Summary
利用三维有机型培养物来可视化唾液腺的形态和功能标记, 可以为辐射后组织损伤的机制提供新的见解。这里描述的是一个协议的部分, 培养, 辐照, 染色, 和图像50-90 微米厚的唾液腺部分之前和之后的电离辐射照射。
Abstract
尿道下管和口口术会引起慢性口腔并发症, 降低接受放射治疗的头颈部癌症患者的生活质量。了解唾液腺功能障碍和修复机制的实验方法集中在体内模型上, 这些模型因无法系统筛选治疗候选体和转染效率而受到阻碍操纵特定基因的能力。这一唾液腺有机型培养协议的目的是评估培养活力的最长时间, 并描述体内放射治疗后的细胞变化特征。我们使用免疫荧光染色和共聚焦显微镜来确定在30天的培养期间, 特定的细胞群和标记物何时存在。此外, 以前在体内辐射模型中报告的细胞标记在体内辐照的培养物中进行评估。展望未来, 该方法是一个有吸引力的平台, 用于快速的体外评估小鼠和人唾液腺组织对治疗药物的反应, 改善唾液功能。
Introduction
适当的唾液腺功能对口腔健康至关重要, 并在头颈部癌症治疗后使用放射治疗1 改变。2017年, 美国报告了近 50,000例头颈部癌症新病例。由于放射治疗对唾液腺等周围正常组织的破坏和往往不可逆转的影响, 患者往往会受到严重的副作用和生活质量的下降 2,3, 4. 我的工作是什么？辐射损伤引起的常见并发症表现为症状, 如口干 (口腔干燥的主观感觉)、蛀牙、咀嚼和吞咽能力受损、言语障碍和口腔微生物受损 2,3 个,4. 这些症状共同导致受影响个人营养不良和生存受损 5。虽然这一人群中的唾液腺功能障碍有据可查, 但对腺节细胞损伤的潜在机制存在争议, 不同动物模型6、7 之间几乎没有整合。
目前研究唾液腺功能和辐射引起的损伤的方法包括使用体内模型、永生细胞系、二维 (2-D) 原代细胞培养和三维 (三维) salisphere 培养物8, 9,10,11,12。传统上, 来自不朽细胞系和二维培养的细胞培养模型涉及在平坦表面培养的单层细胞, 对于快速、简单且经济高效的实验非常有价值。然而, 人工细胞培养条件会改变暴露在各种条件下的细胞的分化状态和生理反应, 其结果往往不能转化为整个生物体模型14,15.此外, 永生细胞培养物需要调节 p53 活性, 这对唾液腺对 dna 损伤的反应至关重要, 为 16,17。
三维 salisphere 培养在培养的早期时间为干细胞和祖细胞丰富, 对了解这一亚度腺体细胞的放射敏感性有很好的了解 9,18。所有这些培养模型的一个关键限制是, 它们在可视化唾液腺的三维结构方面是无效的, 包括细胞外基质 (ECM) 和细胞在不同层的相互作用, 而这些是调节唾液的关键分泌物15。需要一种方法, 包括整个组织的行为, 但也可以在实验室条件下操纵, 以研究治疗的效果, 是必要的, 以进一步发现辐射引起的唾液腺的潜在机制功能 障碍。
活组织切片和培养已被记录以前19,20 , 经常被用来研究脑组织相互作用21。在以前的研究中, 小鼠腮腺 (PAR) 唾液腺组织被分割在大约 50μm, 培养到 48小时, 此后对活力、细胞死亡和功能进行了分析, 19。Su 等人(2016) 通过在 14天20天内培养人类下颌骨腺体 (Smg) 以35μm 或50μm 的速度进行扩展.该方法的进展是, 它包括腮腺和下颌唾液腺被分割在50μm 和90μm 和评估的培养30天。切割一系列组织厚度的能力对于评估细胞和细胞-ecm 相互作用很重要, 而这些相互作用与细胞过程有关, 包括顶基底外侧极性和分泌的神经支配。此外, 在培养过程中对唾液腺切片进行了辐照, 以确定该培养模型研究辐射引起的唾液腺损伤的可行性。
这一唾液腺有机型培养协议的目的是评估培养活力的最长时间, 并描述体内放射治疗后的细胞变化特征。为了确定解剖后可行的最长时间段, 进行了色氨酸蓝染色、活细胞染色和细胞死亡的免疫组织化学染色。共聚焦显微镜和免疫荧光染色用于评估特异性细胞群、形态结构和增殖水平。组织切片培养物也暴露在电离辐射下, 以确定辐射对这一三维模型中各种标记的影响。将诱导细胞死亡、细胞骨架破坏、分化标记丧失和在辐照体外培养物中的代偿增殖与以往体内模型的研究进行了比较。该方法为研究辐射损伤后细胞间相互作用提供了一种手段, 并为有效评估治疗干预 (基因操纵或药理药物) 的有效性提供了实验模型), 可能不太适合体内模型。
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Protocol
1. 振动体的制备
- 喷涂可拆卸部件的振动, 包括缓冲盘, 刀片附件, 琼脂糖块模具, 和实验室膜与70% 乙醇, 然后 uv 消毒至少30分钟。
- 在缓冲盘上放置并固定一张额外的实验室薄膜, 以防止冰层掉进去。
- 用碎冰填充冰室, 从缓冲盘中取出实验室膜, 然后用100毫升的冰凉1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 溶液填充缓冲盘, 辅以1% 青霉素-氨匹西林 (PSA)。
- 将不锈钢剃须刀刀片放入刀片支架中。使用螺丝刀拧紧并改变刀片的角度。
2. 琼脂糖块中组织样品的制备和振动体切片
- 高压灭菌器所有必要的解剖和切片工具, 包括钳子、剪刀和画笔。
- 在无菌 1x PBS 和微波中制备3% 的低熔点琼脂糖, 直到琼脂糖溶解成溶液。确保溶液不会沸腾, 定期将瓶子旋涡混合。
注: 防止低熔融琼脂糖在一个温暖的水浴中固化。低熔融琼脂糖是37°c 的流体, 设置在25°c。然而, 水浴应低于 40°c, 以便在生理温度下将琼脂糖倒在组织周围。 - 分离唾液腺, 并将解剖组织放入2毫升冰冷 1x PBS 中, 在无菌的30毫米培养皿中补充1% 的 PSA。
- 使用高压钳, 从 1x PBS + 1% PSA 溶液中取出唾液腺, 并将其放置在嵌入模具的底部。用液体填充3% 低熔点琼脂糖覆盖组织。
- 使用钳子, 将组织调整到块的中间, 并将唾液腺放置在适当的平面上。下颌和腮腺的最佳横截面在垂直平面上。
- 在冰上放置琼脂糖块10分钟硬化。
- 小心地在琼脂糖的外缘周围运行剃须刀片, 以松开, 并让块从步骤1.1 开始滑落到紫外线消毒的实验室薄膜上。
- 用剃须刀片切掉一个含有唾液腺的琼脂糖盒。确保截面的平面是直的, 与块的另一侧平行 (将粘合的表面)。因为琼脂糖不渗透组织, 不修剪太多琼脂糖周围的组织, 所以组织将得到很好的支持。
- 使用超级胶将块连接到切割表面。
- 在50μm 或90μm 厚度的截面上, 以0.075 毫米的速度和 100 hz 的频率通过振动体进行振动。
注: 将振动组设置为最高频率和最低刀片速度可提供最佳切片。 - 收集在一个24孔组织培养盘含有 ~ 1 毫升冰凉 PBS 每口使用蒸压, 天然毛发画笔的部分, 把刷子在70% 的乙醇之间的切片集合, 以保持无菌。
3. 培养区
- 高压灭菌器, 微型铲子和钳子。
- 制作有或不含有胎儿牛血清 (FBS) 的股票振动体培养基: DMEM/F12 培养基补充 1% PSA, 5μg/ml 转铁蛋白, 1.1μm 氢化可的松, 0.1μm 维甲酸, 5μgml 胰岛素, 80 ngml 表皮生长因子, 5mm l-谷氨酰硫酸庆大霉素和10μlml 微量元素混合物。添加适当数量的 FBS, 使0%、2.5%、5.0% 或10% 的解决方案。
- 在切片之前, 加入300Μl 的预热介质, 并将直径为12毫米、0.4μm 的孔径膜插入24孔组织培养板的每口井中。培养基应到达膜底, 形成用于培养的液-空气界面。
- 在加湿 5% co 2 和95% 空气气氛孵化器中, 用微铲子在37°c 时培养, 轻轻地将唾液部分放置在膜插入物的顶部。
- 每隔一天或根据需要, 将大约300Μl 原生培养基放入井中, 并在膜插入物中滴几滴 (约 40Μl)。适当的培养表明, 这些细胞能够存活, 并在体内维持长达 3 0天。
4. 唾液腺部分的辐射
- 使用钴-60 (或等效) 辐照器治疗单剂量辐射 (5 戈瑞) 的部分。
- 运输部分到辐照器设施使用有盖发泡胶容器, 以避免温度波动。此外, 在运输回实验室孵化器的过程中, 需要小心, 以确保介质不会溅到培养盖上并诱发污染。
- 将距离放射源80厘米的24孔板放置在 32 "x 32" 辐射场的中心。辐射剂量计算和相应的时间将因仪器和钴-60 衰变而异。
- 如第3节所述, 继续监测和培养这些部分。
5. 可振动染色
- 吸收旧培养基, 用无菌、预热的 1x PBS 清洗切片两次。
- 用色氨酸蓝色染料染色部分。
- 使用微型铲子将切片从培养物移动到玻璃滑梯上。
- 在有足够体积覆盖组织 (10–20μl) 的振动片中加入0.4% 的色氨蓝色溶液。
- 在室温下 (RT) 在色氨酸蓝色中进行切片, 时间为 1–2分钟, 使染料能够穿透组织。不可行的细胞将被染成蓝色, 有活力的细胞将不被染色。
- 用钙素染色, AM 活细胞染料染色。
- 添加足够体积的污渍, 以覆盖24井板 (200–300μl) 的井中的部分。
- 在 RT 中培养切片 15分钟, 以允许染料渗透。
- 小心地从井上取下部分, 放在玻璃滑梯上。使用1滴安装介质安装切片。
- 荧光显微镜上的图像切片, 发射波长为488纳米和515纳米。
6. 抗体染色振动部分
注: 以下是针对 ki-67 的一般抗体染色协议;然而, 该协议可以与任何抗体一起使用。除非另有说明, 所有清洗都在 RT 进行。
- 在多井组织培养皿中, 抽吸培养基, 用无菌 1x PBS 清洗至少2倍。
- 在4°C 下使用4% 的甲醛 (PFA) 过夜固定部分。
- 吸收4% 的 PFA 和洗涤3倍与 PBT [1x PBS, 1% 牛血清白蛋白 (BSA), 0.1% Triton X-100]。
注: 部分可以存储在 1x PBS 在4°C 和染色后的时间。在这份手稿中测试的最长储存时间为3周。如果需要, 单个用户需要优化更长的存储时间。 - 在 1x PBS 中使用 0.3% Triton X-100 对切片进行30分钟的渗透。
注: 此步骤可以修改和优化特定的抗体染色和渗透。 - 管道脱落渗透液。
- 用 1x PBS、1% BSA 和 0.1% Triton X-100 (PBT) 清洗切片 3x 5分钟。
- 用1% 正常山羊血清阻滞剂将切片块1小时。
- 用 PBT 清洗切片 3x 5分钟。
- 用500μl 抗 ki67 兔单克隆抗体在 1x PBS 中稀释 1% BSA, 在4°c 下隔夜将切片进行隔夜培养。
注: 对于 phalloidin 染色, 跳过步骤 6.9, 然后使用所使用的特定 phalloidin 的协议。对于 DNA 反染色, 请跳到步骤6.15。 - 吸血抗 ki67 兔单克隆抗体。
- 在 1x PBS 中清洗切片 6x 5分钟。
- 将切片在500Μl 荧光共轭二级抗体中培养, 该抗体与抗 Ki67 抗体在 1x PBS 中稀释的 1% BSA 中, 在 rt 中被光覆盖1.5 小时。
注: 根据所使用的二级抗体, 个体用户可以进一步优化与二级抗体的培养时间。此外, 二级抗体是光敏的。所有后续的清洗都必须在黑暗中进行。 - 吸收二级抗体。
- 用 1x PBS 清洗切片 3x 5分钟。
- 在去离子水中清洗切片5分钟。
- 用 DAPI (1Μg/ml) 进行反染色切片20分钟。
- 在去离子水中清洗切片 (一次) 5分钟。
- 用一滴 (~ 40μl) 的安装介质安装切片。为避免过量气泡, 请从45°角度开始, 慢慢将盖板放置在幻灯片上的安装介质上。
- 为了防止用盖板压碎厚的部分, 请用间隔器安装每个切片。通过将真空润滑脂的边缘放置在组织部分周围的正方形中, 可以创建一个垫片。
- 铺设盖板时, 盖板的边缘可以用真空润滑脂密封。用拇指按下盖板的边缘, 将其牢固地粘附在滑梯上。或者, 使用透明的指甲油将盖板密封在显微镜幻灯片上。
7. 成像振动部分
- 在染色后5天内对染色的幻灯片进行成像。
- 使用共聚焦显微镜获得染色振动体切片的光学切片。使用共聚焦显微镜, 获得一个 z 堆栈在一个定义的步骤大小或采取个别图像, 具体取决于用户的实验设计。共聚焦采集后, 任何计算机屏幕上都可以检查图像。
注: 由于振动体切片的厚度, 建议使用共聚焦显微镜或具有 z 堆栈功能的示波器来可视化样品中的细节。对于本手稿中使用的图像, 使用了63x 的石油目标;但是, 这可以由单个用户和使用的特定范围进行定制和进一步修改。对于最小的光学可解析结构, 使用了每个目标的推荐像素分辨率和假定的 Nyquist 采样在 X 和 Y 中的变焦系数。然而, 一些评论家建议2.3 像素, 而另一些评论家则建议2.8 像素。有关如何进行这些计算的更多详细信息, 请参阅《生物共聚焦显微镜手册22》。
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Representative Results
原代二维培养在胎儿牛血清 (FBS) 补充培养基中生长, 而原代三维 salisphere 培养通常在无血清条件下培养 10,11。此外, 前两项研究利用唾液腺的振动体培养物, 以0% 或10% 的 fbs 补充培养基 19,20。使用振动体将小鼠下颌切片切割成50μm 的厚度, 并使用一系列 FBS 浓度 (0%、2.5%、5.0% 和 10%) 确定最佳培养条件。为了确定生存特征, 在培养日1、4、7、14和30节后拍摄了明亮场显微镜图像 (图 1)。此外, 腺体切片染色0.4% 色氨酸蓝色染料, 并在指定的时间点40x 用明亮的场显微镜成像 (图 2 a)。不存活的细胞被染成蓝色, 有活力的细胞保持清晰。
同样, 为了确定在90μm 的切片中, 在适当的培养物中, 在培养基中采集了具有和不具有色氨酸蓝色染色的明亮场显微镜图像, 并辅以 2.5% FBS (图 2b)。由于切片厚度的原因, 对染色为色氨酸蓝色染料的90μm 截面进行了成像, 然后将其切成两半, 以评估切片的中心 (图 2B)。作为确认, 使用活细胞染料来评估细胞在不同 FBS 培养条件下的存活情况 (图 2C)。在明亮的场图像中, 观察到在50微米和90μm 的组织中, 高水平的半透明、存活的细胞。有趣的是, 切片变得更暗, 整个组织面积在培养过程中随着时间的推移而凝结, 但在30天的培养期内, 部分的很大一部分似乎还能存活下来 (图 1, 图 2)。这种冷凝在0% 和10% 的 FBS 养殖条件中最为明显。无论养殖条件如何, 在所有路段的周边都观察到色氨酸蓝阳性细胞, 与较高的 FBS 培养条件相比, 0% FBS 培养条件下的色氨酸蓝阳性细胞面积增加 (图 2 a) , 2 b)。
使用活细胞染色, 培养在0% 的切片显示染色量最低, 在培养培养基中加入 FBS 可以提高活细胞的数量。综合来看, 在 0% FBS 中培养的切片显示可见组织冷凝, 色氨酸蓝色染色面积升高, 活细胞染色水平最低。在培养物中加入2.5% 的 FBS 改善了半透明组织的数量, 减少了色氨酸蓝阳性区, 并提高了活细胞染色水平。FBS 浓度的进一步增加似乎没有提高组织的生存能力;因此, 振动介质中2.5% 的 FBS 是最佳的 FBS 浓度, 并作为后续实验的培养条件。
为了确定下颌体外组织切片后的可行性, 在培养第1、3、7、14和30天进行了增殖和凋亡标记的评估。在培养切片的子集中, 用 Ki67 免疫染色法评估其增殖活性 (图 3 a)。在所有时间点观察到 ki67 阳性细胞, 并在培养过程中继续存在于第30天, 时间点之间的差异最小。同样, 细胞凋亡的程度被通过在一个单独的部分子集中的裂解的 caspase-3 免疫染色来评估 (图 3B)。在培养过程中, 在第14天之前的所有时间点观察到的裂解虾-3 阳性细胞水平较低, 而在一些地区, 第30天的条件似乎略有增加。对组织边缘的评估没有显示更高水平的裂解的 caspase-3, 这并不重述色氨酸蓝色染色 (图 2)。总体而言, 这些结果表明, 在30天的评价期间, 振动培养中仍然存在扩散和活力的线索。
厚截面振动体培养使人们有机会评估特定组织的细胞成分在一个深度上的相互作用, 深度包括每个方向的多个上皮细胞厚度。此外, 重要的是能够培养两个主要的唾液腺, 因为它们在唾液蛋白的组成, 组织结构, 放射敏感性, 和其他关键特征不同。为了确定下颌腺培养物中不同的细胞群, 用 E-cadherin (E-cad) 对下颌下切片进行染色, 以检测上皮细胞、平滑肌肌动蛋白 (SMA) 检测肌上皮细胞和肌动蛋白丝 (phalloidin)。检测培养过程中30天的细胞骨架结构 (图 4 a)。
在大多数细胞的细胞膜上观察到 e-钙粘蛋白染色, 并在整个30天的培养过程中检测到。在整个培养过程中检测到 SMA + 细胞, 每个时间点都有类似的水平。肌动蛋白丝的细胞骨架组织似乎也保持在每个时间点评估。相反, 在整个评估期间, 有一些细胞标记没有得到一致的维持, 其中包括 CD31 (血管)、TUBB3 (神经元) 和 Aquaporin-5 (Aqp-5, acinar 标记) (图4b)。在培养后第1天和第3天, 通过共灶堆栈的血管结构被清楚地观察到;然而, 这些结构在第7天显得支离破碎。同样, 在培养的第一天, 神经元的过程是完整的, 在第3天出现减少, 随后在第7天在培养中丢失。在培养的第1天、第3天、第7天和第14天观察到 aap5 + 细胞;尽管在第14天, 整体染色水平似乎有所下降, 剩余阳性细胞的相似度更小。这些数据表明, 下颌培养物包含组织成分的多样性, 血管和神经元细胞类型的维持较短的培养周期, 上皮和肌上皮细胞类型的较长培养期。
虽然此前曾报道过腮腺的振动分裂培养物, 但这些培养物保持了 48小时, 限制了研究它们的时间框架。为了确定腮腺是否能维持更长的时间, 对小鼠腮腺进行了分离和培养1、3、7或14天。由于小鼠腮腺体积较小, 从腮腺获得的切片较少;因此, 没有尝试30天的文化期。用抗体对 Ki67 进行免疫荧光染色, 对切片菌的增殖进行了评价。与下颌培养类似, 在所有时间点观察到 Ki67 阳性细胞, 表明这些细胞在培养中保持一定程度的增殖 (图 5a)。
此外, 还评估了功能性腺泡标记 (α-淀粉酶和 Aap5)、上皮标记 (E-cad)、血管 (CD31) 和神经元 (TUBB3) 细胞群的维持。淀粉酶是由分化的腮腺上皮细胞产生的最丰富的蛋白质之一, 在原代腮腺细胞的二维培养过程中经常丢失。在振动组培养中, 在整个14天培养过程中, 在腺节细胞中观察到淀粉酶, 并将淀粉酶排除在导管细胞之外 (图 5B)。与下颌培养类似, A糖 5 + 细胞存在于腮腺培养物中的每个时间点, 与早期时间点相比, 第14天的培养水平有所下降 (图 5C)。在14天的培养期间, 大多数细胞的细胞膜上也保持了 e-钙粘蛋白水平 (图 5d)。在7天的培养过程中, 神经结构似乎得到了维持, 后来没有进行评估 (图 5e)。相反, 血管结构在培养的第一天就原封不动, 在培养的第3天和第7天只出现较小的结构 (图 5F)。这些数据表明, 腮腺培养保持其增殖能力和大多数功能的7-14 的培养, 并有可能表现出一个更完整的组织结构更长的时间框架。
通过单剂量辐射治疗腮腺或下颌下培养物, 讨论了振动体培养模型的功能效用 (图 6, 图 7, 图 8)。此前在辐照小鼠模型方面的研究主要集中在腮腺上, 并展示了在24小时时峰值的细胞凋亡诱导、第5天开始的代偿性增殖诱导、第5天开始的肌动蛋白丝的破坏以及丢失的差异化标记 (如淀粉酶), 在第14天 23,24,26。腮腺振动体培养物的照射导致第1天细胞凋亡增加, 第7天肌动蛋白丝增殖增加, 第7天淀粉酶减少 (图 6)。下颌振动体培养物的照射导致第1天和第3天细胞凋亡增加, 第7天增殖增加, 第7天肌动蛋白丝中断 (图 7)。在腮腺和下颌培养中, e-钙粘蛋白水平相对完整, 与体内观察26相似。与相应未经处理的时间点相比, 下颌腺切片的功能性腺细胞标记 Aap-5 和腮腺部分的淀粉酶在第14天有所下降 (图 8)。这些数据表明, 在辐照的振动培养物中也观察到了在体内观察到的辐射诱导的组织变化。
图 1:50 微米的明亮场显微镜图像下颌骨部分.对雌性 FVB 小鼠 (4-8 大) 的下颌腺体进行解剖, 在培养基中进行了0%、2.5%、5.0% 和10% 的胎牛血清 (FBS) 的下解剖后1、4、7、14和30天的有机细胞培养插入物中培养。确定文化特征, 优化文化条件。刻度柱 = 200 微米。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 可访问性染色下颌骨部分.(A)用色氨酸蓝染色的4至8周大雌性 FBV 小鼠下颌骨50μm 显微镜图像 (0.4%)在 1, 3, 7, 14 和30天的培养与培养基含有2.5% 的胎儿牛血清 (FBS)。(B)明亮的领域显微镜图像90μm 的下颌切片 (左面板), 染色为色氨酸蓝色 (中间面板), 切成半切, 染色为色氨酸蓝色 (右面板), 然后培养到含有 2.5% fbs 的介质解剖后30天。(C)在不同 fbs 浓度下培养的50μm 下颌切片的荧光图像 (0%、2.5%、5%、10%)在培养日第7天用钙素 am 染色, 表示活细胞 (绿色)。刻度柱 = 200 微米。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3:增殖和凋亡标记的评价下颌骨有机组织切片.对雌性 FVB 小鼠 (4-8 大) 的下颌腺体进行解剖, 切片至50μm 厚, 并在培养基中培养, 并在有机型细胞培养插入物上添加2.5% 的 FBS, 进行解剖后1、3、7、14和30天。在指示的时间点, 切片被固定和染色增殖 (Ki67) 和凋亡 (裂解的 caspase-3) 标记。(A) ki67 阳性细胞 (绿色) 和细胞核 (蓝色) 的免疫荧光染色。(B)从切片的两种观点对裂解的 caspase-3 正位细胞 (红色) 和细胞核 (蓝色) 进行免疫荧光染色。顶行面板在切片边缘显示被切割的 caspase-3 阳性单元格, 底部行面板显示切片中间的已裂解的 caspase-3 阳性单元格。每个时间点从多个 z 堆栈中选择具有代表性的共聚焦图像。刻度条 = 30μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4:细胞结构的存在在下颌骨组织切片.对雌性 FVB 小鼠 (4-8 大) 的下颌腺体进行解剖, 切片至50μm 厚, 并在培养基中培养, 并在有机型细胞培养插入物上添加2.5% 的 FBS, 在解剖后的1天内进行。在指示的时间点, 切片被固定和染色, 为其相应的标记与细胞核 (蓝色)。(A)在解剖后第1天、第7天、第14天和第30天对下颌切片进行了对 e-钙粘蛋白、平滑肌肌动蛋白 (sma) 和 f-肌动蛋白 (phalloidin) 水平的评估。(B)在第1天、第3天和第7天对下颌下切片的 cd31 (血管) 和 tubb3 (神经元) 水平进行了评估。在第1、3、7和14天对 aquaporin-5 (Aipp5) 进行了评估。每个时间点从多个 z 堆栈中选择具有代表性的共聚焦图像。刻度柱 = 30 微米。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5:Par 组织切片增殖和功能标志物的评价。对雌性 FVB 小鼠 (4-8) 的腮腺进行解剖, 切片至50μm 厚, 并在培养基中培养, 并在培养基中进行补充, 在有机型细胞培养插入物上进行1、3、7或14天的解剖后。在指示的时间点, 切片被固定和染色, 为其相应的标记与细胞核 (蓝色)。(A) ki67 阳性细胞 (绿色) 的免疫荧光染色。(B)淀粉酶阳性细胞 (红色) 的免疫荧光染色。(C)水通道蛋白-5 (A糖 5) 阳性细胞 (绿色) 的免疫荧光染色。(D) e-钙粘蛋白 (红色) 阳性细胞的免疫荧光染色。(E) TUBB3 (磁体) 阳性细胞所指示的神经元的免疫荧光染色。(F) CD31 (红色) 阳性细胞所指示的血管的免疫荧光染色。每个时间点从多个 z 堆栈中选择具有代表性的共聚焦图像。刻度柱 = 30 微米;d = 导管细胞。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6: 腮腺组织切片照射后的细胞变化.对雌性 FVB 小鼠 (4-8) 的腮腺进行解剖, 切片至50μm 厚, 并在 2.5 FBS 的补充下, 在组织型细胞培养插入物上进行培养。在解剖后第1天, 一个切片子集暴露在5戈伊辐射下, 并在解剖后保持2、4或 8天 (对应于第1天、第3天和第7天后辐射)。未处理和辐照腮腺切片的免疫荧光染色, 以确定(a) ki67 (绿色) 阳性细胞、(b )裂解的 caspase 3 (红色) 阳性细胞、 (c) phooidin (青素)-阳性细胞的水平 (d )淀粉酶 (红色) 阳性细胞和(e) e) e-钙粘蛋白 (红色) 阳性细胞。所有核染色均使用 DAPI (蓝色)。从每个时间点的多个 z 堆栈中选择了具有代表性的共聚焦图像。刻度柱 = 30 微米。请点击这里查看此图的较大版本.
图 7: 下颌骨组织切片照射后的细胞变化.对雌性 FVB 小鼠 (4-8) 的下颌腺体进行解剖, 切片至50μm 厚, 并在培养基中培养, 并在有机型细胞培养插入物上补充2.5% 的 FBS。在解剖后的第1天, 对切片的一个子集进行5Ga 的辐照, 并在解剖后保持2天、4天或 8天 (对应于第1天、第3天和第7天后辐射)。未处理和辐照的下颌骨下切片的免疫荧光染色, 以确定(a) ki67 (绿色) 阳性细胞、( b)裂解的 caspase 3 (红色) 阳性细胞、 (c) phalloidin (青素)-阳性细胞 (d) 的水平水通道蛋白 5 (Aqup5) (绿色) 阳性细胞, 和(e) e) 钙粘蛋白 (红色) 阳性细胞。所有核染色均使用 DAPI (蓝色)。从每个时间点的多个 z 堆栈中选择了具有代表性的共聚焦图像。刻度柱 = 30 微米。请点击这里查看此图的较大版本.
图 8: 辐照腮腺和下颌组织切片中的功能尖锐发物标记.对雌性 FVB 小鼠 (4-8) 的下颌和腮腺进行解剖, 切片至50μm 厚, 并在培养基中培养, 并在有机型细胞培养插入物上补充2.5% 的 FBS。在解剖后的第1天, 对一个切片子集进行5Ga 照射, 并在照射后保持14天。未处理 (UT) 和辐照 (IR) 切片的免疫荧光染色用于测定(a)水通道蛋白 5 (aip5) (绿色) 阳性细胞和(b)淀粉酶 (红色) 阳性) 细胞的水平。所有核染色均使用 DAPI (蓝色)。从每个时间点的多个 z 堆栈中选择了具有代表性的共聚焦图像。刻度柱 = 30 微米。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
唾液腺体的研究已经利用了一些培养模型, 包括不朽的二维培养, 初级二维培养, 三维 salisphere 培养, 和三维器官培养从胚胎外植体, 以确定潜在的生物学和生理学的问题。这些文化模式在各种研究问题上产生了有见地的信息, 并将继续成为唾液研究的重要工具。这些培养模型的局限性包括在永生过程中对 p53 活性的调节、原代培养的短暂活力、培养过程中分化和分泌蛋白的丧失, 以及无法评估细胞、细胞 ecm 和极性在成人组织中的相互作用。2008年18年公布了唾液腺的第一个三维有机切片培养 (振动组切片培养物);然而, 尽管在其他领域经常使用, 但这一技术在这一领域的应用基本上没有得到充分利用。工作培养的腮腺切片 48 h, 这限制了研究这些部分的慢性影响后, 放射治疗或利用转染或转导方案的表型操作后, 特定基因的能力。这里描述的方法经过了优化, 可以延长培养时间, 通过共聚焦显微镜产生高分辨率图像, 提供一种方法来研究三维切片的细胞内和细胞间动力学, 并评估辐射引起的变化。至少14天的文化时期。
虽然实现该技术需要每个步骤, 但有些步骤对于成功的切片和文化维护至关重要。这些方法包括切割唾液腺切片, 保持培养中的切片, 染色和用共聚焦显微镜成像切片。提出的协议提出了一些挑战, 需要耐心和实践, 以便获得最佳的分析切片。以下建议将有助于成功执行本议定书。解剖后, 必须将唾液腺与周围结缔组织完全隔离。残留的结缔组织会导致振动体叶片将腺体从琼脂糖块中拖出, 并要求组织重新嵌入琼脂糖中。这可能是一个主要的限制, 因为多次重新嵌入会增加污染的机会, 降低切片的可行性。这对于腮腺的培养尤其重要, 因为腮腺的结构更小, 因此更有可能有外侧组织。
在所有液体中添加1% 的青霉素-链霉素-两性霉素 B (PSA), 包括缓冲盘、切片收集盘和振动体介质, 最大限度地减少了解剖后切片的污染。利用琼脂糖浓度的变化来优化成功的切割。由于唾液腺的密度, 1. 9% 的琼脂糖太软, 腺体很容易从块中脱落。其他领域的振动体切片使用了5.0% 琼脂糖;然而, 这导致锯齿状的削减和切片不理想。在测试了几个琼脂糖百分比条件后, 3% 的琼脂糖是最理想的支持组织的重量和坚定性。值得注意的是, 华纳等人和 su 等人使用的琼脂糖浓度也为 3%19,20。
此外, 刀片的角度、振动频率和前进速度可以根据要分割的组织进行修改。对于下颌和腮腺唾液腺, 适合切片时的角度为15°角, 速度为 0.075 mm/s, 频率为 100 hz。由于唾液腺的柔软性, 最佳的切割条件要求刀片在高振动下缓慢地穿过组织。对于免疫荧光染色, 渗透性、孵育时间和洗涤步骤对于最佳污渍至关重要。如果阳性染色仅出现在组织切片的外层, 则可能需要使用蛋白酶 K 进行更严格的渗透, 而不均匀的染色或高背景染色可能需要使用 0.2% Triton X-100 进行不那么严格的染色。孵育时间针对高信号和低背景进行了优化, 可能需要针对特定的原代抗体进行定制。较长的清洗步骤对于减少高背景是必不可少的, 这可能是针对所使用的特定抗体量身定制的。
这种方法的一个主要应用是唾液腺辐射照射后的扩展动力学分析。此前的工作已经确定, 经过辐照的唾液腺 6、24、25、26的急性和慢性相变, 振动体培养系统可以成为解剖关键的有力工具治疗后特定时间点的分子事件。例如, 文献中报道的辐射引起的唾液腺细胞变化, 包括淀粉酶减少、腺样细胞凋亡、腺样细胞的代偿增殖、极性丧失和细胞骨架结构。值得注意的是, 在体内照射的振动体培养物在这些标记中表现出类似的改变。
此外, 唾液腺的急性期反应在 p53 活性附近旋转;然而, 由于初级文化的可行性, p53 在以后的时间点上扮演什么角色尚不清楚。该系统将允许在体内, 在以后的时间点控制 p53 活性的中断, 并发现在慢性损伤或再生反应中的作用。此外, 补偿性增殖反应在放射治疗后5天开始, 很难在短暂的初级培养中划分这种反应的分子调节器。这种方法最广泛使用的应用可能涉及细胞细胞、细胞 ecm 和成人组织中的极性相互作用。对胚胎腺体的三维器官培养进行了深入的研究, 以揭示发育中的唾液腺与 27、28、29、 30,31。
这里描述的方法表明, 需要进一步优化的神经元或血管工作中的下颌骨培养, 并可能腮腺培养。辐射损伤还会破坏结合部的调节剂, 诱导胶原蛋白沉积, 改变 f-肌动蛋白组织, 调节分泌颗粒26,30,32。唾液腺体再生研究是由缺乏一个成人模型来评估这些相互作用的障碍。这种有机培养方法可以提供一个系统, 应用先进的分子技术, 并进一步研究这些介质在三维环境中的调节, 并有效地发现新的治疗方法。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了亚利桑那州大学研究和发现办公室和国立卫生研究院向 Kirsten Limesand 提供的试点资金的部分支持。癌症生物学培训补助金 T32CA009213 为文宇黄提供津贴支持。作者要感谢赖斯先生所作的宝贵技术贡献。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystems | N/A | Vibratome for sectioning |
| Double Edge Stainless Steel Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | Low-melt |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P6543 | |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B | Lonza | 17-745H | PSA |
| 24-well plate | CellTreat | 229124 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | |
| Loctite UltraGel Control Superglue | Loctite | N/A | Purchased at hardware store |
| Natural Red Sable Round Paintbrush | Princeton Art & Brush Co | 7400R-2 | |
| Gentamicin Sulfate | Fisher Scientific | ICN1676045 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T-8158-100mg | |
| L-glutatmine | Gibco | 25030-081 | |
| Trace Elements | MP Biomedicals | ICN1676549 | |
| Insulin | Fisher Scientific | 12585014 | |
| Epidermal Growth Factor | Corning | 354001 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| Retinoic acid | Fisher Scientific | R2625-50MG | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3160602 | |
| DMEM/F12 Media | Corning | 150-90-CV | |
| Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma | PICM01250 | 12 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate |
| 0.4% Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo-Fisher | R37601 | Only used LIVE dye component |
| Anti-Ki-67 Antibody | Cell Signaling Technology | 9129S | |
| Anti-E-cadherin Antibody | Cell Signaling Technology | 3195S | |
| Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody | Cell Signaling Technology | 9661L | |
| Anti-SMA Antibody | Sigma-Aldrich | C6198 | |
| Anti-amylase Antibody | Sigma-Aldrich | A8273 | |
| Anti-CD31 Antibody | Abcam | ab28364 | |
| Anti-TUBB3 Antibody | Cell Signaling Technology | 5568S | |
| Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Thermo-Fisher | A20185 | |
| Alexa Fluor 594 Phalloidin | Thermo-Fisher | A12381 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 21568-2500 | |
| Paraformaldehyde Prills | Fisher Scientific | 5027632 | |
| New England Nuclear Blocking Agent | Perkin Elmer | 2346249 | No longer sold |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083S | |
| Prolong Gold Antifade Mounting Media | Invitrogen | P36934 | |
| Leica SPSII Spectral Confocal | Leica Biosystems | N/A | For confocal imaging |
| Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope | Leica Biosystems | N/A | |
| Cobalt-60 Teletherapy Instrument | Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80 | N/A | |
| Amac Box, Clear | The Container Store | 60140 | Agarose block mold |
References
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