, 4, 7, 14, और 30 के बाद सेक्शनिंग में लिया गया था (चित्रा 1) । इसके अतिरिक्त, ग्रंथि वर्गों ०.४% trypan नीले रंग के साथ दाग और 40x पर एक उज्ज्वल क्षेत्र खुर्दबीन संकेत समय अंक (चित्रा 2a) में imaged थे । गैर व्यवहार्य कोशिकाओं को दाग नीले और व्यवहार्य कोशिकाओं को साफ रह रहे थे ।

इसी तरह, ९० μm पर sectioned मोटा स्लाइस की उत्तरजीविता विशेषताओं का निर्धारण करने के लिए, के साथ और trypan ब्लू धुंधला के बिना उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप छवियों २.५% FBS के साथ पूरक संस्कृतियों में 30 दिन में लिया गया (आंकड़ा 2b) । स्लाइस मोटाई के कारण, trypan ब्लू डाई के साथ दाग ९० μm वर्गों पूरे तो आधा में कटौती के लिए टुकड़ा के केंद्र का मूल्यांकन करने के लिए imaged थे (चित्रा 2b) । एक पुष्टिकरण के रूप में, एक जीवित सेल डाई विभिन्न fbs संवर्धन स्थितियों में सेल अस्तित्व का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया गया था (चित्रा 2c). उज्ज्वल क्षेत्र छवियों में, पारभासी के उच्च स्तर, दोनों ५० μm और ९० μm पर sectioned ऊतकों में जीवित कोशिकाओं को देखा गया । दिलचस्प है, वर्गों गहरा हो गया और समग्र ऊतक क्षेत्र संस्कृति में समय के साथ संघनित हो जाती, अभी तक खंड के एक महत्वपूर्ण भाग के लिए 30 दिन संस्कृति अवधि जीवित प्रतीत होता है (चित्रा 1, चित्रा 2) । इस संघनन 0% और 10% fbs संवर्धन स्थितियों में सबसे स्पष्ट था । ट्रिपैन ब्लू पॉजिटिव सेल सभी वर्गों की परिधि पर ध्यान दिए बिना देखा गया था, और जब उच्च fbs संवर्धन शर्तों की तुलना में 0% fbs संस्कृति की स्थिति में trypan नीले सकारात्मक कोशिका क्षेत्र में वृद्धि हुई थी (चित्र 2a , 2b) ।

लाइव सेल दाग का प्रयोग, वर्गों 0% में सुसंस्कृत के धुंधला की सबसे कम राशि दिखाई, और संस्कृति मीडिया के लिए FBS के अलावा जीवित कोशिकाओं की मात्रा में सुधार । एक साथ लिया, वर्गों 0% FBS में सुसंस्कृत दिखाई ऊतक संघनन दिखाया, ऊंचा trypan नीले दाग क्षेत्रों, और लाइव सेल धुंधला के निंनतम स्तर । संस्कृतियों के लिए २.५% FBS के अलावा पारभासी ऊतक की मात्रा में सुधार, trypan नीला सकारात्मक क्षेत्र की कमी हुई है, और जीना सेल धुंधला के स्तर में वृद्धि हुई है । अतिरिक्त FBS एकाग्रता में वृद्धि के लिए ऊतक की उत्तरजीवियता में सुधार दिखाई नहीं दिया; इसलिए, २.५% FBS vibratome मीडिया में इष्टतम FBS एकाग्रता और बाद के सभी प्रयोगों के लिए संस्कृति की स्थिति के रूप में उपयोग किया गया था ।

अवअधोहनुज पूर्व vivo ऊतक स्लाइस के बाद विच्छेदन की व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए, प्रफलन और अपोप्तोटिक मार्कर संस्कृति में 1, 3, 7, 14, और 30 दिनों में मूल्यांकन किया गया था । प्रफलन गतिविधि Ki67 संस्कृति स्लाइस के एक सबसेट में immunostaining द्वारा मूल्यांकन किया गया था (चित्र 3a). Ki67 सकारात्मक कोशिकाओं को सभी समय मूल्यांकन अंक पर मनाया और संस्कृति में 30 दिन में मौजूद होना जारी रखा गया, समय अंक के बीच ंयूनतम अंतर के साथ । इसी प्रकार, apoptosis की डिग्री विभाजित caspase द्वारा मूल्यांकन किया गया था-3 अनुभाग के एक अलग सबसेट में immunostaining (चित्रा 3b). Cleaved caspase के एक निंन स्तर-3 सकारात्मक कोशिकाओं को सभी समय अंक पर मनाया गया था संस्कृति में 14 दिन तक, जबकि 30 दिन की स्थिति के लिए कुछ क्षेत्रों में cleaved caspase-3 सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या में एक छोटे से वृद्धि हुई दिखाई । ऊतक किनारों का मूल्यांकन cleaved caspase-3, जो trypan ब्लू धुंधला (चित्रा 2) संक्षेप नहीं है की उच्च स्तर प्रकट नहीं किया । कुल मिलाकर, इन परिणामों का सुझाव है कि प्रसार और व्यवहार्यता के लिए cues 30 दिन के मूल्यांकन की अवधि के दौरान vibratome संस्कृतियों में मौजूद रहे ।

मोटी धारा vibratome संस्कृतियों का अवसर एक गहराई है कि प्रत्येक दिशा में एक से अधिक उपकला कोशिका मोटाई शामिल है पर एक विशेष ऊतक के सेलुलर घटकों के बीच बातचीत का मूल्यांकन करने के लिए अनुमति देते हैं । इसके अलावा, यह महत्वपूर्ण है कि दोनों प्रमुख लार ग्रंथियों संस्कृति के लिए सक्षम है, के रूप में वे लार उत्पादित प्रोटीन की संरचना में अलग, ऊतकीय वास्तुकला, रेडियोसंवेदनशीलता, और अंय महत्वपूर्ण विशेषताएं । अवअधोहनुज ग्रंथि संस्कृतियों में विभिन्न सेलुलर आबादी का निर्धारण करने के लिए, अवअधोहनुज वर्गों ई-cadherin के साथ दाग थे (ई-सीएडी) उपकला कोशिकाओं का पता लगाने के लिए, चिकनी मांसपेशी actin (SMA) मायोउपकला कोशिकाओं का पता लगाने के लिए, और actin तंतु (phalloidin) संस्कृति में 30 दिनों के दौरान कोशिका कंकाल संरचनाओं का पता लगाने (चित्र 4a).

E-cadherin धुंधला कोशिकाओं के बहुमत की झिल्ली पर मनाया गया और 30 दिन की संस्कृति अवधि के दौरान पाया गया । SMA + कोशिकाओं संस्कृति की अवधि के दौरान पाया गया, हर समय बिंदु पर समान स्तर के साथ । Actin तंतु के साइटोस्केलेटल संगठन भी हर समय मूल्यांकन बिंदु पर बनाए रखा होना दिखाई दिया । इसके विपरीत, वहां सेलुलर मार्कर कि लगातार पूरे मूल्यांकन अवधि के दौरान बनाए रखा नहीं थे और इन CD31 (vasculature), TUBB3 (ंयूरॉंस) शामिल थे, और aquaporin-5 (aqp-5, कोष्ठकी मार्कर) (चित्रा 4b) । संनाभि के ढेर के माध्यम से संवहनी संरचनाओं को स्पष्ट रूप से 1 दिन और 3 के बाद संस्कृति में मनाया गया; हालांकि, इन संरचनाओं 7 दिन में खंडित दिखाई दिया । इसी तरह, न्यूरोनल प्रक्रियाओं संस्कृति के पहले दिन के दौरान बरकरार थे, 3 दिन में कम दिखाई दिया, और बाद में संस्कृति में 7 दिन में खो गए थे. Aqp5 + कोशिकाओं 1, 3, 7, और 14 दिनों में संस्कृति में मनाया गया; हालांकि, 14 दिन में, कुल धुंधला स्तर दिखाई दिया, शेष सकारात्मक कोशिकाओं में एक और दानेदार सादृश्य के साथ कम हो । इन आंकड़ों का सुझाव है कि अवअधोहनुज संस्कृतियों कम संस्कृति अवधि के लिए संवहनी और न्यूरोनल कोशिका प्रकार के रखरखाव के साथ ऊतक घटकों की विविधता होते हैं, और अब संस्कृति अवधि के लिए उपकला और myoepithelial कोशिका प्रकार.

जबकि vibratome-sectioned संस्कृतियों पहले कर्णमूलीय लार ग्रंथि के लिए रिपोर्ट किया गया है, संस्कृतियों ४८ एच के लिए बनाए रखा, समय सीमा के दौरान वे अध्ययन किया जा सकता है सीमित थे । आदेश में निर्धारित करने के लिए कि क्या कर्णमूलीय ग्रंथियों अब के लिए बनाए रखा जा सकता है, murine कर्णमूलीय ग्रंथियों sectioned थे और 1, 3, 7, या 14 दिनों के लिए सुसंस्कृत । चूहों में इसके छोटे आकार के कारण कर्णमूलीय ग्रंथि से कम वर्ग प्राप्त किए गए; इसलिए, 30-दिन की संस्कृति अवधि का प्रयास नहीं किया गया था । स्लाइस immunoफ्लोरोसेंट Ki67 के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग कर धुंधला द्वारा प्रसार के लिए मूल्यांकन किया गया । अवअधोहनुज संस्कृतियों के समान, Ki67 धनात्मक कोशिकाएं सभी समय बिंदुओं पर देखी गईं, जो यह दर्शाती हैं कि कोशिकाएं संस्कृति में प्रसार की मात्रा को बनाए रखती हैं (चित्र 5a) ।

इसके अलावा, कार्यात्मक कोष्ठकी मार्कर के रखरखाव (α-amylase और Aqp5), एक उपकला मार्कर (ई-सीएडी), और संवहनी (CD31) और न्यूरोनल (TUBB3) सेल आबादी का मूल्यांकन किया गया । Amylase विभेदक कर्णमूलीय उपकला कोशिकाओं द्वारा उत्पादित सबसे प्रचुर मात्रा में प्रोटीन में से एक है और अक्सर प्राथमिक कर्णमूलीय कोशिकाओं की 2-डी संवर्धन के दौरान खो दिया है । Vibratome संस्कृतियों में, एमिलेज कोष्ठकी कोशिकाओं में मनाया और 14 दिन की संस्कृति अवधि में वाहिनी कोशिकाओं से बाहर रखा गया था (चित्रा 5b) । अवअधोहनुज संस्कृतियों के समान, Aqp5 + कोशिकाओं कर्णमूलीय संस्कृतियों में प्रत्येक समय बिंदु पर मौजूद थे, 14 दिन पहले समय अंक की तुलना में कम स्तर का प्रदर्शन संस्कृतियों के साथ (चित्रा 5 सी). 14-दिन की संस्कृति अवधि के दौरान अधिकांश कक्षों की झिल्लियों पर ई-कैडबइन स्तर भी बनाए रखे गए थे (चित्र 5d) । Neuronal संरचनाओं को 7 दिन की संस्कृति अवधि के दौरान बनाए रखा है और बाद में समय अंक (चित्रा 5E) पर मूल्यांकन नहीं किया गया दिखाई दिया । इसके विपरीत, संवहनी संरचनाओं संस्कृति में पहले दिन के दौरान बरकरार दिखाई दिया, और केवल छोटे संरचनाओं दिन 3 और 7 संस्कृति में मौजूद थे (चित्रा 5F) । इन आंकड़ों का सुझाव है कि कर्णमूलीय संस्कृतियों उनके प्रफलन क्षमताओं और संस्कृति में 7-14 दिनों के लिए सबसे कार्यात्मक क्षमताओं को बनाए रखने और संभवतः एक लंबे समय सीमा के लिए एक अधिक बरकरार ऊतक संरचना प्रदर्शन ।

वाइटटोम संस्कृति मॉडल की कार्यात्मक उपयोगिता विकिरण की एक खुराक के साथ कर्णमूलीय या अवअधोहनुज संस्कृतियों के इलाज के द्वारा संबोधित किया गया था (चित्रा 6, चित्रा 7, चित्रा 8). किरणित माउस मॉडल में पिछले काम कर्णमूलीय ग्रंथि पर ध्यान केंद्रित किया है और apoptosis की प्रेरण कि चोटियों 24 ज, प्रतिपूरक प्रसार के 5 दिन में शुरू करने के प्रेरण का प्रदर्शन, actin दिन 5 पर शुरू तंतु के विघटन, और के नुकसान भिंनता मार्कर (उदा, amylase) 1423,24,26दिन से । कर्णमूलीय vibratome संस्कृतियों के विकिरण 1 दिन में apoptosis में वृद्धि के लिए नेतृत्व किया, 7 दिन में प्रसार में वृद्धि, 7 दिन में actin तंतु के विघटन, और 7 दिन में एमिलेज में कटौती (चित्रा 6) । अवअधोहनुज vibratome संस्कृतियों के किरणन 1 और 3 दिन apoptosis में वृद्धि हुई, 7 दिन में प्रसार में वृद्धि हुई है, और 7 दिन में actin तंतु के विघटन (चित्रा 7) । E-cadherin स्तर दोनों कर्णमूलीय और अवअधोहनुज संस्कृतियों, जो vivo टिप्पणियों26में समान था में अपेक्षाकृत बरकरार दिखाई दिया । कार्यात्मक कोष्ठकी सेल मार्कर अवअधोहनुज ग्रंथि वर्गों में aqp-5 और कर्णमूलीय ग्रंथि वर्गों में एमिलेज 14 दिन में घटी, इसी अनुपचारित समय अंक की तुलना में (चित्रा 8). इन आंकड़ों से यह पता चलता है कि विवो में पाए जाने वाले विकिरण जनित ऊतक परिवर्तन किरणित वाइटटोम संस्कृतियों में भी देखे गए थे ।

Figure 1
चित्रा 1: ५० μm की उज्ज्वल-फील्ड माइक्रोस्कोप छवियां अवअधोहनुज अनुभाग । महिला FVB चूहों से अवअधोहनुज ग्रंथियों (4-8 सप्ताह पुराने) dissected थे, ५० μm मोटाई के लिए sectioned, और 1, 4, 7, 14 के लिए organotypic सेल संस्कृति आवेषण पर सुसंस्कृत, और 30 दिनों के बाद 0%, २.५%, ५.०% पर dissection, और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FVB) संस्कृति विशेषताओं का निर्धारण और संस्कृति की स्थिति का अनुकूलन । स्केल पट्टियां = २०० μm । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: व्यवहार्यता धुंधला अवअधोहनुज अनुभाग । (क) ५० μm अवअधोहनुज की चमकदार क्षेत्र माइक्रोस्कोप छवियां 4 से 8 सप्ताह पुरानी महिला fbv चूहों से विच्छेदार और trypan नीला के साथ दाग (०.४%) २.५% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) युक्त मीडिया के साथ संस्कृति में 1, 3, 7, 14, और 30 दिनों में । (ख) ९० μm अवअधोहनुज वर्गों (बाएँ पैनल) के उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप छवियों, trypan नीले (मध्य पैनल) के साथ दाग, आधे में कटौती और trypan नीले (सही पैनल) के साथ दाग, तो मीडिया में 30 दिनों के बाद-विच्छेदन के लिए संवर्धित २.५% fbs युक्त । (ग) विभिन्न fbs सांद्रता में ५० μm अवअधोहनुज अनुभागों की प्रतिदीप्त छवियां (0%, २.५%, 5%, 10%) calcein के साथ दाग संस्कृति दिवस 7 पर लाइव कोशिकाओं (हरा) से संकेत मिलता है । स्केल पट्टियां = २०० μm । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: में प्रफलन और अपोप्तोटिक मार्कर का मूल्यांकन अवअधोहनुज organotypic ऊतक स्लाइस । महिला FVB चूहों से अवअधोहनुज ग्रंथियों (4-8 सप्ताह पुराने) dissected थे, ५० μm मोटाई के लिए कटा हुआ है, और 1, 3, 7, 14 के लिए organotypic सेल संस्कृति आवेषण पर २.५% FVB के साथ पूरक मीडिया में सुसंस्कृत, और 30 दिनों के बाद विच्छेदन । संकेत समय अंक में, स्लाइसें और तय किया गया प्रफलन (Ki67) और अपोप्तोटिक के लिए दाग (cleaved caspase-3) मार्करों । (क) Ki67-धनात्मक कोशिकाओं (हरा) तथा नाभिक (नीला) का प्रतिदीप्त अभिरंजक (ब) एक स्लाइस के दो व्यूपाइंट से क्लीवेन्ट कैस्पिस-3-पोसेटिव सेल्स (लाल) और नाभिक (नीला) का इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला होना । शीर्ष पंक्ति पैनल एक स्लाइस के किनारे पर cleaved caspase-3-सकारात्मक कोशिकाओं को प्रदर्शित करता है, और नीचे पंक्ति पैनल एक टुकड़ा के बीच से cleaved caspase-3-सकारात्मक कोशिकाओं को प्रदर्शित करता है । प्रतिनिधि संनाभि छवियों समय बिंदु प्रति एकाधिक z-ढेर से चुना गया । स्केल पट्टियां = 30 μm. इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: सेलुलर संरचनाओं की उपस्थिति में अवअधोहनुज अंगप्ररूपी ऊतक स्लाइस . महिला FVB चूहों से अवअधोहनुज ग्रंथियों (4-8 सप्ताह पुराने) dissected थे, ५० μm मोटाई के लिए कटा हुआ है, और 1, 3, 7, 14, या 30 दिनों के बाद के लिए organotypic सेल संस्कृति आवेषण पर २.५% FVB के साथ पूरक मीडिया में सुसंस्कृत । संकेत समय अंक में, स्लाइसें तय किया गया और नाभिक (नीला) के साथ उनके इसी मार्कर के लिए दाग । (क) अवअधोहनुज खंडों का मूल्यांकन ई-कैडहेराइन, चिकनी मांसपेशी एक्टिन (एसएमए) और एफ-एसीटिन (phalloidin) के स्तरों के लिए 1, 7, 14, और 30 दिनों के बाद किया गया था । (ख) अवअधोहनुज खंडों का मूल्यांकन CD31 (वैस्क्युलेचर) और TUBB3 (ंयूरॉंस) के स्तरों के लिए 1, 3 और 7 दिनों में किया गया था । Aquaporin-5 (Aqp5) दिन 1, 3, 7, और 14 में मूल्यांकन किया गया था । प्रतिनिधि संनाभि छवियों समय बिंदु प्रति एकाधिक z-ढेर से चुना गया । स्केल पट्टियां = 30 μm । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: बराबर organotypic ऊतक स्लाइस में प्रफलन और कार्यात्मक मार्कर का मूल्यांकन। महिला FVB चूहों से parotid ग्रंथियों (4-8 सप्ताह पुराने) dissected थे, ५० μm मोटाई के लिए कटा हुआ, और 1, 3, 7, या 14 दिनों के बाद के लिए organotypic सेल संस्कृति आवेषण पर २.५% FVB के साथ पूरक मीडिया में सुसंस्कृत । संकेत समय अंक में, स्लाइसें तय किया गया और नाभिक (नीला) के साथ उनके इसी मार्कर के लिए दाग । (क) Ki67-धनात्मक कोशिकाओं (हरित) का प्रतिदीप्त अभिरंजक (ख) एमिलेस-पॉजिटिव सेल्स (लाल) का इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला होना । (ग) (Aqp5)-पॉजिटिव सेल्स (ग्रीन) इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला । (घ) ई-कैडहेरिअन (लाल) धनात्मक कोशिकाओं का प्रतिदीप्त अभिरंजक (ङ) TUBB3 (मैग्नेटा) धनात्मक कोशिकाओं द्वारा दर्शाए गए न्यूरॉन्स का इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला होना । (च) CD31 (लाल) धनात्मक कोशिकाओं द्वारा दर्शाए गए वाहिका के प्रतिदीप्त अभिरंजक का अभिरंजन । प्रतिनिधि संनाभि छवियों समय बिंदु प्रति एकाधिक z-ढेर से चुना गया । स्केल पट्टियां = 30 μm; d = वाहिनी कोशिकाओं । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र 6: कर्णक organotypic ऊतक स्लाइस के विकिरण के बाद सेलुलर परिवर्तन । महिला FVB चूहों से parotid ग्रंथियों (4-8 सप्ताह पुराने) dissected थे, ५० μm मोटाई के लिए कटा हुआ, और organotypic सेल संस्कृति आवेषण पर २.५% FVB के साथ पूरक में सुसंस्कृत । 1 दिन के बाद-विच्छेदन, स्लाइस के एक सबसेट 5 Gy विकिरण को उजागर किया गया था और 2, 4, या 8 दिनों के बाद के लिए बनाए रखा-विच्छेदन (दिन 1, 3, और 7 के बाद विकिरण) । (क) Ki67 (हरा)-सकारात्मक कोशिकाओं के स्तर का निर्धारण करने के लिए अनुपचारित और विकिरणित कर्णमूलीय वर्गों के immunoफ्लोरोसेंट धुंधला, (ख) cleaved caspase 3 (लाल)-सकारात्मक कोशिकाओं, (ग) phalloidin (सिअन)-सकारात्मक कोशिकाओं, (घ) एमिलेज (लाल)-सकारात्मक कोशिकाओं, और (ई) ई cadherin (लाल) सकारात्मक कोशिकाओं । सभी परमाणु धुंधला dapi (नीला) का उपयोग किया । प्रतिनिधि संनाभि छवियों एकाधिक z-स्टैक प्रति समय बिंदु से चयनित किए गए थे । स्केल पट्टियां = 30 μm । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्र 7-अवअधोहनुज organotypic ऊतक स्लाइस के विकिरण के बाद सेलुलर परिवर्तन. महिला FVB चूहों से अवअधोहनुज ग्रंथियों (4-8 सप्ताह पुराने) dissected थे, ५० μm मोटाई के लिए कटा हुआ है, और organotypic सेल संस्कृति आवेषण पर २.५% FVB के साथ पूरक मीडिया में सभ्य । 1 दिन के बाद-विच्छेदन, स्लाइस का एक सबसेट 5Gy के साथ किरणित और 2, 4, या 8 दिनों के बाद के लिए बनाए रखा गया था विच्छेदन (दिन 1, 3, और 7 के बाद विकिरण) । (क) Ki67 (हरा)-धनात्मक कोशिकाओं के स्तर को निर्धारित करने के लिए अनुपचारित और विकिरणित अवअधोहनुज खंडों का प्रतिदीप्त अभिरंजन, ( ख) क्लीसनेस 3 (लाल)-सकारात्मक कोशिकाओं, (ग) phalloidin (सिअन)-सकारात्मक कोशिकाओं, (घ) aquaporin 5 (Aqp5) (हरा)-सकारात्मक कोशिकाओं, और (ई) ई cadherin (लाल) सकारात्मक कोशिकाओं । सभी परमाणु धुंधला dapi (नीला) का उपयोग किया । प्रतिनिधि संनाभि छवियों एकाधिक z-स्टैक प्रति समय बिंदु से चयनित किए गए थे । स्केल पट्टियां = 30 μm । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्र 8: किरणित कर्णक और अवअधोहनुज organotypic ऊतक स्लाइस में कार्यात्मक कोष्ठकी मार्कर । महिला FVB चूहों से अवअधोहनुज और कर्णमय ग्रंथियों (4-8 सप्ताह पुराने) dissected थे, ५० μm मोटाई के लिए कटा हुआ, और organotypic सेल संस्कृति आवेषण पर २.५% FVB के साथ पूरक मीडिया में सभ्य । 1 दिन के बाद-विच्छेदन, स्लाइस का एक सबसेट 5Gy के साथ किरणित और 14 दिनों के बाद विकिरण के लिए बनाए रखा गया था । अनुपचारित (यूटी) और किरणित (IR) वर्गों के immunoफ्लोरोसेंट धुंधला का स्तर निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया (एक) aquaporin-5 (Aqp5) (हरा)-सकारात्मक कोशिकाओं और (ख) एमिलेज (लाल)-सकारात्मक कोशिकाओं । सभी परमाणु धुंधला dapi (नीला) का उपयोग किया । प्रतिनिधि संनाभि छवियों एकाधिक z-स्टैक प्रति समय बिंदु से चयनित किए गए थे । स्केल पट्टियां = 30 μm । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

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Discussion

लार ग्रंथि अनुसंधान संस्कृति मॉडल के एक नंबर का उपयोग किया है, अमर 2 सहित-D संस्कृतियों, प्राथमिक 2-डी संस्कृतियों, 3 डी salisphere संस्कृतियों, और 3-भ्रूणीय explants से डी अंग संस्कृतियों अंतर्निहित जीव विज्ञान और शरीर विज्ञान पर सवालों का पता लगाने के लिए । इन संस्कृति मॉडल अनुसंधान सवालों की एक विविध सरणी भर में व्यावहारिक जानकारी मिली है और लार अनुसंधान में महत्वपूर्ण उपकरण होना जारी रहेगा । इन संस्कृति मॉडलों की सीमाएं imनश्वर के दौरान p53 गतिविधि के मॉडुलन, प्राथमिक संस्कृतियों की क्षणिक व्यवहार्यता, संस्कृति में भेदभाव और स्रावी प्रोटीन की हानि, और सेल-सेल, सेल-ECM और polarity का मूल्यांकन करने में असमर्थता शामिल वयस्क ऊतकों में बातचीत । पहले 3-डी organotypic स्लाइस संस्कृति (vibratome sectioned संस्कृतियों) लार ग्रंथियों के लिए विधि २००८18में प्रकाशित किया गया था; हालांकि इस तकनीक का अन्य क्षेत्रों में लगातार उपयोग करने के बावजूद इस क्षेत्र में काफी हद तक कम उपयोग किया गया है । ४८ एच, जो विकिरण उपचार के बाद जीर्ण प्रभाव के लिए इन वर्गों का अध्ययन करने की क्षमता को सीमित करता है और विशिष्ट जीन के हेरफेर के बाद फीनोटाइप के लिए अभिकर्मक या ट्रांसडक्शन प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए काम सुसंस्कृत कर्णमूलीय वर्गों । विधि यहां वर्णित करने के लिए संस्कृति में लंबे समय के लिए अनुमति देने के लिए अनुकूलित किया गया है, संनाभि माइक्रोस्कोपी के माध्यम से उच्च संकल्प छवियों उपज, एक 3-डी अनुभाग पर अंतर और अंतरकोशिकीय गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक विधि प्रदान करते हैं, और के दौरान विकिरण प्रेरित परिवर्तन का मूल्यांकन एक संस्कृति की अवधि कम से 14 दिनों की ।

जबकि प्रत्येक कदम तकनीक के कार्यांवयन के लिए आवश्यक है, कुछ कदम सफल परिच्छेदन और संस्कृति के रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण हैं । ये लार ग्रंथि स्लाइस काटने शामिल हैं, संस्कृति में स्लाइस को बनाए रखने, और धुंधला और संनाभि माइक्रोस्कोपी के साथ स्लाइस इमेजिंग । प्रस्तुत प्रोटोकॉल कुछ चुनौतियों है कि धैर्य और अभ्यास की आवश्यकता के लिए विश्लेषण के लिए इष्टतम स्लाइस प्राप्त करने के लिए बन गया है । निंनलिखित सुझाव इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक कार्यान्वित करने में सहायता करेंगे । यह पूरी तरह से विच्छेदन के बाद आसपास के संयोजी ऊतक से लार ग्रंथि को अलग करने के लिए आवश्यक है । अवशिष्ट संयोजी ऊतक एगरोस ब्लॉक से ग्रंथि को बाहर खींचने के लिए वाइटटोम ब्लेड का कारण बनता है और ऊतक को आगरोस में फिर से एंबेड करने की आवश्यकता होती है । यह एक बड़ी सीमा के बाद से कई फिर से embedding संदूषण की संभावना को बढ़ा सकते है और स्लाइस की व्यवहार्यता में कमी हो सकती है । यह विशेष रूप से कर्णमूलीय ग्रंथियों के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि कर्णमूलीय ग्रंथियों संरचना में अधिक lobular और इसलिए अधिक बाहरी ऊतक होने की संभावना है ।

1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन-एम्फोटेरिसिन बी (पीएसए) बफर ट्रे, स्लाइस संग्रह पकवान, और vibratome मीडिया सहित सभी तरल पदार्थ के अलावा स्लाइस के संदूषण के बाद विच्छेदन कम । सफल कटिंग का अनुकूलन करने के लिए ऐगारोस सांद्रण का प्रयोग किया गया । लार ग्रंथियों के घनत्व के कारण, १.९% agarose बहुत नरम था, और ग्रंथियों आसानी से ब्लॉक से उखाड़ दिया गया । अन्य क्षेत्रों में vibratome परिच्छेदन का इस्तेमाल किया है ५.०% agarose; हालांकि, इस कारण दांतेदार कटौती और स्लाइसें suboptimal थे । कई agarose प्रतिशत शर्तों के परीक्षण के बाद, 3% agarose वजन और ऊतक के दृढ़ता का समर्थन करने के लिए सबसे इष्टतम था । विशेष रूप से, agarose एकाग्रता वार्नर एट अल और सु एट अल में इस्तेमाल किया भी 3%19,20था ।

इसके अतिरिक्त, कोण, कंपन की आवृत्ति, और ब्लेड की गति को आगे बढ़ाने के लिए ऊतक के आधार पर संशोधित किया जा सकता है sectioned । अवअधोहनुज और कर्णमूलीय लार ग्रंथियों के लिए, एक 15 ° कोण, गति ०.०७५ mm/s, और १०० हर्ट्ज की आवृत्ति sectioning के लिए उपयुक्त थे । लार ग्रंथियों की कोमलता के कारण, इष्टतम काटने की स्थिति ब्लेड एक उच्च कंपन पर ऊतक के माध्यम से धीरे से अग्रिम करने के लिए आवश्यक है । Immunoफ्लोरोसेंट धुंधला के लिए, permeabilization, इंक्यूबेशन्स की अवधि, और धोने कदम इष्टतम दाग के लिए आवश्यक हैं । यदि सकारात्मक धुंधला केवल ऊतक टुकड़ा, proteinase कश्मीर के साथ एक और अधिक कठोर permeabilization की बाहरी परतों में प्रकट होता है की जरूरत हो सकती है, जबकि असमान धुंधला या उच्च पृष्ठभूमि धुंधला ०.२% Triton एक्स के साथ एक कम सख्त धुंधला की आवश्यकता हो सकती है १०० । ऊष्मायन समय उच्च संकेत और कम पृष्ठभूमि के लिए अनुकूलित किया गया है, जो विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी के अनुरूप करने की आवश्यकता हो सकती है । अब धोने कदम उच्च पृष्ठभूमि को कम करने में आवश्यक है और यह विशिष्ट एंटीबॉडी के लिए तैयार किया जा सकता है ।

इस पद्धति का एक प्रमुख आवेदन लार ग्रंथियों के विकिरण जोखिम के बाद विस्तारित काइनेटिक विश्लेषण है । पहले काम किरणित लार ग्रंथियों6,24,25,26, और vibratome संस्कृति प्रणाली के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बाहर काटना महत्वपूर्ण हो सकता है में दोनों तीव्र और जीर्ण चरण परिवर्तन की स्थापना की है उपचार के बाद विशिष्ट समय बिंदुओं पर आणविक घटनाओं । उदाहरण के लिए, विकिरण प्रेरित लार ग्रंथि है कि साहित्य में रिपोर्ट किया गया है में सेलुलर परिवर्तन, amylase में कटौती सहित, कोष्ठकी कोशिकाओं के apoptosis, कोष्ठकी कोशिकाओं के प्रतिपूरक प्रसार, polarity और अवरोधों की हानि में कोशिका कंकाल संरचना | विशेष रूप से, vibratome संस्कृतियों पूर्व vivo में इन मार्कर में इसी तरह के परिवर्तन प्रदर्शन किरणित ।

इसके अलावा, लार ग्रंथियों में तीव्र चरण प्रतिक्रिया p53 गतिविधि के आसपास की धुरी; तथापि, यह स्पष्ट नहीं है जो भूमिका p53 बाद के समय में नाटकों ~ 5 प्राथमिक संस्कृतियों के दिन की व्यवहार्यता के कारण अंक । इस प्रणाली के बाद समय बिंदुओं पर p53 गतिविधि के पूर्व vivo, नियंत्रित व्यवधान की अनुमति होगी और पुरानी क्षति या पुनर्योजी प्रतिक्रियाओं में एक भूमिका को उजागर । इसके अलावा, विकिरण उपचार के 5 दिन बाद प्रतिपूरक प्रसार प्रतिक्रिया शुरू की जाती है, और क्षणिक प्राथमिक संस्कृतियों में इस प्रतिक्रिया के आणविक नियामकों को चित्रित करना कठिन है । इस पद्धति के सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया आवेदन की संभावना सेल सेल, सेल-ECM, और वयस्क ऊतकों में polarity बातचीत शामिल होगा । Impactful अध्ययन 3 में आयोजित किया गया है भ्रूण ग्रंथियों से डी अंग संस्कृतियों लार ग्रंथियों और न्यूरोनल या नाड़ी नेटवर्क के विकास के बीच जटिल बातचीत को उजागर करने के लिए27,28,29, 30,31.

विधि यहां वर्णित इंगित करता है कि आगे अनुकूलन अवअधोहनुज संस्कृतियों और संभवतः कर्णमूलीय संस्कृतियों में न्यूरोनल या संवहनी काम के लिए आवश्यक है । विकिरण क्षति भी junctional नियामकों बाधित, कोलेजन बयान लाती है, F-actin संगठन, और नियमन करता है स्रावरोधक granules26,30,३२। लार ग्रंथि उत्थान अध्ययन इन बातचीत का मूल्यांकन करने के लिए एक वयस्क मॉडल की अनुपस्थिति से विकलांग हैं. इस organotypic संस्कृति विधि एक प्रणाली प्रदान करने के लिए उंनत आणविक तकनीक लागू कर सकते है और आगे एक 3-डी संदर्भ में इन मध्यस्थों के विनियमन का अध्ययन और कुशलता से नई चिकित्सा की खोज ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम के पायलट अनुसंधान और डिस्कवरी और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के एरिजोना कार्यालय (R01 DE023534) के द्वारा क्रिस्टन Limesand के विश्वविद्यालय द्वारा प्रदान की वित्त पोषण द्वारा भाग में समर्थित किया गया था । कैंसर जीवविज्ञान प्रशिक्षण अनुदान, T32CA009213, वेन यू वांग के लिए वजीफा सहायता प्रदान की । लेखक अपने मूल्यवान तकनीकी योगदान के लिए एम. राइस का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vibratome VT1000S Leica Biosystems N/A Vibratome for sectioning
Double Edge Stainless Steel Razor Blades Electron Microscopy Sciences 72000
Agarose Fisher Scientific BP165-25 Low-melt
Parafilm Sigma-Aldrich P6543
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Lonza 17-745H PSA
24-well plate CellTreat 229124
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) Gibco 14190-144
Loctite UltraGel Control Superglue Loctite N/A Purchased at hardware store
Natural Red Sable Round Paintbrush Princeton Art & Brush Co 7400R-2
Gentamicin Sulfate Fisher Scientific ICN1676045
Transferrin Sigma-Aldrich T-8158-100mg
L-glutatmine Gibco 25030-081
Trace Elements MP Biomedicals ICN1676549
Insulin Fisher Scientific 12585014
Epidermal Growth Factor Corning 354001
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H0888
Retinoic acid Fisher Scientific R2625-50MG
Fetal Bovine Serum Gibco A3160602
DMEM/F12 Media Corning 150-90-CV
Millicell Cell Culture Insert Millipore Sigma PICM01250 12 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate
0.4% Trypan Blue Sigma-Aldrich T8154
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) Thermo-Fisher R37601 Only used LIVE dye component
Anti-Ki-67 Antibody Cell Signaling Technology 9129S
Anti-E-cadherin Antibody Cell Signaling Technology 3195S
Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody Cell Signaling Technology 9661L
Anti-SMA Antibody Sigma-Aldrich C6198
Anti-amylase Antibody Sigma-Aldrich A8273
Anti-CD31 Antibody Abcam ab28364
Anti-TUBB3 Antibody Cell Signaling Technology 5568S
Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit Thermo-Fisher A20185
Alexa Fluor 594 Phalloidin Thermo-Fisher A12381
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1600
Triton X-100 Sigma-Aldrich 21568-2500
Paraformaldehyde Prills Fisher Scientific 5027632
New England Nuclear Blocking Agent Perkin Elmer 2346249 No longer sold
DAPI Cell Signaling Technology 4083S
Prolong Gold Antifade Mounting Media Invitrogen P36934
Leica SPSII Spectral Confocal Leica Biosystems N/A For confocal imaging
Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope Leica Biosystems N/A
Cobalt-60 Teletherapy Instrument Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80 N/A
Amac Box, Clear The Container Store 60140 Agarose block mold

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References

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दवा मुद्दा १४७ अवअधोहनुज लार ग्रंथि vibratome संस्कृति विकिरण कर्णमूलीय लार ग्रंथि organotypic संस्कृति ज़ेरोस्टोमिया
अवअधोहनुज और Parotid लार ग्रंथियों मॉडल में से Organotypic संस्कृतियों के विकिरण उपचार Vivo में विशेषताएं
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Meyer, R., Wong, W. Y., Guzman, R.,… More

Meyer, R., Wong, W. Y., Guzman, R., Burd, R., Limesand, K. Radiation Treatment of Organotypic Cultures from Submandibular and Parotid Salivary Glands Models Key In Vivo Characteristics. J. Vis. Exp. (147), e59484, doi:10.3791/59484 (2019).

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