Summary

Spettroscopia di assorbanza atomica per misurare le piscine di zinco intracellulare nelle cellule di mammifero

Published: May 16, 2019
doi:

Summary

Le linee cellulari primarie o consolidate sono comunemente utilizzate per affrontare questioni biologiche e meccanicistiche fondamentali come approccio iniziale prima di utilizzare modelli animali. Questo protocollo descrive come preparare estratti di cellule intere e frazioni subcellulari per studi di zinco (Zn) e altri oligoelementi con spettroscopia di assorbanza atomica.

Abstract

I metalli di transizione sono micronutrienti essenziali per gli organismi, ma possono essere tossici per le cellule ad alte concentrazioni competendo con i metalli fisiologici nelle proteine e generando stress redox. Le condizioni patologiche che portano alla deplezione o all’accumulo di metalli sono agenti causali di diverse malattie umane. Alcuni esempi includono l’anemia, l’enteropatica dell’acrodermatite e le malattie di Wilson e Menkes. È quindi importante essere in grado di misurare i livelli e il trasporto dei metalli di transizione in campioni biologici con elevata sensibilità e accuratezza al fine di facilitare la ricerca esplorando come questi elementi contribuiscano alle normali funzioni fisiologiche e Tossicità. Lo zinco (Zn), ad esempio, è un cofattore in molte proteine dei mammiferi, partecipa a eventi di segnalazione ed è un messaggero secondario nelle cellule. In eccesso, Zn è tossico e può inibire l’assorbimento di altri metalli, mentre in deficit, può portare a una varietà di condizioni potenzialmente letali.

La spettroscopia di assorbimento atomico del forno di grafite (GF-AAS) fornisce un metodo altamente sensibile ed efficace per determinare Zn e altre concentrazioni di metalli di transizione in diversi campioni biologici. L’atomizzazione elettrotermica tramite GF-AAS quantifica i metalli atomizzando piccoli volumi di campioni per la successiva analisi selettiva dell’assorbimento utilizzando la lunghezza d’onda dell’eccitazione dell’elemento di interesse. Entro i limiti della linearità della legge della birra-Lambert, l’assorbanza della luce da parte del metallo è direttamente proporzionale alla concentrazione dell’analita. Rispetto ad altri metodi per determinare il contenuto di Zn, GF-AAS rileva sia Zn libero e complessato in proteine e possibilmente in piccole molecole intracellulari con alta sensibilità in piccoli volumi di campione. Inoltre, GF-AAS è anche più facilmente accessibile rispetto alla spettrometria di massa plasmatica induttivamente accoppiata (ICP-MS) o alla fluorescenza a raggi X basata su sincrotrone. In questo metodo, viene descritta la preparazione sistematica del campione di diverse linee cellulari coltivate per le analisi in un GF-AAS. Le variazioni di questo oligoelemento sono state confrontate sia nei lisati a cellule intere che nelle frazioni subcellulari di cellule proliferanti e differenziate come prova di principio.

Introduction

La transizione e i metalli pesanti, come Zn, cu, MN e Fe, si trovano naturalmente nell’ambiente in entrambi i nutrienti negli alimenti e negli inquinanti. Tutti gli organismi viventi richiedono quantità diverse di questi micronutrienti; Tuttavia, l’esposizione a livelli elevati è deleteriosa per gli organismi. L’acquisizione di metalli è principalmente attraverso la dieta, ma i metalli possono anche essere inalati o assorbiti attraverso la pelle1,2,3,4,5. È importante notare che la presenza di metalli nelle particelle atmosferiche è in aumento ed è stata in gran parte associata a rischi per la salute. A causa di attività antropogeniche, sono stati rilevati aumenti dei livelli di metalli pesanti come AG, As, CD, CR, Hg, NI, Fe e PB in particolato atmosferico, acqua piovana e suolo6,7. Questi metalli hanno il potenziale per competere con oligoelementi fisiologici essenziali, in particolare Zn e Fe, e inducono effetti tossici inattivando gli enzimi fondamentali per i processi biologici.

L’oligoelemento Zn è redox neutro e si comporta come un acido di Lewis nelle reazioni biologiche, il che lo rende un cofattore fondamentale necessario per la piegatura delle proteine e l’attività catalitica in oltre il 10% delle proteine dei mammiferi8,9, 10; il di conseguenza, è essenziale per diverse funzioni fisiologiche8,11. Tuttavia, come molti oligoelementi, c’è un delicato equilibrio tra questi metalli facilitando la normale funzione fisiologica e causando tossicità. Nei mammiferi, carenze di Zn portano a anemia, ritardo della crescita, ipogonadismo, anomalie della pelle, diarrea, alopecia, disturbi del gusto, infiammazione cronica, e le funzioni immunitarie e neurologiche compromessa11,12, 13,14,15,16,17,18. In eccesso, lo Zn è citotossico e altera l’assorbimento di altri metalli essenziali come il rame19,20,21.

Inoltre, alcuni metalli come Cu e Fe hanno il potenziale per partecipare a reazioni dannose. La produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) tramite la chimica Fenton può interferire con l’assemblaggio delle proteine del cluster di zolfo di ferro e alterare il metabolismo lipidico22,23,24. Per evitare questo danno, le cellule utilizzano chaperoni e trasportatori di legame metallico per prevenire gli effetti tossici. Indubbiamente, l’omeostasi metallica deve essere strettamente controllata per garantire che determinati tipi di cellule mantengano i livelli appropriati di metalli. Per questo motivo, vi è una significativa necessità di avanzare tecniche per la misurazione accurata dei metalli in tracce in campioni biologici. Negli organismi in via di sviluppo e maturi esiste una necessità biologica differenziale per oligoelementi a livello cellulare, in diverse fasi evolutive, e in condizioni normali e patologiche. Pertanto, la determinazione precisa dei livelli di tessuto e di metallo sistemico è necessaria per comprendere l’omeostasi metallica dell’organismo.

La spettrometria di assorbimento atomico del forno di grafite (GF-AAS) è una tecnica altamente sensibile utilizzata per piccoli volumi di campioni, rendendola ideale per misurare la transizione e i metalli pesanti presenti nei campioni biologici e ambientali25,26 , 27 il , 28. Inoltre, a causa dell’elevata sensibilità della tecnica, si è dimostrato appropriato per studiare le proprietà di trasporto fine di na+/K+-ATPase e gastrico H+/K+-ATPase con Xenopus ovociti come sistema modello29. In GF-AAS, gli elementi atomizzati all’interno di un campione assorbono una lunghezza d’onda della radiazione emessa da una fonte di luce contenente il metallo di interesse, con la radiazione assorbita proporzionale alla concentrazione dell’elemento. L’eccitazione elettronica Elementale avviene dopo l’assorbimento di radiazioni ultraviolette o visibili in un processo quantizzato unico per ogni elemento chimico. In un singolo processo di elettroni, l’assorbimento di un fotone coinvolge un elettrone che si muove da un livello di energia inferiore a un livello superiore all’interno dell’atomo e GF-AAS determina la quantità di fotoni assorbita dal campione, che è proporzionale al numero di radiazioni che assorbono elementi atomizzati nel tubo di grafite.

La selettività di questa tecnica si basa sulla struttura elettronica degli atomi, in cui ogni elemento ha una specifica linea spettrale di assorbimento/emissione. Nel caso di Zn, la lunghezza d’onda di assorbanza è 213,9 Nm e può essere precisamente distinta da altri metalli. Complessivamente, GF-AAS può essere utilizzato per quantificare Zn con adeguati limiti di rilevazione (LOD) e alta sensibilità e selettività25. I cambiamenti nella lunghezza d’onda assorbita sono integrati e presentati come picchi di assorbimento di energia a lunghezze di onda specifiche e isolate. La concentrazione di Zn in un dato campione è di solito calcolata da una curva standard di concentrazioni conosciute secondo la legge della birra-Lambert, in cui l’assorbanza è direttamente proporzionale alla concentrazione di Zn nel campione. Tuttavia, l’applicazione dell’equazione di Beer-Lambert alle analisi di GF-AAS presenta anche alcune complicazioni. Ad esempio, le variazioni nell’atomizzazione e/o nelle concentrazioni non omogenee dei campioni possono influire sulle misurazioni metalliche.

L’atomizzazione del metallo necessaria per l’analisi elementale della traccia GF AAS consiste in tre passaggi fondamentali. Il primo passo è la desolvazione, dove il solvente liquido viene evaporato; lasciando i composti secchi dopo che il forno raggiunge una temperatura di circa 100 ° c. Poi, i composti vengono vaporizzati riscaldandoli da 800 a 1.400 ° c (a seconda dell’elemento da analizzare) e diventare un gas. Infine, i composti allo stato gassoso sono atomizzati con temperature che vanno da 1.500 a 2.500 ° c. Come discusso in precedenza, aumentando le concentrazioni di un metallo di interesse renderà aumenti proporzionali sull’assorbimento rilevato dal GF-AAS, ma il forno riduce la gamma dinamica di analisi, che è il campo di lavoro di concentrazioni che possono essere determinato dallo strumento. Pertanto, la tecnica richiede basse concentrazioni e un’attenta determinazione della gamma dinamica del metodo determinando il LOD e il limite di linearità (LOL) della legge della birra-Lambert. Il LOD è la quantità minima richiesta per una sostanza da rilevare, definita come tre volte la deviazione standard di Zn nella matrice. Il LOL è la massima concentrazione che può essere rilevata utilizzando la legge di birra-Lambert.

In questo lavoro, descriviamo un metodo standard per analizzare i livelli di Zn in estratti di cellule intere, frazioni citoplasmatiche e nucleari, e nel proliferare e differenziare le cellule coltivate (Figura 1). Abbiamo adattato il rapido isolamento del protocollo dei nuclei a diversi sistemi cellulari per prevenire la perdita di metallo durante la preparazione del campione. I modelli cellulari utilizzati erano i mioblasti primari derivati da cellule satelliti del topo, cellule di neuroblastoma murina (N2A o Neuro2A), murine 3T3 L1 adipociti, una linea cellulare epiteliale del seno non tumorigenico umano (MCF10A), e rene epiteliale Madin-Darby canino ( MDCK). Queste cellule sono state stabilite da diversi lignaggi e sono buoni modelli per indagare le variazioni specifiche di lignaggio dei livelli di metallo in vitro.

I mioblasti primari derivati da cellule satelliti del topo costituiscono un modello in vitro ben adatto per indagare la differenziazione muscolare scheletrica. La proliferazione di queste cellule è veloce quando viene coltivata in condizioni sieriche elevate. La differenziazione nel lignaggio muscolare viene quindi indotta da condizioni sieriche basse30. La linea cellulare stabilita dal neuroblastoma murino (N2A) è derivata dalla cresta neurale del topo. Queste cellule presentano la morfologia delle cellule staminali neuronali e amoeboidi. Dopo lo stimolo di differenziazione, le cellule N2A presentano diverse proprietà dei neuroni, come i neurofilamenti. Le cellule N2a sono usate per indagare la malattia di Alzheimer, la crescita del neurite e la neurotossicità31,32,33. Il 3T3-L1 murino pre-adipociti stabilito linea cellulare è comunemente usato per indagare i cambiamenti metabolici e fisiologici associati con adipogenesi. Queste cellule presentano una morfologia simile a fibroblasti, ma una volta stimolata per la differenziazione, presentano l’attivazione enzimatica associata alla sintesi lipidica e all’accumulo di trigliceridi. Questo può essere osservato come cambiamenti morfologici per produrre goccioline di lipidi citoplasmatici34,35. MCF10A è una linea cellulare epiteliale mammaria non tumorale derivata da una donna premenopausale con malattia fibrocistica mammaria36. È stato ampiamente utilizzato per gli studi biochimici, molecolari e cellulari relativi alla carcinogenesi mammaria, come la proliferazione, la migrazione cellulare e l’invasione. La linea cellulare epiteliale del rene canino Madin-Darby (MDCK) è stata ampiamente utilizzata per indagare le proprietà e gli eventi molecolari associati alla creazione del fenotipo epiteliale. Al raggiungimento della confluenza, queste cellule diventano polarizzate e stabiliscono le adesioni cellulari, caratteristiche dei tessuti epiteliali dei mammiferi37.

Per testare la capacità di AAS di misurare i livelli di Zn nelle cellule di mammiferi, abbiamo analizzato frazioni intere e subcellulari (citosol e nucleo) di queste cinque linee cellulari. Le misurazioni di AAS hanno mostrato diverse concentrazioni di Zn in questi tipi di cellule. Le concentrazioni sono state più basse nel proliferare e differenziare i mioblasti primari (da 4 a 7 nmol/mg di proteina) e più in alto nelle quattro linee cellulari stabilite (che vanno da 20 a 40 nmol/mg di proteina). Un piccolo aumento non significativo dei livelli di Zn è stato rilevato nella differenziazione delle mioblasti primari e delle cellule di neuroblastoma rispetto alle cellule proliferanti. L’effetto opposto è stato rilevato in adipociti differenziati. Tuttavia, le cellule 3T3-L1 proliferanti hanno mostrato concentrazioni più elevate del metallo rispetto alle cellule differenziate. È importante sottolineare che, in queste tre linee cellulari, il frazione subcellulare ha mostrato che Zn è distribuito differenzialmente nel citosol e nel nucleo secondo lo stato metabolico di queste cellule. Per esempio, in proliferare mioblasti, cellule N2A, e 3T3-L1 pre-adipociti, la maggior parte del metallo è localizzato al nucleo. Dopo l’induzione della differenziazione utilizzando trattamenti cellulari specifici, Zn localizzato al citosol in questi tre tipi di cellule. È interessante notare che entrambe le linee cellulari epiteliali hanno mostrato livelli più elevati di Zn durante la proliferazione rispetto a quando raggiungono la confluenza, in cui è stato formato un caratteristico monostrato stretto. Nelle cellule epiteliali proliferanti, la linea cellulare mammaria MCF10A aveva una distribuzione uguale di Zn tra il citosol e il nucleo, mentre nella linea cellulare derivata dal rene, la maggior parte del metallo era situata nel nucleo. In questi due tipi di cellule, quando le cellule raggiunsero la confluenza, Zn era prevalentemente localizzato al citosol. Questi risultati dimostrano che GF-AAS è una tecnica altamente sensibile e accurata per eseguire l’analisi elementare in campioni a basso rendimento. GF-AAS accoppiato con frazione subcellulare e può essere adattato per indagare i livelli di oligoelementi metallici in diverse linee cellulari e tessuti.

Protocol

1. coltura cellulare dei mammiferi Considerazioni generali Seguire le tecniche asettiche per la coltura cellulare dei mammiferi precedentemente recensiti38. Mantenere tutte le linee cellulari in un incubatore umidificato 5% CO2 a 37 ° c. Le condizioni di coltura delle celle variano per ogni tipo di cella. È importante mantenere condizioni di coltura appropriate per ogni linea cellulare utilizzata, poiché le variazioni di queste procedur…

Representative Results

Abbiamo testato la capacità del GF-AAS di rilevare i livelli dei minuti di Zn nelle cellule di mammiferi (Figura 1). Così, abbiamo coltivato i mioblasti primari derivati da cellule satelliti del topo, e le linee cellulari stabilite N2A (neuroblastoma derivato), 3T3 L1 (adipocytes), MCF10A (epitelio del seno), e cellule MDCK (epitelio del rene del cane). In primo luogo, abbiamo isolato le frazioni intere di cellule, citosoliche e nucleari di tutti questi tip…

Discussion

La spettroscopia di assorbanza atomica è un metodo altamente sensibile per la quantificazione di Zn in piccoli campioni biologici di volume/massa. L’ottimizzazione descritta della misura Zn rende semplice l’applicazione di questo metodo e garantisce condizioni analitiche ideali. Qui, utilizzando GF-AAS, abbiamo determinato la concentrazione di Zn in cellule intere, e in frazioni citosoliche e nucleari, da diverse linee cellulari. I risultati dimostrano che questa tecnica rende paragonabile a quelle ottenute da sonde flu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dalla facoltà diversità studiosi Award dalla University of Massachusetts Medical School a T.P.-B. N.N.-T. è supportata da SEP-CONACYT, Grant 279879. J. G. N è supportato dalla National Science Foundation Grant DBI 0959476. Gli autori sono grati al dottor Daryl A. bosco per aver fornito la linea cellulare N2A e a Daniella Cangussu per il suo supporto tecnico.

Materials

3-isobutyl-1-methylxanthine Sigma Aldrich I5879
Acetic Acid Sigma Aldrich 1005706
Anti Brg1-antibody (G7) Santa Cruz biotechnologies sc-17796
Anti b-tubulin-antibody (BT7R) Thermo Scientific MA5-16308
Bradford Biorad 5000205
Dexamethasone Sigma Aldrich D4902
Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM) ThermoFischer-Gibco 11965092
Dulbecco's Modified Eagle's Media/Nutrient Mix (DMEM/F12) ThermoFischer-Gibco 11320033
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) ThermoFischer-Gibco 14190144
Epidemal Growth Factor (EGF) Sigma Aldrich E9644
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFischer-Gibco 16000044
Fibroblastic Growth Factor-Basic (FGF) (AA 10-155) ThermoFischer-Gibco PHG0024
Horse serum ThermoFischer-Gibco 16050122
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888
Hydrogen Peroxide (H2O2) Sigma Aldrich 95321
Insulin Sigma Aldrich 91077C
Insulin-Transferrin-Selenium-A ThermoFischer 51300044
Nitric Acid (HNO3) Sigma Aldrich 438073
Nonidet P-40 (NP-40) Thermo Scientific 85125
OptiMEM (Reduced Serum Media) ThermoFischer-Gibco 31985070
Penicillin-Streptomycin ThermoFischer-Gibco 15140148
PureCol (Collagen) Advanced BioMatrix 5005
Retionic Acid Sigma Aldrich PHR1187
Troglitazone Sigma Aldrich 648469-M
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red ThermoFischer-Gibco 25200056
Zinc (Zn) Pure Single-Element Standard, 1,000 µg/mL, 2% HNO3 Perkin Elmer N9300168
Established Cell Lines
3T3-L1 American Type Culture Collection CL-173
MCDK American Type Culture Collection CCL-34
MCF10A American Type Culture Collection CRL-10317
N2A American Type Culture Collection CCL-131
Equipment
Atomic Absortion spectrophotometer PerkinElmer Aanalyst 800
Bioruptor Diagnode UCD-200

References

  1. Sharma, B., Singh, S., Siddiqi, N. J. Biomedical implications of heavy metals induced imbalances in redox systems. Biomed Research International. 640754, (2014).
  2. Jaishankar, M., Tseten, T., Anbalagan, N., Mathew, B. B., Beeregowda, K. N. Toxicity, mechanism and health effects of some heavy metals. Interdisciplinary Toxicology. 7 (2), 60-72 (2014).
  3. Jan, A. T., et al. Heavy Metals and Human Health: Mechanistic Insight into Toxicity and Counter Defense System of Antioxidants. International Journal of Molecular Science. 16 (12), 29592-29630 (2015).
  4. Manutsewee, N., Aeungmaitrepirom, W., Varanusupakul, P., Imyim, A. Determination of Cd, Cu, and Zn in fish and mussel by AAS after ultrasound-assisted acid leaching extraction. Food Chemistry. 101 (2), 817-824 (2007).
  5. Pereira, C. C., de Souza, A. O., Oreste, E. Q., Vieira, M. A., Ribeiro, A. S. Evaluation of the use of a reflux system for sample preparation of processed fruit juices and subsequent determination of Cr, Cu, K, Mg, Na, Pb, and Zn by atomic spectrometry techniques. Food Chemistry. 240, 959-964 (2018).
  6. McComb, J. Q., Rogers, C., Han, F. X., Tchounwou, P. B. Rapid screening of heavy metals and trace elements in environmental samples using portable X-ray fluorescence spectrometer, A comparative study. Water, Air, & Soil Pollution. 225 (12), (2014).
  7. Borgatta, J. P., Paskavitz, A., Kim, D., Navea, J. G. Comparative evaluation of iron leach from different sources of fly ash under atmospherically relevant conditions. Environmental Chemistry. 13, 902-912 (2016).
  8. Dufner-Beattie, J., Langmade, S. J., Wang, F., Eide, D., Andrews, G. K. Structure, function, and regulation of a subfamily of mouse zinc transporter genes. Journal of Biological Chemistry. 278 (50), 50142-50150 (2003).
  9. Sekler, I., Sensi, S. L., Hershfinkel, M., Silverman, W. F. Mechanism and regulation of cellular zinc transport. Molecular Medicine. 13 (7-8), 337-343 (2007).
  10. Berg, J. M., Shi, Y. The galvanization of biology: a growing appreciation for the roles of zinc. Science. 271 (5252), 1081-1085 (1996).
  11. Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. The Physiological, Biochemical, and Molecular Roles of Zinc Transporters in Zinc Homeostasis and Metabolism. Physiology Reviews. 95 (3), 749-784 (2015).
  12. Fukada, T., Kambe, T. Molecular and genetic features of zinc transporters in physiology and pathogenesis. Metallomics. 3 (7), 662-674 (2011).
  13. Prasad, A. S., Halsted, J. A., Nadimi, M. Syndrome of iron deficiency anemia, hepatosplenomegaly, hypogonadism, dwarfism and geophagia. American Journal of Medicine. 31, 532-546 (1961).
  14. Jinno, N., Nagata, M., Takahashi, T. Marginal zinc deficiency negatively affects recovery from muscle injury in mice. Biological Trace Element Research. 158 (1), 65-72 (2014).
  15. Gaither, L. A., Eide, D. J. Eukaryotic zinc transporters and their regulation. Biometals. 14 (3-4), 251-270 (2001).
  16. Fukada, T., Yamasaki, S., Nishida, K., Murakami, M., Hirano, T. Zinc homeostasis and signaling in health and diseases: Zinc signaling. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 16 (7), 1123-1134 (2011).
  17. Kambe, T., Hashimoto, A., Fujimoto, S. Current understanding of ZIP and ZnT zinc transporters in human health and diseases. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3281-3295 (2014).
  18. Plum, L. M., Rink, L., Haase, H. The essential toxin: impact of zinc on human health. International Journal of Environmental Research and Public Health. 7 (4), 1342-1365 (2010).
  19. Broun, E. R., Greist, A., Tricot, G., Hoffman, R. Excessive zinc ingestion. A reversible cause of sideroblastic anemia and bone marrow depression. Journal of the American Medical Association. 264 (11), 1441-1443 (1990).
  20. Fischer, P. W., Giroux, A., L’Abbe, M. R. The effect of dietary zinc on intestinal copper absorption. American Journal of Clinical Nutrition. 34 (9), 1670-1675 (1981).
  21. Ogiso, T., Ogawa, N., Miura, T. Inhibitory effect of high dietary zinc on copper absorption in rats. II. Binding of copper and zinc to cytosol proteins. in the intestinal mucosa. Chemical and Pharmaceutical Bulletin (Tokyo. 27 (2), 515-521 (1979).
  22. Gaetke, L. M., Chow, C. K. Copper toxicity, oxidative stress, and antioxidant nutrients. Toxicology. 189 (1-2), 147-163 (2003).
  23. Macomber, L., Imlay, J. A. The iron-sulfur clusters of dehydratases are primary intracellular targets of copper toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8344-8349 (2009).
  24. Robotham, J. L., Lietman, P. S. Acute iron poisoning. A review. American Journal of Diseases of Children. 134 (9), 875-879 (1980).
  25. Yang, W., Ni, Z., Guang, P., Xue, Y., Guang, P., Fen, X. . Recent advances in absolute analysis by graphite furnace atomic absorption spectrometry. 17 (2), 104-110 (1997).
  26. Gomez-Nieto, B., Gismera, M. J., Sevilla, M. T., Satrustegui, J., Procopio, J. R. Micro-sampling method based on high-resolution continuum source graphite furnace atomic absorption spectrometry for calcium determination in blood and mitochondrial suspensions. Talanta. 170, 15-21 (2017).
  27. Shaw, J. C., Bury, A. J., Barber, A., Mann, L., Taylor, A. A micromethod for the analysis of zinc in plasma or serum by atomic absorption spectrophotometry using graphite furnace. Clin Chim Acta. 118 (2-3), 229-239 (1982).
  28. Stevens, B. J., Hare, D. J., Volitakis, I., Cherny, R. A., Roberts, B. R. Direct determination of zinc in plasma by graphite furnace atomic absorption spectrometry using palladium/magnesium and EDTA matrix modification with high temperature pyrolysis. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 32 (4), 843-847 (2017).
  29. Durr, K. L., Tavraz, N. N., Spiller, S., Friedrich, T. Measuring cation transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus oocytes by atomic absorption spectrophotometry: an alternative to radioisotope assays. Journal of Visualized Experiments. (72), e50201 (2013).
  30. Conejo, R., Valverde, A. M., Benito, M., Lorenzo, M. Insulin produces myogenesis in C2C12 myoblasts by induction of NF-kappaB and downregulation of AP-1 activities. Journal of Cellular Physiology. 186 (1), 82-94 (2001).
  31. Salto, R., et al. beta-Hydroxy-beta-Methylbutyrate (HMB) Promotes Neurite Outgrowth in Neuro2a Cells. PLoS One. 10 (8), e0135614 (2015).
  32. LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
  33. Provost, P. Interpretation and applicability of microRNA data to the context of Alzheimer’s and age-related diseases. Aging (Albany NY). 2 (3), 166-169 (2010).
  34. Green, H., Kehinde, O. An established preadipose cell line and its differentiation in culture. II. Factors affecting the adipose conversion. Cell. 5 (1), 19-27 (1975).
  35. Padilla-Benavides, T., Velez-delValle, C., Marsch-Moreno, M., Castro-Munozledo, F., Kuri-Harcuch, W. Lipogenic Enzymes Complexes and Cytoplasmic Lipid Droplet Formation During Adipogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 117 (10), 2315-2326 (2016).
  36. Soule, H. D., et al. Isolation and characterization of a spontaneously immortalized human breast epithelial cell line, MCF-10. Cancer Research. 50 (18), 6075-6086 (1990).
  37. Leighton, J., Estes, L. W., Mansukhani, S., Brada, Z. A cell line derived from normal dog kidney (MDCK) exhibiting qualities of papillary adenocarcinoma and of renal tubular epithelium. Cancer. 26 (5), 1022-1028 (1970).
  38. Cote, R. J. Aseptic technique for cell culture. Current Protocols in Cell Biology. , (2001).
  39. Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. A two minute cell fractionation method. BMC Research Notes. 3, 294 (2010).
  40. Nabbi, A., Riabowol, K. Rapid Isolation of Nuclei from Cells In Vitro. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (8), 769-772 (2015).
  41. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  42. Carpenter, M. C., Lo, M. N., Palmer, A. E. Techniques for measuring cellular zinc. Archive of Biochemistry and Biophysics. 611, 20-29 (2016).
  43. Paskavitz, A. L., et al. Differential expression of zinc transporters accompanies the differentiation of C2C12 myoblasts. Journal of Trace Elements in Medical Biology. 49, 27-34 (2018).
  44. Chandler, P., et al. Subtype-specific accumulation of intracellular zinc pools is associated with the malignant phenotype in breast cancer. Molecular Cancer. 15 (2), (2016).
  45. Gordon, S. J. V., Fenker, D. E., Vest, K. E., Padilla-Benavides, T. Manganese influx and expression of ZIP8 is essential in primary myoblasts and contributes to activation of SOD2. bioRxiv. , 494542 (2018).
  46. Jansen, S., Arning, J., Beyersmann, D. Zinc homeostasis in C6 glioma cells: phospholipase C activity regulates cellular zinc export. Biological Trace Element Research. 108 (1-3), 87-104 (2005).
  47. Fahrni, C. J. Biological applications of X-ray fluorescence microscopy: exploring the subcellular topography and speciation of transition metals. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (2), 121-127 (2007).
  48. Huang, Z., Lippard, S. J. Illuminating mobile zinc with fluorescence from cuvettes to live cells and tissues. Methods in Enzymology. 505, 445-468 (2012).
  49. Qiao, W., Mooney, M., Bird, A. J., Winge, D. R., Eide, D. J. Zinc binding to a regulatory zinc-sensing domain monitored in vivo by using FRET. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (23), 8674-8679 (2006).
  50. Tomat, E., Lippard, S. J. Imaging mobile zinc in biology. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (2), 225-230 (2010).
  51. Jajda, H. M., et al. Comparative efficacy of two standard methods for determination of iron and zinc in fruits, pulses and cereals. Journal of Food Science and Technology. 52 (2), 1096-1102 (2015).
  52. Padilla-Benavides, T., Long, J. E., Raimunda, D., Sassetti, C. M., Argüello, J. M. A novel P1B-type Mn2+-transporting ATPase is required for secreted protein metallation in mycobacteria. Journal of Biological Chemistry. 288 (16), 11334-11347 (2013).

Play Video

Cite This Article
Gordon, S. J., Xiao, Y., Paskavitz, A. L., Navarro-Tito, N., Navea, J. G., Padilla-Benavides, T. Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (147), e59519, doi:10.3791/59519 (2019).

View Video