Summary
El uso de cultivos organotípica tridimensionales para visualizar la morfología y los marcadores funcionales de las glándulas salivales puede proporcionar ideas novedosas sobre los mecanismos de daño tisular después de la radiación. Aquí se describe un protocolo de sección, cultura, irradiar, mancha, y la imagen de 50 – 90 μm grueso secciones de la glándula salival antes y después de la exposición a la radiación ionizante.
Abstract
La hiposalivación y la xerostomía crean complicaciones orales crónicas que disminuyen la calidad de vida en pacientes con cáncer de cabeza y cuello que reciben tratamiento con radioterapia. Los enfoques experimentales para comprender los mecanismos de disfunción y restauración de las glándulas salivales se han centrado en los modelos in vivo, que se encuentran discapacitados por la incapacidad de sistematiar sistemáticamente a los candidatos terapéuticos y la eficiencia en la transfección capacidad de manipular genes específicos. El propósito de este protocolo de cultivo organotípico de la glándula salival es evaluar el tiempo máximo de viabilidad de la cultura y caracterizar los cambios celulares después del tratamiento de radiación ex vivo. Utilizamos la tinción inmunofluorescente y la microscopía confocal para determinar cuándo están presentes poblaciones y marcadores específicos de células durante un período de cultivo de 30 días. Además, los marcadores celulares notificados previamente en modelos de radiación in vivo se evalúan en cultivos irradiados ex vivo. Avanzando, este método es una plataforma atractiva para la evaluación rápida ex vivo de las respuestas del tejido de las glándulas salivales murinas y humanas a los agentes terapéuticos que mejoran la función salival.
Introduction
La función de la glándula salival adecuada es esencial para la salud bucal y se altera después del tratamiento del cáncer de cabeza y cuello con radioterapia1. En 2017, se notificaron cerca de 50.000 casos nuevos de cáncer de cabeza y cuello en los Estados Unidos2. Debido a los efectos perjudiciales para los tejidos y con frecuencia irreversibles de la radioterapia en los tejidos normales circundantes, como las glándulas salivales, a los pacientes a menudo se les deja con efectos secundarios graves y disminución de la calidad de vida2,3, 4. Las complicaciones comunes causadas por el daño por radiación se manifiestan en síntomas como la xerostomía (la sensación subjetiva de sequedad bucal), la caries dental, la capacidad deteriorada para masticar y tragar, las deficiencias del habla y los microbiomas orales comprometidos2, 3 , 4. estos síntomas colectivamente pueden conducir a la desnutrición y la supervivencia deteriorada en los individuos afectados5. Mientras que la disfunción de las glándulas salivales en esta población ha sido bien documentada, los mecanismos subyacentes de daño a las células acinares han sido cuestionados, y hay poca integración entre los diferentes modelos animales6,7.
Los métodos actuales de estudio de la función de la glándula salival y el daño inducido por la radiación incluyen el uso de modelos in vivo, líneas celulares inmortalizadas, cultivos de células primarias bidimensionales (2-D) y culturas tridimensionales (3-D) de la salifera8, 9,10,11,12. Tradicionalmente, los modelos de cultivo celular de líneas celulares inmortalizadas y cultivos en 2-D implican células de capas únicas cultivadas en superficies planas y son valiosas para una experimentación rápida, fácil y rentable. Sin embargo, las condiciones de cultivo celular artificial pueden alterar el estado de diferenciación y las respuestas fisiológicas de las células expuestas a diversas afecciones, y los resultados a menudo no se traducen a los modelos de organismos enteros14,15. Además, los cultivos celulares inmortalizados requieren la modulación de la actividad de p53, que es fundamental para la respuesta de la glándula salival al daño del ADN16,17.
las culturas salisfera 3-D se enriquecen para las células madre y progenitoras en los primeros momentos de la cultura y han sido útiles para comprender la radiosensibilidad de este subconjunto de células de la glándula salival9,18. Una limitación crítica de todos estos modelos de cultivo es que son ineficaces en la visualización de la estructura 3-D de la glándula salival, incluyendo la matriz extracelular (ECM) y las interacciones de células celulares sobre varias capas, que son cruciales en la modulación de salivales secreción15. La necesidad de un método que abarque el comportamiento del tejido en su conjunto, pero también puede ser manipulado en condiciones de laboratorio para estudiar los efectos del tratamiento es necesario para descubrir los mecanismos subyacentes de la glándula salival inducida por radiación disfunción.
La seccionamiento de tejido vivo y la cultura se han documentado previamente19,20 y a menudo se utiliza para estudiar interacciones cerebro-tejido21. En estudios previos, el tejido parótida (PAR) de las glándulas salivales de los ratones se seccionó a aproximadamente 50 μm y se cultivó hasta 48 h, y se realizaron análisis de viabilidad, muerte celular y función a partir de entonces19. Su et al. (2016) ampliado en esta metodología mediante el cultivo de glándulas submandibulares humanas (SMG) seccionadas a 35 μm o 50 μm durante 14 días20. El método propuesto es un avance en el que incluye las glándulas salivales parótidas y submandibulares seccionadas a 50 μm y 90 μm y la evaluación de los cultivos durante 30 días. La capacidad de cortar una gama de espesor de tejido es importante en la evaluación de las interacciones célula-célula y Cell-ECM que son relevantes para los procesos celulares incluyendo la polaridad apical-basolateral y la inervación para la secreción. Además, las rebanadas de las glándulas salivales fueron irradiadas mientras estaban en cultivo para determinar la viabilidad de este modelo de cultivo para estudiar el daño causado por la glándula salival inducida por radiación.
El propósito de este protocolo de cultivo organotípico de la glándula salival es evaluar el tiempo máximo de viabilidad de la cultura y caracterizar los cambios celulares después del tratamiento de radiación ex vivo. Para determinar las secciones máximas de tiempo que son viables después de la disección, se realizaron manchas azules de tripan, tinción de células vivas e inmunohistoquímica para la muerte celular. La microscopía confocal y la tinción inmunofluorescente se utilizaron para evaluar poblaciones celulares específicas, estructuras morfológicas y niveles de proliferación. Los cultivos de sección de tejido también se exponían a la radiación ionizante para determinar los efectos de la radiación en varios marcadores en este modelo 3-D. Se comparó la inducción de la muerte celular, la alteración del citoesqueleto, la pérdida de marcadores de diferenciación y la proliferación compensatoria en cultivos ex vivo irradiados a estudios previos de modelos in vivo. Esta metodología proporciona un medio para investigar el papel de las interacciones de células celulares tras el daño por radiación y proporciona un modelo experimental para evaluar eficientemente la eficacia de las intervenciones terapéuticas (manipulaciones genéticas o agentes farmacológicos ) que pueden ser menos adecuados para los modelos in vivo.
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Protocol
1. preparación del vibratomo
- Pulverizar los componentes desmontables del vibratomo incluyendo la bandeja tampón, el accesorio de la cuchilla, el molde del bloque de agarosa, y la película de laboratorio con el etanol 70%, entonces esterilizar UV por lo menos 30 minutos.
- Coloque y asegure una lámina adicional de película de laboratorio sobre la bandeja de amortiguación para evitar que caiga hielo.
- Llene la cámara de hielo con hielo triturado, extraiga la película de laboratorio de la bandeja de la zona de influencia y llene la bandeja de la zona de influencia con 100 mL de solución salina helada de 1x fosfato (PBS), complementada con 1% de penicilina-estreptomicina-ampicilina (PSA).
- Coloque una cuchilla de afeitar de acero inoxidable en el soporte de la cuchilla. Utilice el destornillador para apretar/aflojar y cambiar el ángulo de la cuchilla.
2. preparación de la muestra de tejido en bloque de agarosa y seccionador utilizando el vibratomo
- Esterilice todas las herramientas de disección y seccionamiento necesarias, incluyendo fórceps, tijeras y cepillos de pintura.
- Prepare una agarosa de punto de fusión 3% baja en 1 PBS estéril y microondas hasta que la agarosa se disuelve en solución. Asegúrese de que la solución no hierva y gire el frasco periódicamente para mezclar.
Nota: Evite que la agarosa de baja fusión se solidifica manteniéndola en un baño de agua tibia. El agarosa de baja fusión es fluido a 37 ° c y se fija a 25 ° c. Sin embargo, el baño de agua debe estar por debajo de 40 ° c con el fin de verter la agarosa alrededor del tejido a temperatura fisiológica. - Aísle las glándulas salivales y coloque el tejido diseccionado en 2 mL de helado 1x PBS complementado con 1% de PSA en un plato de cultivo estéril de 30 mm.
- Utilizando fórceps esterilizados en autoclave, retire las glándulas salivales de 1x PBS + 1% solución de PSA y colóque en la parte inferior de un molde de incrustación. Llene el molde con líquido de punto de fusión 3% baja para cubrir el tejido.
- Con el fórceps, ajuste el tejido a la mitad del bloque y coloque la glándula salival en el plano apropiado. Las mejores secciones transversales para las glándulas submandibulares y parótidas están en el plano vertical.
- Coloque el bloque de agarosa sobre el hielo durante 10 minutos para endurecer.
- Ejecute con cuidado una cuchilla de afeitar alrededor del borde exterior de la agarosa para aflojar y dejar que el bloque se deslice hacia fuera en la película de laboratorio esterilizada por UV del paso 1,1.
- Utilice una cuchilla de afeitar para cortar una caja de agarosa que contenga la glándula salival. Asegúrese de que el plano de la sección es recto y paralelo al lado opuesto del bloque (la superficie que se va a pegar). Dado que la agarosa no se infiltra en el tejido, no recortar demasiada agarosa alrededor del tejido por lo que el tejido será bien apoyado.
- Utilice superpegamento para sujetar el bloque a la superficie de corte.
- Sección a 50 μm o 90 μm de espesor por vibratomo a una velocidad de 0,075 mm/s y frecuencia de 100 Hz.
Nota: el ajuste del vibratomo con la frecuencia más alta y la menor velocidad de la cuchilla proporciona las rodajas más óptimas. - Recoja las secciones en un plato de cultivo de tejido de 24-Well que contenga ~ 1 mL de PBS helado por pozo usando un cepillo de pelo natural en autoclave, colocando el cepillo en etanol al 70% entre las colecciones de rebanadas para mantener la esterilidad.
3. las secciones de cultivo
- Autoclave una micro-espátula y fórceps.
- Hacer un medio de cultivo de vibratomo en stock con o sin suero bovino fetal (FBS): medios DMEM/F12 complementados con 1% de PSA, 5 μg/ml de transferrina, 1,1 μm de hidrocortisona, 0,1 μm de ácido retinoico, 5 μg/ml 50 de insulina, 80 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico, 5 mm L sulfato de gentamicina y 10 μL/mL de mezcla de oligoelementos. Agregue una cantidad adecuada de FBS para hacer 0%, 2,5%, 5,0%, o 10% soluciones.
- Antes de la sección, agregue 300 μL de medios precalentados y coloque un inserto de membrana de tamaño de poro de 12 mm de diámetro, 0,4 μm en cada pozo de una placa de cultivo de tejido de 24 potes. Los medios deben llegar a la parte inferior de la membrana para crear una interfaz de aire líquido para la cultura.
- Coloque suavemente las secciones salivales en la parte superior del inserto de membrana usando la micro espátula y la cultura a 37 ° c en la incubadora de atmósfera humidificada 5% CO2 y 95%.
- Añadir aproximadamente 300 μL de medio de cultivo primario en el pozo y unas pocas gotas en las inserciones de membrana (aproximadamente 40 μL) cada otro día o según sea necesario. El cultivo adecuado demostró que las células son capaces de sobrevivir y mantenerse por hasta 30 días ex vivo.
4. la irradiación de las secciones de la glándula salival
- Tratar las secciones con una sola dosis de radiación (5 GY) utilizando un irradiador cobalto-60 (o equivalente).
- Transporte de secciones a la instalación del Irradiador utilizando un recipiente de poliestireno cubierto para evitar fluctuaciones de temperatura. Además, se debe tener cuidado durante el transporte de vuelta a la incubadora de laboratorio para garantizar que los medios no salpican la tapa de la cultura e inducen a la contaminación.
- Colocar la placa de 24 pozo que contiene las secciones de la glándula salival 80 cm de la fuente de radiación, en el centro de un campo de radiación de 32 "x 32". Los cálculos de dosis de radiación y el tiempo correspondiente en el irradiador variarán según el instrumento y la descomposición del cobalto-60.
- Continuar supervisando y cultivando estas secciones como se describe en la sección 3.
5. tinción de viabilidad
- Aspire los medios viejos y lave las rodajas dos veces con PBS estéril pre-calentado.
- Manchas en las secciones con tinte azul tripan.
- Utilice una micro espátula para mover la rebanada de la cultura a un portaobjetos de vidrio.
- Añadir 0,4% de solución azul tripan a la rebanada de vibratomo con suficiente volumen para cubrir el tejido (10 – 20 μl).
- Incubar las rodajas a temperatura ambiente (RT) en el azul tripan durante 1 – 2 min para que el tinte penetre en el tejido. Las células no viables serán manchadas de azul, y las células viables serán sin mancha.
- Mancha las secciones con Calcein, AM tinte de células vivas.
- Añadir suficiente volumen de mancha para cubrir la sección en un pozo de una placa de 24 pozo (200 – 300 μL).
- Incubar las rodajas en RT durante 15 minutos para permitir la penetración del tinte.
- Retire con cuidado la sección del pozo y colóquelo en un portaobjetos de cristal. Monte las rodajas con 1 gota de soporte de montaje.
- Secciones de imagen en un microscopio fluorescente a longitudes de onda de excitación/emisión de 488 nm y 515 nm.
6. secciones de vibratomo de coloración de anticuerpos
Nota: el siguiente proporciona un protocolo de tinción de anticuerpos general específico para Ki-67; sin embargo, este protocolo se puede utilizar con cualquier anticuerpo. Todos los lavados se realizan en RT a menos que se indique lo contrario.
- En el plato de cultivo de tejido multi-pozo, aspirar los medios y lavar al menos 2x con 1x PBS estéril.
- Fije las secciones con 4% de paraformaldehído (PFA) durante la noche a 4 ° c.
- Aspirar 4% PFA y lavar 3x con PBT [1x PBS, 1% albúmina sérica bovina (BSA), 0,1% Tritón X-100].
Nota: las secciones se pueden almacenar en 1x PBS a 4 ° c y teñidas en un momento posterior. El tiempo máximo de almacenamiento probado en este manuscrito fue de 3 semanas. El tiempo de almacenamiento más largo tendrá que ser optimizado por el usuario individual si se desea. - Permeabilizar secciones utilizando 0,3% Triton X-100 en 1x PBS durante 30 min.
Nota: este paso se puede modificar y optimizar para la tinción y la permeabilización de anticuerpos específicos. - Solución de permeabilización de Pipet OFF.
- Lavar las rodajas 3x durante 5 min con 1x PBS, 1% BSA, y 0,1% Triton X-100 (PBT).
- Bloquee las rodajas con un agente bloqueante con un 1% de suero de cabra normal durante 1 h.
- Lavar las rodajas 3x durante 5 min con PBT.
- Incubar las rodajas durante la noche a 4 ° c con 500 μL de anticuerpo monoclonal de conejo anti-Ki67 diluido en 1% de BSA en 1x PBS.
Nota: para la tinción de Phalloidin, omita el paso 6,9 y proceda utilizando el protocolo para la Phalloidin específica utilizada. Para la antimanchas de ADN, salte al paso 6,15. - Aspirate anti-Ki67 conejo monoclonal anticuerpo.
- Lave las rodajas 6X durante 5 min en 1x PBS.
- Incubar las rodajas en 500 μL de anticuerpo secundario conjugada fluorescentemente compatible con el anticuerpo anti-Ki67 diluido en 1% BSA en 1x PBS en RT para 1,5 h cubierto de luz.
Nota: basado en el anticuerpo secundario utilizado, el tiempo de incubación con el anticuerpo secundario puede ser optimizado aún más por el usuario individual. Además, el anticuerpo secundario es sensible a la luz. Todos los lavados subsiguientes deben realizarse en la oscuridad. - Aspirar el anticuerpo secundario.
- Lave las rodajas durante 3x durante 5 min con 1x PBS.
- Lavar las rodajas durante 5 min en agua desionizada.
- Las rebanadas de avellanas con DAPI (1μg/mL) durante 20 min en RT.
- Lavar las rodajas (una vez) durante 5 min en agua desionizada.
- Monte las rodajas con una gota (~ 40 μL) de soportes de montaje. Para evitar el exceso de burbujas, Coloque lentamente la manta sobre el soporte de montaje en la diapositiva, comenzando con un ángulo de 45 °.
- Para evitar la trituración de las secciones gruesas con el recubrimiento, Monte cada rebanada con un espaciador. Se puede crear un espaciador colocando un borde de grasa de vacío en un cuadrado alrededor de la sección de tejido.
- Al colocar la manta, los bordes de la manta se pueden sellar con grasa de vacío. Presione hacia abajo en los bordes de la cubreobjetos con el pulgar para adherirse firmemente a la diapositiva. Alternativamente, selle el recubrimiento en la diapositiva del microscopio usando un esmalte de uñas transparente.
7. las secciones de vibratomo Imaging
- Imagen de las diapositivas manchadas dentro de 5 días de tinción.
- Obtener secciones ópticas de las rodajas de vibratomo manchadas con un microscopio confocal. Con un microscopio confocal, obtener una pila z en un tamaño de paso definido o tomar imágenes individuales dependiendo del diseño experimental del usuario. Las imágenes se pueden examinar en cualquier pantalla del ordenador después de la colección confocal.
Nota: debido al grosor de las rodajas de vibratomo, se recomienda utilizar un microscopio confocal o un endoscopio con capacidad z-Stack para visualizar los detalles dentro de las muestras. Para las imágenes utilizadas en este manuscrito, se utilizó un objetivo de aceite de 63X; sin embargo, esto puede ser adaptado y modificado por el usuario individual y el ámbito específico utilizado. Se utilizó la resolución de píxeles recomendada para cada objetivo y factor de zoom con el muestreo de Nyquist asumido de 2,5 píxeles en X e y para la estructura ópticamente resolvable más pequeña. Sin embargo, algunos comentaristas sugieren 2,3 píxeles, mientras que otros sugieren 2,8 píxeles. Por favor refiérase al manual de microscopía biológica confocal22 para más detalles sobre cómo hacer estos cálculos.
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Representative Results
Los cultivos primarios en 2-D se cultivan en el suero bovino fetal (FBS), mientras que la cultura salisfera primaria 3-D se cultiva típicamente en condiciones libres de suero10,11. Además, los dos estudios previos que utilizan cultivos de vibratomo de glándulas salivales cultivaron sus secciones en 0% o 10% de FBS suplementados con medios de comunicación19,20. Las rodajas submandibulares del ratón se seccionaron a un espesor de 50 μm utilizando un vibratomo y las condiciones óptimas de cultivo se determinaron utilizando una serie de concentraciones de FBS (0%, 2,5%, 5,0% y 10%). Para determinar las características de supervivencia, se tomaron imágenes de microscopio de campo brillante en los días de cultivo 1, 4, 7, 14 y 30 después de seccionar (figura 1). Además, las secciones de las glándulas se teñían con un 0,4% de tinte azul tripan y se fotografiaban con un microscopio de campo brillante a 40 veces en los puntos de tiempo indicados (figura 2A). Las células no viables estaban manchadas de azul y las células viables seguían claras.
Del mismo modo, para determinar las características de supervivencia de las rebanadas más gruesas seccionadas a 90 μm, se tomaron imágenes de microscopio de campo brillante con y sin tinción de azul tripan en el día 30 en cultivos complementados con 2,5% de FBS (figura 2B). Debido al espesor de la rebanada, las secciones de 90 μm manchadas con tinte azul tripan fueron imágenes enteras y luego cortadas por la mitad para evaluar el centro de la rebanada (figura 2B). Como confirmación, se utilizó un tinte de células vivas para evaluar la supervivencia celular en diferentes condiciones de cultivo de FBS (figura 2C). En las imágenes de campo brillante, se observaron altos niveles de células traslúcidas y sobrevivientes en tejidos seccionados tanto en 50 μm como en 90 μm. Curiosamente, las secciones se volvieron más oscuras y el área general del tejido se condensa con el tiempo en la cultura, sin embargo, una porción significativa de la sección parece sobrevivir al período de cultivo de 30 días (figura 1, figura 2). Esta condensación fue más evidente en las condiciones de cultivo de 0% y 10% de FBS. Se observaron células azules de tripan positivas en el perímetro de todas las secciones, independientemente de las condiciones de cultivo, y hubo un aumento en el área celular positiva de tripan azul en condiciones de cultivo de 0% de FBS en comparación con las condiciones de cultivo de FBS más altas (figura 2A , 2B).
Usando la mancha de la célula viva, las secciones cultivadas en 0% mostraron la menor cantidad de manchas, y la adición de FBS a los medios de cultivo mejoró la cantidad de células vivas. Tomados en conjunto, las secciones cultivadas en el 0% de FBS mostraron condensación de tejido visible, zonas con manchas azules elevadas de tripan y los niveles más bajos de tinción de células vivas. La adición de 2,5% de FBS a las culturas mejoró la cantidad de tejido translúcido, disminuyó el área azul de tripan positivo, y aumentó los niveles de tinción de células vivas. Aumentos adicionales en la concentración de FBS no parecen mejorar la capacidad de supervivencia del tejido; por lo tanto, el 2,5% de FBS en los medios vibratomo fue la concentración óptima de FBS y se utilizó como la condición de cultivo para todos los experimentos posteriores.
Para determinar la viabilidad de las rebanadas de tejido ex vivo submandibulares posteriores a la disección, los marcadores proliferativos y apopónticos se evaluaron en los días 1, 3, 7, 14 y 30 en cultivo. La actividad proliferativa fue evaluada por el inmunostinamiento de Ki67 en un subconjunto de sectores de cultivo (figura 3a). Se observaron células positivas de Ki67 en todos los puntos de tiempo evaluados y continuaron presentes en el día 30 en la cultura, con mínimas diferencias entre los puntos de tiempo. Del mismo modo, el grado de apoptosis fue evaluado por inmunostado de caspasa-3 con hendición en un subconjunto separado de secciones (figura 3B). Se observó un bajo nivel de células positivas de caspasa-3 en todos los momentos hasta el día 14 en la cultura, mientras que las condiciones del día 30 parecían tener un pequeño aumento en el número de células positivas de caspasa-3 con hendiradas en algunas áreas. La evaluación de los bordes de los tejidos no reveló niveles más elevados de caspasa-3 con hendición, que no recapitulan la mancha azul de tripan (figura 2). En general, estos resultados sugieren que las señales de proliferación y viabilidad permanecieron presentes en las culturas vibratomo durante el período de evaluación de 30 días.
Los cultivos de vibratomo de sección gruesa permiten la oportunidad de evaluar las interacciones entre los componentes celulares de un tejido particular a una profundidad que incluye más de un espesor de célula epitelial en cada dirección. Además, es importante ser capaz de cultivo de ambas glándulas salivales principales, ya que difieren en la composición de las proteínas salivales producidas, arquitectura histológica, radiosensibilidad, y otras características críticas. Para determinar diferentes poblaciones celulares en cultivos de glándulas submandibulares, las secciones submandibulares fueron manchadas con E-cadherin (E-CAD) para detectar células epiteliales, actina muscular lisa (SMA) para detectar células mioepiteliales, y filamentos de actina (Phalloidin) para detectar estructuras citoesqueléticas durante los 30 días de cultivo (figura 4a).
La tinción E-cadherina se observó en las membranas de la mayoría de las células y se detectó a lo largo del período de cultivo de 30 días. Células SMA + se detectaron a lo largo del período de cultivo, con niveles similares en cada punto de tiempo. La organización del citoesqueleto de los filamentos de actina también pareció mantenerse en cada momento evaluado. En contraste, había marcadores celulares que no se mantuvieron sistemáticamente durante todo el período de evaluación y que incluían CD31 (vasculatura), TUBB3 (neuronas) y Aquaporin-5 (AQP-5, marcador acinares) (Figura 4B). Las estructuras vasculares a través de las acumulaciones confocales se observaron claramente en los días 1 y 3 post-cultivo; sin embargo, estas estructuras parecían fragmentadas en el día 7. Del mismo modo, los procesos neuronales estuvieron intactos durante el primer día de la cultura, aparecieron disminuidos en el día 3, y posteriormente se perdieron en el día 7 en la cultura. Aqp5 + células se observaron en los días 1, 3, 7, y 14 en la cultura; Aunque, en el día 14, el nivel de tinción general pareció reducirse, con un parecido más granular en las células positivas restantes. Estos datos sugieren que los cultivos submandibulares contienen la diversidad de los componentes del tejido con el mantenimiento de los tipos de células vasculares y neuronales para períodos de cultivo más cortos, y los tipos de células epiteliales y mioepitelio para períodos de cultivo más largos.
Mientras que las culturas seccionadas por vibratome se han reportado previamente para la glándula parótida salival, las culturas se mantuvieron durante 48 h, limitando el período de tiempo durante el cual se pudieron estudiar. Con el fin de determinar si las glándulas parótidas se pueden mantener durante más tiempo, las glándulas parótidas murinas fueron seccionadas y cultivadas durante 1, 3, 7 o 14 días. Se obtuvieron menos secciones de la glándula parótida debido a su menor tamaño en ratones; por lo tanto, no se intentó un período de cultivo de 30 días. Las rebanadas fueron evaluadas para la proliferación por tinción inmunofluorescente usando anticuerpos contra Ki67. Al igual que los cultivos submandibulares, se observaron células positivas de Ki67 en todos los puntos de tiempo, lo que indica que las células están manteniendo un grado de proliferación en la cultura (figura 5A).
Además, se evaluó el mantenimiento de marcadores acinares funcionales (α-amilasa y Aqp5), un marcador epitelial (E-CAD), y las poblaciones vasculares (CD31) y neuronales (TUBB3). La amilasa es una de las proteínas más abundantes producidas por células epiteliales parótidas diferenciadas y frecuentemente perdida durante el cultivo en 2-D de células parótidas primarias. En las culturas vibratomo, la amilasa se observó en las células acinares y se excluyó de las células ductales durante el período de cultivo de 14 días (figura 5b). Al igual que en los cultivos submandibulares, las células Aqp5 + estaban presentes en las culturas parótidas en cada momento, con el día 14 cultivos que mostraban niveles reducidos en comparación con los puntos de tiempo anteriores (figura 5C). Los niveles de E-cadherin también se mantuvieron en las membranas de la mayoría de las células durante el período de cultivo de 14 días (Figura 5D). Las estructuras neuronales parecían mantenerse durante el período de cultivo de 7 días y no se evaluaron en puntos de tiempo posteriores (figura 5e). En contraste, las estructuras vasculares aparecieron intactas durante el primer día en la cultura, y sólo las estructuras más pequeñas estuvieron presentes en los días 3 y 7 en la cultura (figura 5F). Estos datos sugieren que las culturas parótidas mantienen sus capacidades proliferativas y la mayoría de las capacidades funcionales durante 7-14 días en la cultura y potencialmente exhiben una estructura de tejido más intacta para un marco de tiempo más largo.
La utilidad funcional del modelo de cultivo de vibratomo se abordó mediante el tratamiento de cultivos parótidas o submandibulares con una sola dosis de radiación (figura 6, figura 7, figura 8). El trabajo previo en modelos de ratones irradiados se ha centrado en la glándula parótida y demostró la inducción de la apoptosis que alcanza los picos a las 24 h, la inducción de la proliferación compensatoria a partir del día 5, la interrupción de los filamentos de actina a partir del día 5, y la pérdida de marcadores de diferenciación (p. ej., amilasa) en el día 1423,24,26. La irradiación de cultivos de vibratomo parótida condujo a aumentos en la apoptosis en el día 1, aumentos en la proliferación en el día 7, alteración de los filamentos de actina en el día 7, y reducciones en la amilasa en el día 7 (figura 6). La irradiación de cultivos de vibratomo submandibular condujo a aumentos en la apoptosis en los días 1 y 3, aumentos en la proliferación en el día 7, y la alteración de los filamentos de actina en el día 7 (figura 7). Los niveles de E-cadherin parecían relativamente intactos en las culturas parótidas y submandibulares, que eran similares a las observaciones in vivo26. Los marcadores funcionales de células acinares AQP-5 en las secciones de la glándula submandibular y la amilasa en las secciones de la glándula parótida disminuyeron en el día 14, en comparación con los puntos de tiempo no tratados correspondientes (figura 8). Estos datos sugieren que los cambios en los tejidos inducidos por radiación observados in vivo también se observaron en cultivos de vibratomo irradiados.
Figura 1: Imágenes de microscopio de campo brillante de 50 μm submandibular secciones. Las glándulas submandibulares de ratones FVB femeninos (4-8 semanas de edad) fueron diseccionadas, seccionadas a 50 μm de espesor, y cultivadas en insertos de cultivo celular organotíticos para 1, 4, 7, 14 y 30 días después de disección en 0%, 2,5%, 5,0%, y 10% suero bovino fetal (FBS) en medios para determinar las características de cultivo y optimizar las condiciones de cultivo. Barras de escala = 200 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: tinción de viabilidad de submandibular secciones. (A) imágenes de microscopio de campo brillante de 50 μm submandibulares diseccionadas de ratones FBV hembra de 4 a 8 semanas de edad y manchadas con azul tripan (0,4%) en 1, 3, 7, 14 y 30 días en cultivo con medios que contengan un 2,5% de suero bovino fetal (FBS). (B) imágenes de microscopio de campo brillante de secciones submandibulares de 90 μm (panel izquierdo), manchadas con azul tripan (panel central), cortadas por la mitad y manchadas con azul tripan (panel derecho), luego cultivadas a 30 días después de la disección en medios que contengan 2,5% FBS. (C) imágenes fluorescentes de secciones submandibulares de 50 μm cultivadas en diversas concentraciones de FBS (0%, 2,5%, 5%, 10%) teñida con calceína AM para indicar células vivas (verdes) en el día de cultivo 7. Barras de escala = 200 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Evaluación de marcadores proliferativos y apopónticos en submandibular rodajas de tejido organotíticos. Las glándulas submandibulares de ratones FVB femeninos (4-8 semanas de edad) fueron diseccionados, cortados a 50 μm de espesor, y cultivados en medios de comunicación complementados con 2,5% de FBS en insertos de cultivo celular organotíticos para 1, 3, 7, 14 y 30 días después de la disección. En los puntos de tiempo indicados, los cortes fueron fijos y manchados para los marcadores proliferativos (Ki67) y apopónticos (caspase de hendición-3). (A) tinción inmunofluorescente de células Ki67-positivas (verde) y del núcleo (azul). (B) tinción inmunofluorescente de caspasa-3-células postive (rojo) y el núcleo (azul) de dos puntos de vista de una rebanada. El panel de la fila superior muestra las celdas de la caspasa-3-positivo con hendiradas en el borde de una rebanada, y el panel de la fila inferior muestra las celdas de caspase-3-positivas de la mitad de un trozo. Se seleccionaron imágenes confocales representativas de varias pilas z por punto de tiempo. Barras de escala = 30 μm. por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Presencia de estructuras celulares en el submandibular las rodajas de tejido organotíticos . Las glándulas submandibulares de ratones FVB femeninos (4-8 semanas de edad) fueron diseccionados, cortados a 50 μm de espesor, y cultivados en medios de comunicación complementados con 2,5% de FBS en insertos de cultivo celular organotíticos para 1, 3, 7, 14, o 30 días después de la disección. En los puntos de tiempo indicados, los trozos fueron fijados y manchados para sus correspondientes marcadores con el núcleo (azul). (A) las secciones submandibulares se evaluaron en los días 1, 7, 14 y 30 después de la disección para los niveles de E-cadherin, actina del músculo liso (SMA) y F-actina (Phalloidin). (B) las secciones submandibulares se evaluaron en los días 1, 3 y 7 para los niveles de CD31 (vasculatura) y TUBB3 (neuronas). El Aquaporin-5 (Aqp5) se evaluó en los días 1, 3, 7 y 14. Se seleccionaron imágenes confocales representativas de varias pilas z por punto de tiempo. Barras de escala = 30 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Evaluación de marcadores proliferativos y funcionales en rodajas de tejido organotífico par. Las glándulas parótidas de ratones FVB femeninos (4-8 semanas de edad) fueron diseccionadas, cortadas a 50 μm de espesor, y cultivadas en medios suplementados con 2,5% de FBS en insertos de cultivo celular organotíticos para 1, 3, 7, o 14 días después de la disección. En los puntos de tiempo indicados, los trozos fueron fijados y manchados para sus correspondientes marcadores con el núcleo (azul). (A) tinción inmunofluorescente de células Ki67-positivas (verde). (B) tinción inmunofluorescente de células positivas de amilasa (rojo). (C) manchas inmunofluorescentes de Aquaporin-5 (Aqp5)-células positivas (verde). (D) tinción inmunofluorescente de células positivas de E-cadherin (rojo). (E) manchas inmunofluorescentes de las neuronas indicadas por TUBB3 (Magneta) células positivas. (F) tinción inmunofluorescente de la vasculatura indicada por células CD31 (rojas) positivas. Se seleccionaron imágenes confocales representativas de varias pilas z por punto de tiempo. Barras de escala = 30 μm; d = células ductales. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: cambios celulares tras la irradiación de las rebanadas de tejido organotípico parótida. Las glándulas parótidas de ratones FVB femeninos (4-8 semanas de edad) fueron diseccionadas, cortadas a 50 μm de espesor, y cultivadas en complementado con 2,5% de FBS en insertos de cultivo celular organotíticos. En el día 1 después de la disección, un subconjunto de rodajas se expuso a la radiación de 5 GY y se mantuvo durante 2, 4 u 8 días después de la disección (corresponde a los días 1, 3 y 7 después de la radiación). Tinción inmunofluorescente de las secciones parótidas no tratadas e irradiadas para determinar los niveles de (a) Ki67 (verde)-células positivas, (B) caspasa de hendidura 3 (rojo)-células positivas, (C) Phalloidin (cian)-células positivas, (D) células positivas de amilasa (rojo) y (e) e-cadherin (rojo). Todas las manchas nucleares utilizadas DAPI (azul). Se seleccionaron imágenes confocales representativas de múltiples z-Stack por punto de tiempo. Barras de escala = 30 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: cambios celulares tras la irradiación de las rebanadas de tejido organotípico submandibular. Las glándulas submandibulares de ratones FVB femeninos (4-8 semanas de edad) fueron diseccionados, cortados a 50 μm de espesor, y cultivados en medios de comunicación complementados con 2,5% de FBS en insertos de cultivo celular organotíticos. En el día 1 después de la disección, se irradió un subconjunto de rebanadas con 5Gy y se mantuvo durante 2, 4 u 8 días después de la disección (corresponde a los días 1, 3 y 7 después de la radiación). Tinción inmunofluorescente de las secciones submandibulares no tratadas e irradiadas para determinar los niveles de (a) Ki67 (verde)-células positivas, (B) caspasa de hendidura 3 (rojo)-células positivas, (C) Phalloidin (cian)-células positivas, (D) Acuaporina 5 (Aqp5) (verde)-células positivas, y (e) e-cadherin (rojo) células positivas. Todas las manchas nucleares utilizadas DAPI (azul). Se seleccionaron imágenes confocales representativas de múltiples z-Stack por punto de tiempo. Barras de escala = 30 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: marcadores acinares funcionales en rebanadas de tejido de parótida irradiada y submandibular. Las glándulas submandibulares y parótidas de ratones FVB femeninos (4-8 semanas de edad) fueron diseccionadas, cortadas a 50 μm de espesor, y cultivadas en medios suplementados con 2,5% de FBS en insertos de cultivo celular organotíticos. En el día 1 después de la disección, se irradió un subconjunto de rebanadas con 5Gy y se mantuvo durante 14 días después de la irradiación. Se utilizaron manchas inmunofluorescentes de las secciones no tratadas (UT) e irradiadas (IR) para determinar los niveles de (a) Aquaporin-5 (Aqp5) (verde)-células positivas y (B) amilasa (rojo)-positivo) células. Todas las manchas nucleares utilizadas DAPI (azul). Se seleccionaron imágenes confocales representativas de múltiples z-Stack por punto de tiempo. Barras de escala = 30 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La investigación de glándulas salivales ha utilizado una serie de modelos de cultivo, incluyendo culturas 2-D inmortalizadas, cultivos primarios 2-D, cultivos salisales 3-D, y cultivos de órganos 3-D de explantas embrionarias para determinar preguntas sobre la biología subyacente y la fisiología. Estos modelos de cultura han arrojado información perspicaz a través de una diversa variedad de preguntas de investigación y seguirán siendo herramientas importantes en la investigación salival. Las limitaciones de estos modelos de cultivo incluyen la modulación de la actividad de p53 durante la inmortalización, la viabilidad transitoria de las culturas primarias, la pérdida de diferenciación y las proteínas secretarias en la cultura, y la incapacidad para evaluar células celulares, células-ECM y polaridad interacciones en los tejidos adultos. El primer método de cultivo de rebanada organotísica en 3-D (cultivos seccionados con vibratome) para glándulas salivales se publicó en 200818; sin embargo, esta técnica se ha infrautilizado en gran medida en este campo a pesar del uso frecuente en otros campos. El trabajo cultivado secciones parótidas para 48 h, que limita la capacidad de estudiar estas secciones para efectos crónicos después de tratamiento de radiación o utilizar transfectar o protocolos de transducción para los fenotipos después de la manipulación de genes específicos. El método descrito aquí se ha optimizado para permitir más tiempo en la cultura, producir imágenes de alta resolución a través de la microscopía confocal, proporcionar un método para estudiar la dinámica intra e intercelular en una sección 3-D, y evaluar los cambios inducidos por la radiación durante un período de cultivo de al menos 14 días.
Mientras que cada paso es necesario para la implementación de la técnica, algunos pasos son cruciales para el mantenimiento exitoso de la seccionamiento y la cultura. Estos incluyen cortar las rodajas de la glándula salival, mantener las rodajas en la cultura, y la tinción y la toma de imágenes de las rodajas con microscopía confocal. El protocolo presentado plantea algunos desafíos que requieren paciencia y práctica para obtener sectores óptimos para el análisis. Las siguientes sugerencias ayudarán a llevar a cabo este protocolo con éxito. Es imperativo aislar completamente la glándula salival del tejido conectivo circundante después de la disección. El tejido conectivo residual hace que la hoja del vibratomo arrastre la glándula hacia afuera del bloque de agarosa y requiere que el tejido se vuelva a incrustar en agarosa. Esto puede ser una limitación importante ya que la re-incrustación múltiple puede aumentar las posibilidades de contaminación y disminuir la viabilidad de las rebanadas. Esto es especialmente crucial para cultivar glándulas parótidas, ya que las glándulas parótidas son más lobulares en su estructura y por lo tanto más propensas a tener tejido extraño.
La adición de 1% de penicilina-estreptomicina-anfotericina B (PSA) a todos los líquidos incluyendo la bandeja tampón, el plato de recolección de rebanadas, y los medios de vibratomo minimizan la contaminación de las rodajas después de la disección. La variación de la concentración de agarosa se utilizó para optimizar el corte exitoso. Debido a la densidad de las glándulas salivales, el 1,9% de agarosa era demasiado blando, y las glándulas se desalojados fácilmente del bloque. Los seccionadores de vibratome en otros campos han utilizado 5,0% de agarosa; sin embargo, esto causó cortes irregulares y rebanadas fueron subóptimas. Después de probar varias condiciones de porcentaje de agarosa, 3% agarosa fue el más óptimo para apoyar el peso y la firmeza del tejido. En particular, la concentración de agarosa utilizada en Warner et al. y su et al. fue también 3%19,20.
Además, el ángulo, la frecuencia de vibración y la velocidad de avance de la cuchilla se pueden modificar en función del tejido que se seccionará. Para las glándulas salivales submandibulares y parótidas, un ángulo de 15 °, una velocidad de 0,075 mm/s y una frecuencia de 100 Hz fueron apropiados para seccionar. Debido a la suavidad de las glándulas salivales, las condiciones óptimas de corte requerían que la cuchilla avanzaría lentamente a través del tejido a una alta vibración. Para la tinción inmunofluorescente, la permeabilización, la duración de las incubaciones y los pasos de lavado son esenciales para las manchas óptimas. Si la tinción positiva solo aparece en las capas externas de la rebanada de tejido, puede ser necesaria una permeabilización más estricta con proteinasa K, mientras que las manchas irregulares o las manchas de fondo altas pueden requerir una coloración menos estricta con 0,2% de Tritón X-100. Los tiempos de incubación fueron optimizados para alta señal y bajo fondo, que pueden necesitar ser adaptados a anticuerpos primarios específicos. Los pasos de lavado más largos son esenciales para reducir el fondo alto y esto se puede adaptar a los anticuerpos específicos utilizados.
Una de las principales aplicaciones de esta metodología es el análisis cinético extendido tras la exposición a la radiación de glándulas salivales. El trabajo previo ha establecido tanto los cambios de fase aguda y crónica en las glándulas salivales irradiadas6,24,25,26, y el sistema de cultivo de vibratomo puede ser una herramienta poderosa para diseccionar el crítico eventos moleculares en momentos específicos después del tratamiento. Por ejemplo, los cambios celulares inducidos por radiación en la glándula salival que se han reportado en la literatura, incluyendo reducciones en la amilasa, apoptosis de las células acinares, proliferación compensatoria de células acinares, pérdida de polaridad y alteraciones en estructura citoesquelética. En particular, las culturas vibratomo irradiado ex vivo exhiben alteraciones similares en estos marcadores.
Además, la respuesta de fase aguda en las glándulas salivales pivota alrededor de la actividad de p53; sin embargo, no está claro qué papel desempeña p53 en los momentos posteriores debido a la viabilidad de ~ 5 días de las culturas primarias. Este sistema permitiría una alteración ex vivo y controlada de la actividad de p53 en momentos posteriores y descubriría un papel en el daño crónico o las respuestas regenerativas. Además, la respuesta compensatoria de la proliferación se inicia 5 días después del tratamiento con radiación, y es difícil delinearlos reguladores moleculares de esta respuesta en cultivos primarios transitorios. La aplicación más ampliamente utilizada de esta metodología probablemente implicará interacciones célula-célula, célula-ECM, y polaridad en los tejidos adultos. Se han realizado estudios impactantes en cultivos de órganos 3-D de glándulas embrionarias para descubrir la intrincada interacción entre el desarrollo de glándulas salivales y la red neuronal o vascular27,28,29, 30,31.
El método descrito aquí indica que se necesita una mayor optimización para el trabajo neuronal o vascular en los cultivos submandibulares y posiblemente en las culturas parótidas. El daño por radiación también altera los reguladores junccionales, induce la deposición de colágeno, altera la organización de F-actin y modula los gránulos secretores26,30,32. Los estudios de regeneración de glándulas salivales son discapacitados por la ausencia de un modelo adulto para evaluar estas interacciones. Este método de cultivo organotífico puede proporcionar un sistema para aplicar técnicas moleculares avanzadas y seguir estudiando la regulación de estos mediadores en un contexto 3D y descubrir de manera eficiente nuevas terapias.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado en parte por la financiación piloto proporcionada por la oficina de investigación y descubrimiento de la Universidad de Arizona y los institutos nacionales de salud (r01 DE023534) a Kirsten Limesand. La beca de capacitación en Biología del cáncer, T32CA009213, proporcionó apoyo de estipendio a Wen Yu Wong. A los autores les gustaría agradecer a M. Rice su valiosa contribución técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystems | N/A | Vibratome for sectioning |
| Double Edge Stainless Steel Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | Low-melt |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P6543 | |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B | Lonza | 17-745H | PSA |
| 24-well plate | CellTreat | 229124 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | |
| Loctite UltraGel Control Superglue | Loctite | N/A | Purchased at hardware store |
| Natural Red Sable Round Paintbrush | Princeton Art & Brush Co | 7400R-2 | |
| Gentamicin Sulfate | Fisher Scientific | ICN1676045 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T-8158-100mg | |
| L-glutatmine | Gibco | 25030-081 | |
| Trace Elements | MP Biomedicals | ICN1676549 | |
| Insulin | Fisher Scientific | 12585014 | |
| Epidermal Growth Factor | Corning | 354001 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| Retinoic acid | Fisher Scientific | R2625-50MG | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3160602 | |
| DMEM/F12 Media | Corning | 150-90-CV | |
| Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma | PICM01250 | 12 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate |
| 0.4% Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo-Fisher | R37601 | Only used LIVE dye component |
| Anti-Ki-67 Antibody | Cell Signaling Technology | 9129S | |
| Anti-E-cadherin Antibody | Cell Signaling Technology | 3195S | |
| Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody | Cell Signaling Technology | 9661L | |
| Anti-SMA Antibody | Sigma-Aldrich | C6198 | |
| Anti-amylase Antibody | Sigma-Aldrich | A8273 | |
| Anti-CD31 Antibody | Abcam | ab28364 | |
| Anti-TUBB3 Antibody | Cell Signaling Technology | 5568S | |
| Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Thermo-Fisher | A20185 | |
| Alexa Fluor 594 Phalloidin | Thermo-Fisher | A12381 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 21568-2500 | |
| Paraformaldehyde Prills | Fisher Scientific | 5027632 | |
| New England Nuclear Blocking Agent | Perkin Elmer | 2346249 | No longer sold |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083S | |
| Prolong Gold Antifade Mounting Media | Invitrogen | P36934 | |
| Leica SPSII Spectral Confocal | Leica Biosystems | N/A | For confocal imaging |
| Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope | Leica Biosystems | N/A | |
| Cobalt-60 Teletherapy Instrument | Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80 | N/A | |
| Amac Box, Clear | The Container Store | 60140 | Agarose block mold |
References
- Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: a literature review. Cancer. 107 (11), 2525-2534 (2006).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Hancock, P. J., Epstein, J. B., Sadler, G. R. Oral and dental management related to radiation therapy for head and neck cancer. Journal of the Canadian Dental Association. 69 (9), 585-590 (2003).
- Nguyen, N. P., et al. Quality of life following chemoradiation and postoperative radiation for locally advanced head and neck cancer. Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 69 (5), 271-276 (2007).
- Gorenc, M., Kozjek, N. R., Strojan, P. Malnutrition and cachexia in patients with head and neck cancer treated with (chemo)radiotherapy. Reports of Practical Oncology and Radiotherapy. Journal of Greatpoland Cancer Center in Poznań and Polish Society of Radiation Oncology. 20 (4), 249-258 (2015).
- Grundmann, O., Mitchell, G. C., Limesand, K. H. Sensitivity of salivary glands to radiation: from animal models to therapies. Journal of Dental Research. 88 (10), 894-903 (2009).
- Konings, A. W., Coppes, R. P., Vissink, A. On the mechanism of salivary gland radiosensitivity. International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 62 (4), 1187-1194 (2005).
- Chan, Y. -H., Huang, T. -W., Young, T. -H., Lou, P. -J. Human salivary gland acinar cells spontaneously form three-dimensional structures and change the protein expression patterns. Journal of Cellular Physiology. 226 (11), 3076-3085 (2011).
- Nguyen, V. T., Dawson, P., Zhang, Q., Harris, Z., Limesand, K. H. Administration of growth factors promotes salisphere formation from irradiated parotid salivary glands. PLoS ONE. 13 (3), e0193942 (2018).
- Limesand, K. H., et al. Characterization of Rat Parotid and Submandibular Acinar Cell Apoptosis In Primary Culture. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 39 (3), 170 (2003).
- Wei, L., Xiong, H., Li, W., Li, B., Cheng, Y. Upregulation of IL-6 expression in human salivary gland cell line by IL-17 via activation of p38 MAPK, ERK, PI3K/Akt, and NF-κB pathways. Journal of Oral Pathology & Medicine. 47 (9), 847-855 (2018).
- Chuong, C., Katz, J., Pauley, K. M., Bulosan, M., Cha, S. RAGE expression and NF-κB activation attenuated by extracellular domain of RAGE in human salivary gland cell line. Journal of Cellular Physiology. 221 (2), 430-434 (2009).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Bhadriraju, K., Chen, C. S. Engineering cellular microenvironments to improve cell-based drug testing. Drug Discovery Today. 7 (11), 612-620 (2002).
- Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
- Avila, J. L., Grundmann, O., Burd, R., Limesand, K. H. Radiation-induced salivary gland dysfunction results from p53-dependent apoptosis. International Journal of Radiation Oncology, Biololgy, Physics. 73 (2), 523-529 (2009).
- Mitchell, G. C., et al. IGF1 activates cell cycle arrest following irradiation by reducing binding. of DeltaNp63 to the p21 promoter. Cell Death & Disease. 1, (2010).
- Lombaert, I. M. A., et al. Rescue of Salivary Gland Function after Stem Cell Transplantation in Irradiated Glands. PLoS ONE. 3 (4), (2008).
- Warner, J. D., et al. Visualizing form and function in organotypic slices of the adult mouse parotid gland. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 295 (3), G629-G640 (2008).
- Su, X., et al. Three-dimensional organotypic culture of human salivary glands: the slice culture model. Oral Diseases. 22 (7), 639-648 (2016).
- Mattei, G., Cristiani, I., Magliaro, C., Ahluwalia, A. Profile analysis of hepatic porcine and murine brain tissue slices obtained with a vibratome. PeerJ - The Journal of Life and Environmental Sciences. 3, 932 (2015).
- Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. , 3rd ed, Springer U.S. Boston, MA. (2006).
- Limesand, K. H., et al. Insulin-Like Growth Factor-1 Preserves Salivary Gland Function After Fractionated Radiation. International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 78 (2), 579-586 (2010).
- Grundmann, O., Fillinger, J. L., Victory, K. R., Burd, R., Limesand, K. H. Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration. BMC Cancer. 10, 417 (2010).
- Chibly, A. M., et al. aPKCzeta-dependent Repression of Yap is Necessary for Functional Restoration of Irradiated Salivary Glands with IGF-1. Scientific Reports. 8 (1), 6347 (2018).
- Wong, W. Y., Pier, M., Limesand, K. H. Persistent disruption of lateral junctional complexes and actin cytoskeleton in parotid salivary glands following radiation treatment. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 315 (4), R656-R667 (2018).
- Emmerson, E., et al. SOX2 regulates acinar cell development in the salivary gland. eLife. 6, (2017).
- Nedvetsky, P. I., et al. Parasympathetic innervation regulates tubulogenesis in the developing salivary gland. Developmental Cell. 30 (4), 449-462 (2014).
- Kwon, H. R., Nelson, D. A., DeSantis, K. A., Morrissey, J. M., Larsen, M. Endothelial cell regulation of salivary gland epithelial patterning. Development. 144 (2), 211-220 (2017).
- Mellas, R. E., Leigh, N. J., Nelson, J. W., McCall, A. D., Baker, O. J. Zonula occludens-1, occludin and E-cadherin expression and organization in salivary glands with Sjogren's syndrome. Jounral of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (1), 45-56 (2015).
- Daley, W. P., et al. Btbd7 is essential for region-specific epithelial cell dynamics and branching morphogenesis in vivo. Development. 144 (12), 2200-2211 (2017).
- Nam, K., et al. Post-Irradiated Human Submandibular Glands Display High Collagen Deposition, Disorganized Cell Junctions, and an Increased Number of Adipocytes. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (6), 343-352 (2016).
