Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Strålebehandling af Organotypiske kulturer fra Submandibulær og Parotid spytkirtler modeller Key in vivo egenskaber

Published: May 17, 2019 doi: 10.3791/59484
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 1,2
1Department of Nutritional Sciences, University of Arizona, 2Cancer Biology Graduate Interdisciplinary Program, University of Arizona, 3Department of Chemical Engineering, University of Arizona

Summary

Ved hjælp af tre-dimensionelle organotypiske kulturer til at visualisere morfologi og funktionelle markører for spytkirtler kan give nye indblik i mekanismerne for vævsskade efter stråling. Beskrevet her er en protokol til sektion, kultur, irradiat, bejdsen, og billede 50 – 90 μm tykke spytkirtel sektioner før og efter udsættelse for ioniserende stråling.

Abstract

Hyposalivation og xerostomi skaber kroniske orale komplikationer, der mindsker livskvaliteten hos patienter med hoved-og hals kræft, som behandles med strålebehandling. Eksperimentelle tilgange til forståelse mekanismer af spytkirtel dysfunktion og restaurering har fokuseret på in vivo modeller, som er handicappet af en manglende evne til systematisk at screene terapeutiske kandidater og effektivitetsgevinster i transfektering evne til at manipulere specifikke gener. Formålet med denne spytkirtel organotypiske kultur protokol er at evaluere maksimal tid for kulturens levedygtighed og karakterisere cellulære ændringer efter ex vivo strålebehandling. Vi udnyttede immuno fluorescens farvning og confokal mikroskopi til at bestemme, hvornår specifikke cellepopulationer og markører er til stede i løbet af en 30-dages kultur periode. Desuden evalueres celle markører, der tidligere er indberettet i in vivo-strålings modeller, i kulturer, der er bestrålet ex vivo. Bevæger sig fremad, denne metode er en attraktiv platform for hurtig ex vivo vurdering af murine og humane spytkirtel væv svar til terapeutiske midler, der forbedrer spyt funktion.

Introduction

Korrekt spytkirtel funktion er afgørende for oral sundhed og er ændret efter hoved-og hals kræftbehandling med strålebehandling1. I 2017 blev der rapporteret næsten 50.000 nye tilfælde af hoved-og hals kræft i USA2. På grund af de vævsskade lige og ofte uoprettelige virkninger af strålebehandling på omgivende normale væv såsom spytkirtler, patienter er ofte tilbage med alvorlige bivirkninger og forringet livskvalitet2,3, 4. for at Almindelige komplikationer forårsaget af strålingsskader manifesterer sig i symptomer som xerostomi (den subjektive følelse af mundtørhed), tand karies, nedsat evne til at tygge og sluge, taleforstyrrelser og kompromitterede orale mikrobiomer2, 3 af , 4. disse symptomer kollektivt kan føre til underernæring og nedsat overlevelse hos berørte personer5. Mens spytkirtel dysfunktion i denne population har været veldokumenteret, er de underliggende mekanismer for skader på acinic celler blevet anfægtet, og der er ringe integration mellem forskellige dyremodeller6,7.

De nuværende metoder til at studere spytkirtel funktion og stråling-induceret skader omfatter brugen af in vivo modeller, udødeliggjort cellelinjer, to-dimensionelle (2-D) primære cellekulturer og tredimensionale (3-D) salisphere kulturer8, 9,10,11,12. Traditionelt, cellekultur modeller fra udødeliggjort cellelinjer og 2-D kulturer involverer enkeltlags celler dyrket på flade overflader og er værdifulde for hurtige, nemme og omkostningseffektive eksperimenter. Men, kunstige cellekultur betingelser kan ændre differentierings status og fysiologiske reaktioner af celler udsat for forskellige betingelser, og resultaterne ofte undlader at oversætte til hele organismen modeller14,15. Hertil kommer, udødeliggjort cellekulturer kræver graduering af P53 aktivitet, som er afgørende for spytkirtel respons på DNA-skade16,17.

3-D salisphere kulturer er beriget for Stam-og progenitorceller på tidlige tidspunkter i kultur og har været nyttige for forståelsen af radio følsomhed af denne delmængde af spytkirtel celler9,18. En kritisk begrænsning af alle disse kultur modeller er de ineffektive i at visualisere 3-D struktur af spytkirtel, herunder den ekstracellulære matrix (ECM) og celle-celle interaktioner over forskellige lag, som er afgørende i modulende spyt sekretion15. Behovet for en metode, der omfatter opførsel af vævet som helhed, men kan også manipuleres under laboratoriebetingelser for at studere virkningerne af behandlingen er nødvendig for yderligere at opdage de underliggende mekanismer af stråling-induceret spytkirtel Dysfunktion.

Levende vævs skæring og kultur er blevet dokumenteret tidligere19,20 og bruges ofte til at studere hjernens-vævs interaktioner21. I tidligere studier blev parotideale (par) spytkirtel vævet fra mus opdelt på ca. 50 μm og kultiveret i op til 48 h, og analyse af levedygtighed, celledød og funktion blev udført derefter19. Su et al. (2016) udvidet på denne metode ved dyrkning af humane submandibulære kirtler (Smg'er) opdelt på 35 μm eller 50 μm i 14 dage20. Den foreslåede metode er en avancement i, at det omfatter både parotitis og submandibulære spytkirtler sekeret på 50 μm og 90 μm og evaluering af kulturerne i 30 dage. Evnen til at skære en række vævs tykkelse er vigtig i vurderingen celle-celle-og celle-ECM interaktioner, der er relevante for cellulære processer, herunder apical-basolaterale polaritet og innervation for sekretion. Desuden blev de spytkirtel skiver bestrålet mens i kulturen for at bestemme gennemførligheden af denne kulturmodel til at studere stråling-induceret spytkirtel skader.

Formålet med denne spytkirtel organotypiske kultur protokol er at evaluere maksimal tid for kulturens levedygtighed og karakterisere cellulære ændringer efter ex vivo strålebehandling. For at bestemme den maksimale tid sektioner, der er levedygtige efter dissektion, trypan blå farvning, levende celle farvning, og immunhistokemiske farvning for celledød blev udført. Confokal mikroskopi og immuno fluorescens farvning blev udnyttet til at evaluere specifikke cellepopulationer, morfologiske strukturer og niveauer af spredning. Væv sektion kulturer blev også udsat for ioniserende stråling til at bestemme virkningerne af stråling på forskellige markører i denne 3-D model. Induktion af celledød, cytoskeletale forstyrrelser, tab af differentierings markører og kompenserende proliferation i bestrålede ex vivo-kulturer blev sammenlignet med tidligere undersøgelser af in vivo-modeller. Denne metode giver et middel til at undersøge den rolle, som celle celle interaktioner efter strålingsskader og giver en eksperimentel model til effektivt at vurdere effekten af terapeutiske interventioner (genmanipulationer eller farmakologiske agenser ), som kan være mindre velegnet til in vivo-modeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. fremstilling af vibratome

  1. Spray aftagelige komponenter af vibratome herunder buffer bakken, klinge fastgørelse, agopstået blok skimmel, og laboratorie film med 70% ethanol, derefter UV-sterilisere i mindst 30 min.
  2. Placer og fastgør et ekstra ark laboratorie film over buffer bakken for at forhindre is i at falde i.
  3. Fyld iskammeret med knust is, Fjern laboratorie filmen fra buffer bakken, og fyld buffer bakken med 100 mL iskold 1x fosfat bufferet saltopløsning (PBS), suppleret med 1% penicillin-streptomycin-ampicillin (PSA).
  4. Anbring et barberblad af rustfrit stål i klingeholderen. Brug skruetrækkeren til at stramme/løsne og ændre klingens vinkel.

2. fremstilling af vævsprøve i agopstået blok og skæring ved hjælp af vibratome

  1. Autoclave alle nødvendige dissektion og skæreværktøjer, herunder pincet, saks og pensler.
  2. Forbered 3% lavt smeltepunkt agopstod i steril 1x PBS og mikroovn, indtil den agopstået opløses i opløsning. Sørg for, at opløsningen ikke koger over og Hvirvl flasken med jævne mellemrum for at blande den.
    Bemærk: undgå, at den lavsmeltende agopstod fra at størkne ved at holde den i et varmt vandbad. Den lavsmeltede agrose er flydende ved 37 °C og sætter ved 25 °C. Dog skal vandbad være under 40 °C for at hælde agopstod omkring vævet ved fysiologisk temperatur.
  3. Isoler spytkirtler og Anbring dissekeret væv i 2 mL iskold 1x PBS suppleret med 1% PSA i en steril 30 mm kultur skål.
  4. Brug autoklaveret pincet, Fjern spytkirtler fra 1x PBS + 1% PSA-opløsning og position i bunden af en indlejrings skimmel. Fyld formen med flydende 3% lavt smeltepunkt agopstod til at dække vævet.
  5. Ved hjælp af tang, justere vævet til midten af blokken og placere spytkirtel i det relevante plan. De bedste tværsnit for submandibulære og parotideale kirtler er i det lodrette plan.
  6. Sted agopstået blok på is i 10 min at hærde.
  7. Kør forsigtigt et barberblad rundt om den ydre kant af agløsen for at løsne og lad blokken glide ud på den UV-steriliserede laboratorie film fra trin 1,1.
  8. Brug et barberblad til at skære en agopstået æske, der indeholder spyt kirtlen. Sørg for, at planet af sektionen er lige og parallelt med den modsatte side af blokken (den overflade, der vil blive limet ned). Da agopstod ikke infiltrere vævet, ikke trim for meget agopstået omkring vævet, så vævet vil blive godt støttet.
  9. Brug superlim til at vedhæfte blokken til skære overfladen.
  10. Sektion ved 50 μm eller 90 μm tykkelse af vibratome med en hastighed på 0,075 mm/s og frekvens på 100 Hz.
    Bemærk: indstilling af vibratome ved den højeste frekvens og den laveste klinge hastighed giver de mest optimale skiver.
  11. Saml sektioner i en 24-brønd vævskultur skål indeholdende ~ 1 mL iskold PBS pr. brønd ved hjælp af en autoklaveret, naturlig hårpensel, der placerer børsten i 70% ethanol mellem skive samlinger for at opretholde steriliteten.

3. kulturering af sektioner

  1. Autoclave en mikro-spatel og pincet.
  2. Gør bestanden vibratome kultur medier med eller uden føtale kvægserum (FBS): DMEM/F12 medier suppleret med 1% PSA, 5 μg/ml transferrin, 1,1 μm hydrocortison, 0,1 μm retinsyre syre, 5 μg/ml insulin, 80 ng/ml epidermal vækstfaktor, 5 mm L-glutamin, 50 μg/ml gentamicin sulfat og 10 μL/mL sporstof blanding. Tilføj en passende mængde FBS for at lave 0%, 2,5%, 5,0% eller 10% løsninger.
  3. Før skæring tilsættes 300 μL forvarmede medier, og der anbringes en diameter på 12 mm, 0,4 μm porestørrelse membran indsats i hver brønd af en 24-brønd vævskultur plade. Medierne skal nå membran bunden for at skabe en flydende luft grænseflade for kultur.
  4. Læg forsigtigt spyt sektionerne oven på membran indlægget ved hjælp af mikro-spatel og-kultur ved 37 °C i befuret 5% CO2 og 95% luft atmosfære-inkubator.
    1. Der tilsættes ca. 300 μL primær kultur medie til brønden og et par dråber ind i membran skær (ca. 40 μL) hver anden dag eller efter behov. Korrekt dyrkning viste, at cellerne er i stand til at overleve og opretholdes i op til 30 dage ex vivo.

4. bestråling af dele af spyt kirtlen

  1. Behandl sektioner med en enkelt dosis af stråling (5 Gy) ved hjælp af cobalt-60 (eller tilsvarende) irradiator.
    1. Transport sektioner til irradiator facilitet ved hjælp af en overdækket Styrofoam container for at undgå udsving i temperaturen. Derudover skal der udvises forsigtighed under transporten tilbage til laboratorieinkubatoren for at sikre, at mediet ikke sprøjter ud på dyrknings låget og inducerer kontaminering.
    2. Anbring 24-brønd pladen, der indeholder spytkirtel sektioner 80 cm fra strålekilden, i midten af et 32 "x 32" strålingsfelt. Strålingsdosis beregninger og tilsvarende tid i irradiator vil variere efter instrument og cobalt-60 forfald.
  2. Fortsæt overvågning og dyrkning af disse sektioner som beskrevet i afsnit 3.

5. levedygtig farvning

  1. Aspirer gamle medier og vask skiver to gange med steril, pre-varmet 1x PBS.
  2. Bejdde sektioner med trypan blåt farvestof.
    1. Brug en mikro-spatel til at flytte udsnittet fra kulturen til et glas slide.
    2. Tilsæt 0,4% trypan blå opløsning til vibratome skive med tilstrækkelig volumen til at dække vævet (10 – 20 μL).
    3. Der inkuperer skiver ved stuetemperatur (RT) i trypan blåt i 1 – 2 min. for at farvestoffet trænger ind i vævet. Ikke-levedygtige celler vil blive farvet blå, og levedygtige celler vil blive ufarvede.
  3. Bejdser sektioner med calcein, AM levende cellefarve.
    1. Der tilsættes nok pletter til at dække sektionen i et brønd af en 24 brønd plade (200 – 300 μL).
    2. Der inkube skiver ved RT i 15 minutter for at tillade farve indtrængning.
    3. Fjern forsigtigt sektionen fra brønden, og Placer den på et glas skred. Monter skiver med 1 dråbe monterings medie.
    4. Billed sektioner på et fluorescerende mikroskop ved excitation/emission bølgelængder på 488 nm og 515 nm.

6. antistof farvning vibratome sektioner

Bemærk: følgende indeholder en generel antistof farvnings protokol, der er specifik for ki-67; denne protokol kan dog anvendes med ethvert antistof. Alle skyller udføres på RT, medmindre andet er angivet.

  1. I multi-brønden vævskultur skålen, Aspirer off medier og vask mindst 2x med steril 1x PBS.
  2. Fastgør sektioner med 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) natten over ved 4 °C.
  3. Aspirer fra 4% PFA og vask 3x med PBT [1x PBS, 1% bovint serumalbumin (BSA), 0,1% Triton X-100].
    Bemærk: sektioner kan opbevares i 1x PBS ved 4 °C og farves på et senere tidspunkt. Den maksimale opbevaringstid, der blev testet i dette manuskript, var 3 uger. Længere opbevaringstid skal optimeres af den enkelte bruger, hvis det ønskes.
  4. Permeabilize sektioner ved hjælp af 0,3% Triton X-100 i 1x PBS i 30 min.
    Bemærk: dette trin kan modificeres og optimeres til specifik antistof farvning og permeabilisering.
  5. Pipet off permeabiliserings løsning.
  6. Vask skiver 3x i 5 min med 1x PBS, 1% BSA og 0,1% Triton X-100 (PBT).
  7. Bloker skiver med blokerende middel med 1% normalt gede serum i 1 time.
  8. Vask skiver 3x i 5 min med PBT.
  9. Der inkurueres i skiver natten over ved 4 °C med 500 μL anti-Ki67 kanin monoklonalt antistof fortyndet i 1% BSA i 1x PBS.
    Bemærk: for phalloidin farvning, springe trin 6,9 og fortsætte med at bruge protokollen for den specifikke phalloidin anvendes. Gå til trin 6,15 for DNA-counterstain.
  10. Aspirate anti-Ki67 kanin monoklonalt antistof.
  11. Vask skiver 6x i 5 min. i 1x PBS.
  12. Udtyndede skiver i 500 μL fluorescerende konjugeret sekundært antistof, der er kompatibelt med anti-Ki67 antistof, fortyndet i 1% BSA i 1x PBS ved RT for 1,5 h dækket af lys.
    Bemærk: baseret på sekundært antistof kan inkubationstid med det sekundære antistof optimeres yderligere af den enkelte bruger. Derudover er det sekundære antistof lysfølsomt. Alle efterfølgende skyller skal udføres i mørke.
  13. Aspirer sekundært antistof.
  14. Vask skiver for 3x i 5 min med 1x PBS.
  15. Vask skiver i 5 min i deioniseret vand.
  16. Kontra pletskiver med DAPI (1 μg/mL) i 20 minutter ved RT.
  17. Vask skiver (én gang) i 5 min i deioniseret vand.
  18. Monter skiver med en dråbe (~ 40 μL) af monterings mediet. For at undgå overskydende bobler anbringes dæksedlen langsomt på monterings mediet på sliden, begyndende med en vinkel på 45 °.
    1. For at undgå at knuse de tykke sektioner med coverslip, monteres hvert udsnit med et afstandsstykke. En spacer kan skabes ved at placere en rand af vakuum fedt i en firkant omkring vævet sektion.
    2. Ved lægning af dækglas, kan kanterne af dækglas forsegles med vakuum fedt. Tryk ned på kanten af dæksedlen med tommelfingeren for at holde den fast på sliden. Alternativt kan du forsegle dæksedlen på mikroskop sliden med klar neglelak.

7. Imaging vibratome sektioner

  1. Billede de farvede slides inden for 5 dage efter farvning.
  2. Få optiske sektioner af de farvede vibratome skiver ved hjælp af et confokal mikroskop. Med et confokalt mikroskop skal du anskaffe en z-stak i en defineret trin størrelse eller tage individuelle billeder, afhængigt af brugerens eksperimentelle design. Billeder kan undersøges på enhver computerskærm efter confokal samling.
    Bemærk: på grund af tykkelsen af vibratome skiver, anbefales det, at et confokal mikroskop eller et område med z-stack kapacitet bruges til at visualisere detaljer i prøverne. For de billeder, der anvendes i dette manuskript, blev der anvendt en 63x olie målsætning; Dette kan dog skræddersys og modificeres af den enkelte bruger og det specifikke anvendelsesområde, der anvendes. Anbefalet pixel opløsning for hvert mål og zoomfaktor med den formodede Nyquist sampling af 2,5 pixels i X og Y for den mindste optisk afvikles struktur blev anvendt. Nogle kommentatorer foreslår dog 2,3 pixels, mens andre foreslår 2,8 pixels. Der henvises til håndbogen for biologisk Konfokal mikroskopi22 for yderligere oplysninger om, hvordan disse beregninger foretages.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Primær 2-D kulturer dyrkes i føtale kvægserum (FBS) suppleret medier mens primær 3-D salisphere kultur er typisk dyrkes i serum-fri betingelser10,11. Desuden har de to tidligere undersøgelser, der udnytter vibratome kulturer fra spytkirtler, dyrket deres sektioner i 0% eller 10% FBS suppleret Media19,20. Mus submandibulære skiver blev opdelt i en tykkelse på 50 μm ved hjælp af en vibratome og optimale dyrkningsbetingelser blev fastlagt ved hjælp af en række FBS koncentrationer (0%, 2,5%, 5,0%, og 10%). For at bestemme overlevelses karakteristika blev der taget lyse mikroskoper billeder på Kulturdage 1, 4, 7, 14 og 30 efter skæring (figur 1). Desuden, kirtel sektioner blev plettet med 0,4% trypan blå farvestof og indpakket med en lys-felt mikroskop ved 40x på de angivne tidspunkter (figur 2a). Ikke-levedygtige celler blev farvet blå og levedygtige celler forblev klar.

For at bestemme overlevelses egenskaberne for tykkere skiver, der er opdelt på 90 μm, blev der på dag 30 taget billeder af lyse felter med og uden trypan blå farvning i kulturer suppleret med 2,5% FBS (figur 2b). På grund af udsnittet tykkelse, 90 μm sektioner farvet med trypan blå farvestof blev ubeskadigede hele derefter skæres i halve for at vurdere midten af skive (figur 2b). Som en bekræftelse, en levende cellefarve stof blev udnyttet til at vurdere celle overlevelse i forskellige FBS dyrkningsbetingelser (figur 2c). I lyse feltbilleder blev der observeret høje niveauer af gennemskinnelige, overlevende celler i væv fordelt på både 50 μm og 90 μm. Interessant, sektioner blev mørkere og samlede væv område kondenserer over tid i kultur, men en betydelig del af afsnittet synes at overleve den 30-dages kultur periode (figur 1, figur 2). Denne kondensation var tydeligst i de 0% og 10% FBS-dyrkningsbetingelser. Trypan-blå positive celler blev observeret på omkredsen af alle sektioner uanset dyrkningsbetingelser, og der var en stigning i Trypan blåt positivt celleområde i 0% FBS-dyrkningsbetingelser sammenlignet med de højere FBS-dyrkningsbetingelser (figur 2a , 2b).

Ved hjælp af levende celle pletter, de sektioner dyrket i 0% viste den laveste mængde farvning, og tilføjelsen af FBS til kultur medierne forbedret mængden af levende celler. Taget sammen, sektioner dyrket i 0% FBS viste synlige væv kondensation, forhøjede trypan blå bejdsede områder, og de laveste niveauer af levende celle farvning. Tilføjelsen af 2,5% FBS til kulturerne forbedret mængden af gennemskinnelige væv, faldt trypan blå positive område, og øget niveauet af levende celle farvning. Yderligere stigninger i FBS-koncentrationen syntes ikke at forbedre vævets overlevelsesevne. Derfor, 2,5% FBS i vibratome medier var den optimale FBS koncentration og udnyttet som kultur betingelse for alle efterfølgende eksperimenter.

For at bestemme levedygtigheden af de submandibulære ex vivo vævs skiver efter dissektion blev proliferativ og apoptotiske markører evalueret på dag 1, 3, 7, 14 og 30 i kulturen. Den proliferativ aktivitet blev vurderet ved Ki67 immunofarvning i en delmængde af kultur skiver (figur 3a). Ki67 positive celler blev observeret på alle tidspunkter evalueret og fortsatte med at være til stede på dag 30 i kultur, med minimal forskelle mellem tidspunkter. Tilsvarende blev graden af apoptose evalueret af kløvet caspase-3-immunofarvning i en separat delmængde af sektioner (figur 3b). En lav grad af kløvet caspase-3 positive celler blev observeret på alle tidspunkter op til dag 14 i kultur, mens dag 30 betingelser syntes at have en lille stigning i antallet af kløvet caspase-3 positive celler i nogle områder. Ved vurdering af vævs kanterne blev der ikke afsløret højere niveauer af kløvet caspase-3, som ikke overtager den blå farvning af trypan (figur 2). Samlet set tyder disse resultater på, at der i de vibratome kulturer i den 30-dages evalueringsperiode stadig findes stikord til spredning og levedygtighed.

Tyk sektion vibratome kulturer giver mulighed for at vurdere interaktioner mellem cellulære bestanddele af et bestemt væv i en dybde, der omfatter mere end én epitelial celle tykkelse i hver retning. Desuden er det vigtigt at være i stand til at kultur både store spytkirtler, da de afviger i sammensætningen af spyt proteiner produceret, histologisk arkitektur, radio følsomhed, og andre kritiske funktioner. For at bestemme forskellige cellulære populationer i submandibulær kirtel kulturer blev submandibulære sektioner plettet med E-cadherin (E-CAD) til at detektere epitelceller, glat muskelaktin (SMA) til at detektere myoepiteliale celler og actin filamenter (phalloidin) til detektere cytoskeletale strukturer i løbet af de 30 dage i kulturen (figur 4a).

E-cadherin farvning blev observeret på membranerne i et flertal af celler og påvist i løbet af 30-dages kultur periode. SMA + celler blev opdaget i hele kultur perioden, med lignende niveauer på hvert tidspunkt. Cytoskeletale organisering af actin filamenter syntes også at være vedligeholdt på hvert tidspunkt evalueret. I modsætning hertil var der cellulære markører, der ikke konsekvent blev opretholdt i hele evalueringsperioden, og disse omfattede CD31 (vaskulatur), TUBB3 (neuroner) og aquaporin-5 (aqp-5, acinic markør) (figur 4b). Vaskulære strukturer gennem de konfokale stakke blev tydeligt observeret på dag 1 og 3 post-kultur; men disse strukturer syntes fragmenteret på dag 7. Tilsvarende neuronal processer var intakt i den første dag i kulturen, syntes formindsket på dag 3, og blev efterfølgende tabt på dag 7 i kultur. Aqp5 + celler blev observeret på dag 1, 3, 7 og 14 i kultur; om end, på dag 14, det samlede farvnings niveau syntes at være reduceret, med en mere granuleret lighed i de resterende positive celler. Disse data tyder på, at submandibulære kulturer indeholder mangfoldigheden af væv bestanddele med vedligeholdelse af de vaskulære og neuronal celletyper for kortere dyrkningsperioder, og epitelial og myoepithelial celletyper for længere kultur perioder.

Mens vibratome-sekerede kulturer er blevet rapporteret tidligere for parotideale spytkirtel, blev kulturerne opretholdt for 48 h, hvilket begrænser den tidsramme, hvorunder de kunne undersøgt. For at afgøre, om parotitis kirtler kan opretholdes i længere tid, murine parotideale kirtler blev opdelt og kultiveret i 1, 3, 7 eller 14 dage. Færre sektioner blev hentet fra parotideale kirtel på grund af sin mindre størrelse i mus; Derfor blev der ikke gjort forsøg på en kultur periode på 30 dage. Skiver blev evalueret for spredning ved immuno fluorescens farvning ved hjælp af antistof mod Ki67. I lighed med submandibulære kulturer blev der observeret Ki67 positive celler på alle tidspunkter, hvilket indikerer, at cellerne opretholder en grad af spredning i kulturen (figur 5a).

Desuden blev vedligeholdelsen af funktionelle acinic markører (α-amylase og Aqp5), en epitel markør (E-CAD) og vaskulære (CD31) og neuronal (TUBB3) cellepopulationer evalueret. Amylase er et af de mest rigelige proteiner, der produceres af differentierede parotideale epitelceller og ofte tabt under 2-D dyrkning af primære parotideale celler. I de vibratome kulturer, blev amylase observeret i acinic celler og udelukket fra duktalt celler i hele den 14-dages kultur periode (figur 5b). Svarende til submandibulære kulturer, Aqp5 + celler var til stede i parotideale kulturer på hvert tidspunkt, med den dag 14 kulturer udviser reducerede niveauer i forhold til tidligere tidspunkter (figur 5c). E-cadherin niveauer blev også opretholdt på membranerne i et flertal af celler i løbet af 14-dages kultur periode (figur 5D). Neuronal strukturer syntes at blive opretholdt i løbet af den 7 dages kultur periode og blev ikke vurderet på senere tidspunkter (figur 5E). I modsætning hertil forekom vaskulære strukturer intakt i den første dag i kulturen, og kun mindre strukturer var til stede på dag 3 og 7 i kultur (figur 5F). Disse data tyder på, at parotideale kulturer opretholde deres proliferativ kapaciteter og de fleste funktionelle kapaciteter for 7-14 dage i kultur og potentielt udviser en mere intakt vævs struktur for en længere tidsramme.

Den funktionelle nytte af vibratome kulturmodel blev behandlet ved at behandle parotideale eller submandibulære kulturer med en enkelt dosis af stråling (figur 6, figur 7, figur 8). Tidligere arbejde med bestrålede musemodeller har fokuseret på parotiserkirtlen og påvist induktion af apoptose, der topper ved 24 timer, induktion af kompensatorisk proliferation begyndende på dag 5, afbrydelse af aktiv filamenter fra dag 5 og tab af differentierings markører (f. eks. amylase) efter dag 1423,24,26. Bestråling af parotitis vibratome kulturer førte til stigninger i apoptose på dag 1, stigninger i proliferation på dag 7, afbrydelse af actin filamenter på dag 7, og reduktioner i amylase på dag 7 (figur 6). Bestråling af submandibulær vibratome kulturer førte til stigninger i apoptose på dag 1 og 3, stigninger i proliferation på dagen 7, og afbrydelse af aktive filamenter på dag 7 (figur 7). Niveauerne for E-cadherin forekom relativt intakte i både parotitis og submandibulære kulturer, hvilket lignede in vivo observationer26. De funktionelle acinic celle markører aqp-5 i submandibulære kirtel sektioner og amylase i parotidkirtel sektionerne faldt på dag 14 sammenlignet med tilsvarende ubehandlede tidspunkter (figur 8). Disse data tyder på, at strålingsinduceret vævs ændringer, der blev observeret in vivo, også blev observeret i bestrålede vibratome kulturer.

Figure 1
Figur 1: Bright-felt mikroskop billeder af 50 μm submandibulær sektioner. Submandibulære kirtler fra kvindelige FVB-mus (4-8 uger gamle) blev dissekeret, sekteret til 50 μm tykkelse, og kultiveret på organotypiske cellekulturer indsætter i 1, 4, 7, 14 og 30 dage efter dissektion ved 0%, 2,5%, 5,0% og 10% føtal kvægserum (FBS) i medier til fastlægge kultur karakteristika og optimere kultur forholdene. Skala stænger = 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: levedygtig farvning af submandibulær sektioner. (A) billeder i Bright-felt mikroskop af 50 μm submandibulær dissekeret fra 4 til 8 uger gamle fbv-mus og farvet med trypan blåt (0,4%) på 1, 3, 7, 14 og 30 dage i kultur med medier, der indeholder 2,5% føtal kvægserum (FBS). (B) Bright-felt mikroskop billeder af 90 μm submandibulære sektioner (venstre panel), farvet med trypan blå (midterste panel), skåret i halve og farves med trypan blå (højre panel), derefter dyrkes til 30 dage efter dissektion i medier, der indeholder 2,5% FBS. C) fluorescerende billeder af 50 μm submandibulære dele, der dyrkes i forskellige FBS-koncentrationer (0%, 2,5%, 5%, 10%) plettet med calcein AM til at indikere levende celler (grøn) på kultur dagen 7. Skala stænger = 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Vurdering af proliferativ og apoptotiske markører i submandibulær organotypiske vævs skiver. Submandibulære kirtler fra kvindelige FVB-mus (4-8 uger gamle) blev dissekeret, skåret til 50 μm tykkelse og dyrket i medier suppleret med 2,5% FBS på organotypiske cellekultur skær for 1, 3, 7, 14 og 30 dage efter dissektion. På de angivne tidspunkter blev skiver fikseret og farves for proliferativ (Ki67) og apoptotiske (kløvede caspase-3) markører. (A) immunofluorescerende farvning af Ki67-positive celler (grøn) og kernen (blå). (B) Immunofluorescent farvning af kløvet caspase-3-postive celler (rød) og kernen (blå) fra to vinkler af et udsnit. Det øverste række panel viser spaltet caspase-3-positive celler på kanten af et udsnit, og det nederste række panel viser kløvede caspase-3-positive celler fra midten af et udsnit. Repræsentative konfokale billeder blev udvalgt fra flere z-stakke pr. tidspunkt. Skala stænger = 30 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Tilstedeværelsen af cellulære strukturer under submandibulær organotypiske vævs skiver . Submandibulære kirtler fra kvindelige FVB-mus (4-8 uger gamle) blev dissekeret, skåret til 50 μm tykkelse, og dyrket i medier suppleret med 2,5% FBS på organotypiske cellekultur skær for 1, 3, 7, 14 eller 30 dage efter dissektion. På de angivne tidspunkter blev skiver fastgjort og farves for deres tilsvarende markører med kernen (blå). A) submandibulære sektioner blev evalueret på dag 1, 7, 14 og 30 efter dissektion for niveauerne af E-cadherin, glatte MUSKELAKTIN (SMA) og F-actin (phalloidin). (B) submandibulære sektioner blev evalueret på dag 1, 3 og 7 for niveauer af CD31 (vaskulatur) og TUBB3 (neuroner). Aquaporin-5 (Aqp5) blev evalueret på dag 1, 3, 7 og 14. Repræsentative konfokale billeder blev udvalgt fra flere z-stakke pr. tidspunkt. Skala stænger = 30 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Vurdering af proliferativ og funktionelle markører i par organotypiske vævs skiver. Parotid kirtler fra kvindelige FVB-mus (4-8 uger gamle) blev dissekeret, skåret til 50 μm tykkelse, og dyrket i medier suppleret med 2,5% FBS på organotypiske cellekultur skær for 1, 3, 7 eller 14 dage efter dissektion. På de angivne tidspunkter blev skiver fastgjort og farves for deres tilsvarende markører med kernen (blå). (A) immunofluorescerende farvning af Ki67-positive celler (grøn). (B) immunofluorescerende farvning af amylase-positive celler (rød). (C) immunofluorescerende farvning af aquaporin-5 (Aqp5)-positive celler (grøn). (D) immunofluorescerende farvning af E-cadherin (røde) positive celler. (E) immunofluorescerende farvning af neuroner INDIKERET af TUBB3 (Magneta) positive celler. (F) immunofluorescerende farvning af Vaskulaturen angivet ved CD31 (røde) positive celler. Repræsentative konfokale billeder blev udvalgt fra flere z-stakke pr. tidspunkt. Skala stænger = 30 μm; d = duktalt celler. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: cellulære ændringer efter bestråling af parotitis organotypiske vævs skiver. Parotid kirtler fra kvindelige FVB-mus (4-8 uger gamle) blev dissekeret, skåret til 50 μm tykkelse, og kultiveret i suppleret med 2,5% FBS på organotypiske cellekultur skær. På dag 1 efter dissektion blev en delmængde af skiver udsat for 5 Gy stråling og vedligeholdt i 2, 4 eller 8 dage efter dissektion (svarer til dag 1, 3 og 7 efter stråling). Immunofluorescerende farvning af ubehandlet og bestrålet parotitis sektioner for at bestemme niveauet af (a) Ki67 (grønne)-positive celler, (B) kløvet caspase 3 (rød)-positive celler, (C) phalloidin (cyan)-positive celler, ( D) amylase (røde)-positive celler og (e) e-cadherin (røde) positive celler. Alle nukleare farvning udnyttet DAPI (blå). Repræsentative konfokale billeder blev udvalgt fra flere z-stack pr. tidspunkt. Skala stænger = 30 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: cellulære ændringer efter bestråling af submandibulære organotypiske vævs skiver. Submandibulære kirtler fra kvindelige FVB-mus (4-8 uger gamle) blev dissekeret, skåret til 50 μm tykkelse og dyrket i medier suppleret med 2,5% FBS på organotypiske cellekultur skær. På dag 1 efter dissektion blev en delmængde af skiver bestrålet med 5Gy og vedligeholdt i 2, 4 eller 8 dage efter dissektion (svarende til dag 1, 3 og 7 efter stråling). Immunofluorescent farvning af ubehandlet og bestrålet submandibulær sektioner for at bestemme niveauet af (a) Ki67 (grønne)-positive celler, (B) kløvet caspase 3 (rød)-positive celler, (C) phalloidin (cyan)-positive celler, (D) aquaporin 5 (Aqp5) (grøn)-positive celler og (e) e-cadherin (røde) positive celler. Alle nukleare farvning udnyttet DAPI (blå). Repræsentative konfokale billeder blev udvalgt fra flere z-stack pr. tidspunkt. Skala stænger = 30 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: funktionelle acinic markører i bestrålet parotitis og submandibulær organotypiske vævs skiver. Submandibulær og parotideale kirtler fra kvindelige FVB-mus (4-8 uger gamle) blev dissekeret, skåret til 50 μm tykkelse, og dyrkes i medier suppleret med 2,5% FBS på organotypiske cellekultur skær. På dag 1 efter dissektion blev en delmængde af skiver bestrålet med 5Gy og vedligeholdt i 14 dage efter bestråling. Immunofluorescent farvning af ubehandlede (UT) og bestrålede (IR) sektioner blev anvendt til at bestemme niveauer af (a) aquaporin-5 (Aqp5) (grøn)-positive celler og (B) amylase (røde)-positive) celler. Alle nukleare farvning udnyttet DAPI (blå). Repræsentative konfokale billeder blev udvalgt fra flere z-stack pr. tidspunkt. Skala stænger = 30 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Salivary kirtel forskning har udnyttet en række kultur modeller, herunder udødeliggjort 2-d kulturer, primære 2-d kulturer, 3-d salisphere kulturer, og 3-d organ kulturer fra embryonale eksplanteret væv at fastslå spørgsmål om underliggende biologi og fysiologi. Disse kultur modeller har givet indsigtsfulde oplysninger på tværs af en bred vifte af forskningsspørgsmål og vil fortsat være vigtige værktøjer i spyt forskning. Begrænsningerne af disse kultur modeller omfatter graduering af P53 aktivitet under immortalization, forbigående levedygtighed af primære kulturer, tab af differentiering og sekretoriske proteiner i kulturen, og manglende evne til at evaluere celle celle, Cell-ECM og polaritet interaktioner i voksne væv. Den første 3-D organotypiske Slice kultur (vibratome sekeret kulturer) metode til spytkirtler blev offentliggjort i 200818; men denne teknik er i vid udstrækning blevet underudnyttet på dette område trods hyppig brug på andre områder. Det arbejde kultiverede parotitis sektioner for 48 h, som begrænser evnen til at studere disse sektioner for kroniske virkninger efter strålebehandling eller udnytte transfektering eller transduktion protokoller for fænotyper efter manipulation af specifikke gener. Den metode, der er beskrevet her, er optimeret til at give længere tid i kulturen, give billeder i høj opløsning gennem confokal mikroskopi, give en metode til at studere intra-og intercellulær dynamik på en 3-D sektion og evaluere strålingsinducerede ændringer under en kultur periode på mindst 14 dage.

Mens hvert trin er nødvendigt for gennemførelsen af teknikken, nogle skridt er afgørende for en vellykket skæring og kultur vedligeholdelse. Disse omfatter skæring af spytkirtel skiver, vedligeholdelse af skiver i kultur, og farvning og billeddannelse skiver med confokal mikroskopi. Den præsenterede protokol rejser nogle udfordringer, der kræver tålmodighed og praksis for at opnå optimale skiver til analyse. Følgende forslag vil hjælpe med at gennemføre denne protokol med succes. Det er bydende nødvendigt at helt isolere spytkirtel fra det omgivende bindevæv efter dissektion. Resterende bindevæv forårsager vibratome bladet til at trække kirtel ud fra agopstået blokken og kræver, at vævet skal re-indlejret i agopstod. Dette kan være en væsentlig begrænsning, da flere re-indlejring kan øge chancerne for kontaminering og mindske levedygtigheden af skiver. Dette er især afgørende for dyrkning parotideale kirtler, da parotideale kirtler er mere lobulær i struktur og derfor mere tilbøjelige til at have fremmede væv.

Tilsætning af 1% penicillin-streptomycin-amphotericin B (PSA) til alle væsker, herunder buffer bakken, udsnitsskålen, og vibratome mediet minimerer kontaminering af snittene efter dissektion. Variation af agopstået koncentration blev brugt til at optimere en vellykket skæring. På grund af tætheden af spytkirtler, 1,9% agopstod var for blød, og kirtler blev let afspærret fra blokken. Vibratome skæring i andre felter har brugt 5,0% agopstået; men dette forårsagede takkede nedskæringer og skiver var suboptimale. Efter at have testet flere agopstået procentvise forhold, var 3% agopstået den mest optimale til at understøtte vægten og fasthed af vævet. Især var den agopstået koncentration, der blev benyttet i Warner et al. og Su et al., også 3%19,20.

Desuden kan vinklen, hyppigheden af vibrationer, og fremrykkende hastighed af bladet ændres baseret på det væv, der skal sekeres. For submandibulær og parotideale spytkirtler, en 15 ° vinkel, hastighed på 0,075 mm/s, og hyppigheden af 100 Hz var passende for skæring. På grund af blødhed af spytkirtlerne, krævede de optimale skære betingelser, at klingen langsomt gik frem gennem vævet ved høj vibration. For immuno fluorescens farvning, permeabilization, varighed af inkuationer, og vask trin er afgørende for optimale pletter. Hvis der kun forekommer positiv farvning i de ydre lag af vævs udsnittet, kan der være behov for en mere stringent permeabilisering med proteinase K, mens ujævn farvning eller høj baggrunds farvning kan kræve en mindre streng farvning med 0,2% Triton X-100. Inkubationstiderne blev optimeret til højt signal og lav baggrund, som muligvis skal skræddersys til specifikke primære antistoffer. Længere vask trin er afgørende for at reducere høj baggrund, og dette kan være skræddersyet til de specifikke antistoffer, der anvendes.

En større anvendelse af denne metode er udvidet kinetisk analyse efter strålingseksponering af spytkirtler. Tidligere arbejde har fastslået både akutte og kroniske faseændringer i bestrålede spytkirtler6,24,25,26, og vibratome kultur system kan være et effektivt værktøj til at dissekere de kritiske molekylære hændelser på bestemte tidspunkter efter behandlingen. For eksempel stråling-induceret cellulære ændringer i spytkirtel, der er blevet rapporteret i litteraturen, herunder reduktioner i amylase, apoptose af acinic celler, kompenserende proliferation af acinic celler, tab af polaritet og forstyrrelser i cytoskelet struktur. Især er vibratome kulturer bestrålet ex vivo udviser lignende ændringer i disse markører.

Desuden pivoterer den akutte fase respons i spytkirtler omkring P53 aktivitet; Det er dog uklart, hvilken rolle P53 spiller i senere tidspunkter på grund af den ~ 5-dages levedygtighed af primær kulturer. Dette system vil tillade ex vivo, kontrolleret afbrydelse af P53 aktivitet på senere tidspunkter og afdække en rolle i kroniske skader eller total reaktioner. Desuden initieres den kompenserende proliferation respons 5 dage efter strålebehandling, og det er vanskeligt at afgrænse de molekylære regulatorer af dette respons i forbigående primær kulturer. Den mest udbredte anvendelse af denne metode vil sandsynligvis involvere celle celle, Cell-ECM, og polaritet interaktioner i voksne væv. Der er udført virkningsfulde studier i 3-D organ kulturer fra embryonale kirtler for at afdække den indviklede interaktion mellem udvikling af spytkirtler og det neuronale eller vaskulære netværk27,28,29, 30,31.

Den metode, der er beskrevet her indikerer, at yderligere optimering er nødvendig for neuronal eller vaskulære arbejde i submandibulære kulturer og eventuelt parotideale kulturer. Stråling skader også forstyrrer Junctional regulatorer, inducerer kollagen deposition, ændrer F-aktin organisation, og moduserer sekretorisk granulat26,30,32. Spytkirtel regenererings undersøgelser er hæmmet af fraværet af en voksen model til at evaluere disse interaktioner. Denne organotypiske kultur metode kan give et system til at anvende avancerede molekylære teknikker og yderligere studere reguleringen af disse mæglere i en 3-D sammenhæng og effektivt opdage nye terapier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev delvist støttet af pilot finansiering fra University of Arizona Office of Research and Discovery og National Institutes of Health (R01 DE023534) til Kirsten Limesand. Den kræft biologi uddannelse Grant, T32CA009213, forudsat stipendium støtte til Wen Yu Wong. Forfatterne vil gerne takke M. Rice for hans værdifulde tekniske bidrag.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vibratome VT1000S Leica Biosystems N/A Vibratome for sectioning
Double Edge Stainless Steel Razor Blades Electron Microscopy Sciences 72000
Agarose Fisher Scientific BP165-25 Low-melt
Parafilm Sigma-Aldrich P6543
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Lonza 17-745H PSA
24-well plate CellTreat 229124
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) Gibco 14190-144
Loctite UltraGel Control Superglue Loctite N/A Purchased at hardware store
Natural Red Sable Round Paintbrush Princeton Art & Brush Co 7400R-2
Gentamicin Sulfate Fisher Scientific ICN1676045
Transferrin Sigma-Aldrich T-8158-100mg
L-glutatmine Gibco 25030-081
Trace Elements MP Biomedicals ICN1676549
Insulin Fisher Scientific 12585014
Epidermal Growth Factor Corning 354001
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H0888
Retinoic acid Fisher Scientific R2625-50MG
Fetal Bovine Serum Gibco A3160602
DMEM/F12 Media Corning 150-90-CV
Millicell Cell Culture Insert Millipore Sigma PICM01250 12 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate
0.4% Trypan Blue Sigma-Aldrich T8154
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) Thermo-Fisher R37601 Only used LIVE dye component
Anti-Ki-67 Antibody Cell Signaling Technology 9129S
Anti-E-cadherin Antibody Cell Signaling Technology 3195S
Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody Cell Signaling Technology 9661L
Anti-SMA Antibody Sigma-Aldrich C6198
Anti-amylase Antibody Sigma-Aldrich A8273
Anti-CD31 Antibody Abcam ab28364
Anti-TUBB3 Antibody Cell Signaling Technology 5568S
Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit Thermo-Fisher A20185
Alexa Fluor 594 Phalloidin Thermo-Fisher A12381
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1600
Triton X-100 Sigma-Aldrich 21568-2500
Paraformaldehyde Prills Fisher Scientific 5027632
New England Nuclear Blocking Agent Perkin Elmer 2346249 No longer sold
DAPI Cell Signaling Technology 4083S
Prolong Gold Antifade Mounting Media Invitrogen P36934
Leica SPSII Spectral Confocal Leica Biosystems N/A For confocal imaging
Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope Leica Biosystems N/A
Cobalt-60 Teletherapy Instrument Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80 N/A
Amac Box, Clear The Container Store 60140 Agarose block mold

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: a literature review. Cancer. 107 (11), 2525-2534 (2006).
  2. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).
  3. Hancock, P. J., Epstein, J. B., Sadler, G. R. Oral and dental management related to radiation therapy for head and neck cancer. Journal of the Canadian Dental Association. 69 (9), 585-590 (2003).
  4. Nguyen, N. P., et al. Quality of life following chemoradiation and postoperative radiation for locally advanced head and neck cancer. Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 69 (5), 271-276 (2007).
  5. Gorenc, M., Kozjek, N. R., Strojan, P. Malnutrition and cachexia in patients with head and neck cancer treated with (chemo)radiotherapy. Reports of Practical Oncology and Radiotherapy. Journal of Greatpoland Cancer Center in Poznań and Polish Society of Radiation Oncology. 20 (4), 249-258 (2015).
  6. Grundmann, O., Mitchell, G. C., Limesand, K. H. Sensitivity of salivary glands to radiation: from animal models to therapies. Journal of Dental Research. 88 (10), 894-903 (2009).
  7. Konings, A. W., Coppes, R. P., Vissink, A. On the mechanism of salivary gland radiosensitivity. International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 62 (4), 1187-1194 (2005).
  8. Chan, Y. -H., Huang, T. -W., Young, T. -H., Lou, P. -J. Human salivary gland acinar cells spontaneously form three-dimensional structures and change the protein expression patterns. Journal of Cellular Physiology. 226 (11), 3076-3085 (2011).
  9. Nguyen, V. T., Dawson, P., Zhang, Q., Harris, Z., Limesand, K. H. Administration of growth factors promotes salisphere formation from irradiated parotid salivary glands. PLoS ONE. 13 (3), e0193942 (2018).
  10. Limesand, K. H., et al. Characterization of Rat Parotid and Submandibular Acinar Cell Apoptosis In Primary Culture. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 39 (3), 170 (2003).
  11. Wei, L., Xiong, H., Li, W., Li, B., Cheng, Y. Upregulation of IL-6 expression in human salivary gland cell line by IL-17 via activation of p38 MAPK, ERK, PI3K/Akt, and NF-κB pathways. Journal of Oral Pathology & Medicine. 47 (9), 847-855 (2018).
  12. Chuong, C., Katz, J., Pauley, K. M., Bulosan, M., Cha, S. RAGE expression and NF-κB activation attenuated by extracellular domain of RAGE in human salivary gland cell line. Journal of Cellular Physiology. 221 (2), 430-434 (2009).
  13. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
  14. Bhadriraju, K., Chen, C. S. Engineering cellular microenvironments to improve cell-based drug testing. Drug Discovery Today. 7 (11), 612-620 (2002).
  15. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  16. Avila, J. L., Grundmann, O., Burd, R., Limesand, K. H. Radiation-induced salivary gland dysfunction results from p53-dependent apoptosis. International Journal of Radiation Oncology, Biololgy, Physics. 73 (2), 523-529 (2009).
  17. Mitchell, G. C., et al. IGF1 activates cell cycle arrest following irradiation by reducing binding. of DeltaNp63 to the p21 promoter. Cell Death & Disease. 1, (2010).
  18. Lombaert, I. M. A., et al. Rescue of Salivary Gland Function after Stem Cell Transplantation in Irradiated Glands. PLoS ONE. 3 (4), (2008).
  19. Warner, J. D., et al. Visualizing form and function in organotypic slices of the adult mouse parotid gland. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 295 (3), G629-G640 (2008).
  20. Su, X., et al. Three-dimensional organotypic culture of human salivary glands: the slice culture model. Oral Diseases. 22 (7), 639-648 (2016).
  21. Mattei, G., Cristiani, I., Magliaro, C., Ahluwalia, A. Profile analysis of hepatic porcine and murine brain tissue slices obtained with a vibratome. PeerJ - The Journal of Life and Environmental Sciences. 3, 932 (2015).
  22. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. , 3rd ed, Springer U.S. Boston, MA. (2006).
  23. Limesand, K. H., et al. Insulin-Like Growth Factor-1 Preserves Salivary Gland Function After Fractionated Radiation. International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 78 (2), 579-586 (2010).
  24. Grundmann, O., Fillinger, J. L., Victory, K. R., Burd, R., Limesand, K. H. Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration. BMC Cancer. 10, 417 (2010).
  25. Chibly, A. M., et al. aPKCzeta-dependent Repression of Yap is Necessary for Functional Restoration of Irradiated Salivary Glands with IGF-1. Scientific Reports. 8 (1), 6347 (2018).
  26. Wong, W. Y., Pier, M., Limesand, K. H. Persistent disruption of lateral junctional complexes and actin cytoskeleton in parotid salivary glands following radiation treatment. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 315 (4), R656-R667 (2018).
  27. Emmerson, E., et al. SOX2 regulates acinar cell development in the salivary gland. eLife. 6, (2017).
  28. Nedvetsky, P. I., et al. Parasympathetic innervation regulates tubulogenesis in the developing salivary gland. Developmental Cell. 30 (4), 449-462 (2014).
  29. Kwon, H. R., Nelson, D. A., DeSantis, K. A., Morrissey, J. M., Larsen, M. Endothelial cell regulation of salivary gland epithelial patterning. Development. 144 (2), 211-220 (2017).
  30. Mellas, R. E., Leigh, N. J., Nelson, J. W., McCall, A. D., Baker, O. J. Zonula occludens-1, occludin and E-cadherin expression and organization in salivary glands with Sjogren's syndrome. Jounral of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (1), 45-56 (2015).
  31. Daley, W. P., et al. Btbd7 is essential for region-specific epithelial cell dynamics and branching morphogenesis in vivo. Development. 144 (12), 2200-2211 (2017).
  32. Nam, K., et al. Post-Irradiated Human Submandibular Glands Display High Collagen Deposition, Disorganized Cell Junctions, and an Increased Number of Adipocytes. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (6), 343-352 (2016).

Tags

Medicin udstedelse 147 submandibulær spytkirtel vibratome kultur stråling parotideale spytkirtel organotypiske kultur xerostomien
Strålebehandling af Organotypiske kulturer fra Submandibulær og Parotid spytkirtler modeller Key in vivo egenskaber
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Meyer, R., Wong, W. Y., Guzman, R.,… More

Meyer, R., Wong, W. Y., Guzman, R., Burd, R., Limesand, K. Radiation Treatment of Organotypic Cultures from Submandibular and Parotid Salivary Glands Models Key In Vivo Characteristics. J. Vis. Exp. (147), e59484, doi:10.3791/59484 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter