Summary
3 차원 유기 typic 문화권을 사용 하 여 타 액 선의 형태학 및 기능적인 마커를 시각화 하는 것은 방사선을 따르는 조직 손상의 기계 장치에 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기에서 설명 하는 프로토콜은 이온화 방사선에 노출 되기 전에 섹션, 문화, 방사선, 얼룩 및 이미지 50-90 μ m 두께의 타 액 선 섹션에 관한 것 이다.
Abstract
Xerostomia는 방사선 요법으로 치료 되는 머리와 목 암 환자에 있는 삶의 질을 감소 시키는 만성 경구 합병증을 만듭니다. 타 액 선 기능 장애 및 복원의 이해 메커니즘에 대 한 실험적 접근법은 생체 내 모델에 초점을 맞추고 있으며,이는 형질 감염의 치료 후보 및 효율성을 체계적으로 화면 화 하는 무 능력에 의해 장애인 특정 유전자를 조작 하는 기능. 이 침 샘 유기 typic 배양 프로토콜의 목적은 배양 생존 율의 최대 시간을 평가 하 고 전 생체 방사선 치료 후 세포 변화를 특성화 하는 것입니다. 우리는 면역 형광 염색 및 공초점 현미경을 이용 하 여 특정 세포 집단 및 마커가 30 일 배양 기간 동안 존재 하는 시기를 결정 합니다. 또한, 이전에 생체 내 방사선 모델에서 보고 된 세포 마커는 생체 내 조사 되는 배양 물에서 평가 된다. 전진 하는이 방법은 침 샘 기능을 개선 하는 치료제에 대 한 뮤 린 및 인간 타 액 선 조직 반응의 신속한 ex 생체 내 평가를 위한 매력적인 플랫폼입니다.
Introduction
적절 한 타 액 선 기능은 구강 건강에 필수적 이며 방사선 요법으로 머리와 목 암 치료 다음에 변경 됩니다1. 2017에서, 머리와 목 암의 거의 5만 새로운 케이스는 미국에서 보고 되었다2. 침 샘과 같은 주변 정상 조직에 대 한 방사선 요법의 조직 손상 및 자주 돌이킬 수 없는 효과로 인해, 환자는 종종 심각한 부작용으로 남아 있고 삶의 질을 감소2,3, 4. 방사선 손상으로 인 한 일반적인 합병증은 xerostomia (구강 건조의 주관적인 느낌), 치아 우 식, 씹는 것과 삼 킴, 음성 장애 및 손상 된 경구 마이크로 바이오 메스2 와 같은 증상에서 나타난다 3 , 4.이 현상은 집단적으로 영향 받은 개별에 있는 영양실조 그리고 손상 한 생존에 지도할 수 있습니다5. 이 인구의 침 샘 기능 장애는 잘 문서화 되었지만, 포상 세포에 대 한 손상의 근본적인 기전이 논란이 되었으며, 다른 동물 모델 들 사이에는 약간의 통합이 있다6,7.
침 샘 기능 및 방사선 유발 손상 연구의 현재 방법은 생체 내 모델의 사용을 포함, 불멸의 세포 주, 2 차원 (2-d) 일차 세포 배양 물 및 3 차원 (3-d) 살 리 구 균 배양 물8, 10,11,12. 전통적으로, 불멸의 세포 라인과 2 차원 배양에서 세포 배양 모델은 평평한 표면에 배양 된 단일 층 세포를 포함 하 고 빠르고, 쉽고, 비용 효율적인 실험에 대 한 가치가 있다. 그러나, 인공 세포 배양 조건은 다양 한 조건에 노출 된 세포의 분화 상태 및 생리 적 반응을 변화 시킬 수 있으며, 그 결과는 종종 전체 유기 체 모델14,15로의 번역에 실패 하 게 된다. 또한, 불멸 세포 배양은 DNA 손상16,17에 대 한 침 샘 반응에 중요 한 p53 활성의 변조를 필요로 한다.
3 차원 살 리 구의 배양은 배양 초기 시점에서 줄기 및 전구 세포에 대해 풍부 하 고, 침 샘 세포의이 서브셋 인9,18의 방사선 민감성을 이해 하는데 유용 하였다. 이러한 모든 배양 모델의 중요 한 제한은 세포 외 기질 (ECM) 및 다양 한 층을 통한 세포 세포 상호 작용을 포함 하는 침 샘의 3 차원 구조를 시각화 하는 데 효과가 없으며,이는 타 액 조절에 결정적인 역할을 합니다. 분 비15. 전체적으로 조직의 거동을 포괄 하는 방법에 대 한 필요성이 있지만, 또한 방사선 유발 침 샘의 근본적인 메커니즘을 더 발견 하기 위해 치료의 효과를 연구 하기 위해 실험실 조건 하에서 조작 될 수 있다 장애.
살아있는 조직 절편 및 문화는 이전에 문서화 되었습니다19,20 종종 뇌 조직 상호 작용을 연구 하는 데 사용21. 이전 연구에서, 파 타 액 선 조직은 마우스 로부터 약 50 µm에서 단면화 되었고 최대 48 h까지 배양 하였으며, 생존 율, 세포 사 멸 및 기능을 분석 한 후19를 수행 하였다. Su 외. (2016) 35 µm 또는 50 µm에서 단면화 된 인간 턱 밑 샘 (SMGs)을 14 일 동안 배양 하 여이방법론을 확장 하였다. 제안 된 방법은 30 일 동안 50 µm 및 90 µm 및 배양에 대 한 평가에서 단면화 된 파와 턱 밑 침 샘 모두를 포함 한다는 것에서 전진 합니다. 조직 두께 범위를 절단 하는 능력은 분 비에 대 한 apical-basolateral 극성 및 신경 분포를 포함 하는 세포 프로세스와 관련 된 세포 세포 및 세포-ECM 상호작용을 평가 하는 데 중요 합니다. 더욱이, 침 샘 슬라이스는 배양 중에 조사 되어 방사선 유발 된 타 액 선 손상을 연구 하기 위한이 배양 모델의 타당성을 확인 하였다.
이 침 샘 유기 typic 배양 프로토콜의 목적은 배양 생존 율의 최대 시간을 평가 하 고 전 생체 방사선 치료 후 세포 변화를 특성화 하는 것입니다. 세포 사 멸을 위한, 트리 판 청색 염색, 살아있는 세포 염색 및 면역 조직 염색을 실행 가능한 최대 시간 섹션을 결정 하기 위해 수행 하였다. 공초점 현미경 및 면역 형광 염색은 특정 세포 집단, 형태학 적 구조 및 증식 수준을 평가 하기 위해 활용 되었다. 조직 섹션 배양은 또한이 3-d 모델에서 다양 한 마커에 대 한 방사선의 영향을 확인 하기 위해 이온화 방사선에 노출 되었다. 세포 사 멸 유도, 세포 골격 파괴, 분화 마커의 상실 및 조사 된 전 생체 배양에서의 보상 증식은 생체 내 모델의 이전 연구와 비교 하였다. 이 방법론은 방사선 손상에 따르는 세포 세포 상호 작용의 역할을 조사 하 고 치료 적 개입의 효능을 효율적으로 평가할 수 있는 실험적 모델을 제공 하는 수단을 제공 한다 (유전자 조작 또는 약리학 적 제제 )는 생체 내 모델에 대해 덜 적합할 수 있다.
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Protocol
1. 진동의 제조
- 완충 트레이, 블레이드 부착, 아가 로스 블록 몰드 및 실험실 필름을 포함 하 여 진동의 분리 가능한 구성품을 70% 에탄올로 분무 한 다음 적어도 30 분 동안 자외선 살 균 합니다.
- 얼음이 떨어지는 것을 막기 위해 추가의 실험실 필름을 완충 트레이에 놓고 고정 하십시오.
- 얼음 실에 분쇄 된 얼음을 채우고 버퍼 트레이에서 실험실 필름을 제거 하 고 1% 페니실린-streptomycin-앰 피 실린 (PSA)로 보충 되는 100 mL의 얼음 차가운 1x 인산 완충 식 염 액 (PBS) 용액으로 완충 트레이를 채웁니다.
- 스테인레스 스틸 면도날을 블레이드 홀더에 넣습니다. 스크루 드라이버를 사용 하 여 블레이드의 각도를 강화/풀고 변경 합니다.
2. 진동 체를 사용 하 여 아가 로스 블록 및 절편으로 조직 샘플의 제조
- 집게,가 위 및 페인트 브러시를 포함 하 여 필요한 모든 해 부 및 절편 도구를 오토 클레이 브.
- 3% 낮은 융 점 아가 로스를 멸 균 된 1x PBS로 준비 하 고 아가 로스가 용액에 녹을 때까지 전자 레인지에 넣습니다. 용액이 끓이 지 않는지 확인 하 고 병을 주기적으로 소용돌이치 세요.
참고: 저 융 점 오 스를 따뜻한 수조에 보관 하 여 응고 시키는 것을 방지 하십시오. 저 용융 아가 로스는 37 ° c에서 유체 이며 25°c에서 설정 합니다. 그러나, 수 욕은 생리 적 온도에서 조직 주위에 아가 로스를 부 어 하기 위해 40 ° c이 하 이어야 한다. - 침 샘을 분리 하 고 하 부 조직을 2 mL 아이스 콜드 1x PBS에 넣고 1% PSA로 보충 한 후 30 mm의 무 균 배양 접시에 넣습니다.
- 멸 균 핀셋을 사용 하 여 1pb+1% PSA 솔루션에서 침 샘을 제거 하 고 임베딩 몰드 하단에 위치 시킵니다. 조직을 커버 하는 액체 3% 낮은 융 점 아가 로스로 금형을 채 웁 니다.
- 포 셉을 사용 하 여 조직을 블록의 중간으로 조정 하 고 침 샘을 적절 한 평면에 놓습니다. 하 악 및 파 니 스 땀 샘에 대 한 최적의 횡단면은 수직 평면에 있습니다.
- 아가 로스 블록을 얼음에 10 분 동안 넣고 굳 힙 니다.
- 조심 스럽게 아가 로스의 바깥 가장자리 주위에 면도날을 실행 하 여 느슨하게 하 고 블록을 1.1 단계에서 UV 멸 균 된 실험실 필름 위로 밀어 넣으십시오.
- 면도날을 사용 하 여 타 액 샘이 들어 있는 아가 로스 상자를 잘라냅니다. 단면의 평면이 직선 이며 블록의 반대쪽 (아래로 붙일 서피스)에 평행 인지 확인 합니다. 아가 로스가 조직에 침투 하지 않기 때문에 조직이 잘 지원 될 수 있도록 조직 주위에 너무 많은 아가 로스를 트리밍 하지 마십시오.
- 절단 표면에 블록을 부착 하려면 수퍼 접착제를 사용 합니다.
- 50 µm 또는 90 µm 두께 0.075 mm/s의 속도 및 100 Hz의 주파수에서의 진동.
주: 가장 높은 주파수와 가장 낮은 블레이드 속도로 진동을 설정 하면 최적의 슬라이스를 제공 합니다. - 무 균 성을 유지 하기 위해 슬라이스 컬렉션 사이에 70%의 에탄올에 브러시를 배치 하 고, 오토 클레이 브, 천연 헤어 브러시를 사용 하 여 잘 1 mL 얼음 차가운 PBS를 포함 하는 24 웰 조직 배양 접시에 섹션을 수집 합니다.
3. 배양 섹션
- 마이크로-주걱 및 집게를 오토 클레이 브.
- 소 태아를 포함 하거나 없이 스톡 진동 배양 배지 만들기 세럼 (FBS): 1% PSA, 5µ g/mL 트랜스 페 린으로 보충 되는 DMEM/F12 미디어, 1.1 µ M 하이드로 코르 티 손, 0.1 µ M 레 틴 산, 5 80 µ 표 피 성장 인자, 5mm L 글루타민, 50 µ 겐 타 마이 신 설 페이트 및 10 µ L/mL 미 량 원소 혼합물. 적절 한 양의 FBS를 추가 하 여 0%, 2.5%, 5.0% 또는 10% 솔루션을 만듭니다.
- 절편 하기 전에, 미리 데워 진 매체의 300 μ l를 추가 하 고 직경 12mm, 0.4 µm 기 공 크기 멤브레인을 24 웰 조직 배양 판의 각 웰에 삽입 합니다. 매체는 배양을 위한 액체 공기 인터페이스를 만들기 위해 멤브레인 바닥에 도달 해야 합니다.
- 37 ° c에서 마이크로 주걱 및 배양 액을 사용 하 여 멤브레인 인서트의 상단에 침 섹션을 부드럽게가 습 5 % co2 및 95% 공기 분위기 인큐베이터에 놓는다.
- 약 300 μ l의 1 차 배양 배지를 웰에 넣고 멤브레인 인서트 (약 40 μ l)에 몇 방울 떨어뜨려 서 또는 필요에 따라 매일 첨가 하십시오. 적절 한 배양은 세포가 최대 30 일 전 생체 내에서 생존 하 고 유지 될 수 있음을 보여주었다.
4. 침 샘 섹션의 조사
- 코발트-60 (또는이에 상응 하는) 조사 기를 사용 하 여 단일 용량의 방사선 (5Gy)으로 섹션을 처리 합니다.
- 온도 변동을 방지 하기 위해 지붕이 있는 스티로폼 용기를 사용 하 여 방사선 조사 시설에 운송 섹션을 전송 합니다. 또한, 미디어가 배양 뚜껑에 튀 지 않고 오염을 유도 하지 않도록 실험실 인큐베이터로 반송 하는 동안 주의가 필요 합니다.
- 침 샘 섹션을 포함 하는 24 웰 플레이트를 방사선 공급원에서 80 센티미터, 32 "x 32" 방사선 분야의 중심에 배치 합니다. 방사선 량 계산 및 조사 기의 해당 시간은 계측기와 코발트-60 붕괴에 따라 달라 집니다.
- 섹션 3에 설명 된 대로 이러한 섹션을 계속 모니터링 하 고 배양 합니다.
5. 생존 염색
- 오래 된 미디어를 흡 기 하 고 멸 균으로 두 번 슬라이스를 세척, 미리 따뜻하게 1x PBS.
- 염색 부분에는 트리 판 블루 염료가 있습니다.
- 마이크로 주걱을 사용 하 여 문화에서 유리 슬라이드로 슬라이스를 이동 합니다.
- 조직 (10 ~ 20 µ L)을 커버 하기에 충분 한 부피의 진동에 0.4% 트리 판 블루 솔루션을 추가 합니다.
- 염료가 조직에 침투 하기 위해 트리 판 분 동안 실 온 (RT)에서 슬라이스를 배양 합니다. 생존 하지 않은 세포는 청색으로 얼룩진 것 이며, 생존 가능한 세포는 얼룩 지지 않습니다.
- 얼룩 부분은 칼 세 인, AM 살 세포 염료입니다.
- 24 웰 플레이트 (µ L)의 한 우물에서 부분을 커버 하기 위해 충분 한 양의 얼룩을 추가 하십시오.
- 염료 침투가 가능 하도록 RT에서 15 분 동안 슬라이스를 배양 합니다.
- 조심 스럽게 우물에서 섹션을 제거 하 고 유리 슬라이드에 놓습니다. 마운팅 미디어 1 방울로 슬라이스를 마운트합니다.
- 488 nm 및 515 nm의 여기/방출 파장의 형광 현미경에 대 한 이미지 섹션.
6. 항 체 염색 진동 섹션
참고: 다음은 Ki-67에 특이 적인 일반적인 항 체 염색 프로토콜을 제공 합니다. 그러나,이 프로토콜은 임의의 항 체와 함께 사용 될 수 있다. 별도의 언급이 없는 한 모든 세척은 RT에서 진행 됩니다.
- 다중 우물 조직 배양 접시에, 미디어를 흡 인 하 고 멸 균 1x PBS로 적어도 2 배를 씻으십시오.
- 4°c에서 밤새 4% 파라 포름알데히드 (PFA)를 사용 하 여 섹션을 수정 합니다.
- 4% PFA를 흡 기 하 고 PBT를 사용 하 여 3 배를 세척 하 고, 0.1% 트리톤 X-100).
참고: 섹션은 4°c에서 1x PBS에 저장 하 고 나중에 염색 할 수 있습니다. 이 원고에서 테스트 한 최대 보관 시간은 3 주 였습니다. 필요한 경우 개별 사용자가 더 긴 저장 시간을 최적화 해야 합니다. - 0.3% 트리톤 X-100을 사용 하 여 30 분 동안 1 PBS에서의 투과 섹션
참고:이 단계는 특정 항 체 염색 및 투과를 위해 수정 및 최적화 될 수 있습니다. - 의 침투를 차단 합니다.
- 1% BSA와 0.1% 트리톤 X 100 (PBT)와 함께 5 분 동안 슬라이스 3x를 씻으십시오.
- 1% 정상 염소 세럼 1%로 차단 제로 슬라이스를 차단 합니다.
- PBT로 5 분 동안 슬라이스 3x를 씻으십시오.
- 1% BSA에서 500 µ L 항 Ki67 토끼 단 클론 항 체를 1x PBS로 희석 하 여 4°c에서 밤새 슬라이스를 배양 한다.
참고: phalloidin 염색에 대 한, 6.9 단계를 건너 뛰고 특정 phalloidin에 대 한 프로토콜을 사용 하 여 계속. DNA 반대 얼룩의 경우, 6.15 단계로 건너뜁니다. - Ki67 토끼 단 클론 항 체를 흡입 합니다.
- 1x PBS에서 5 분 동안 슬라이스 6 배를 씻으십시오.
- Ki67 항 체와 호환 되는 형광 공액 2 차 항 체의 500 µ L의 슬라이스를 1.5 h의 RT에서 1% BSA에 1x PBS로 희석 하 여 배양 하 여 빛 으로부터 보호 한다.
주: 사용 되는 이차 항 체에 기초 하 여, 이차 항 체와의 인큐베이션 시간은 개별 사용자에 의해 더욱 최적화 될 수 있다. 또한, 2 차 항 체는 광 감 응 이다. 모든 후속 세척은 어둠 속에서 수행 되어야 합니다. - 2 차 항 체를 흡 기.
- 1x PBS로 5 분 동안 슬라이스를 3 배 씻으십시오.
- 탈 이온 수에서 5 분간 슬라이스를 씻으십시오.
- RT에서 20 분 동안 DAPI (1 µ를 사용 하 여 슬라이스를 반염색 합니다.
- 슬라이스 (한 번)를 탈 이온 수에서 5 분간 씻으십시오.
- 장착 용지의 한 방울 (~ 40 µ L)으로 슬라이스를 마운트합니다. 과잉 기포를 방지 하려면 45 ° 각도로 시작 하 여 슬라이드의 마운팅 미디어에 커버 슬립을 천천히 놓습니다.
- 커버 슬립으로 두꺼운 부분을 분쇄 하는 것을 방지 하려면 각 슬라이스를 스페이서와 함께 장착 합니다. 스페이서는 조직 섹션 주위에 있는 정사각형에 진공 그리스의 테두리를 배치 하 여 만들 수 있습니다.
- 커버 슬립을 배치할 때 커버 슬립의 가장자리를 진공 그리스로 밀봉 할 수 있습니다. 엄지 손가락으로 커버 슬립의 가장자리를 아래로 눌러 슬라이드에 단단히 부착 합니다. 또는 투명 매니큐어를 사용 하 여 커버 슬립을 현미경 슬라이드에 밀봉 하십시오.
7. 이미징 진동 섹션
- 염색 후 5 일 이내에 염색 된 슬라이드를 이미지 합니다.
- 공초점 현미경을 이용 하 여 스테인드 진동 조각의 광학 단면을 얻는다. 공초점 현미경을 사용 하 여 정의 된 스텝 사이즈로 z-스택을 획득 하거나 사용자의 실험 설계에 따라 개별 이미지를 촬영 합니다. 공초점 수집 후 모든 컴퓨터 화면에서 이미지를 검사할 수 있습니다.
참고: 진동 슬라이스 두께 때문에 공초점 현미경 또는 z-스택 기능이 있는 스코프를 사용 하 여 샘플 내 세부 사항을 시각화할 것을 권장 합니다. 이 원고에 사용 된 이미지의 경우 63x 오일 목표가 사용 되었습니다. 그러나이는 개별 사용자 및 사용 된 특정 범위에 따라 조정 되 고 추가로 수정 될 수 있습니다. 가장 작은 광학적으로 확인 가능한 구조에 대해 X 및 Y에서 2.5 픽셀의 추정 된 나이 퀴 스 트 샘플링을 사용 하 여 각 대물 렌즈 및 확대/축소 계수에 권장 되는 픽셀 해상도. 그러나 일부 주석 가들은 2.3 픽셀을 제안 하 고 나머지는 2.8 픽셀을 제안 합니다. 이러한 계산을 수행 하는 방법에 대 한 자세한 내용은 생물학적 공초점 현미경 안내서 (22 )를 참조 하십시오.
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Representative Results
1 차 2 차원 배양은 소 혈 청 (FBS) 보충 된 배지에서 성장 되 고, 일차 3 차원 살 리 구 배양은 전형적으로 무 혈 청 조건10,11에서 배양 된다. 추가적으로, 침 샘에서의 진동 배양을 활용 한 두 개의 이전 연구는 보충 된 배지 FBS을0% 또는 10%로 배양 하였다. 마우스 턱 밑의 슬라이스는 50 µm의 두께에서 단면화 되어 진동 및 최적 배양 조건을 사용 하 여 일련의 FBS 농도 (0%, 2.5%, 5.0% 및 10%)를 사용 하 여 결정 하였다. 생존 특성을 결정 하기 위해, 밝은 전계 현미경 이미지는 배양 일 1, 4, 7, 14 및 30 사후 절편에서 촬영 하였다 (그림 1). 추가적으로, 글 랜드 섹션은 0.4% 트리 판 청색 염료로 염색 되 고 표시 된 시간 지점에서 40x에서 밝은 시야 현미경으로 이미지화 되었습니다 (그림 2a). 비 생존 세포는 청색으로 염색 되었고 생존 가능한 세포는 분명 하 게 남아 있었다.
유사 하 게, 90 µm에서 단면화 된 두꺼운 슬라이스의 생존 특성을 결정 하기 위해, 트리 판 블루 염색 없이 밝은 시야 현미경 이미지는 2.5% FBS로 보충 된 배양 물에서 30 일째에 촬영 하였다 (도 2b). 슬라이스 두께로 인해, 트리 판 블루 염료로 얼룩진 90 µm 섹션은 전체를 이미지화 한 다음 슬라이스 중심을 평가 하기 위해 반으로 자릅니다 (그림 2b). 확인을 위해, 살아있는 세포 염료를 이용 하 여 상이한 FBS 배양 조건에서 세포 생존을 평가 하였다 (도 2c). 밝은 필드 이미지에서, 50 µm 및 90 µm 모두에서 단면화 된 조직에서 반투명, 생존 세포의 높은 수준이 관찰 되었다. 흥미롭게도, 섹션은 더 어둡고 전반적인 조직 영역이 문화에서 시간이 지남에 따라 응축 되었지만 섹션의 상당 부분은 30 일 문화 기간 동안 생존 하는 것 처럼 보입니다 (그림 1, 그림 2). 이러한 응축은 0%와 10% FBS 배양 조건에서 가장 분명 하 게 드러납니다. 트리 판 블루 양성 세포는 배양 조건에 관계 없이 모든 단면의 둘레에서 관찰 되었으며, 높은 FBS 배양 조건과 비교 하였을 때 0% FBS 배양 조건에서 트리 판 청색 양성 세포 면적이 증가 하였다 (도 2a , 2b).
살아있는 세포 얼룩을 이용 하 여, 0%에서 배양 된 절편은 가장 낮은 양의 염색을 보였고, 배양 배지에 FBS를 첨가 하 여 살아있는 세포의 양을 향상 시켰다. 0% FBS에서 배양 된 섹션은 눈에 띄는 조직 응축, 높은 트리 판 청색 염색 영역 및 살아있는 세포 염색의 최저 수준을 보여주었습니다. 배양 물에 2.5% FBS의 첨가는 반투명 조직의 양을 개선 하 고, 트리 판 청색 양성 영역을 감소 시키고, 살아있는 세포 염색의 수준을 증가 시켰다. FBS 농도의 추가 증가는 조직의 생존 가능성을 개선 하기 위해 나타나지 않았다; 따라서, 2.5%의 진동 배지는 최적의 FBS 농도를 FBS, 이후의 모든 실험에 대 한 배양 조건으로 활용 하였다.
하 악 전의 생체 내 조직 절편의 생존 율을 결정 하기 위해 후 해 부, 증식 및 사 멸 마커를 배양에서 일 1, 3, 7, 14 및 30에서 평가 하였다. 증식 활성은 배양 슬라이스 (도 3a)의 서브셋에서 Ki67 면역 염색에 의해 평가 되었다. Ki67 양성 세포는 배양 시에 30 일째에 존재 하는 것으로 평가 되 고 지속 되는 시점에서 관찰 되었으며, 시간 포인트 간의 차이를 최소화 하였다. 유사 하 게, 아 폽 토시 스의 정도는 별도의 부분 서브 세트에서 카스파 아 제 면역 염색을 절단 하 여 평가 하였다 (도 3b). 절단 된 카스파 아 제 양성 세포의 저급은 배양에서 일 14 까지의 모든 시점에서 관찰 되었으며, 반면에 30 일 조건은 일부 영역에서 절단 된 카스파 아 제 양성 세포 수의 작은 증가를 갖는 것으로 나타났다. 조직 가장자리의 평가는 트리 판 청색 염색을 탈환 하지 않는 절단 된 카스파 아 제의 높은 수준을 공개 하지 않았다 (그림 2). 전반적으로, 이러한 결과는 30 일 평가 기간 동안 증식 및 생존 능력에 대 한 단서는 진동 문화에 존재 남아 있음을 시사 한다.
굵은 단면 진동 배양은 각 방향으로 하나 이상의 상피 세포 두께를 포함 하는 깊이에서 특정 조직의 세포 구성 성분 사이의 상호작용을 평가할 수 있는 기회를 허용 한다. 또한 타 액이 생성 되는 조성, 조직학 건축, 방사선 민감성 및 기타 중요 한 기능 들이 다르기 때문에 주요 침 샘을 배양 할 수 있는 것이 중요 합니다. 턱 밑 동맥 문화에서 다른 세포 집단을 결정 하기 위해, 턱 밑 부분에는 상피 세포, 평활 근 액 틴 (SMA)를 검출 하기 위해 근 상피 세포 및 액 틴 필 라 멘 트 (phalloidin)를 검출 하기 위해 전자 cadherin (전자 cad)로 염색 되었다 배양 30 일 동안 세포 골격 구조를 검출 한다 (도 4a).
E-cadherin 염색은 세포의 대다수의 막에 관찰 되었고 30 일 배양 기간 동안 검출 되었다. SMA + 세포는 각 시점에서 유사한 수준과 함께 배양 기간에 걸쳐 검출 되었다. 액 틴 필 라 멘 트의 세포 골격 조직 또한 평가 된 각 시점에서 유지 되는 것으로 나타났다. 대조적으로, 전체 평가 기간 동안 일관 되 게 유지 되지 않은 세포 마커 들이 CD31 (맥 관 구조), TUBB3 및 아쿠아 포린-5(Aqp-5, 포상 마커)를 포함 하였다. 공초점 스택을 통한 혈관 구조는 배양 후 1 일째 및 3 일에 명확히 관찰 되었다; 그러나, 이러한 구조는 7 일째에 파편 화 나타났다. 마찬가지로, 뉴런 과정은 배양 첫 날에 온전 하 게 나타났고, 셋째 날에는 감소 하 고, 이후 배양에서 7 일째에 소실 되었다. 의 aqp5 사용법 + 세포를 배양에서 일 1, 3, 7 및 14에서 관찰 하였다; 이기는 하지만, 14 일째에, 전체 염색 수준은 나머지 양성 세포에서 보다 세분화 된 유사성과 함께 감소 된 것으로 나타났다. 이러한 데이타는 하 악 배양 기간이 짧은 배양 기간 동안 혈관 및 뉴런 세포 종류의 유지와 함께 조직 성분의 다양성을 포함 하 고, 더 긴 배양 기간 동안 상피 및 근 상피 세포 유형을 함유 하는 것을 시사 한다.
진동으로 단면화 된 배양은 이전에는 파 타 침 선에 대해 보고 되었지만, 배양은 48 h에 대해 유지 되었으며,이 기간을 제한 하 여 연구 할 수 있었습니다. 더 오래 유지 될 수 있는지를 결정 하기 위해, 뮤 린 파 글 랜드는 1, 3, 7 또는 14 일 동안 단면화 되 고 배양 되었습니다. 더 적은 수의 섹션은 생쥐에서의 더 작은 크기 때문에이 글 랜드 로부터 얻어 졌다; 따라서 30 일 문화 기간이 시도 되지 않았습니다. 슬라이스는 Ki67에 대하여 항 체를 사용 하 여 면역 형광 염색에 의해 증식을 평가 하였다. 하 악 배양 액과 유사 하 게, Ki67 세포가 배양에서 증식 정도를 유지 하 고 있음을 나타내는 모든 시점에서 양성 세포가 관찰 되었다 (도 5a).
또한, 기능성 포상 마커 (α-아 밀라 아 제 및의 aqp5 사용법), 상피 마커 (전자 캐 드) 및 혈관 (CD31) 및 뉴런 (TUBB3) 세포 집단의 유지가 평가 되었다. 아 밀라 아 제는 분화 된 세포에 의해 생성 된 가장 풍부한 단백질 중의 하나 이며, 1 차 파로 니 셀의 2 차원 배양 중에 빈번 하 게 소실 된다. 상기 진동 배양 물에서, 아 밀라 제는 포상 세포에서 관찰 되었으며, 14 일 배양 기간 동안 ductal 세포 로부터 배제 되었다 (도 5b). 하 악 턱 배양 물과 유사 하 게,의 aqp5 사용법 + 세포는 이전 시점에 비해 감소 된 레벨을 나타내는 14 개의 배양 물과 함께 각 시점에서의 파 니 트 배양 물에 존재 하였다 (도 5c). 전자 cadherin 수준은 또한 14 일 배양 기간 동안 대다수의 세포의 막에 유지 되었다 (도 5d). 신경 구조는 7 일 배양 기간 동안 유지 되는 것으로 나타났으며 이후 시점에서 평가 되지 않았다 (도 5e). 대조적으로, 혈관 구조는 배양 첫날에 온전한 상태로 나타났고, 작은 구조물만이 배양 물에서 제 3 일과 7 일에 존재 하였다 (도 5f). 이러한 데이터는 파로 니 컬 문화가 증식 능력과 대부분의 기능 능력을 배양에서 7-14 일 동안 유지 하 고 잠재적으로 더 긴 시간 프레임 동안 보다 온전한 조직 구조를 나타낼 수 있음을 시사 한다.
진동 성 배양 모델의 기능적 유용성은 단일 투여 량 (그림6, 그림 7, 그림 8)으로 파 마 나 턱 밑 배양을 처리 하 여 해결 되었습니다. 조사 된 마우스 모델에서의 이전 작업은 파 멸의 동맥에 초점을 맞추고 24 시간 피크 인 아 폽 토시 스의 유도, 5 일째에 시작 되는 보상 증식의 유도, 5 일째에 시작 되는 액 틴 필 라 멘 트의 파괴 및 손실을 보여 주었습니다. 분화 마커 (예를 들어 아 밀라 아 제)는 제 14 일23일,26일까 지. 이에 대 한 방사선 조사는 1 일째에 세포 사 멸에 증가 하 고, 7 일째에는 액 틴 필 라 멘 트의 붕괴를 증가 시키고, 7 일째에 아 밀라 제를감소 시켰다. 턱 밑의 진동 배양의 조사는 1 일과 3 일에 세포 사 멸의 증가를 초래 하였으며, 7 일째에는 증식이 증가 하 고 7 일째에 액 틴 필 라 멘 트가 붕괴 되었다 (도7). E-cadherin 수준은 생체 내 관찰 (26)과 유사 했던 두 파와 턱 밑 배양 모두에서 상대적으로 그대로 나타났다. 기능적 포상 셀 마커 Aqp-5에서 턱 밑 글 랜드 섹션 및 아 밀라 제는 해당 처리 되지 않은 시간 포인트와 비교 하 여 14 일째에 감소했다. 이러한 데이터는 방사선-유도 된 조직 변화를 생체 내에서 관찰 하 여 조사 된 진동 배양 물 에서도 관찰 하였다는 것을 시사 한다.
그림 1: 50 µm의 밝은 영역 현미경 이미지 턱 밑 섹션. 여성 FVB 마우스 (4-8 주)에서 하 악 땀 샘을 해 부 하 고, 50 μ m 두께로 절 개 하 고, 1, 4, 7, 14 및 30 일에 대 한 유기 typic 세포 배양 삽입물을 0%로 하 고, 2.5%, 5.0% 및 10% 태아 소 혈 청 (FBS) 문화 특성을 결정 하 고 배양 조건을 최적화 합니다. 스케일 바 = 200 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 생존 염색 턱 밑 섹션. (A) 4 ~ 8 주 된 여성 fbv 마우스에서 50 µm 턱 하 부의 밝은 분야 현미경 이미지와 트리 판 블루로 염색 (0.4%) 1, 3, 7, 14 및 30 일에서 2.5%의 소 태아 혈 청 (FBS)을 함유 하는 배지로 배양 한다. (B) 90 µm 턱 밑 부분 (왼쪽 패널)의 밝은 분야 현미경 이미지는 반으로 자르고 트리 판 파란색 (오른쪽 패널)으로 염색 한 다음 2.5% FBS를 포함 하는 매체에서 30 일 후 해 부로 배양 하였다. (C) 다양 한 FBS 농도에서 배양 한 50 µm 턱 밑 부분의 형광 이미지 (0%, 2.5%, 5%, 10%) 문화 7 일째에 살아있는 세포 (녹색)를 나타내기 위해 칼 세 인으로 얼룩진. 스케일 바 = 200 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 에서 증식 및 사 멸 마커의 평가 턱 밑 유기 유형 조직 슬라이스. 여성 FVB 마우스 (4-8 주)의 하 악 땀 샘은 50 µm 두께로 슬라이스 하 여 해 부 하 고, 1, 3, 7, 14 및 30 일 후 해 부에 대 한 유기 typic 세포 배양 삽입물에 2.5% FBS으로 보충 된 배지에서 배양 하였다. 표시 된 시점에서 슬라이스는 고정 되 고 증식 (Ki67) 및 사 멸 (절단 된 카스파 아 제) 마커로 염색 되었습니다. (A) Ki67 양성 세포 (녹색)와 핵 (청색)의 면역 형광 염색. (B) 절단 된 카스파 아 제 세포 (적색)와 슬라이스 두 관점에서 핵 (청색)의 면역 형광 염색. 상단 행 패널에는 슬라이스 가장자리의 절단 된 카스파 아 제-3 양성 셀이 표시 되 고, 아래쪽 행 패널에는 슬라이스 중간에서 절단 된 카스파 아 제-3 양성 셀이 표시 됩니다. 대표적인 공초점 이미지는 시간 포인트 당 여러 개의 z-스택에서 선택 되었다. 축척 막대 = 30 µm 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 세포 구조의 존재 에서의 턱 밑 유기 유형 조직 슬라이스 . 여성 FVB 마우스 (4-8 주)의 하 악 땀 샘은 50 μ m 두께로 슬라이스 하 여 해 부 하였으며, 1, 3, 7, 14 또는 30 일 후에 유기 형 세포 배양 삽입물에 2.5% FBS으로 보충 된 배지에서 배양 하였다. 표시 된 시간 지점에서, 조각은 고정 하 고 핵 (파란색)와 해당 마커를 위해 얼룩이 졌다. (A) 하 악 섹션은 액 틴 및 액 틴 (phalloidin)의 레벨에 대 한 일 1, 7, 14 및 30 사후 해 부에서 평가 되었다. (B) 하 악 섹션은 CD31 (혈관 구조) 및 TUBB3 (뉴런)의 수준에 대해 일 1, 3 및 7에서 평가 되었다. 아쿠아 포린-5 (의 aqp5 사용법)는 일 1, 3, 7 및 14에서 평가 하였다. 대표적인 공초점 이미지는 시간 포인트 당 여러 개의 z-스택에서 선택 되었다. 스케일 바 = 30 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 동위 유기 형 조직 절편에서 증식 성 및 기능적 마커의 평가. 여성 FVB 마우스 (4-8 주) 로부터의 파 글 랜드는 50 µm 두께로 슬라이스 하 여 해 부 하였으며, 1, 3, 7 또는 14 일 후에 유기 형 세포 배양 삽입물에 2.5% FBS으로 보충 된 배지에서 배양 하였다. 표시 된 시간 지점에서, 조각은 고정 하 고 핵 (파란색)와 해당 마커를 위해 얼룩이 졌다. (A) Ki67 양성 세포 (녹색)의 면역 형광 염색. (B) 아 밀라 아 제의 면역 형광 염색-양성 세포 (적색). (C) 의 aqp5 사용법 양성 세포 (녹색)의 면역 형광 염색. (D) E-cadherin (적색) 양성 세포의 면역 형광 염색 (E) TUBB3에 의해 지시 된 뉴런의 면역 형광 염색 (magneta) 양성 세포. (F) CD31 (적색) 양성 세포에 의해 지시 되는 혈관 구조의 면역 형광 염색. 대표적인 공초점 이미지는 시간 포인트 당 여러 개의 z-스택에서 선택 되었다. 스케일 바 = 30 μ m; d = ductal 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
도 6: 세포 변화를 조사 하 고이를 통한 유기 타이계 조직 슬라이스. 여성 FVB 마우스 (4-8 주)에서의 파 글 랜드는 50 μ m 두께로 슬라이스 하 고, 유기 typic 세포 배양 삽입물에 2.5% FBS로 보충 하 여 배양 하였다. 1 일째 후 해 부에 조각의 서브셋이 5 Gy 방사선에 노출 되 고 2, 4 또는 8 일 후에 유지 됨 (일 1, 3, 7 포스트 방사선에 해당). 비 처리 및 조사 된 Ki67의 레벨을 결정 하기 위해 ( B ) 양성 세포의 면역 형광 염색을 하 는 단계 (카스파 아 제)-양성 세포, ( C ) phalloidin (청록색) 포지티브 셀 ( D) 아 밀라 아 제 (적색)-양성 세포 및 e-카 데 인 (적색) 양성 세포. 모든 핵 염색은 DAPI (청색)를 이용 하였다. 대표적인 공초점 이미지는 시간 포인트 당 여러 개의 z-스택에서 선택 되었다. 스케일 바 = 30 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
도 7: 하 악 유기 typic 조직 슬라이스를 조사 한 후의 세포 변화. 여성 FVB 마우스 (4-8 주)에서 하 악 땀 샘은 50 μ m 두께로 슬라이스 하 고, 유기 typic 세포 배양 삽입물에 2.5% FBS으로 보충 된 배지에서 배양 하였다. 제 1 일 사후 해 부에 있어서, 슬라이스 들의 서브셋은 5Gy로 조사 되 고 2, 4 또는 8 일 후에 유지 됨 (제 1, 3 및 7 사후 방사선에 해당). 비 처리 및 조사 된 턱 밑 부분의 면역 형광 염색은 (A) Ki67 (녹색) 양성 세포의 수준을 결정 하기 위해 ( B ) 양성 세포, ( C ) phalloidin (청록색) 양성 세포 ( D) 아쿠아 포린 5 (의 aqp5 사용법)-양성 세포 및 e-카 데 인 (적색) 양성 세포. 모든 핵 염색은 DAPI (청색)를 이용 하였다. 대표적인 공초점 이미지는 시간 포인트 당 여러 개의 z-스택에서 선택 되었다. 스케일 바 = 30 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
도 8: 조사 된 포상 및 턱 하 악 유기 형 조직 절편의 기능적 마커. 암컷 FVB 마우스 (4-8 주)의 턱 밑과 파 나 스 땀 샘은 50 μ m 두께로 슬라이스 하 고, 유기 형 세포 배양 삽입물에 2.5% FBS으로 보충 된 배지에서 배양 하였다. 제 1 일 사후 해 부에 있어서, 조각의 서브셋은 5Gy로 조사 되 고 후에 14 일 동안 유지 되었다. 치료 되지 않은 (UT) 및 방사선 조사 된 (IR) 절편의 면역 형광 염색 은 ( 의 aqp5 사용법) 양성 세포 및 ( 적색) 양성 세포의 아 밀라 아 제 (A)의 수준을 결정 하는데 사용 되었다. 모든 핵 염색은 DAPI (청색)를 이용 하였다. 대표적인 공초점 이미지는 시간 포인트 당 여러 개의 z-스택에서 선택 되었다. 스케일 바 = 30 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
타 액 선 연구는 불멸 화 된 2-d 배양 물, 일차 2-d 배양 물, 3 차원 살 균 구 배양 물, 기저 생물학 및 생리학에 대 한 질문을 확인 하기 위해 배아에서의 3 차원 장기 배양을 포함 한 다양 한 문화권 모델을 활용 하 고 있습니다. 이러한 문화 모델 연구 질문의 다양 한 배열에 걸쳐 통찰력 있는 정보를 굴복 하 고 침 연구에서 중요 한 도구를 계속 됩니다. 이러한 배양 모델의 한계는 불멸 화 동안의 p53 활성의 변조, 일차 배양의 일시적인 생존 능력, 분화 및 분 비 단백질의 손실 및 세포 세포, 세포-ECM 및 극성을 평가 하는 무 능력을 포함 한다 성인 조직에서의 상호 작용. 첫 번째 3 차원 유기 형 슬라이스 배양 (진동으로 단면화 된 배양 물) 침 샘에 대 한 방법은 200818에 출판 되었다; 그러나이 기술은 다른 분야에서 빈번 하 게 사용 함에도 불구 하 고이 필드에서 크게 미달 되었습니다. 48 h에 대 한 작업 배양 된이 섹션은 방사선 치료 후 만성 효과에 대 한 이러한 부분을 연구 하거나 특정 유전자의 조작에 따라 표현 형에 대 한 형질 전환 또는 형질 전환 프로토콜을 활용 하는 능력을 제한 한다. 여기에서 설명 하는 방법은 문화에서 더 긴 시간을 허용 하 고, 공초점 현미경을 통해 고해상도 이미지를 산출 하며, 3 차원 섹션에서 인트라 및 인터 셀 역학을 연구 하 고, 방사선 유발 변화를 평가 하는 방법을 제공 합니다. 적어도 14 일의 배양 기간.
각 단계는 기술의 구현을 위해 필요 하지만, 몇 가지 단계는 성공적인 절편 및 문화 유지 보수에 중요 하다. 여기에는 침 샘 슬라이스를 절단 하 고, 배양 슬라이스를 유지 하며, 공초점 현미경으로 슬라이스를 염색 하 고 이미징 하는 것이 포함 됩니다. 제시 된 프로토콜은 분석을 위한 최적의 슬라이스를 얻기 위해 인내심과 연습이 필요한 몇 가지 과제를 제기 합니다. 다음 제안은이 프로토콜을 성공적으로 수행 하는 데 도움이 됩니다. 그것은 완전히 주변 결합 조직에서 침 샘을 분리 하는 것이 필수적입니다. 잔류 결합 조직은 아가 로스 블록에서 글 랜드를 밖으로 끌기 위해 진동 블레이드를 유발 하 고, 조직이 아가 로스에 재 포함 될 것을 요구 한다. 다중 재 포함은 오염의 가능성을 증가 시키고 조각의 생존 율을 감소 시킬 수 있기 때문에 이것은 주요한 한계가 될 수 있습니다. 이는 파로 니 아 땀 샘이 구조에서 더 소 엽 이며 따라서 관계 없는 조직을 가질 가능성이 더 있기 때문에이를 배양 하는 데 특히 중요 합니다.
완충 트레이, 슬라이스 수집 접시 및 진동 매체를 포함 한 모든 액체에 1% 페니실린-streptomycin-암포 테리 신 B (PSA)를 첨가 하면 슬라이스 후 해 부의 오염을 최소화 합니다. 아가 로스 농도의 변화는 성공적인 절단을 최적화 하기 위해 사용 되었다. 침 샘의 밀도로 인해 1.9% 아가 로스가 너무 부 드러 웠 고 땀 샘이 블록에서 쉽게 빠질 수 있었습니다. 다른 분야에서의 진동 절편은 5.0% 아가 로스를 사용 했습니다. 그러나이로 인해 톱니 모양 컷과 슬라이스는 최적이 아닙니다. 몇몇 아가 로스 백분율 조건을 시험 한 후에, 3% 아가 로스는 조직의 무게 그리고 단단 함을 지원 하기 위하여 가장 최적 이었습니다. 특히, 워너 외. 및 Su 외에 이용 된 아가 로스 농도는 또한 3%19,20이었다.
추가적으로, 블레이드의 각도, 진동 주파수 및 전진 속도는 단면화 될 조직에 기초 하 여 변형 될 수 있다. 턱 밑과 파 타 액 선의 경우 15 ° 각도, 0.075의 속도 및 100 Hz의 주파수는 절편에 적합 합니다. 침 샘의 부드러움으로 인해, 최적의 절단 조건은 높은 진동에서 조직을 통해 천천히 진행 하기 위해 블레이드가 필요 합니다. 면역 형광 염색의 경우 최적의 얼룩을 위해 투과도, 인큐베이터의 지속 시간 및 세척 단계가 필수적입니다. 양성 얼룩이 조직 조각의 바깥 층에만 나타나는 경우, 프로 테이 나 제 K와의 더 엄격한 투과도가 필요할 수 있으며, 고르지 못한 얼룩이 나 높은 배경 염색은 0.2% 트리톤 X-100으로 덜 엄격한 얼룩이 필요할 수 있습니다. 인큐베이션 시간은 높은 신호와 낮은 배경에 대해 최적화 되었으며,이는 특정 일차 항 체에 맞게 조정 될 필요가 있습니다. 더 긴 세척 단계는 높은 배경 감소에 필수적이 고 이것은 사용 되는 특정 항 체에 맞추어질 수 있습니다.
이 방법론의 한 가지 주요 적용은 침 샘의 방사선 노출에 따라 확장 된 운동 분석입니다. 종래 작업은 조사 된 타 액 선6,24,25,26등의 급성 및 만성 상 변화를 모두 확립 하 고, 진동 배양 시스템은 임계를 분해 하는 강력한 도구가 될 수 있다 처리 후 특정 시점에서의 분자 이벤트. 예를 들어, 아 밀라 아 제 감소, 포상 세포의 세포 사 멸, 포상 세포의 보상 증식, 극성 손실 및 중단 등 문헌에서 보고 된 타 액 선에 방사선 유발 세포 변화 세포 골격 구조. 특히, 진동 체 배양 체는 ex 생체 내에서 이러한 마커에 유사한 변화를 나타낸다.
또한, 침 샘의 급성 기 반응은 p53 활성을 중심으로 선회 합니다. 그러나 1 차 문화의 5 일 생존 율 때문에 p53이 추후 시점에서 어떤 역할을 하는지는 불분명 합니다. 이 시스템은 이후 시점에서 p53 활동의 전 생체, 제어 된 파괴를 허용 하 고 만성 손상이 나 회생 반응에서의 역할을 발견 할 것 이다. 더욱이, 보상 증식 반응은 방사선 치료 후 5 일 후에 개시 되 고, 일시적인 일차 배양 물에서이 반응의 분자 조절기를 묘사 하기 어렵다. 이 방법론의 가장 널리 사용 되는 응용 프로그램은 세포 세포, 세포 ECM 및 성인 조직의 극성 상호 작용을 포함 합니다. 영향을 받은 연구는 배아 땀 샘에서 3 차원 기관 배양을 진행 하 여 침 샘과 신경 또는 혈관 네트워크 개발 사이의 복잡 한 상호작용을 밝히기 위해27,28,29, 30,31.
여기에 설명 된 방법은 추가의 최적화가 하위 하 악 배양과 가능 하 게 파 타 문화권에서 뉴런 또는 혈관 작업에 필요 하다는 것을 나타냅니다. 방사선 손상은 또한 융 형 조절기에 지장을 주며, 콜라겐 침착을 유도 하 고 액 틴 조직을 변화 시키고 분 비과 립26,30,32을 조절 합니다. 타 액 선 재생 연구는 이러한 상호 작용을 평가 하는 성인 모델의 부재에 의해 장애인. 이러한 유기 형 배양 법은 고급 분자 기술을 적용 하 고, 3 차원 문맥에서 이러한 매개체의 조절을 더욱 연구 하 고 새로운 치료법을 효율적으로 발견 하는 시스템을 제공할 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 애리조나 대학 연구 및 발견의 대학과 건강의 국립 연구소에서 제공 하는 파일럿 기금에 의해 부분적으로 지원 되었다 (R01 DE023534) 키 어스 틴. 암 생물학 연수 교부 금, T32CA009213, 원 유 웡에 대 한 급여를 제공 했다. 저자는 그의 귀중 한 기술 공헌에 대 한 m. 쌀에 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystems | N/A | Vibratome for sectioning |
| Double Edge Stainless Steel Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | Low-melt |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P6543 | |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B | Lonza | 17-745H | PSA |
| 24-well plate | CellTreat | 229124 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | |
| Loctite UltraGel Control Superglue | Loctite | N/A | Purchased at hardware store |
| Natural Red Sable Round Paintbrush | Princeton Art & Brush Co | 7400R-2 | |
| Gentamicin Sulfate | Fisher Scientific | ICN1676045 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T-8158-100mg | |
| L-glutatmine | Gibco | 25030-081 | |
| Trace Elements | MP Biomedicals | ICN1676549 | |
| Insulin | Fisher Scientific | 12585014 | |
| Epidermal Growth Factor | Corning | 354001 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| Retinoic acid | Fisher Scientific | R2625-50MG | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3160602 | |
| DMEM/F12 Media | Corning | 150-90-CV | |
| Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma | PICM01250 | 12 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate |
| 0.4% Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo-Fisher | R37601 | Only used LIVE dye component |
| Anti-Ki-67 Antibody | Cell Signaling Technology | 9129S | |
| Anti-E-cadherin Antibody | Cell Signaling Technology | 3195S | |
| Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody | Cell Signaling Technology | 9661L | |
| Anti-SMA Antibody | Sigma-Aldrich | C6198 | |
| Anti-amylase Antibody | Sigma-Aldrich | A8273 | |
| Anti-CD31 Antibody | Abcam | ab28364 | |
| Anti-TUBB3 Antibody | Cell Signaling Technology | 5568S | |
| Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Thermo-Fisher | A20185 | |
| Alexa Fluor 594 Phalloidin | Thermo-Fisher | A12381 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 21568-2500 | |
| Paraformaldehyde Prills | Fisher Scientific | 5027632 | |
| New England Nuclear Blocking Agent | Perkin Elmer | 2346249 | No longer sold |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083S | |
| Prolong Gold Antifade Mounting Media | Invitrogen | P36934 | |
| Leica SPSII Spectral Confocal | Leica Biosystems | N/A | For confocal imaging |
| Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope | Leica Biosystems | N/A | |
| Cobalt-60 Teletherapy Instrument | Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80 | N/A | |
| Amac Box, Clear | The Container Store | 60140 | Agarose block mold |
References
- Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: a literature review. Cancer. 107 (11), 2525-2534 (2006).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Hancock, P. J., Epstein, J. B., Sadler, G. R. Oral and dental management related to radiation therapy for head and neck cancer. Journal of the Canadian Dental Association. 69 (9), 585-590 (2003).
- Nguyen, N. P., et al. Quality of life following chemoradiation and postoperative radiation for locally advanced head and neck cancer. Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 69 (5), 271-276 (2007).
- Gorenc, M., Kozjek, N. R., Strojan, P. Malnutrition and cachexia in patients with head and neck cancer treated with (chemo)radiotherapy. Reports of Practical Oncology and Radiotherapy. Journal of Greatpoland Cancer Center in Poznań and Polish Society of Radiation Oncology. 20 (4), 249-258 (2015).
- Grundmann, O., Mitchell, G. C., Limesand, K. H. Sensitivity of salivary glands to radiation: from animal models to therapies. Journal of Dental Research. 88 (10), 894-903 (2009).
- Konings, A. W., Coppes, R. P., Vissink, A. On the mechanism of salivary gland radiosensitivity. International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 62 (4), 1187-1194 (2005).
- Chan, Y. -H., Huang, T. -W., Young, T. -H., Lou, P. -J. Human salivary gland acinar cells spontaneously form three-dimensional structures and change the protein expression patterns. Journal of Cellular Physiology. 226 (11), 3076-3085 (2011).
- Nguyen, V. T., Dawson, P., Zhang, Q., Harris, Z., Limesand, K. H. Administration of growth factors promotes salisphere formation from irradiated parotid salivary glands. PLoS ONE. 13 (3), e0193942 (2018).
- Limesand, K. H., et al. Characterization of Rat Parotid and Submandibular Acinar Cell Apoptosis In Primary Culture. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 39 (3), 170 (2003).
- Wei, L., Xiong, H., Li, W., Li, B., Cheng, Y. Upregulation of IL-6 expression in human salivary gland cell line by IL-17 via activation of p38 MAPK, ERK, PI3K/Akt, and NF-κB pathways. Journal of Oral Pathology & Medicine. 47 (9), 847-855 (2018).
- Chuong, C., Katz, J., Pauley, K. M., Bulosan, M., Cha, S. RAGE expression and NF-κB activation attenuated by extracellular domain of RAGE in human salivary gland cell line. Journal of Cellular Physiology. 221 (2), 430-434 (2009).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Bhadriraju, K., Chen, C. S. Engineering cellular microenvironments to improve cell-based drug testing. Drug Discovery Today. 7 (11), 612-620 (2002).
- Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
- Avila, J. L., Grundmann, O., Burd, R., Limesand, K. H. Radiation-induced salivary gland dysfunction results from p53-dependent apoptosis. International Journal of Radiation Oncology, Biololgy, Physics. 73 (2), 523-529 (2009).
- Mitchell, G. C., et al. IGF1 activates cell cycle arrest following irradiation by reducing binding. of DeltaNp63 to the p21 promoter. Cell Death & Disease. 1, (2010).
- Lombaert, I. M. A., et al. Rescue of Salivary Gland Function after Stem Cell Transplantation in Irradiated Glands. PLoS ONE. 3 (4), (2008).
- Warner, J. D., et al. Visualizing form and function in organotypic slices of the adult mouse parotid gland. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 295 (3), G629-G640 (2008).
- Su, X., et al. Three-dimensional organotypic culture of human salivary glands: the slice culture model. Oral Diseases. 22 (7), 639-648 (2016).
- Mattei, G., Cristiani, I., Magliaro, C., Ahluwalia, A. Profile analysis of hepatic porcine and murine brain tissue slices obtained with a vibratome. PeerJ - The Journal of Life and Environmental Sciences. 3, 932 (2015).
- Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. , 3rd ed, Springer U.S. Boston, MA. (2006).
- Limesand, K. H., et al. Insulin-Like Growth Factor-1 Preserves Salivary Gland Function After Fractionated Radiation. International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 78 (2), 579-586 (2010).
- Grundmann, O., Fillinger, J. L., Victory, K. R., Burd, R., Limesand, K. H. Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration. BMC Cancer. 10, 417 (2010).
- Chibly, A. M., et al. aPKCzeta-dependent Repression of Yap is Necessary for Functional Restoration of Irradiated Salivary Glands with IGF-1. Scientific Reports. 8 (1), 6347 (2018).
- Wong, W. Y., Pier, M., Limesand, K. H. Persistent disruption of lateral junctional complexes and actin cytoskeleton in parotid salivary glands following radiation treatment. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 315 (4), R656-R667 (2018).
- Emmerson, E., et al. SOX2 regulates acinar cell development in the salivary gland. eLife. 6, (2017).
- Nedvetsky, P. I., et al. Parasympathetic innervation regulates tubulogenesis in the developing salivary gland. Developmental Cell. 30 (4), 449-462 (2014).
- Kwon, H. R., Nelson, D. A., DeSantis, K. A., Morrissey, J. M., Larsen, M. Endothelial cell regulation of salivary gland epithelial patterning. Development. 144 (2), 211-220 (2017).
- Mellas, R. E., Leigh, N. J., Nelson, J. W., McCall, A. D., Baker, O. J. Zonula occludens-1, occludin and E-cadherin expression and organization in salivary glands with Sjogren's syndrome. Jounral of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (1), 45-56 (2015).
- Daley, W. P., et al. Btbd7 is essential for region-specific epithelial cell dynamics and branching morphogenesis in vivo. Development. 144 (12), 2200-2211 (2017).
- Nam, K., et al. Post-Irradiated Human Submandibular Glands Display High Collagen Deposition, Disorganized Cell Junctions, and an Increased Number of Adipocytes. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (6), 343-352 (2016).
