Summary
Met behulp van driedimensionale organotypic culturen te visualiseren morfologie en functionele markers van speekselklieren kunnen nieuwe inzichten in de mechanismen van weefselbeschadiging na straling. Hier beschreven is een protocol bij sectie, cultuur, bestralen, vlek, en beeld 50 – 90 μm dikke speekselklier secties voorafgaand aan en na blootstelling aan ioniserende straling.
Abstract
Hyposalivation en xerostomie maken chronische orale complicaties die de kwaliteit van leven in hoofd-en nek kankerpatiënten die worden behandeld met radiotherapie verminderen. Experimentele benaderingen van het begrijpen van mechanismen van speekselklier dysfunctie en restauratie hebben zich gericht op in vivo modellen, die gehandicapt zijn door een onvermogen om systematisch screenen therapeutische kandidaten en efficiëntie in Transfectie mogelijkheid om specifieke genen te manipuleren. Het doel van deze speekselklier organotypic cultuur protocol is het evalueren van de maximale tijd van cultuur levensvatbaarheid en karakteriseren cellulaire veranderingen na ex vivo stralingsbehandeling. We gebruikten immunefluorescentie kleuring en confocale microscopie om te bepalen wanneer specifieke cel populaties en markers aanwezig zijn tijdens een 30-daagse cultuurperiode. Bovendien worden de cellulaire markers die eerder in in vivo stralings modellen worden gerapporteerd geëvalueerd in culturen die ex vivo worden bestraald. Moving Forward, deze methode is een aantrekkelijk platform voor snelle ex vivo beoordeling van muizen en menselijke speekselklier weefsel reacties op therapeutische middelen die de speeksel functie te verbeteren.
Introduction
Een goede speekselklier functie is essentieel voor de mondgezondheid en wordt gewijzigd na hoofd en nek kankerbehandeling met radiotherapie1. In 2017, bijna 50.000 nieuwe gevallen van hoofd en hals kanker werden gerapporteerd in de Verenigde Staten2. Wegens de weefsel-beschadigende en vaak onomkeerbare gevolgen van bestralingstherapie op het omringen van normale weefsels zoals speekselklieren, worden de patiënten vaak verlaten met strenge bijwerkingen en verminderde kwaliteit van het leven2,3, 4. Veelvoorkomende complicaties veroorzaakt door stralingsschade manifesteert zich in symptomen zoals xerostomie (het subjectieve gevoel van een droge mond), cariës, verminderde mogelijkheid om te kauwen en slikken, spraakstoornissen, en gecompromitteerd orale microbiomen2, 3 , 4. deze symptomen collectief kan leiden tot ondervoeding en verminderde overleving in de getroffen personen5. Terwijl speekselklier dysfunctie in deze populatie is goed gedocumenteerd, de onderliggende mechanismen van schade aan acinaire cellen zijn betwist, en er is weinig integratie tussen de verschillende diermodellen6,7.
De huidige methoden van het bestuderen van speekselklier functie en straling geïnduceerde schade omvatten het gebruik van in vivo modellen, onsterfelijke cel lijnen, twee-dimensionale (2-D) primaire cel culturen, en drie-dimensionale (3-D) salisphere culturen8, 9,10,11,12. Traditioneel, de modellen van de cel cultuur van vereeuwigde cel lijnen en 2-D culturen impliceren enige gelaagde cellen die op vlakke oppervlakten worden gekweekt en zijn waardevol voor snelle, gemakkelijke, en rendabele experimenten. Echter, kunstmatige cel cultuur voorwaarden kunnen veranderen de differentiatie status en fysiologische reacties van cellen blootgesteld aan verschillende omstandigheden, en de resultaten vaak niet te vertalen naar hele organisme modellen14,15. Bovendien vereisen de vereeuwigde cellen culturen modulatie van p53 activiteit, die voor de speekselklier reactie op de schade van DNA16,17kritiek is.
3-D salisphere culturen zijn verrijkt voor stam-en voorlopercellen in de vroege tijdpunten in de cultuur en zijn nuttig geweest voor het begrijpen van de stralingsgevoeligheid van deze subset van speekselklier cellen9,18. Een kritische beperking van al deze cultuur modellen is dat ze niet effectief zijn in het visualiseren van de 3-D structuur van de speekselklier, met inbegrip van de extracellulaire matrix (ECM) en cel-cel interacties over verschillende lagen, die cruciaal zijn in modulerende speeksel afscheiding15. De noodzaak van een methode die het gedrag van het weefsel als geheel omvat, maar kan ook worden gemanipuleerd onder laboratoriumomstandigheden om de effecten van de behandeling studie is noodzakelijk om verder te ontdekken de onderliggende mechanismen van straling geïnduceerde speekselklier Dysfunctie.
Live weefsel sectie en cultuur is gedocumenteerd eerder19,20 en wordt vaak gebruikt om hersenweefsel interacties studie21. In eerdere studies, parotis (PAR) speekselklier weefsel van muizen werd in deel op ongeveer 50 µm en gekweekt voor maximaal 48 h, en analyse van de levensvatbaarheid, celdood, en functie werd uitgevoerd daarna19. Su et al. (2016) uitgebreid op deze methodologie door kweken Human submandibulaire klieren (SMGs) in 35 µm of 50 µm voor 14 dagen20. De voorgestelde methode is een vooruitgang in dat het zowel parotis als submandibulaire speekselklieren omvat die bij 50 µm en 90 µm en evaluatie van de culturen 30 dagen worden deelgenomen. De capaciteit om een waaier van weefsel dikte te snijden is belangrijk in het evalueren van cel-cel en cel-ECM interactie die voor cellulaire processen met inbegrip van apicaal-basolaterale polariteit en innervatie voor afscheiding relevant zijn. Voorts werden de speekselklier plakken bestraald terwijl in cultuur om de haalbaarheid van dit cultuur model te bepalen om straling-veroorzaakte speekselklier schade te bestuderen.
Het doel van deze speekselklier organotypic cultuur protocol is het evalueren van de maximale tijd van cultuur levensvatbaarheid en karakteriseren cellulaire veranderingen na ex vivo stralingsbehandeling. Voor het bepalen van de maximale tijdsecties die levensvatbaar zijn post-dissectie, trypaanblauw blauwe kleuring, levende cel kleuring, en immunohistochemische kleuring voor celdood werden uitgevoerd. Confocale microscopie en immunefluorescentie kleuring werden gebruikt om specifieke cel populaties, morfologische structuren en niveaus van proliferatie te evalueren. Weefsel sectie culturen werden ook blootgesteld aan ioniserende straling om de effecten van straling op verschillende markers in dit 3-D model te bepalen. De inductie van celdood, cytoskelet verstoring, verlies van differentiatie markeringen, en compenserende proliferatie in bestraalde ex vivo culturen werden vergeleken bij vorige studies van in vivo modellen. Deze methodologie biedt een middel om de rol van cel-cel interacties na stralingsschade te onderzoeken en biedt een experimenteel model om de effectiviteit van therapeutische interventies efficiënt te evalueren (gen manipulaties of farmacologische agentia ) die mogelijk minder geschikt zijn voor in vivo modellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiding van vibratome
- Spray afneembare componenten van de vibratome met inbegrip van de buffer lade, blad gehechtheid, agarose blok mal, en laboratorium film met 70% ethanol, dan UV-steriliseren voor ten minste 30 min.
- Plaats en beveilig een extra vel laboratorium folie over de buffer lade om te voorkomen dat ijs vallen in.
- Vul de Ice kamer met crushed ice, verwijder het laboratorium film uit de buffer lade, en vul de buffer lade met 100 mL ijskoude 1x fosfaat buffered saline (PBS) oplossing aangevuld met 1% penicilline-streptomycine-AMPICILLIN (PSA).
- Plaats een roestvrijstalen scheermesje in de blad houder. Gebruik de schroevendraaier aan te scherpen/los en verander de hoek van het mes.
2. voorbereiding van weefselmonster in agarose blok en segmenteren met behulp van de vibratome
- Autoclaaf alle noodzakelijke dissectie en secties gereedschappen, waaronder tangen, scharen en penselen.
- Bereid 3% laag smeltpunt agarose in steriele 1x PBS en microgolf voor tot agarose in oplossing oplost. Zorg ervoor dat de oplossing niet koken over en draai de fles periodiek te mengen.
Nota: Verhinder de laag-smeltende agarose van het stollen door het in een warmwaterbad te houden. De laag-smelting agarose is vloeistof bij 37 °C en reeksen bij 25 °C. Nochtans, zou het waterbad onder 40 °C moeten zijn om agarose rond het weefsel bij fysiologische temperatuur te gieten. - Isoleer speekselklieren en plaats ontleed weefsel in 2 mL ijskoud 1x PBS aangevuld met 1% PSA in een steriel, 30 mm kweekschaal.
- Met behulp van autoclaaf Tang, verwijder speekselklieren van 1x PBS + 1% PSA-oplossing en de positie aan de onderkant van een inbedding mal. Vul de mal met vloeibare 3% laag smeltpunt agarose om het weefsel te dekken.
- Met behulp van de Tang, het weefsel aan te passen aan het midden van het blok en de positie van de speekselklier in het juiste vlak. De beste dwarsdoorsneden voor de submandibulaire en parotisklieren zijn in het verticale vlak.
- Plaats agarose blok op ijs voor 10 min te harden.
- Zorgvuldig lopen een scheermes rond de buitenste rand van de agarose te los en laat het blok glijden op de UV-gesteriliseerd laboratorium film van stap 1,1.
- Gebruik een scheermesje te snijden uit een agarose vak met de speekselklier. Zorg ervoor dat het vlak van de sectie is recht en evenwijdig aan de andere kant van het blok (het oppervlak dat zal worden gelijmd). Aangezien agarose niet het weefsel infiltreert, trim niet teveel agarose rond het weefsel zodat zal het weefsel goed worden gesteund.
- Gebruik superlijm om het blok te hechten aan het snijvlak.
- Sectie bij 50 µm of 90 µm dikte door vibratome bij een snelheid van 0,075 mm/s en frequentie van 100 Hz.
Opmerking: het instellen van de vibratome op de hoogste frequentie en de laagste snelheid van het blad zorgt voor de meest optimale Slices. - Verzamel secties in een 24-Well weefselkweek gerecht met ~ 1 mL ijskoude PBS per goed met behulp van een gesteriliseerd, natuurlijk haar penseel, het plaatsen van de borstel in 70% ethanol tussen slice collecties te handhaven steriliteit.
3. kweken secties
- Autoclaaf een micro-spatel en een tang.
- Maak voorraad vibratome cultuurmedia met of zonder foetale boviene serum (FBS): DMEM/F12 media aangevuld met 1% PSA, 5 µ g/mL transferrin, 1,1 µ M hydrocortison, 0,1 µ M retinol zuur, 5 µ g/mL insuline, 80 ng/mL epidermale groeifactor, 5 mM L-glutamine, 50 µ g/mL Gentamicine sulfaat, en 10 µ L/mL Trace element mengsel. Voeg een geschikte hoeveelheid FBS toe om 0%, 2,5%, 5,0%, of 10% oplossingen te maken.
- Voorafgaand aan de sectie, voeg 300 l van voorverwarmde media en plaats een 12 mm diameter, 0,4 µm porie-size membraan insert in elk goed van een 24-Well weefselkweek plaat. De media zouden de membraan bodem moeten bereiken om een vloeibare-lucht interface voor cultuur tot stand te brengen.
- Leg voorzichtig de speeksel secties bovenop het membraan tussenvoegsel gebruikend de micro-spatel en de cultuur bij 37 °C in bevochtigde 5% CO2 en 95% de atmosfeer Incubator van de lucht.
- Voeg ongeveer 300 l primaire cultuurmedia toe aan de put en een paar druppels in de membraan inserts (ongeveer 40 l) om de dag of als dat nodig is. Goede kweken toonde aan dat de cellen in staat zijn om te overleven en worden gehandhaafd voor maximaal 30 dagen ex vivo.
4. bestraling van speekselklier secties
- Behandel secties met een enkele dosis straling (5 Gy) met behulp van kobalt-60 (of equivalent) bestraling.
- Transport secties naar bestralings inrichting met behulp van een overdekte piepschuim container om schommelingen in temperatuur te voorkomen. Daarnaast moet de zorg worden genomen tijdens het vervoer terug naar de laboratorium incubator om ervoor te zorgen dat de media niet Splash op cultuur deksel en veroorzaken verontreiniging.
- Plaats de 24-Well plaat met speekselklier secties 80 cm van de stralingsbron, in het midden van een 32 "x 32" straling veld. Straling dosis berekeningen en de bijbehorende tijd in bestraling zal variëren per instrument en kobalt-60 verval.
- Doorgaan met het monitoren en kweken van deze secties zoals beschreven in punt 3.
5. levensvatbaarheid kleuring
- Aspireren oude media en was plakjes tweemaal met steriele, voorverwarmde 1x PBS.
- Vlek secties met trypaanblauw blauwe kleurstof.
- Gebruik een micro-spatel om het segment te verplaatsen van de cultuur naar een glazen glijbaan.
- Voeg 0,4% trypaanblauw blauwe oplossing toe aan de vibratome Slice met voldoende volume om het weefsel te bedekken (10 – 20 µ L).
- Incubeer plakjes bij kamertemperatuur (RT) in de trypaanblauw blauw voor 1 – 2 min voor de kleurstof om het weefsel te penetreren. Niet-levensvatbare cellen zullen blauw worden gekleurd, en levensvatbare cellen zullen worden ongekleurd.
- Vlek secties met calceïne, AM levend-cel kleurstof.
- Voeg voldoende volume van de vlek om de sectie te dekken in een put van een 24 goed-plaat (200-300 µ L).
- Incubeer Slices op RT voor 15 minuten om kleurstof penetratie mogelijk te maken.
- Verwijder voorzichtig de sectie van de put en plaats op een glazen glijbaan. Mount slices met 1 druppel montage media.
- De secties van het beeld op een fluorescente microscoop bij opwindings/emissie golflengten van 488 nm en 515 nm.
6. antilichaam kleuring vibratome secties
Nota: het volgende verstrekt een algemeen antilichaam het bevlekken protocol specifiek voor Ki-67; Nochtans, kan dit protocol met om het even welk antilichaam worden gebruikt. Alle wasbeurten worden uitgevoerd op RT, tenzij anders vermeld.
- In de multi-well tissue cultuur schotel, aspireren off media en wassen ten minste 2x met steriele 1x PBS.
- Fix secties met 4% Paraformaldehyde (middel) overnachting bij 4 °C.
- Aspireren off 4% en was 3x met PBT [1x PBS, 1% boviene serum albumine (BSA), 0,1% Triton X-100].
Nota: de secties kunnen in 1x PBS bij 4 °C worden opgeslagen en op een recentere tijd bevlekt. Maximale opslagtijd getest in dit manuscript was 3 weken. De langere opslagtijd zal door de individuele gebruiker moeten worden geoptimaliseerd als dat wordt gewenst. - Permeabilize secties met behulp van 0,3% Triton X-100 in 1x PBS voor 30 min.
Opmerking: deze stap kan worden aangepast en geoptimaliseerd voor specifieke antilichaam kleuring en permeabilization. - Pipet off permeabilization oplossing.
- Was plakjes 3x voor 5 min met 1x PBS, 1% BSA, en 0,1% Triton X-100 (PBT).
- Blokkeer de plakjes met blokkerende agent met 1% normaal geit serum voor 1 h.
- Was de plakjes 3x voor 5 min met PBT.
- Incubeer de plakjes 's nachts bij 4 °C met 500 µ L anti-Ki67 van het konijn monoclonal antilichaam dat in 1% BSA in 1x PBS wordt verdund.
Opmerking: voor phalloidin kleuring, sla stap 6,9 en ga verder met het protocol voor de specifieke phalloidin gebruikt. Voor DNA eosine, ga naar stap 6,15. - Aspireren anti-Ki67 konijn monoclonal antilichamen.
- Was de plakjes 6x voor 5 min in 1x PBS.
- Incubeer de plakjes in 500 µ L van fluorescently geconjugeerd secundair antilichaam compatibel met anti-Ki67 antilichaam dat in 1% BSA in 1x PBS bij RT voor 1,5 h wordt verdund die van licht wordt behandeld.
Nota: gebaseerd op secundair gebruikt antilichaam, kan de incubatietijd met het secundaire antilichaam verder door de individuele gebruiker worden geoptimaliseerd. Bovendien is het secundaire antilichaam lichtgevoelig. Alle daaropvolgende wasbeurten moeten in het donker worden uitgevoerd. - Aspireren secundair antilichaam.
- Was plakjes voor 3x voor 5 min met 1x PBS.
- Was schijfjes voor 5 min in geioniseerd water.
- Eosine plakjes met DAPI (1 µ g/mL) voor 20 min bij RT.
- Was plakjes (eenmaal) voor 5 min in deioniseerde water.
- Mount slices met een druppel (~ 40 µ L) van de montage media. Om te voorkomen dat overtollige bubbels, langzaam plaats de dekglaasje op de montage media op de dia, te beginnen met een 45 ° hoek.
- Om te voorkomen dat verpletterende de dikke delen met de dekglaasje, Monteer elk segment met een spacer. Een afstandhouder kan worden gemaakt door het plaatsen van een rand van vacuüm vet in een vierkant rond het weefsel sectie.
- Bij het leggen van de dekglaasje kunnen de randen van de dekglaasje met vacuüm vet worden verzegeld. Druk op de randen van de dekglaasje met je duim om stevig te houden op de glijbaan. Alternatief, verzegelt de dekglaasje op de Microscoop dia gebruikend duidelijke nagellak.
7. Imaging vibratome secties
- Afbeelding van de gekleurd dia's binnen 5 dagen na de kleuring.
- Verkrijg optische delen van de gekleurde vibratome plakjes met behulp van een confocale Microscoop. Met een confocale Microscoop, het verkrijgen van een z-stack bij een gedefinieerde stapgrootte of neem individuele beelden, afhankelijk van de gebruiker experimenteel ontwerp. Beelden kunnen worden onderzocht op elke computerscherm na confocale collectie.
Nota: wegens de dikte van de vibratome segmenten, adviseert men dat een confocal microscoop of een werkingsgebied met z-stapel vermogen wordt gebruikt om details binnen de steekproeven te visualiseren. Voor de beelden gebruikt in dit manuscript, werd een 63x olie doelstelling gebruikt; Dit kan echter worden aangepast en verder aangepast door de individuele gebruiker en de specifieke scope gebruikt. De geadviseerde pixelresolutie voor elke objectieve en gezoem factor met de veronderstelde Nyquist bemonstering van 2,5 pixel in X en Y voor de kleinste optisch oplosbaarheid structuur werd gebruikt. Echter, sommige commentatoren suggereren 2,3 pixels, terwijl anderen suggereren 2,8 pixels. Raadpleeg het handboek van de biologische confocale microscopie22 voor verdere details over hoe deze berekeningen te maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Primaire 2-D culturen worden geteeld in foetale boviene serum (FBS) aangevuld media, terwijl primaire 3-D salisphere cultuur worden meestal gekweekt in serum-vrije voorwaarden10,11. Daarnaast, de twee eerdere studies gebruik te maken van vibratome culturen uit speekselklieren gekweekt hun secties in 0% of 10% FBS aangevuld media19,20. Muis submandibulaire plakjes werden op een dikte van 50 µm met behulp van een vibratome en optimale cultuuromstandigheden werden bepaald met behulp van een reeks van FBS concentraties (0%, 2,5%, 5,0%, en 10%). Om de overlevings karakteristieken te bepalen, werden de licht-veld Microscoop beelden genomen bij cultuurdagen 1, 4, 7, 14, en 30 post-sectioning (Figuur 1). Bovendien, klier secties werden gekleurd met 0,4% trypaanblauw blauwe kleurstof en afgebeeld met een helder-veld microscoop op 40x op de aangegeven tijdpunten (Figuur 2a). Niet-levensvatbare cellen werden blauw gekleurd en levensvatbare cellen bleven duidelijk.
Evenzo, om de overlevings kenmerken van dikkere plakjes te bepalen die bij 90 µm worden gesegmenteerd, werden de helder-gebieds Microscoop beelden met en zonder trypaanblauw blauwe kleuring genomen bij dag 30 in culturen die met 2,5% FBS (Figuur 2b) worden aangevuld. Als gevolg van de slice dikte, 90 µm secties gekleurd met trypaanblauw blauwe kleurstof werden afgebeeld geheel vervolgens in tweeën gesneden om het centrum van de slice (Figuur 2b) te evalueren. Ter bevestiging, een Live-Cell kleurstof werd gebruikt om de overleving van cellen te evalueren in verschillende FBS kweken voorwaarden (figuur 2c). In helder-gebied beelden, werden de hoge niveaus van doorschijnende, overlevende cellen in weefsels die bij zowel 50 µm als 90 µm worden geconstateerd waargenomen. Interessant, werden de secties donkerder en het algemene weefsel gebied condenseert in tijd in cultuur, nog schijnt een significant gedeelte van de sectie om de periode van de 30 dagen cultuur (Figuur 1, figuur 2) te overleven. Deze condensatie was het meest duidelijk in de 0% en 10% FBS kweken voorwaarden. Trypaanblauw blauwe positieve cellen werden waargenomen op de rand van alle secties, ongeacht kweken omstandigheden, en er was een toename in trypaanblauw blauwe positieve cel gebied in 0% FBS cultuur voorwaarden in vergelijking met de hogere FBS kweken voorwaarden (Figuur 2a , 2b).
Met behulp van de Live Cell vlek, de secties gekweekt in 0% toonde de laagste hoeveelheid van de kleuring, en de toevoeging van FBS aan de cultuurmedia verbeterde de hoeveelheid levende cellen. Samen genomen, secties gekweekt in 0% FBS toonde zichtbare weefsel condensatie, verhoogde trypaanblauw blauwe bevlekte gebieden, en de laagste niveaus van levende cel het bevlekken. De toevoeging van 2,5% FBS aan de culturen verbeterde de hoeveelheid doorschijnend weefsel, verminderde het trypaanblauw blauwe positieve gebied, en verhoogde de niveaus van levende cel het bevlekken. De extra verhogingen van FBS concentratie niet schijnen om overlevingsvermogen van het weefsel te verbeteren; Daarom 2,5% FBS in de vibratome media was de optimale FBS concentratie en gebruikt als de cultuur voorwaarde voor alle daaropvolgende experimenten.
Om de levensvatbaarheid van de submandibulaire ex vivo weefsel segmenten na de dissectie te bepalen, werden de proliferatie-en apoptotic markeringen geëvalueerd op de dagen 1, 3, 7, 14 en 30 in de cultuur. De proliferatie activiteit werd beoordeeld door Ki67 immunokleuring in een subset van de segmenten van de cultuur (Figuur 3a). Ki67 positieve cellen werden waargenomen op alle tijdpunten geëvalueerd en bleef aanwezig zijn op dag 30 in de cultuur, met minimale verschillen tussen de tijdpunten. Ook werd de graad van apoptosis geëvalueerd door gekloofd caspase-3 immunokleuring in een afzonderlijke ondergroep van secties (Figuur 3b). Een laag niveau van gekloofd caspase-3 positieve cellen werd waargenomen op elk moment punten tot dag 14 in de cultuur, terwijl de dag 30 voorwaarden bleek een kleine toename van het aantal gekloofd caspase-3 positieve cellen in sommige gebieden hebben. Evaluatie van de weefsel randen niet onthullen hogere niveaus van gekloofd caspase-3, die niet recapituleren de trypaanblauw blauwe kleuring (Figuur 2). In het algemeen suggereren deze resultaten dat de signalen voor proliferatie en levensvatbaarheid tijdens de evaluatieperiode van 30 dagen in de vibratome culturen aanwezig bleven.
De dikke sectie vibratome culturen staan de kans toe om interactie tussen cellulaire bestanddelen van een bepaald weefsel bij een diepte te evalueren die meer dan één epitheel cel dikte in elke richting omvat. Daarnaast is het belangrijk om te kunnen cultuur zowel grote speekselklieren, omdat ze verschillen in de samenstelling van de geproduceerde speeksel eiwitten, histologische architectuur, stralingsgevoeligheid, en andere kritieke kenmerken. Om te bepalen verschillende cellulaire populaties in submandibulaire klier culturen, submandibulaire secties werden gekleurd met E-cadherine (E-CAD) op te sporen Epitheelcellen, gladde spier actine (SMA) om Myo cellen te detecteren, en actine filamenten (phalloidin) om detecteren cytoskelet structuren tijdens de 30 dagen in cultuur (figuur 4a).
E-cadherine kleuring werd waargenomen op de membranen van een meerderheid van de cellen en gedetecteerd gedurende de 30-daagse cultuurperiode. SMA + cellen werden gedetecteerd in de hele cultuurperiode, met vergelijkbare niveaus op elk moment punt. Cytoskelet organisatie van actine filamenten bleek ook te worden gehandhaafd op elke tijdpunt geëvalueerd. In tegenstelling, waren er cellulaire tellers die niet constant tijdens de volledige evaluatieperiode werden gehandhaafd en deze omvatten CD31 (vasculatuur), TUBB3 (neuronen), en aquaporine-5 (Aqp-5, acinaire teller) (figuur 4b). De vasculaire structuren door de confocale stapels werden duidelijk waargenomen bij dagen 1 en 3 post-cultuur; echter, deze structuren verschenen gefragmenteerd op dag 7. Evenzo, neuronale processen waren intact tijdens de eerste dag van de cultuur, bleek verminderd op dag 3, en werden vervolgens verloren op dag 7 in de cultuur. Aqp5 + cellen werden waargenomen op de dagen 1, 3, 7 en 14 in de cultuur; Hoewel, op dag 14, de totale kleuring niveau bleek te zijn verminderd, met een meer granulaire gelijkenis in de resterende positieve cellen. Deze gegevens suggereren dat submandibulaire culturen bevatten de diversiteit van weefsel bestanddelen met het onderhoud van de vasculaire en neuronale cel types voor kortere cultuur periodes, en epitheel en Myo cel types voor langere cultuur periodes.
Terwijl de vibratome culturen eerder voor de parotis speekselklier werden gerapporteerd, werden de culturen gehandhaafd voor 48 h, die het tijdsbestek beperken waarin zij zouden kunnen worden bestudeerd. Om te bepalen of de parotisklieren langer kunnen worden gehandhaafd, werden de muizen parotisklieren en gekweekt voor 1, 3, 7, of 14 dagen. Minder secties werden verkregen van de parotis klier toe te schrijven aan zijn kleinere grootte in muizen; Daarom werd een cultuurperiode van 30 dagen niet geprobeerd. Slices werden geëvalueerd voor proliferatie door immunefluorescentie kleuring met behulp van antilichaam tegen Ki67. Gelijkaardig aan de submandibulaire culturen, werden de Ki67 positieve cellen waargenomen bij alle tijdpunten, die erop wijzen dat de cellen een graad van proliferatie in cultuur (figuur 5a) handhaven.
Daarnaast werd het onderhoud van functionele acinaire markers (α-amylase en Aqp5), een epitheel marker (E-CAD), en vasculaire (CD31) en neuronale (TUBB3) cel populaties geëvalueerd. Amylase is een van de meest voorkomende eiwitten geproduceerd door gedifferentieerde parotis epitheelcellen en vaak verloren tijdens de 2-D kweken van primaire parotis cellen. In de vibratome culturen, amylase werd waargenomen in de acinaire cellen en uitgesloten van de ductale cellen gedurende de 14-daagse cultuurperiode (Figuur 5b). Vergelijkbaar met de submandibulaire culturen, Aqp5 + cellen waren aanwezig in de parotis culturen op elk moment punt, met de dag 14 culturen vertonen verlaagd niveau ten opzichte van eerdere tijdpunten (figuur 5c). E-cadherine niveaus werden ook gehandhaafd op de membranen van een meerderheid van cellen tijdens de 14-daagse cultuurperiode (figuur 5d). Neuronale structuren bleken te worden gehandhaafd tijdens de 7 dagen cultuurperiode en werden niet beoordeeld op latere tijdpunten (figuur 5e). In tegenstelling, de vasculaire structuren leken intact tijdens de eerste dag in de cultuur, en alleen kleinere structuren aanwezig waren op de dagen 3 en 7 in de cultuur (figuur 5F). Deze gegevens suggereren dat parotis culturen hun proliferative capaciteiten en de meeste functionele capaciteiten te handhaven voor 7-14 dagen in de cultuur en mogelijk vertonen een meer intact weefselstructuur voor een langere tijd frame.
Het functionele nut van het vibratome cultuur model werd aangepakt door de behandeling van parotis of submandibulaire culturen met een enkele dosis straling (Figuur 6, Figuur 7, Figuur 8). Het vorige werk in bestraalde Muismodellen heeft zich op de parotis klier geconcentreerd en de inductie van apoptosis aangetoond die pieken bij 24 h, inductie van compenserende proliferatie die bij dag 5 begint, verstoring van actine gloeidraden die bij dag 5 beginnen, en verlies van de tellers van de differentiatie (b.v., amylase) tegen dag 1423,24,26. De bestraling van parotis vibratome culturen leidde tot verhogingen van apoptosis bij dag 1, verhogingen van proliferatie bij dag 7, verstoring van actine gloeidraden bij dag 7, en vermindering van amylase bij dag 7 (Figuur 6). De bestraling van submandibulaire vibratome culturen leidde tot verhogingen van apoptosis bij dagen 1 en 3, verhogingen van proliferatie bij dag 7, en verstoring van actine filamenten bij dag 7 (Figuur 7). E-cadherine niveaus leken relatief intact in zowel parotis en submandibulaire culturen, die vergelijkbaar was met in vivo observaties26. De functionele acinaire Cell markers Aqp-5 in submandibulaire klier secties en Amylase in parotis klier secties daalden op dag 14, vergeleken met de overeenkomstige onbehandelde tijdpunten (Figuur 8). Deze gegevens suggereren dat straling-geïnduceerde weefselveranderingen die werden waargenomen in vivo werden ook waargenomen in bestraalde vibratome culturen.
Figuur 1: Bright-veld Microscoop beelden van 50 µm submandibulaire secties. Submandibulaire klieren van vrouwelijke FVB muizen (4-8 weken oud) werden ontleed, sectie tot 50 μm dikte, en gekweekt op organotypic Cell cultuur inserts voor 1, 4, 7, 14, en 30 dagen na de dissectie op 0%, 2,5%, 5,0%, en 10% foetale boviene serum (FBS) in de media om Bepaal cultuur kenmerken en optimaliseer cultuurvoorwaarden. Schaal staven = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: kleuring van levensvatbaarheid submandibulaire secties. (A) Bright-veld Microscoop beelden van 50 µm submandibulaire ontleed van 4-tot 8-week oude vrouwelijke FBV muizen en gekleurd met trypaanblauw blauw (0,4%) bij 1, 3, 7, 14, en 30 dagen in cultuur met media die 2,5% foetale boviene serum (FBS) bevatten. (B) Bright-veld Microscoop beelden van 90 µm submandibulaire secties (linker paneel), gekleurd met trypaanblauw blauw (middelste paneel), in tweeën gesneden en gekleurd met trypaanblauw blauw (rechter paneel), dan gekweekt tot 30 dagen na de dissectie in de media met 2,5% FBS. (C) fluorescerende beelden van 50 µm submandibulaire secties gekweekt in verschillende FBS concentraties (0%, 2,5%, 5%, 10%) bevlekt met calceïne AM om levende cellen (groen) bij cultuur dag 7 aan te geven. Schaal staven = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Evaluatie van proliferatie-en apoptotic markers in submandibulaire organotypic weefsel plakjes. Submandibulaire klieren van vrouwelijke FVB muizen (4-8 weken oud) werden ontleed, gesneden tot 50 µm dikte, en gekweekt in de media aangevuld met 2,5% FBS op organotypic Cell cultuur inserts voor 1, 3, 7, 14, en 30 dagen na de dissectie. Op de aangegeven tijdpunten, plakjes werden vastgesteld en gekleurd voor proliferative (Ki67) en apoptotic (gekloofd caspase-3) markers. A immunefluorescentie kleuring van Ki67-positieve cellen (groen) en de kern (blauw). (B) immunefluorescentie kleuring van gekloofd caspase-3-postive cellen (rood) en de kern (blauw) uit twee gezichtspunten van een schijfje. In het bovenste deelvenster rij worden gekloofd caspase-3-positieve cellen aan de rand van een segment weergegeven en in het onderste deelvenster wordt gekloofd caspase-3-positieve cellen uit het midden van een segment weergegeven. Representatieve confocale beelden werden geselecteerd uit meerdere z-stacks per tijdpunt. Schaal staven = 30 µm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Aanwezigheid van cellulaire structuren in submandibulaire organotypic weefsel plakjes . Submandibulaire klieren van vrouwelijke FVB muizen (4-8 weken oud) werden ontleed, gesneden tot 50 μm dikte, en gekweekt in de media aangevuld met 2,5% FBS op organotypic cel cultuur inserts voor 1, 3, 7, 14, of 30 dagen na de dissectie. Op de aangegeven tijdpunten, plakjes werden vastgesteld en gekleurd voor hun overeenkomstige markeringen met de kern (blauw). (A) submandibulaire secties werden geëvalueerd op de dagen 1, 7, 14, en 30 post-dissectie voor de niveaus van E-cadherine, gladde spier ACTINE (SMA), en F-actine (phalloidin). B submandibulaire secties werden geëvalueerd op de dagen 1, 3 en 7 voor niveaus van CD31 (vasculatuur) en TUBB3 (neuronen). Aquaporine-5 (Aqp5) werd geëvalueerd op de dagen 1, 3, 7 en 14. Representatieve confocale beelden werden geselecteerd uit meerdere z-stacks per tijdpunt. Schaal staven = 30 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Evaluatie van de proliferative en functionele markers in par organotypic weefsel slices. Parotisklieren van vrouwelijke FVB muizen (4-8 weken oud) werden ontleed, gesneden tot 50 µm dikte, en gekweekt in de media aangevuld met 2,5% FBS op organotypic cel cultuur inserts voor 1, 3, 7, of 14 dagen post-dissectie. Op de aangegeven tijdpunten, plakjes werden vastgesteld en gekleurd voor hun overeenkomstige markeringen met de kern (blauw). A immunefluorescentie kleuring van Ki67-positieve cellen (groen). B immunefluorescentie kleuring van amylase-positieve cellen (rood). C immunefluorescentie kleuring van aquaporine-5 (Aqp5)-positieve cellen (groen). D immunefluorescentie kleuring van E-cadherine (rood) positieve cellen. (E) immunefluorescentie kleuring van neuronen aangegeven door TUBB3 (Magneta) positieve cellen. (F) immunefluorescentie kleuring van de vasculatuur aangegeven door CD31 (rood) positieve cellen. Representatieve confocale beelden werden geselecteerd uit meerdere z-stacks per tijdpunt. Schaal staven = 30 μm; d = ductale cellen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: cellulaire veranderingen na bestraling van parotis organotypic weefsel segmenten. Parotisklieren van vrouwelijke FVB muizen (4-8 weken oud) werden ontleed, gesneden tot 50 μm dikte, en gekweekt in aangevuld met 2,5% FBS op organotypic cel cultuur inserts. Op dag 1 post-dissectie, werd een ondergroep van segmenten blootgesteld aan 5 Gy straling en gehandhaafd voor 2, 4, of 8 dagen post-dissectie (komt overeen met dagen 1, 3, en 7 post-straling). Immunefluorescentie kleuring van onbehandelde en bestraalde parotis secties om de niveaus van (a) Ki67 (groen)-positieve cellen te bepalen, (B) gekloofd caspase 3 (rood)-positieve cellen, (C) phalloidin (cyaan)-positieve cellen, (D) Amylase (rood)-positieve cellen, en (e) e-cadherine (rood) positieve cellen. Alle nucleaire vlekken gebruikt DAPI (blauw). Representatieve confocale beelden werden geselecteerd uit meerdere z-stack per tijdpunt. Schaal staven = 30 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: cellulaire veranderingen na bestraling van submandibulaire organotypic weefsel segmenten. Submandibulaire klieren van vrouwelijke FVB muizen (4-8 weken oud) werden ontleed, gesneden tot 50 μm dikte, en gekweekt in de media aangevuld met 2,5% FBS op organotypic cel cultuur inserts. Op dag 1 post-dissectie, werd een ondergroep van segmenten bestraald met 5Gy en werd gehandhaafd voor 2, 4, of 8 dagen post-dissectie (komt overeen met dagen 1, 3, en 7 post-straling). Immunefluorescentie kleuring van onbehandelde en bestraalde submandibulaire secties om de niveaus van (a) Ki67 (groen)-positieve cellen te bepalen, (B) gekloofd caspase 3 (rood)-positieve cellen, (C) phalloidin (cyaan)-positieve cellen, (D) aquaporine 5 (Aqp5) (groen)-positieve cellen, en (e) e-cadherine (rood) positieve cellen. Alle nucleaire vlekken gebruikt DAPI (blauw). Representatieve confocale beelden werden geselecteerd uit meerdere z-stack per tijdpunt. Schaal staven = 30 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 8: functionele acinaire markeringen in bestraalde parotis en submandibulaire organotypic weefsel segmenten. Submandibulaire en parotisklieren van vrouwelijke FVB muizen (4-8 weken oud) werden ontleed, gesneden tot 50 μm dikte, en gekweekt in de media aangevuld met 2,5% FBS op organotypic cel cultuur inserts. Op dag 1 post-dissectie, werd een ondergroep van segmenten bestraald met 5Gy en werd gehandhaafd voor 14 dagen post-bestraling. Immunefluorescentie kleuring van onbehandelde (UT) en bestraalde (IR) secties werden gebruikt om de niveaus van (a) aquaporine-5 (Aqp5) (groen)-positieve cellen en (B) amylase (rood)-positieve cellen te bepalen. Alle nucleaire vlekken gebruikt DAPI (blauw). Representatieve confocale beelden werden geselecteerd uit meerdere z-stack per tijdpunt. Schaal staven = 30 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het speekselklier onderzoek heeft een aantal cultuur modellen, met inbegrip van vereeuwigde 2-D culturen, primaire 2-D culturen, 3-D salisphere culturen, en 3-D orgaan culturen van embryonale Explants gebruikt om vragen over onderliggende biologie en fysiologie te bepalen. Deze cultuur modellen hebben inzichtelijke informatie over een divers scala van onderzoeksvragen en zal blijven belangrijke instrumenten in het speeksel onderzoek. De beperkingen van deze cultuur modellen omvatten modulatie van p53 activiteit tijdens immortalisatie, voorbijgaande levensvatbaarheid van primaire culturen, verlies van differentiatie en secretoire proteïnen in cultuur, en onvermogen om cel-cel, cel-ECM en polariteit te evalueren interacties in volwassen weefsels. De eerste 3-D organotypic slice Culture (vibratome sectie culturen) methode voor speekselklieren werd gepubliceerd in 200818; echter, deze techniek is grotendeels onderbenut op dit gebied, ondanks veelvuldig gebruik in andere gebieden. Het werk beschaafde parotis secties voor 48 h, wat de capaciteit beperkt om deze secties voor chronische gevolgen na bestralingsbehandeling te bestuderen of transfectie of transductie protocollen voor fenotypen na manipulatie van specifieke genen te gebruiken. De hier beschreven methode is geoptimaliseerd om voor een langere tijd in de cultuur, de opbrengst hoge resolutie beelden via confocale microscopie, bieden een methode om intra-en intercellulaire dynamiek studie op een 3-D sectie, en evalueren straling geïnduceerde veranderingen tijdens een cultuurperiode van minstens 14 dagen.
Terwijl elke stap is vereist voor de uitvoering van de techniek, een aantal stappen zijn van cruciaal belang voor een succesvolle afdeling en cultuur onderhoud. Deze omvatten het snijden van de speekselklier plakjes, het behoud van de plakjes in de cultuur, en kleuring en Imaging de plakjes met confocale microscopie. Het gepresenteerde protocol vormt een aantal uitdagingen die geduld en praktijk vereisen om optimale segmenten voor analyse te verkrijgen. De volgende suggesties zullen helpen bij de uitvoering van dit protocol met succes. Het is noodzakelijk om de speekselklier volledig te isoleren van het omliggende bindweefsel na dissectie. Het resterende verbindingsweefsel veroorzaakt het vibratome blad om de klier uit het agarose blok te slepen en vereist het weefsel dat in agarose moet worden opnieuw ingebed. Dit kan een belangrijke beperking, omdat meerdere re-inbedding kan de kans op besmetting te verhogen en de levensvatbaarheid van de segmenten te verminderen. Dit is vooral cruciaal voor kweken parotisklieren, omdat de parotisklieren zijn meer lobulair in structuur en dus meer kans op vreemde weefsels hebben.
De toevoeging van 1% penicilline-streptomycine-amfotericine B (PSA) aan alle vloeistoffen met inbegrip van de buffer lade, de slice collectie schaal, en de vibratome media minimaliseert verontreiniging van de segmenten post-dissectie. De variatie van agarose concentratie werd gebruikt om succesvol knipsel te optimaliseren. Wegens de dichtheid van de speekselklieren, was 1,9% agarose te zacht, en de klieren werden gemakkelijk van het blok verdreven. Vibratome die op andere gebieden sectioning heeft 5,0% agarose gebruikt; echter, dit veroorzaakt gekartelde snijwonden en plakjes waren suboptimaal. Na het testen van verscheidene agarose percentage voorwaarden, was 3% agarose het meest optimaal om het gewicht en de stevigheid van het weefsel te steunen. Met name de agarose concentratie gebruikt in Warner et al. en su et al. was ook 3%19,20.
Bovendien kan de hoek, frequentie van trillingen, en het bevorderen van de snelheid van het mes worden aangepast op basis van het weefsel te worden ondergebracht. Voor submandibulaire en parotis speekselklieren, een 15 ° hoek, de snelheid van 0,075 mm/s, en de frequentie van 100 Hz waren geschikt voor het sectioneren. Door de zachtheid van de speekselklieren, de optimale snij omstandigheden vereist het mes om langzaam door het weefsel op een hoge trilling. Voor immunefluorescentie kleuring, de permeabilization, de duur van incubaties, en wassen stappen zijn essentieel voor een optimale vlekken. Als positieve kleuring verschijnt alleen in de buitenste lagen van het weefsel slice, een meer stringente permeabilization met proteïnase K kan nodig zijn, terwijl ongelijke vlekken of hoge achtergrond vlekken kan een minder strenge kleuring met 0,2% Triton X-100 vereisen. De incubatietijden werden geoptimaliseerd voor hoge signaal en lage achtergrond, die kunnen moeten worden afgestemd op specifieke primaire antilichamen. De langere was stappen zijn essentieel in het verminderen van hoge achtergrond en dit kan aan de specifieke antilichamen worden aangepast die worden gebruikt.
Een belangrijke toepassing van deze methodologie is uitgebreide kinetische analyse na blootstelling aan straling van speekselklieren. Het vroegere werk heeft zowel scherpe als chronische fase veranderingen in bestraalde speekselklieren6,24,25,26, en het vibratome cultuursysteem gevestigd kan een krachtig hulpmiddel zijn om de kritieke ontleden uit te moleculaire gebeurtenissen op specifieke tijdpunten na behandeling. Bijvoorbeeld, straling-geïnduceerde cellulaire veranderingen in de speekselklier die zijn gerapporteerd in de literatuur, met inbegrip van reducties in amylase, apoptosis van acinaire cellen, compenserende proliferatie van acinaire cellen, verlies van polariteit en verstoringen in cytoskelet structuur. Met name vibratome culturen bestraald ex vivo vertonen vergelijkbare veranderingen in deze markers.
Bovendien draait de acute fase respons in speekselklieren rond p53 activiteit; het is echter onduidelijk welke rol p53 speelt in latere tijdpunten als gevolg van de ~ 5-daagse levensvatbaarheid van primaire culturen. Dit systeem zou toestaan ex vivo, gecontroleerde verstoring van de p53 activiteit op latere tijdstippen en het blootstellen van een rol bij chronische schade of regeneratieve reacties. Bovendien wordt de compenserende proliferatie respons gestart 5 dagen na de bestralingsbehandeling, en het is moeilijk om de moleculaire regulatoren van deze reactie af te bakenen in voorbijgaande primaire culturen. De meest gebruikte toepassing van deze methodologie zal waarschijnlijk cel-cel, cel-ECM, en polariteits interactie in volwassen weefsels impliceren. Impactstudies zijn uitgevoerd in 3-D orgel culturen uit embryonale klieren om de ingewikkelde interactie tussen de ontwikkeling van speekselklieren en het neuronale of vasculaire netwerk te ontdekken27,28,29, 30,31.
De hier beschreven methode geeft aan dat verdere optimalisatie nodig is voor neuronale of vasculaire werk in de submandibulaire culturen en eventueel parotis culturen. Stralingsschade verstoort ook junctionele regulatoren, induceert collageen depositie, verandert F-actine organisatie, en moduleert secretoire korrels26,30,32. Speekselklier regeneratie studies zijn gehandicapt door het ontbreken van een volwassen model om deze interacties te evalueren. Deze organotypic cultuurmethode kan een systeem bieden om geavanceerde moleculaire technieken toe te passen en de regulering van deze bemiddelaars in een 3-D context verder te bestuderen en efficiënt nieuwe therapieën te ontdekken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd deels ondersteund door pilot financiering verstrekt door de Universiteit van Arizona Office of Research and Discovery en de nationale instituten van de gezondheid (R01 DE023534) aan Kirsten Limesand. De Cancer biologie training Grant, T32CA009213, mits toelage ondersteuning voor Wen Yu Wong. De auteurs willen M. Rice bedanken voor zijn waardevolle technische bijdrage.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystems | N/A | Vibratome for sectioning |
| Double Edge Stainless Steel Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | Low-melt |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P6543 | |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B | Lonza | 17-745H | PSA |
| 24-well plate | CellTreat | 229124 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | |
| Loctite UltraGel Control Superglue | Loctite | N/A | Purchased at hardware store |
| Natural Red Sable Round Paintbrush | Princeton Art & Brush Co | 7400R-2 | |
| Gentamicin Sulfate | Fisher Scientific | ICN1676045 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T-8158-100mg | |
| L-glutatmine | Gibco | 25030-081 | |
| Trace Elements | MP Biomedicals | ICN1676549 | |
| Insulin | Fisher Scientific | 12585014 | |
| Epidermal Growth Factor | Corning | 354001 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| Retinoic acid | Fisher Scientific | R2625-50MG | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3160602 | |
| DMEM/F12 Media | Corning | 150-90-CV | |
| Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma | PICM01250 | 12 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate |
| 0.4% Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo-Fisher | R37601 | Only used LIVE dye component |
| Anti-Ki-67 Antibody | Cell Signaling Technology | 9129S | |
| Anti-E-cadherin Antibody | Cell Signaling Technology | 3195S | |
| Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody | Cell Signaling Technology | 9661L | |
| Anti-SMA Antibody | Sigma-Aldrich | C6198 | |
| Anti-amylase Antibody | Sigma-Aldrich | A8273 | |
| Anti-CD31 Antibody | Abcam | ab28364 | |
| Anti-TUBB3 Antibody | Cell Signaling Technology | 5568S | |
| Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Thermo-Fisher | A20185 | |
| Alexa Fluor 594 Phalloidin | Thermo-Fisher | A12381 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 21568-2500 | |
| Paraformaldehyde Prills | Fisher Scientific | 5027632 | |
| New England Nuclear Blocking Agent | Perkin Elmer | 2346249 | No longer sold |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083S | |
| Prolong Gold Antifade Mounting Media | Invitrogen | P36934 | |
| Leica SPSII Spectral Confocal | Leica Biosystems | N/A | For confocal imaging |
| Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope | Leica Biosystems | N/A | |
| Cobalt-60 Teletherapy Instrument | Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80 | N/A | |
| Amac Box, Clear | The Container Store | 60140 | Agarose block mold |
References
- Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: a literature review. Cancer. 107 (11), 2525-2534 (2006).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Hancock, P. J., Epstein, J. B., Sadler, G. R. Oral and dental management related to radiation therapy for head and neck cancer. Journal of the Canadian Dental Association. 69 (9), 585-590 (2003).
- Nguyen, N. P., et al. Quality of life following chemoradiation and postoperative radiation for locally advanced head and neck cancer. Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 69 (5), 271-276 (2007).
- Gorenc, M., Kozjek, N. R., Strojan, P. Malnutrition and cachexia in patients with head and neck cancer treated with (chemo)radiotherapy. Reports of Practical Oncology and Radiotherapy. Journal of Greatpoland Cancer Center in Poznań and Polish Society of Radiation Oncology. 20 (4), 249-258 (2015).
- Grundmann, O., Mitchell, G. C., Limesand, K. H. Sensitivity of salivary glands to radiation: from animal models to therapies. Journal of Dental Research. 88 (10), 894-903 (2009).
- Konings, A. W., Coppes, R. P., Vissink, A. On the mechanism of salivary gland radiosensitivity. International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 62 (4), 1187-1194 (2005).
- Chan, Y. -H., Huang, T. -W., Young, T. -H., Lou, P. -J. Human salivary gland acinar cells spontaneously form three-dimensional structures and change the protein expression patterns. Journal of Cellular Physiology. 226 (11), 3076-3085 (2011).
- Nguyen, V. T., Dawson, P., Zhang, Q., Harris, Z., Limesand, K. H. Administration of growth factors promotes salisphere formation from irradiated parotid salivary glands. PLoS ONE. 13 (3), e0193942 (2018).
- Limesand, K. H., et al. Characterization of Rat Parotid and Submandibular Acinar Cell Apoptosis In Primary Culture. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 39 (3), 170 (2003).
- Wei, L., Xiong, H., Li, W., Li, B., Cheng, Y. Upregulation of IL-6 expression in human salivary gland cell line by IL-17 via activation of p38 MAPK, ERK, PI3K/Akt, and NF-κB pathways. Journal of Oral Pathology & Medicine. 47 (9), 847-855 (2018).
- Chuong, C., Katz, J., Pauley, K. M., Bulosan, M., Cha, S. RAGE expression and NF-κB activation attenuated by extracellular domain of RAGE in human salivary gland cell line. Journal of Cellular Physiology. 221 (2), 430-434 (2009).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Bhadriraju, K., Chen, C. S. Engineering cellular microenvironments to improve cell-based drug testing. Drug Discovery Today. 7 (11), 612-620 (2002).
- Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
- Avila, J. L., Grundmann, O., Burd, R., Limesand, K. H. Radiation-induced salivary gland dysfunction results from p53-dependent apoptosis. International Journal of Radiation Oncology, Biololgy, Physics. 73 (2), 523-529 (2009).
- Mitchell, G. C., et al. IGF1 activates cell cycle arrest following irradiation by reducing binding. of DeltaNp63 to the p21 promoter. Cell Death & Disease. 1, (2010).
- Lombaert, I. M. A., et al. Rescue of Salivary Gland Function after Stem Cell Transplantation in Irradiated Glands. PLoS ONE. 3 (4), (2008).
- Warner, J. D., et al. Visualizing form and function in organotypic slices of the adult mouse parotid gland. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 295 (3), G629-G640 (2008).
- Su, X., et al. Three-dimensional organotypic culture of human salivary glands: the slice culture model. Oral Diseases. 22 (7), 639-648 (2016).
- Mattei, G., Cristiani, I., Magliaro, C., Ahluwalia, A. Profile analysis of hepatic porcine and murine brain tissue slices obtained with a vibratome. PeerJ - The Journal of Life and Environmental Sciences. 3, 932 (2015).
- Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. , 3rd ed, Springer U.S. Boston, MA. (2006).
- Limesand, K. H., et al. Insulin-Like Growth Factor-1 Preserves Salivary Gland Function After Fractionated Radiation. International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 78 (2), 579-586 (2010).
- Grundmann, O., Fillinger, J. L., Victory, K. R., Burd, R., Limesand, K. H. Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration. BMC Cancer. 10, 417 (2010).
- Chibly, A. M., et al. aPKCzeta-dependent Repression of Yap is Necessary for Functional Restoration of Irradiated Salivary Glands with IGF-1. Scientific Reports. 8 (1), 6347 (2018).
- Wong, W. Y., Pier, M., Limesand, K. H. Persistent disruption of lateral junctional complexes and actin cytoskeleton in parotid salivary glands following radiation treatment. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 315 (4), R656-R667 (2018).
- Emmerson, E., et al. SOX2 regulates acinar cell development in the salivary gland. eLife. 6, (2017).
- Nedvetsky, P. I., et al. Parasympathetic innervation regulates tubulogenesis in the developing salivary gland. Developmental Cell. 30 (4), 449-462 (2014).
- Kwon, H. R., Nelson, D. A., DeSantis, K. A., Morrissey, J. M., Larsen, M. Endothelial cell regulation of salivary gland epithelial patterning. Development. 144 (2), 211-220 (2017).
- Mellas, R. E., Leigh, N. J., Nelson, J. W., McCall, A. D., Baker, O. J. Zonula occludens-1, occludin and E-cadherin expression and organization in salivary glands with Sjogren's syndrome. Jounral of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (1), 45-56 (2015).
- Daley, W. P., et al. Btbd7 is essential for region-specific epithelial cell dynamics and branching morphogenesis in vivo. Development. 144 (12), 2200-2211 (2017).
- Nam, K., et al. Post-Irradiated Human Submandibular Glands Display High Collagen Deposition, Disorganized Cell Junctions, and an Increased Number of Adipocytes. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (6), 343-352 (2016).
