이 프로토콜은 시험관 내 표면 분석법을 사용하여 미세 소관의 무, 고대비, 고속 이미징을 위한 표준 형광 현미경에 간섭 반사 현미경 을 구현하기 위한 가이드입니다.
표면 근처의 정제된 생체 분자를 시각화하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 검사법은 일반적으로 사용되는 방법이지만 형광 라벨링이 필요하며 분자의 활동을 방해 할 수 있다는 단점이 있습니다. 또한, 광 표백 및 광 손상이 우려된다. 미세소관의 경우, 우리는 TIRF와 유사한 품질의 이미지가 간섭 반사 현미경 검사법 (IRM)을 사용하여 얻을 수 있음을 발견했습니다. 이것은 IRM이 시험관에서 큰 생체 분자 및 올리고머의 역학을 구상하기 위한 일반적인 기술일지도 모른다는 것을 건의합니다. 이 백서에서는 형광 현미경이 단순히 IRM 이미지를 얻기 위해 수정될 수 있는 방법을 보여줍니다. IRM은 차동 간섭 대비 현미경 또는 간섭 산란 현미경 검사법과 같은 다른 조영기술보다 더 쉽고 상당히 저렴합니다. 그것은 또한 암시야 현미경 검사법 보다는 표면 결점 및 해결책 불순물에 보다 적게 영향을 받기 쉽습니다. IRM을 사용하여, 이 백서에 설명된 이미지 분석 소프트웨어와 함께, 시야와 프레임 속도는 카메라에 의해서만 제한된다; sCMOS 카메라와 광시야피소 미세소관 길이를 10Hz 대역폭으로 최대 20nm의 정밀도로 측정할 수 있습니다.
미세소관의 라벨없는 이미징은 이미지에서 대비를 생성하기 위해 tubulin의 형광 라벨링의 필요성을 우회하기 때문에 흥미 롭습니다. 형광 라벨링에는 여러 가지 단점이 있습니다: 단백질 농도가 1이고 광표백 및 광손상이 관찰 시간을 제한하면 불가능합니다. 비디오 강화 차동 간섭 조영법(DIC) 및 다크필드 현미경 검사법 2,3,4,5를포함하여 라벨이 없는 미세소관을 이미지화하는 데 몇 가지 기술이 사용되어 왔다. 최근에는 간섭경산법(iSCAT) 6,회전-비차질산란현미경(ROCS)7 및 공간광 간섭 현미경(SLIM)8도사용되고 있다. 이 모든 기술은 미세소관을 이미징할 수 있으며 미세소관 역학을 연구하는 데 유용하다는 것이 입증되었습니다. 그러나 각각에는 고유한 제한이 있습니다. DIC에서 대비는 미세소관과 노마르스키 프리즘 축 사이의 각도에 따라 달라집니다. 암시야에서는 불순물이나 표면 결함으로 인해 산란된 빛에 의해 미세소관 신호가 저하됩니다. iSCAT는 특별한 감도(단일 단백질까지)를 나타내고 ROCS는 시료 깊숙이 미세소관을 심층적으로 이미지화할 수 있지만, 두 방법 모두 기술적으로 까다로운 레이저 스캐너를 필요로 합니다.
이 프로토콜은 간섭 반사 현미경 검사법(IRM)9,10이 마이크로소튜브의 무표지 이미징을 위한 대체 기술로 설정할 수 있는 방법을 보여줍니다. IRM은 표준 형광 현미경에 저렴한 50/50 미러만 추가해야 하므로 구현하기 쉽습니다. 여기에 설명된 소프트웨어와 함께 사용하면 IRM은 고대비 미세소관 이미지를 생성하고, 큰 시야를 고속으로 이미지화할 수 있으며, 한 번 정렬이 필요하며 형광 이미징과 같은 다른 기술과 쉽게 결합될 수 있습니다.
이 프로토콜은 미세소관 역학의 이미징 및 측정을 위한 IRM의 성공적인 사용을 입증했습니다. 이미지 대비에 가장 큰 영향을 미치기 때문에 조명 수치 조리개를 올바르게 설정하려면 주의해야 합니다. 또한 높은 NA 목표치에 비해 높은 NA 목표치에 비해 높은 광 수집 전력을 가지므로 높은 수치 조리개(NA) 목표를 사용하는 것이 고해상도/고대비 이미지를 얻는 데 중요합니다. 표면과 솔루션이 더 깨끗할수록 먼지가 표면에 부착되고 이미지에 노이즈와 같은 얼룩이 추가되면서 노이즈가 낮아집니다. 배경 이미지의 수집은 조명 불균질성, 정적 노이즈 및 표면 불규칙성을 제거할 뿐만 아니라 중요합니다.
권장되는 수정사항은 조명 경로에 긴 패스 필터(>600 nm)를 도입하는 것입니다. 백색 광원의 스펙트럼은 전형적으로 미세관을 손상시킬 수 있는 UV에 있는 파장을 포함합니다. 또한 IRM에 긴 파장을 사용하면 IRM과 형광을 결합할 때 유용합니다(예: 미세소관 역학에 대한 미세소관 관련 단백질(MAPs)의 효과를 연구할 때). 소모된 시간 동안 이미징할 때 샘플 드리프트(특히 광축을 따라)는 배경 평면에서 이미지 평면의 편차로 인해 이미지 대비가 감소합니다. 현대 현미경은 종종 안정화 메커니즘 (예를 들어, 완벽한 초점 (니콘), 명확한 초점.2 (자이스), IX3-ZDC2 (올림푸스))를 갖추고 있습니다. 대체 솔루션은 수동 또는 능동18 또는 드리프트 19,20,21에대한 보정을 통해 설정을 열적으로 안정화시키는 것입니다. 마지막으로, 미세소관 대비는 필드 다이어프램의 크기를 감소시킴으로써 증가될 수 있다(70% 개방은 증가하는 대비와 시야 크기 사이의 균형이기 때문에 좋은 선택이다)15.
IRM은 화상 진찰 microtubules를 위해 적당하지만 단 하나 단백질을 검출하기 위하여 충분히 과민하지 않습니다. 이러한 적용을 위해, iSCAT는 더 적합한 기술이다. 마찬가지로 형광 및 iSCAT는 10nm 미만의 추적 정밀도가 필요한 경우에 더 적합합니다. IRM의 경우 그림7과 같이 측정된 길이 추적 정밀도는 ~20 nm입니다.
표면 검사에 IRM의 사용은 미세 소관을 넘어 갈 수 있습니다; 예를 들어, 분자 모터는 금 나노 입자로 라벨을 붙이고 미세 소관과 상호 작용할 때 추적 할 수 있습니다. 또한 반사 간섭 대비 현미경 검사법(RICM)22로 알려진 보다 진보된 형태의 IRM은 원칙적으로 미세소관 대비를 더욱 향상시키고 더 높은 추적 정밀도를 얻기 위해 사용될 수 있다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 프로토콜에 대한 비판적 독서와 의견에 대한 안나 루크니아크와 음웨이 쿠오 에게 감사드립니다.
Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | An inverted microscope used for perfoming the expriments |
50/50 beam splitter | Chroma | 21000 | When buying make sure to choose the splitter dimensions that fit the cube used in the microscope |
NIKON PLAN FLUOR 100X/0.5-1.3 Iris objective | Nikon | MRH02902 | Imaging objective. This objective has a NA adjusting iris that was opened to NA 1.3 |
Mucasol universal detergent | Sigma-aAldrich | Z637181-2L | Used for cleaning coverslips and slides |
plastic paraffin film (commerical name Parafilm M) | Sigma-aAldrich | P7793 | Used for constructing flow channels |
Anti-TAMRA antibody | Invitrogen | A-6397 | Used to bind TAMRA labeled molecules (e.g. microtubules) to the sample surface. RRID (AB_2536196) |
Poloxamer 407 (commercial name Pluronic F-127) | Sigma-aAldrich | Used for blocking the channel surface to prevent nonspecific binding | |
40 nm gold nanoparticles | Sigma-aAldrich | 753637 | Used as a control sample |
20 nm gold nanoparticles | Sigma-aAldrich | 753610 | Used as a control sample |
Zyla 4.2 Camera | Andor | Zyla 4.2 | 2048×2048 pixles (6.5µm pixel size) with quantum efficiency of 72% and 16bit dynamic range |
Feista tracking software | https://www.bcube-dresden.de/fiesta/wiki/FIESTA | ||
Stabilized microtubles | prepared in house (see references in text) |