Summary
L’utilisation de cultures organotypiques tridimensionnelles pour visualiser la morphologie et les marqueurs fonctionnels des glandes salivaires peut donner de nouvelles perspectives sur les mécanismes des lésions des tissus après rayonnement. Décrit ici est un protocole à la section, culture, irradier, tache, et l’image des sections de glande salivaire d’épaisseur 50 – 90 μM avant et après l’exposition aux rayonnements ionisants.
Abstract
L’hyposalivation et la xérostomie créent des complications orales chroniques qui diminuent la qualité de vie chez les patients atteints de cancer de la tête et du cou qui sont traités par radiothérapie. Les approches expérimentales de la compréhension des mécanismes du dysfonctionnement et de la restauration des glandes salivaires se sont concentrées sur des modèles in vivo, qui sont handicapés par l’incapacité de dépistage systématique des candidats thérapeutiques et d’efficacité dans la transfection capacité à manipuler des gènes spécifiques. Le but de ce protocole de culture organotypique de la glande salivaire est d’évaluer le temps maximal de viabilité de la culture et de caractériser les changements cellulaires après un traitement par rayonnement ex vivo. Nous avons utilisé la coloration immunofluorescente et la microscopie confocale pour déterminer quand des populations de cellules et des marqueurs spécifiques sont présents au cours d’une période de culture de 30 jours. En outre, les marqueurs cellulaires précédemment rapportés dans les modèles de rayonnement in vivo sont évalués dans les cultures qui sont irradiées ex vivo. Pour aller de l’avant, cette méthode est une plate-forme attrayante pour l’évaluation ex vivo rapide des réponses tissulaires de la glande salivaire et humaine aux agents thérapeutiques qui améliorent la fonction salivaire.
Introduction
La fonction de glande salivaire appropriée est essentielle à la santé bucco-dentaire et est altérée après le traitement du cancer de la tête et du cou avec la radiothérapie1. En 2017, près de 50 000 nouveaux cas de cancer de la tête et du cou ont été signalés aux États-Unis2. En raison des effets nocifs tissulaires et souvent irréversibles de la radiothérapie sur les tissus normaux environnants tels que les glandes salivaires, les patients sont souvent laissés avec des effets secondaires sévères et une qualité de vie diminuée2,3, 4. les autres. Les complications courantes causées par les radiations se manifestent par des symptômes tels que la xérostomie (le sentiment subjectif de la bouche sèche), les caries dentaires, la capacité altérée de mâcher et d’avaler, les troubles de la parole et les microbiomes oraux infectés2, 3 les trois , 4. ces symptômes collectivement peuvent conduire à la malnutrition et à la survie altérée chez les personnes touchées5. Alors que le dysfonctionnement de la glande salivaire dans cette population a été bien documenté, les mécanismes sous-jacents de dommages aux cellules acineuses ont été contestés, et il y a peu d’intégration parmi les différents modèles animaux6,7.
Les méthodes actuelles d’étude de la fonction des glandes salivaires et des dommages induits par les radiations comprennent l’utilisation de modèles in vivo, de lignées cellulaires immortalisées, de cultures de cellules primaires bidimensionnelles (2d) et de cultures tridimensionnelles (3-D) de salisphères8, 9,10,11,12. Traditionnellement, les modèles de culture cellulaire des lignées cellulaires immortalisées et des cultures 2D impliquent des cellules monocouches cultivées sur des surfaces planes et sont précieuses pour une expérimentation rapide, facile et rentable. Cependant, les conditions de culture de cellules artificielles peuvent altérer l’état de différenciation et les réponses physiologiques des cellules exposées à diverses conditions, et les résultats ne parviennent souvent pas à se traduire en modèles d’organismes entiers14,15. En outre, les cultures cellulaires immortalisées nécessitent une modulation de l’activité de la culture, ce qui est essentiel pour la réponse de la glande salivaire aux dégâts de l’ADN16,17.
les cultures de salisphères 3-D sont enrichies pour les cellules souches et progénitrices aux premiers moments de la culture et ont été utiles pour comprendre la radiosensibilité de ce sous-ensemble de cellules de glandes salivaires9,18. Une limitation critique de tous ces modèles de culture est qu’ils sont inefficaces dans la visualisation de la structure 3D de la glande salivaire, y compris la matrice extracellulaire (ECM) et les interactions cellule-cellule sur diverses couches, qui sont cruciales dans la modulation salivaire la sécrétion15. La nécessité d’une méthode qui englobe le comportement du tissu dans son ensemble, mais peut également être manipulé dans des conditions de laboratoire pour étudier les effets du traitement est nécessaire pour découvrir plus loin les mécanismes sous-jacents de la glande salivaire induite par rayonnement dysfonction.
La culture et la sectionnement des tissus vivants ont été documentées antérieurement19,20 et sont souvent utilisées pour étudier les interactions cerveau-tissu21. Dans des études antérieures, le tissu de la glande salivaire parotide (PAR) des souris a été sectionné à environ 50 μM et cultivé jusqu’à 48 h, et l’analyse de la viabilité, de la mort cellulaire et de la fonction a été effectuée par la suite19. Su et coll. (2016) a élargi cette méthodologie en cultivant les glandes sous-mandibulaires humaines (SMGs) sectionnées à 35 μm ou 50 μM pendant 14 jours20. La méthode proposée est une avancée en ce qu’elle comprend à la fois les glandes salivaires parotidiques et sous-mandibulaires sectionnées à 50 μM et 90 μm et l’évaluation des cultures pendant 30 jours. La capacité de couper une gamme d’épaisseur tissulaire est importante dans l’évaluation des interactions cellule-cellule et cellules-ECM qui sont pertinentes pour les processus cellulaires, y compris la polarité apical-basolatérale et l’innervation pour la sécrétion. En outre, les tranches de glandes salivaires ont été irradiées alors qu’elles étaient en culture pour déterminer la faisabilité de ce modèle de culture pour étudier les dommages causés par la glande salivaire induite par le rayonnement.
Le but de ce protocole de culture organotypique de la glande salivaire est d’évaluer le temps maximal de viabilité de la culture et de caractériser les changements cellulaires après un traitement par rayonnement ex vivo. Pour déterminer les sections de temps maximales qui sont viables post-dissection, coloration bleu trypan, coloration des cellules vivantes, et la coloration immunohistochimique pour la mort cellulaire ont été effectuées. La microscopie confocale et la coloration immunofluorescente ont été utilisées pour évaluer les populations cellulaires spécifiques, les structures morphologiques et les niveaux de prolifération. Les cultures des sections tissulaires ont également été exposées à des rayonnements ionisants pour déterminer les effets du rayonnement sur divers marqueurs dans ce modèle 3D. L’induction de la mort cellulaire, la perturbation du cytosquelette, la perte de marqueurs de différenciation et la prolifération compensatoire dans les cultures ex vivo irradiées ont été comparées à des études antérieures de modèles in vivo. Cette méthodologie fournit un moyen d’étudier le rôle des interactions cellulaires-cellules suite aux dommages causés par les radiations et fournit un modèle expérimental pour évaluer efficacement l’efficacité des interventions thérapeutiques (manipulations géniques ou agents pharmacologiques ) qui peuvent être moins adaptés aux modèles in vivo.
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Protocol
1. préparation du vibratome
- Vaporisez des composants détachables du vibratome, y compris le plateau tampon, l’attachement de la lame, le moule de bloc d’d’agarose, et le film de laboratoire avec 70% d’éthanol, puis stériliser UV pendant au moins 30 min.
- Placez et fixez une feuille supplémentaire de film de laboratoire sur le plateau de tampon pour empêcher la glace de tomber dedans.
- Remplissez la chambre de glace avec de la glace pilée, enlevez le film de laboratoire du plateau de tampon, et remplissez le plateau de tampon avec 100 mL de solution saline de sérum de phosphate de glace-froid 1x (PBS) complétée avec 1% de pénicilline-streptomycine-ampicilline (PSA).
- Placez une lame de rasoir en acier inoxydable dans le porte-lame. Utilisez le tournevis pour serrer/desserrer et changer l’angle de la lame.
2. préparation de l’échantillon de tissu dans le bloc d’d’agarose et sectionnement en utilisant le vibratome
- Autoclaver tous les outils de dissection et de sectionnement nécessaires, y compris forceps, ciseaux, et pinceaux.
- Préparer 3% d’d’agarose de point de fusion faible dans le PBS 1x stérile et le micro-ondes jusqu’à ce que l’d’agarose se dissout en solution. S’assurer que la solution ne se fait pas bouillir et agiter périodiquement la bouteille pour la mélanger.
Remarque: empêchez l’d’agarose à faible fusion de se solidifier en le gardant dans un bain d’eau tiède. L’d’agarose à faible fonte est fluide à 37 ° c et se fixe à 25 ° c. Cependant, le bain d’eau doit être inférieur à 40 ° c afin de verser l’d’agarose autour du tissu à température physiologique. - Isoler les glandes salivaires et placer le tissu disséqué dans 2 mL de glace froide 1x PBS complétée par 1% de PSA dans un plat de culture stérile de 30 mm.
- En utilisant des pinces autoclavées, retirer les glandes salivaires de 1x PBS + 1% solution PSA et la position au fond d’un moule d’incorporation. Remplissez le moule avec du liquide 3% de point de fusion faible d’agarose pour couvrir le tissu.
- À l’aide de la pince, ajustez le tissu au milieu du bloc et positionnez la glande salivaire dans le plan approprié. Les meilleures coupes transversales pour les glandes sous-mandibulaires et parotides se trouvent dans le plan vertical.
- Placer le bloc d’d’agarose sur la glace pendant 10 min pour durcir.
- Faites soigneusement tourner une lame de rasoir autour du bord extérieur de l’d’agarose pour desserrer et laisser le bloc glisser sur le film de laboratoire stérilisé UV de l’étape 1,1.
- Utilisez une lame de rasoir pour découper une boîte d’d’agarose contenant la glande salivaire. Assurez-vous que le plan de la section est droit et parallèle au côté opposé du bloc (la surface qui sera collée vers le bas). Puisque l’d’agarose n’infiltrent pas le tissu, ne coupez pas trop d’d’agarose autour du tissu ainsi le tissu sera bien soutenu.
- Utilisez de la colle superglue pour attacher le bloc à la surface de coupe.
- Section à 50 μM ou 90 μM d’épaisseur par vibratome à une vitesse de 0,075 mm/s et une fréquence de 100 Hz.
Remarque: le réglage du vibratome à la fréquence la plus élevée et la vitesse de la lame la plus basse fournit les tranches les plus optimales. - Recueillir des sections dans un plat de culture de tissus de 24 puits contenant ~ 1 mL de PBS glacé par puits à l’aide d’un pinceau à poils naturels autoclavés, en plaçant la brosse dans 70% d’éthanol entre les collections de tranches pour maintenir la stérilité.
3. les sections culturing
- Autoclave une micro-spatule et forceps.
- Faire des milieux de culture de vibratome de stock avec ou sans sérum bovin fœtal (FBS): DMEM/F12 milieux additionnés de 1% PSA, 5 μg/mL de transferrine, 1,1 μM d’hydrocortisone, 0,1 μM d’acide rétinoïque, 5 μg/mL d’insuline, 80 ng/mL de facteur de croissance épidermique, 5 mM de 50 L sulfate de gentamicine et 10 μL/mL de mélange d’oligo-éléments. Ajoutez une quantité appropriée de FBS pour faire 0%, 2,5%, 5,0%, ou 10% solutions.
- Avant la coupe, ajouter 300 μL de milieu préchauffé et placer un insert de 12 mm de diamètre, 0,4 μm de dimension interstitielle dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits. Les médias doivent atteindre le fond de la membrane pour créer une interface air-liquide pour la culture.
- Poser délicatement les sections salivaires au-dessus de l’insert membranaire à l’aide de la micro-spatule et de la culture à 37 ° c dans un incubateur humidifié à 5% CO2 et 95% air atmosphère.
- Ajouter environ 300 μL de milieu de culture primaire dans le puits et quelques gouttes dans les inserts membranaires (environ 40 μL) tous les deux jours ou selon les besoins. Une culture appropriée a montré que les cellules sont capables de survivre et d’être maintenues jusqu’à 30 jours ex vivo.
4. irradiation des sections de la glande salivaire
- Traiter les sections avec une seule dose de rayonnement (5 Gy) à l’aide de l’irradiateur cobalt-60 (ou équivalent).
- Sections de transport à l’installation d’irradiateur à l’aide d’un récipient de styromousse recouvert pour éviter les fluctuations de température. En outre, les soins doivent être pris pendant le transport de nouveau à l’incubateur de laboratoire pour s’assurer que les médias n’éclaboussent pas sur le couvercle de culture et induisent la contamination.
- Placer la plaque de 24 puits contenant les sections de la glande salivaire à 80 cm de la source de rayonnement, au centre d’un champ de rayonnement de 32 "x 32". Les calculs de dose de rayonnement et le temps correspondant dans l’irradiateur varient selon l’instrument et la désintégration du cobalt-60.
- Continuer à surveiller et à cultiver ces sections comme décrit à la section 3.
5. coloration de la viabilité
- Aspirer les vieux médias et laver les tranches deux fois avec du PBS 1x stérile et pré-chauffé.
- Sections de teinture avec colorant bleu trypan.
- Utilisez une micro-spatule pour déplacer la tranche de la culture à une glissière en verre.
- Ajouter 0,4% de solution de bleu trypan à la tranche de vibratome avec suffisamment de volume pour couvrir le tissu (10 – 20 μL).
- Incuber les tranches à température ambiante (RT) dans le bleu trypan pendant 1 – 2 min pour que le colorant pénètre dans le tissu. Les cellules non viables seront colorées en bleu, et les cellules viables seront non colorées.
- Sections de teinture avec calcéine, colorant de cellules vivantes AM.
- Ajouter suffisamment de volume de tache pour recouvrir la section dans un puits d’une plaque de 24 puits (200 – 300 μL).
- Incuber les tranches à RT pendant 15 min pour permettre la pénétration de colorant.
- Retirez délicatement la section du puits et placez-la sur une glissière en verre. Montez les tranches avec 1 goutte de support de montage.
- Sections d’image sur un microscope fluorescent à des longueurs d’onde d’excitation/émission de 488 nm et 515 nm.
6. coloration des anticorps des sections vibratomes
NOTE: ce qui suit fournit un protocole général de coloration d’anticorps spécifique pour le Ki-67; Cependant, ce protocole peut être utilisé avec n’importe quel anticorps. Tous les lavages sont effectués à RT, sauf indication contraire.
- Dans le plat de culture de tissus multi-puits, aspirer les médias et laver au moins 2x avec le PBS 1x stérile.
- Fixer les sections en utilisant 4% de paraformaldéhyde (PFA) pendant la nuit à 4 ° c.
- Aspirer 4% PFA et laver 3x avec PBT [1x PBS, 1% albumine de sérum bovine (BSA), 0,1% Triton X-100].
Remarque: les sections peuvent être stockées dans 1x PBS à 4 ° c et colorées ultérieurement. Le temps de stockage maximal testé dans ce manuscrit était de 3 semaines. Une durée de stockage plus longue devra être optimisée par l’utilisateur individuel si cela est souhaité. - Perméabilize sections utilisant 0,3% Triton X-100 en 1x PBS pendant 30 min.
Remarque: cette étape peut être modifiée et optimisée pour la coloration et la perméabilization spécifiques des anticorps. - Solution de perméabilization de Pipet OFF.
- Laver les tranches 3x pendant 5 min avec 1x PBS, 1% BSA, et 0,1% Triton X-100 (PBT).
- Bloquez les tranches avec un agent bloquant avec 1% de sérum de chèvre normal pendant 1 h.
- Laver les tranches 3x pendant 5 min avec PBT.
- Incuber les tranches pendant la nuit à 4 ° c avec 500 μL d’anticorps monoclonal de lapin anti-KI67 dilué dans 1% de BSA dans 1x PBS.
Remarque: pour la coloration de la phalloidine, sautez l’étape 6,9 et continuez à utiliser le protocole pour la phalloidine spécifique utilisée. Pour la contre-tache d’ADN, passez à l’étape 6,15. - Aspirate anticorps monoclonal de lapin anti-KI67.
- Laver les tranches 6x pendant 5 min en 1x PBS.
- Incuber les tranches dans 500 μl d’anticorps secondaires conjugués fluorescent compatibles avec l’anticorps anti-KI67 dilué dans 1% de BSA dans 1x PBS à RT pour 1,5 h recouvert de lumière.
Remarque: en fonction de l’anticorps secondaire utilisé, le temps d’incubation avec l’anticorps secondaire peut être optimisé par l’utilisateur individuel. En outre, l’anticorps secondaire est sensible à la lumière. Tous les lavages ultérieurs doivent être exécutés dans l’obscurité. - Anticorps secondaire d’aspirate.
- Lavez les tranches pour 3x pendant 5 min avec 1x PBS.
- Laver les tranches pendant 5 min dans de l’eau désionisée.
- Les tranches de contre-tache avec DAPI (1μg/mL) pendant 20 min à RT.
- Lavez les tranches (une fois) pendant 5 min dans de l’eau désionisée.
- Monter les tranches avec une goutte (~ 40 μL) de support de montage. Pour éviter les excès de bulles, placer lentement la bavette sur le support de montage sur la glissière, en commençant par un angle de 45 °.
- Pour éviter d’écraser les sections épaisses avec la lamelle, montez chaque tranche avec une entretoise. Une entretoise peut être créée en plaçant une jante de graisse sous vide dans un carré autour de la section tissulaire.
- Lors de la pose de la lamelle, les bords de la lamelle peuvent être scellés avec de la graisse sous vide. Appuyez sur les bords de la lèvre avec votre pouce pour l’adhérer fermement sur la glissière. Vous pouvez également sceller la bavette sur la glissière du microscope à l’aide d’un vernis à ongles transparent.
7. sections de vibratome d’imagerie
- Image les diapositives colorées dans les 5 jours de coloration.
- Obtenir des sections optiques des tranches vibratomes colorées à l’aide d’un microscope confocale. Avec un microscope confocale, obtenir une pile z à une taille de pas définie ou prendre des images individuelles en fonction de la conception expérimentale de l’utilisateur. Les images peuvent être examinées sur n’importe quel écran d’ordinateur après la collecte confocale.
NOTE: en raison de l’épaisseur des tranches de vibratome, il est recommandé qu’un microscope confocale ou une portée avec la capacité z-Stack soit utilisé pour visualiser les détails dans les échantillons. Pour les images utilisées dans ce manuscrit, un objectif d’huile de 63X a été utilisé; Toutefois, cela peut être adapté et modifié par l’utilisateur individuel et la portée spécifique utilisée. La résolution de pixel recommandée pour chaque objectif et facteur de zoom avec l’échantillonnage présumé de Nyquist de 2,5 pixels en X et Y pour la plus petite structure optiquement résolvable a été utilisée. Cependant, certains commentateurs suggèrent 2,3 pixels, tandis que d’autres suggèrent 2,8 pixels. Veuillez consulter le manuel de microscopie confocale biologique22 pour plus de détails sur la façon de faire ces calculs.
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Representative Results
Les cultures primaires 2D sont cultivées dans des milieux additionnés de sérum bovin (FBS), tandis que la culture des salisphères 3-D primaires est généralement cultivée dans des conditions exemptes de sérum10,11. En outre, les deux études antérieures utilisant des cultures de vibratome des glandes salivaires ont cultivé leurs sections dans 0% ou 10% FBS additionnés de medias19,20. Les tranches sous-mandibulaires de souris ont été sectionnées à une épaisseur de 50 μM à l’aide d’un vibratome et les conditions de culture optimales ont été déterminées à l’aide d’une série de concentrations de FBS (0%, 2,5%, 5,0% et 10%). Pour déterminer les caractéristiques de survie, des images de microscope à champ vif ont été prises aux jours de culture 1, 4, 7, 14 et 30 post-sectionnement (figure 1). En outre, les sections de la glande ont été colorées avec 0,4% de colorant bleu trypan et ont été imagées avec un microscope à champ vif à 40x aux points de temps indiqués (figure 2a). Les cellules non viables étaient colorées en bleu et les cellules viables restaient claires.
De même, pour déterminer les caractéristiques de survie des tranches plus épaisses sectionnées à 90 μm, les images de microscope à champ vif avec et sans coloration bleu trypan ont été prises au jour 30 dans les cultures additionnées de 2,5% FBS (figure 2b). En raison de l’épaisseur de la tranche, les sections de 90 μm colorées avec le colorant bleu trypan ont été imagées entières puis coupées en deux afin d’évaluer le centre de la tranche (figure 2b). À titre de confirmation, un colorant de cellules vivantes a été utilisé pour évaluer la survie des cellules dans différentes conditions culturantes de FBS (Figure 2c). Dans les images de champ vif, des niveaux élevés de cellules translucides et survivantes dans les tissus coupés à la fois 50 μM et 90 μM ont été observés. Fait intéressant, les sections sont devenues plus sombres et la zone tissulaire globale se condense au fil du temps dans la culture, mais une partie importante de la section semble survivre à la période de culture de 30 jours (figure 1, figure 2). Cette condensation était la plus évidente dans les conditions culturantes de 0% et de 10% de FBS. Des cellules positives bleues de trypan ont été observées sur le périmètre de toutes les sections indépendamment des conditions culturantes, et il y a eu une augmentation de la zone de cellules positives bleues de trypan dans des conditions de culture de 0% de FBS par rapport aux conditions plus élevées de culture de FBS (figure 2a , 2b).
En utilisant la tache de cellules vivantes, les sections cultivées dans 0% ont montré la plus faible quantité de coloration, et l’addition de FBS aux milieux de culture a amélioré la quantité de cellules vivantes. Prises ensemble, les sections cultivées en 0% FBS ont montré une condensation tissulaire visible, des zones colorées bleues de trypan élevées et les niveaux les plus bas de coloration des cellules vivantes. L’addition de 2,5% de FBS aux cultures a amélioré la quantité de tissu translucide, diminué la zone positive bleu trypan, et augmenté les niveaux de coloration des cellules vivantes. Des augmentations additionnelles de la concentration de FBS ne semblaient pas améliorer la survivabilité du tissu; par conséquent, 2,5% FBS dans le milieu vibratome était la concentration optimale de FBS et utilisée comme condition de culture pour toutes les expériences ultérieures.
Pour déterminer la viabilité des tranches de tissu sous-mandibulaire ex vivo post-dissection, les marqueurs PROLIFÉRATIFS et apoptotiques ont été évalués aux jours 1, 3, 7, 14 et 30 en culture. L’activité proliférative a été évaluée par l’immunocoloration KI67 dans un sous-ensemble de tranches de culture (figure 3A). KI67 cellules positives ont été observées à tous les points de temps évalués et ont continué à être présents au jour 30 dans la culture, avec des différences minimales entre les points de temps. De même, le degré d’apoptose a été évalué par une immunostentation de la caspase-3 climée dans un sous-ensemble distinct de sections (figure 3b). Un faible niveau de cellules positives de caspase-3 clivées a été observée à tous les points de temps jusqu’au jour 14 en culture, alors que les conditions du jour 30 semblaient avoir une légère augmentation du nombre de cellules positives de caspase-3 clivées dans certaines régions. L’évaluation des bords tissulaires n’a pas révélé de niveaux plus élevés de caspase-3 clifté, ce qui ne récapitule pas la coloration bleue du trypan (figure 2). Globalement, ces résultats suggèrent que des indices de prolifération et de viabilité sont restés présents dans les cultures vibratomes au cours de la période d’évaluation de 30 jours.
Les cultures vibratomes à section épaisse permettent d’évaluer les interactions entre les constituants cellulaires d’un tissu particulier à une profondeur qui comprend plus d’une épaisseur de cellule épithéliale dans chaque direction. En outre, il est important de pouvoir faire la culture des deux glandes salivaires majeures, car elles diffèrent dans la composition des protéines salivaires produites, l’architecture histologique, la radiosensibilité, et d’autres caractéristiques critiques. Pour déterminer les différentes populations cellulaires dans les cultures de glandes sous-mandibulaires, les sections sous-mandibulaires ont été colorées avec E-cadhérine (E-CAD) pour détecter les cellules épithéliales, l’actine musculaire lisse (SMA) pour détecter les cellules myoépithéliales, et les filaments d’actine (phalloidine) pour détecter les structures cytosquelettiques pendant les 30 jours de culture (figure 4a).
La coloration de l’E-cadhérine a été observée sur les membranes d’une majorité de cellules et détectée tout au long de la période de culture de 30 jours. Les cellules SMA + ont été détectées tout au long de la période de culture, avec des niveaux similaires à chaque point de temps. L’organisation cytosquelettique des filaments d’actine semble également être maintenue à chaque point évalué. En revanche, il y avait des marqueurs cellulaires qui n’étaient pas systématiquement maintenus pendant toute la période d’évaluation et ceux-ci comprenaient CD31 (vasculature), TUBB3 (neurones) et aquaporine-5 (AQP-5, marqueur acinaire) (figure 4b). Les structures vasculaires à travers les cheminées confocales ont été clairement observées aux jours 1 et 3 post-culture; Cependant, ces structures semblaient fragmentées au jour 7. De même, les processus neuronaux ont été intacts au cours de la première journée de la culture, est apparu diminué au jour 3, et ont ensuite été perdus au jour 7 dans la culture. Les cellules Aqp5 + ont été observées aux jours 1, 3, 7 et 14 en culture; mais, au jour 14, le niveau de coloration global semble être réduit, avec une ressemblance plus granulaire dans les cellules positives restantes. Ces données suggèrent que les cultures sous-mandibulaires contiennent la diversité des constituants tissulaires avec l’entretien des types de cellules vasculaires et neuronales pour des périodes de culture plus courtes, et des types de cellules épithéliales et myoépithéliales pour des périodes de culture plus longues.
Alors que des cultures de vibratome-sectionnés ont été rapportées antérieurement pour la glande salivaire parotide, les cultures ont été maintenues pendant 48 h, limitant le délai pendant lequel elles pourraient être étudiées. Afin de déterminer si les glandes parotides peuvent être maintenues pendant plus longtemps, les glandes parotides murines ont été sectionnées et cultivées pendant 1, 3, 7 ou 14 jours. Moins de sections ont été obtenues à partir de la glande parotide en raison de sa taille plus petite chez les souris; par conséquent, une période de culture de 30 jours n’a pas été tentée. Des tranches ont été évaluées pour la prolifération par coloration immunofluorescente à l’aide d’anticorps contre KI67. À l’instar des cultures sous-mandibulaires, des cellules positives de Ki67 ont été observées à tous les points de temps, ce qui indique que les cellules maintiennent un degré de prolifération dans la culture (figure 5A).
De plus, on a évalué le maintien de marqueurs ACINAIRES fonctionnels (α-amylase et Aqp5), d’un marqueur épithélial (E-CAD) et de cellules vasculaires (CD31) et neuronales (TUBB3). L’amylase est l’une des protéines les plus abondantes produites par les cellules épithéliales parotides différenciées et souvent perdues pendant la culture 2D des cellules parotides primaires. Dans les cultures vibratomes, l’amylase a été observée dans les cellules ACINAIRES et exclue des cellules ductales tout au long de la période de culture de 14 jours (figure 5B). À l’instar des cultures sous-mandibulaires, les cellules Aqp5 + étaient présentes dans les cultures parotidiques à chaque point de temps, les cultures de 14 jours présentant des niveaux réduits par rapport aux points de temps antérieurs (Figure 5C). Les teneurs en E-cadhérine ont également été maintenues sur les membranes d’une majorité de cellules pendant la période de culture de 14 jours (figure 5D). Les structures neuronales semblaient maintenues pendant la période de culture de 7 jours et n’ont pas été évaluées à des moments ultérieurs (figure 5e). En revanche, les structures vasculaires semblaient intactes au cours de la première journée de culture, et seules les structures plus petites étaient présentes aux jours 3 et 7 en culture (figure 5F). Ces données suggèrent que les cultures parotidiques maintiennent leurs capacités prolifératives et la plupart des capacités fonctionnelles pendant 7-14 jours en culture et présentent potentiellement une structure tissulaire plus intacte pour un plus long laps de temps.
L’utilité fonctionnelle du modèle de culture vibratome a été traitée en traitant des cultures parotidiques ou sous-mandibulaires avec une seule dose de rayonnement (figure6, figure 7, figure 8). Des travaux antérieurs dans des modèles de souris irradiés ont porté sur la glande parotide et ont démontré l’induction de l’apoptose qui culminait à 24 h, induction de la prolifération compensatoire à partir du jour 5, perturbation des filaments d’actine à partir du jour 5, et perte de marqueurs de différenciation (par exemple, amylase) par jour 1423,24,26. L’irradiation des cultures de vibratomes de parotides a entraîné une augmentation de l’apoptose au jour 1, une augmentation de la prolifération au jour 7, une perturbation des filaments d’actine au jour 7 et une réduction de l’amylase au jour 7 (figure 6). L’irradiation des cultures vibratomes sous-mandibulaires a entraîné une augmentation de l’apoptose aux jours 1 et 3, une augmentation de la prolifération au jour 7 et une perturbation des filaments d’actine au jour 7 (figure 7). Les niveaux d’E-cadhérine sont apparus relativement intacts dans les cultures parotidiques et sous-mandibulaires, ce qui est semblable aux observations in vivo26. Les marqueurs de cellules acineuses fonctionnelles AQP-5 dans les sections de la glande sous-mandibulaire et l’amylase dans les sections de la glande parotide ont diminué au jour 14, comparativement aux points de temps non traités correspondants (figure 8). Ces données suggèrent que les changements tissulaires induits par les rayonnements observés in vivo ont également été observés dans les cultures de vibratomes irradiés.
Figure 1: Images de microscope à champ vif de 50 μM sous-mandibulaire sections. Les glandes sous-mandibulaires des souris femelles FVB (4-8 semaines) ont été disséquées, sectionnées à 50 μM d’épaisseur et cultivées sur des inserts de culture de cellules organotypiques pour 1, 4, 7, 14 et 30 jours après dissection à 0%, 2,5%, 5,0% et 10% de sérum bovin fœtal (FBS) dans les milieux déterminer les caractéristiques de la culture et optimiser les conditions de culture. Barres d’échelle = 200 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: coloration de la viabilité des sous-mandibulaire sections. (A) images de microscope à champ vif de 50 μM de sous-mandibulaire disséqué de souris FBV femelles de 4 à 8 semaines et colorées avec du bleu de trypan (0,4%) à 1, 3, 7, 14 et 30 jours en culture avec des milieux contenant 2,5% de sérum bovin fœtal (FBS). B images de microscope à champ lumineux de sections sous-mandibulaires de 90 μm (panneau de gauche), colorées avec du bleu trypan (panneau du milieu), coupées en deux et colorées avec du bleu trypan (panneau droit), puis cultivées jusqu’à 30 jours après la dissection dans des milieux contenant 2,5% de FBS. C) des images fluorescentes de sections sous-mandibulaires de 50 μM cultivées dans diverses concentrations de FBS (0%, 2,5%, 5%, 10%) teinté de calcéine AM pour indiquer les cellules vivantes (vertes) au jour de la culture 7. Barres d’échelle = 200 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Évaluation des marqueurs PROLIFÉRATIFS et apoptotiques dans sous-mandibulaire tranches de tissu organotypiques. Les glandes sous-mandibulaires des souris femelles FVB (4-8 semaines) ont été disséquées, tranchées à 50 μM d’épaisseur, et cultivées dans des milieux additionnés de 2,5% de FBS sur des inserts de culture de cellules organotypiques pour 1, 3, 7, 14 et 30 jours après la dissection. Aux points de temps indiqués, les tranches ont été fixées et colorées pour les marqueurs PROLIFÉRATIFS (KI67) et apoptotiques (caspase-3 clivés). (A) coloration immunofluorescente des cellules KI67-positives (vertes) et du noyau (bleu). (B) coloration immunofluorescente de cellules caspase-3-postives clivées (rouge) et du noyau (bleu) à partir de deux points de vue d’une tranche. Le panneau de la rangée supérieure affiche les cellules caspase-3 positives cliavées sur le bord d’une tranche, et le panneau de la rangée inférieure affiche les cellules caspase-3 positives cliavées du milieu d’une tranche. Les images confocales représentatives ont été sélectionnées à partir de plusieurs piles z par point de temps. Barres d’échelle = 30 μm. s’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: Présence de structures cellulaires en sous-mandibulaire tranches de tissu organotypiques . Les glandes sous-mandibulaires des souris femelles FVB (4-8 semaines) ont été disséquées, tranchées à 50 μM d’épaisseur, et cultivées dans des milieux additionnés de 2,5% de FBS sur des inserts de culture de cellules organotypiques pour 1, 3, 7, 14 ou 30 jours après la dissection. Aux points de temps indiqués, les tranches ont été fixées et colorées pour leurs marqueurs correspondants avec le noyau (bleu). (A) les sections sous-mandibulaires ont été évaluées aux jours 1, 7, 14 et 30 après la dissection pour les concentrations d’E-cadhérine, d’actine musculaire lisse (SMA) et de F-actine (phalloidine). (B) les sections sous-mandibulaires ont été évaluées aux jours 1, 3 et 7 pour les concentrations de CD31 (vasculature) et de TUBB3 (neurones). Aquaporin-5 (Aqp5) a été évalué aux jours 1, 3, 7 et 14. Les images confocales représentatives ont été sélectionnées à partir de plusieurs piles z par point de temps. Barres d’échelle = 30 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5: Évaluation des marqueurs PROLIFÉRATIFS et fonctionnels dans les tranches tissulaires par organotypiques. Les glandes parotidiques des souris femelles FVB (4-8 semaines) ont été disséquées, tranchées à 50 μM d’épaisseur, et cultivées dans des milieux additionnés de 2,5% de FBS sur des inserts de culture de cellules organotypiques pour 1, 3, 7 ou 14 jours après la dissection. Aux points de temps indiqués, les tranches ont été fixées et colorées pour leurs marqueurs correspondants avec le noyau (bleu). (A) coloration immunofluorescente des cellules KI67-positives (vertes). (B) coloration immunofluorescente des cellules amylase-positives (rouge). (C) coloration immunofluorescente des cellules positives de l’aquaporine-5 (Aqp5) (vertes). (D) coloration immunofluorescente des cellules positives de l’E-cadhérine (rouge). (E) coloration immunofluorescente des neurones indiqués par les cellules positives de TUBB3 (Magneta). (F) coloration immunofluorescente du système vasculaire indiquée par les cellules positives CD31 (rouges). Les images confocales représentatives ont été sélectionnées à partir de plusieurs piles z par point de temps. Barres d’échelle = 30 μm; d = cellules ductales. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6: changements cellulaires suite à l’irradiation des tranches de tissu organotypiques parotidiques. Les glandes parotidiques des souris femelles FVB (4-8 semaines) ont été disséquées, tranchées à 50 μM d’épaisseur, et cultivées en additionnée de 2,5% de FBS sur des inserts de culture de cellules organotypiques. Le jour 1 après la dissection, un sous-ensemble de tranches a été exposé à un rayonnement de 5 GY et maintenu pendant 2, 4 ou 8 jours après la dissection (correspond aux jours 1, 3 et 7 post-radiation). Coloration immunofluorescente de sections parotidiques non traitées et irradiées pour déterminer les niveaux de (A) Ki67 (vert)-cellules positives, (B) cellules positives de caspase 3 (rouge)-positif, (C) phalloïdine (cyan)-cellules positives, (D) amylase (rouge)-cellules positives, et (e) e-cellules positives de cadhérine (rouge). Toutes les taches nucléaires utilisées DAPI (bleu). Les images confocales représentatives ont été sélectionnées à partir de plusieurs z-Stack par point de temps. Barres d’échelle = 30 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 7: changements cellulaires suite à l’irradiation de tranches de tissu organotypiques sous-mandibulaires. Les glandes sous-mandibulaires des souris femelles FVB (4-8 semaines) ont été disséquées, tranchées à 50 μM d’épaisseur et cultivées dans des milieux additionnés de 2,5% de FBS sur des inserts de culture de cellules organotypiques. Le jour 1 après la dissection, un sous-ensemble de tranches a été irradié avec 5Gy et maintenu pendant 2, 4, ou 8 jours après la dissection (correspond aux jours 1, 3 et 7 post-radiation). Coloration immunofluorescente de sections sous-mandibulaires non traitées et irradiées pour déterminer les concentrations de (A) Ki67 (vert)-cellules positives, (B) cellules positives de la caspase 3 (rouge), (C) phalloïdine (cyan)-cellules positives, (D) aquaporine 5 (Aqp5) (vert)-cellules positives, et (e) e-cellules positives de cadhérine (rouge). Toutes les taches nucléaires utilisées DAPI (bleu). Les images confocales représentatives ont été sélectionnées à partir de plusieurs z-Stack par point de temps. Barres d’échelle = 30 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 8: marqueurs ACINAIRES fonctionnels dans les tranches de tissus organotypiques de parotides et sous-mandibulaires irradiés. Les glandes submandibulaires et parotides des souris femelles FVB (4-8 semaines) ont été disséquées, tranchées à 50 μM d’épaisseur, et cultivées dans des milieux additionnés de 2,5% de FBS sur des inserts de culture de cellules organotypiques. Le jour 1 après la dissection, un sous-ensemble de tranches a été irradié avec 5Gy et maintenu pendant 14 jours après l’irradiation. La coloration immunofluorescente des sections non traitées (UT) et irradiées (IR) a été utilisée pour déterminer les niveaux des cellules positives ( A) aquaporin-5 (Aqp5) (vertes) et (B) amylase (rouge)-positives). Toutes les taches nucléaires utilisées DAPI (bleu). Les images confocales représentatives ont été sélectionnées à partir de plusieurs z-Stack par point de temps. Barres d’échelle = 30 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
La recherche sur les glandes salivaires a utilisé un certain nombre de modèles de culture, y compris des cultures 2-D immortalisées, des cultures 2-D primaires, des cultures de salisphères 3-d et des cultures d’organes 3-D issues d’explants embryonnaires pour déterminer les questions sur la biologie et la physiologie sous-jacentes. Ces modèles de culture ont donné des informations perspicaces dans un éventail varié de questions de recherche et continueront d’être des outils importants dans la recherche salivaire. Les limitations de ces modèles de culture comprennent la modulation de l’activité de la protéine de base pendant l’immortalisation, la viabilité transitoire des cultures primaires, la perte de différenciation et les protéines sécrétoires dans la culture, et l’incapacité d’évaluer les cellules cellulaires, la cellule-ECM et la polarité interactions dans les tissus adultes. La première méthode de culture en tranches organotypiques en 3-D (cultures de vibratomes coupés) pour les glandes salivaires a été publiée au 200818; Cependant, cette technique a été largement sous-utilisée dans ce domaine malgré une utilisation fréquente dans d’autres domaines. Le travail a cultivé des sections parotidiennes pour 48 h, ce qui limite la capacité d’étudier ces sections pour les effets chroniques après un traitement par rayonnement ou d’utiliser des protocoles de transfection ou de transduction pour les phénotypes après la manipulation de gènes spécifiques. La méthode décrite ici a été optimisée pour permettre un temps plus long dans la culture, produire des images à haute résolution par microscopie confocale, fournir une méthode pour étudier la dynamique intra-et intercellulaire sur une section 3-D, et évaluer les changements induits par le rayonnement pendant une période de culture d’au moins 14 jours.
Alors que chaque étape est nécessaire pour la mise en œuvre de la technique, certaines étapes sont cruciales pour réussir la sectionnement et la maintenance de la culture. Il s’agit notamment de couper les tranches de glande salivaire, de maintenir les tranches dans la culture, et de colorer et d’imagerie des tranches avec la microscopie confocale. Le protocole présenté pose quelques défis qui exigent la patience et la pratique afin d’obtenir des tranches optimales pour l’analyse. Les suggestions suivantes aideront à réaliser ce protocole avec succès. Il est impératif d’isoler complètement la glande salivaire du tissu conjonctif environnant après dissection. Le tissu conjonctif résiduel provoque la lame du vibratome pour faire glisser la glande du bloc d’d’agarose et exige que le tissu soit réincorporé dans l’d’agarose. Cela peut être une limitation majeure puisque la réincorporation multiple peut augmenter les chances de contamination et diminuer la viabilité des tranches. Ceci est particulièrement crucial pour la culture des glandes parotides, puisque les glandes parotides sont plus lobulaires dans la structure et donc plus susceptibles d’avoir des tissus étrangers.
L’addition de 1% de pénicilline-streptomycine-amphotéricine B (PSA) à tous les liquides, y compris le plateau tampon, le plat de collecte des tranches et le milieu vibratome, minimise la contamination de la tranche post-dissection. La variation de la concentration d’d’agarose a été utilisée pour optimiser la coupe réussie. En raison de la densité des glandes salivaires, 1,9% d’d’agarose était trop mou, et les glandes étaient facilement délogées du bloc. La sectionnement du vibratome dans d’autres domaines ont utilisé 5,0% d’agarose; Cependant, cela a provoqué des coupes déchiquetées et des tranches ont été sous-optimales. Après avoir testé plusieurs conditions de pourcentage d’d’agarose, 3% d’d’agarose était le plus optimal pour soutenir le poids et la fermeté du tissu. En particulier, la concentration d’d’agarose utilisée dans Warner et al. et su et al. était également de 3%19,20.
En outre, l’angle, la fréquence des vibrations et la vitesse de progression de la lame peuvent être modifiées en fonction du tissu à sectionné. Pour les glandes salivaires sous-mandibulaires et parotides, un angle de 15 °, une vitesse de 0,075 mm/s, et une fréquence de 100 Hz ont été appropriés pour la sectionnement. En raison de la douceur des glandes salivaires, les conditions de coupe optimales ont exigé que la lame avance lentement à travers le tissu à une vibration élevée. Pour la coloration immunofluorescente, la perméabilization, la durée des incubations et les étapes de lavage sont essentielles pour des taches optimales. Si la coloration positive n’apparaît que dans les couches externes de la tranche de tissu, une perméabilization plus stricte avec la protéinase K peut être nécessaire, tandis que la coloration inégale ou la coloration de fond élevée peuvent nécessiter une coloration moins stricte avec 0,2% de Triton X-100. Les temps d’incubation ont été optimisés pour un signal élevé et un fond bas, qui peuvent nécessiter d’être adaptés à des anticorps primaires spécifiques. Des étapes de lavage plus longues sont essentielles pour réduire le fond élevé et cela peut être adapté aux anticorps spécifiques utilisés.
Une application majeure de cette méthodologie est l’analyse cinétique prolongée après l’exposition aux radiations des glandes salivaires. Les travaux antérieurs ont établi des changements de phase aiguë et chronique dans les glandes salivaires irradiées6,24,25,26, et le système de culture de vibratome peut être un outil puissant pour disséquer les critiques des événements moléculaires à des moments précis après le traitement. Par exemple, les changements cellulaires induits par la radiation dans la glande salivaire qui ont été rapportés dans la littérature, y compris la réduction de l’amylase, l’apoptose des cellules ACINAIRES, la prolifération compensatoire des cellules ACINAIRES, la perte de polarité et les perturbations dans structure cytosquelettique. En particulier, les cultures vibratomes irradiées ex vivo présentent des altérations similaires dans ces marqueurs.
En outre, la réponse en phase aiguë dans les glandes salivaires pivote autour de l’activité du Toutefois, il est difficile de savoir quel rôle joue l’enseignement de la culture dans les points ultérieurs en raison de la viabilité à 5 jours des cultures primaires. Ce système permettrait une perturbation ex vivo, contrôlée de l’activité de la part de la part des autres points et révélera un rôle dans les dommages chroniques ou les réponses régénératives. En outre, la réponse à la prolifération compensatoire est initiée 5 jours après le traitement radiologique, et il est difficile de délimiter les régulateurs moléculaires de cette réponse dans les cultures primaires transitoires. L’application la plus largement utilisée de cette méthodologie impliquera probablement des interactions cellule-cellule, cellule-ECM et polarité dans les tissus adultes. Des études impactful ont été menées dans des cultures d’organes 3-D à partir de glandes embryonnaires pour découvrir l’interaction complexe entre le développement des glandes salivaires et le réseau neuronale ou vasculaire27,28,29, 30,31.
La méthode décrite ici indique qu’une optimisation supplémentaire est nécessaire pour le travail neuronale ou vasculaire dans les cultures sous-mandibulaires et éventuellement les cultures parotidiques. Les dommages causés par les radiations perturbent également les régulateurs de la jonctionnelle, induisant le dépôt de collagène, altère l’organisation F-actine et module les granules sécrétoires26,30,32. Les études de régénération des glandes salivaires sont handicapées par l’absence d’un modèle adulte pour évaluer ces interactions. Cette méthode de culture organotypique peut fournir un système permettant d’appliquer des techniques moléculaires avancées et d’étudier plus avant la régulation de ces médiateurs dans un contexte 3D et de découvrir efficacement de nouvelles thérapies.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été appuyé en partie par le financement pilote fourni par l’Université de l’Arizona Bureau de la recherche et de la découverte et instituts nationaux de la santé (R01 DE023534) à Kirsten Limesand. La bourse de formation en biologie du cancer, T32CA009213, a fourni un soutien à l’allocation pour Wen Yu Wong. Les auteurs aimeraient remercier M. Rice pour sa précieuse contribution technique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystems | N/A | Vibratome for sectioning |
| Double Edge Stainless Steel Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | Low-melt |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P6543 | |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B | Lonza | 17-745H | PSA |
| 24-well plate | CellTreat | 229124 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | |
| Loctite UltraGel Control Superglue | Loctite | N/A | Purchased at hardware store |
| Natural Red Sable Round Paintbrush | Princeton Art & Brush Co | 7400R-2 | |
| Gentamicin Sulfate | Fisher Scientific | ICN1676045 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T-8158-100mg | |
| L-glutatmine | Gibco | 25030-081 | |
| Trace Elements | MP Biomedicals | ICN1676549 | |
| Insulin | Fisher Scientific | 12585014 | |
| Epidermal Growth Factor | Corning | 354001 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| Retinoic acid | Fisher Scientific | R2625-50MG | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3160602 | |
| DMEM/F12 Media | Corning | 150-90-CV | |
| Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma | PICM01250 | 12 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate |
| 0.4% Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo-Fisher | R37601 | Only used LIVE dye component |
| Anti-Ki-67 Antibody | Cell Signaling Technology | 9129S | |
| Anti-E-cadherin Antibody | Cell Signaling Technology | 3195S | |
| Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody | Cell Signaling Technology | 9661L | |
| Anti-SMA Antibody | Sigma-Aldrich | C6198 | |
| Anti-amylase Antibody | Sigma-Aldrich | A8273 | |
| Anti-CD31 Antibody | Abcam | ab28364 | |
| Anti-TUBB3 Antibody | Cell Signaling Technology | 5568S | |
| Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Thermo-Fisher | A20185 | |
| Alexa Fluor 594 Phalloidin | Thermo-Fisher | A12381 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 21568-2500 | |
| Paraformaldehyde Prills | Fisher Scientific | 5027632 | |
| New England Nuclear Blocking Agent | Perkin Elmer | 2346249 | No longer sold |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083S | |
| Prolong Gold Antifade Mounting Media | Invitrogen | P36934 | |
| Leica SPSII Spectral Confocal | Leica Biosystems | N/A | For confocal imaging |
| Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope | Leica Biosystems | N/A | |
| Cobalt-60 Teletherapy Instrument | Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80 | N/A | |
| Amac Box, Clear | The Container Store | 60140 | Agarose block mold |
References
- Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: a literature review. Cancer. 107 (11), 2525-2534 (2006).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Hancock, P. J., Epstein, J. B., Sadler, G. R. Oral and dental management related to radiation therapy for head and neck cancer. Journal of the Canadian Dental Association. 69 (9), 585-590 (2003).
- Nguyen, N. P., et al. Quality of life following chemoradiation and postoperative radiation for locally advanced head and neck cancer. Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 69 (5), 271-276 (2007).
- Gorenc, M., Kozjek, N. R., Strojan, P. Malnutrition and cachexia in patients with head and neck cancer treated with (chemo)radiotherapy. Reports of Practical Oncology and Radiotherapy. Journal of Greatpoland Cancer Center in Poznań and Polish Society of Radiation Oncology. 20 (4), 249-258 (2015).
- Grundmann, O., Mitchell, G. C., Limesand, K. H. Sensitivity of salivary glands to radiation: from animal models to therapies. Journal of Dental Research. 88 (10), 894-903 (2009).
- Konings, A. W., Coppes, R. P., Vissink, A. On the mechanism of salivary gland radiosensitivity. International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 62 (4), 1187-1194 (2005).
- Chan, Y. -H., Huang, T. -W., Young, T. -H., Lou, P. -J. Human salivary gland acinar cells spontaneously form three-dimensional structures and change the protein expression patterns. Journal of Cellular Physiology. 226 (11), 3076-3085 (2011).
- Nguyen, V. T., Dawson, P., Zhang, Q., Harris, Z., Limesand, K. H. Administration of growth factors promotes salisphere formation from irradiated parotid salivary glands. PLoS ONE. 13 (3), e0193942 (2018).
- Limesand, K. H., et al. Characterization of Rat Parotid and Submandibular Acinar Cell Apoptosis In Primary Culture. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 39 (3), 170 (2003).
- Wei, L., Xiong, H., Li, W., Li, B., Cheng, Y. Upregulation of IL-6 expression in human salivary gland cell line by IL-17 via activation of p38 MAPK, ERK, PI3K/Akt, and NF-κB pathways. Journal of Oral Pathology & Medicine. 47 (9), 847-855 (2018).
- Chuong, C., Katz, J., Pauley, K. M., Bulosan, M., Cha, S. RAGE expression and NF-κB activation attenuated by extracellular domain of RAGE in human salivary gland cell line. Journal of Cellular Physiology. 221 (2), 430-434 (2009).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Bhadriraju, K., Chen, C. S. Engineering cellular microenvironments to improve cell-based drug testing. Drug Discovery Today. 7 (11), 612-620 (2002).
- Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
- Avila, J. L., Grundmann, O., Burd, R., Limesand, K. H. Radiation-induced salivary gland dysfunction results from p53-dependent apoptosis. International Journal of Radiation Oncology, Biololgy, Physics. 73 (2), 523-529 (2009).
- Mitchell, G. C., et al. IGF1 activates cell cycle arrest following irradiation by reducing binding. of DeltaNp63 to the p21 promoter. Cell Death & Disease. 1, (2010).
- Lombaert, I. M. A., et al. Rescue of Salivary Gland Function after Stem Cell Transplantation in Irradiated Glands. PLoS ONE. 3 (4), (2008).
- Warner, J. D., et al. Visualizing form and function in organotypic slices of the adult mouse parotid gland. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 295 (3), G629-G640 (2008).
- Su, X., et al. Three-dimensional organotypic culture of human salivary glands: the slice culture model. Oral Diseases. 22 (7), 639-648 (2016).
- Mattei, G., Cristiani, I., Magliaro, C., Ahluwalia, A. Profile analysis of hepatic porcine and murine brain tissue slices obtained with a vibratome. PeerJ - The Journal of Life and Environmental Sciences. 3, 932 (2015).
- Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. , 3rd ed, Springer U.S. Boston, MA. (2006).
- Limesand, K. H., et al. Insulin-Like Growth Factor-1 Preserves Salivary Gland Function After Fractionated Radiation. International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 78 (2), 579-586 (2010).
- Grundmann, O., Fillinger, J. L., Victory, K. R., Burd, R., Limesand, K. H. Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration. BMC Cancer. 10, 417 (2010).
- Chibly, A. M., et al. aPKCzeta-dependent Repression of Yap is Necessary for Functional Restoration of Irradiated Salivary Glands with IGF-1. Scientific Reports. 8 (1), 6347 (2018).
- Wong, W. Y., Pier, M., Limesand, K. H. Persistent disruption of lateral junctional complexes and actin cytoskeleton in parotid salivary glands following radiation treatment. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 315 (4), R656-R667 (2018).
- Emmerson, E., et al. SOX2 regulates acinar cell development in the salivary gland. eLife. 6, (2017).
- Nedvetsky, P. I., et al. Parasympathetic innervation regulates tubulogenesis in the developing salivary gland. Developmental Cell. 30 (4), 449-462 (2014).
- Kwon, H. R., Nelson, D. A., DeSantis, K. A., Morrissey, J. M., Larsen, M. Endothelial cell regulation of salivary gland epithelial patterning. Development. 144 (2), 211-220 (2017).
- Mellas, R. E., Leigh, N. J., Nelson, J. W., McCall, A. D., Baker, O. J. Zonula occludens-1, occludin and E-cadherin expression and organization in salivary glands with Sjogren's syndrome. Jounral of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (1), 45-56 (2015).
- Daley, W. P., et al. Btbd7 is essential for region-specific epithelial cell dynamics and branching morphogenesis in vivo. Development. 144 (12), 2200-2211 (2017).
- Nam, K., et al. Post-Irradiated Human Submandibular Glands Display High Collagen Deposition, Disorganized Cell Junctions, and an Increased Number of Adipocytes. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (6), 343-352 (2016).
