Summary
Bu protokol, etiket içermeyen, yüksek kontrastı, yüksek hızlı görüntüleme için standart bir floresan mikroskop üzerinde girişim yansıma mikroskopisi uygulamak için bir kılavuzdur mikrotubules in vitro yüzeyler kullanarak.
Abstract
Yüzeylere yakın saflaştırılmış biyomoleküllerin görselleştirmek için çeşitli yöntemler vardır. Total-iç yansıma floresans (TIRF) mikroskobu yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir, ancak moleküllerin aktivitesine engel olabilecek floresan etiketleme gerektirdiği dezavantajı vardır. Ayrıca, photobleaching ve photodam endişeleri vardır. Microtubules durumunda, biz TIRF benzer kalitede görüntüleri girişim yansıma mikroskopisi (ıRM) kullanılarak elde edilebilir bulduk. Bu, IRM 'nin büyük biyomoleküllerin ve oligomerler in vitro dinamiklerini görselleştirmenin genel bir tekniği olabileceğini göstermektedir. Bu yazıda, bir Floresan Mikroskobu sadece ıRM görüntüleri elde etmek için nasıl değiştirildiğini gösteriyoruz. IRM, diferansiyel parazit kontrast mikrokopya veya interferometrik saçılma mikroskobu gibi diğer kontrast tekniklerinden daha kolay ve önemli ölçüde daha ucuzdur. Ayrıca, karanlık alan mikroskobu daha yüzey kusurları ve çözüm kirlikleri daha az duyarlıdır. IRM kullanarak, bu yazıda açıklanan görüntü analiz yazılımı ile birlikte, görüş alanı ve kare hızı sadece kamera tarafından sınırlıdır; bir scmos kamera ve geniş alan aydınlatma Mikrotubul uzunluğu ile ölçülebilir 20 NM ile 10 Hz bant genişliği ile ölçülebilir.
Introduction
Mikrotubüllerin etiketsiz görüntülenmesi, görüntülerde kontrast üretmek için tübülin flüoresan etiketlemesi ihtiyacını atlatmaları gibi ilgi çekici bir şey. Floresan etiketleme çeşitli dezavantajları vardır: Eğer protein konsantrasyonu düşük1 ve photobleaching ve fotodamat izleme süresini sınırlamak mümkün değildir. Video geliştirilmiş diferansiyel girişim kontrast mikroskopisi (DIC) ve Darkfield mikroskobu2,3,4,5dahil olmak üzere etiket içermeyen microtubules görüntü için çeşitli teknikler kullanılmıştır. Son zamanlarda, interferometrik saçılma mikroskopisi (ıscat)6, dönen-tutarlı-saçılma mikroskobu (rocs)7 ve uzamsal ışık paraziti MIKROSKOPISI (ince)8de kullanılmıştır. Tüm bu teknikler görüntüleme mikrotübüller yeteneğine sahiptir ve Mikrotubul dinamikleri okumak için değerli olduğunu kanıtladı. Ancak, her biri kendi sınırlamaları vardır. DıC 'de kontrast microtubül ve Nomarski prizma ekseni arasındaki açıya bağlıdır. Darkfield 'de mikrotubule sinyali, kirler veya yüzeyler kusurlarından kaynaklanan dağınık ışık ile bozulur. Iscat olağanüstü hassasiyet (aşağı tek proteinler) sergiler ve rocs örnek içine derin görüntü mikrotübüller olabilir rağmen, her iki yöntem Teknik olarak talep, lazer tarayıcılar gerektirir.
Bu protokol, mikroskobik yansıma mikroskobu (IRM)9,10 ' u mikrotubüllerin etiketsiz görüntüleme için alternatif bir teknik olarak nasıl ayarlanacağını gösterir. Bir standart floresan mikroskop sadece ucuz 50/50 ayna ilavesi gerektirir gibi ıRM uygulamak kolaydır. Burada açıklanan yazılım ile birlikte kullanıldığında, IRM yüksek kontrast mikrotubule görüntüler üretir, yüksek hızda görüş büyük alanları görüntü, bir tek seferlik hizalama gerektirir ve kolayca floresan görüntüleme gibi diğer teknikler ile kombine edilebilir.
Protocol
1. mikroskop modifikasyon ve objektif objektif
- Uygun bir filtre küpü kullanarak floresan mikroskop filtre tekerleğine bir 50/50 ayna takın (Şekil 1). 50/50 aynası, sıklıkla Anti-yansıma kaplamasına sahip olarak özen yansıtın.
Not: Biz mikroskop boş bir filtre küpü bir 50/50 ayna kullandık. 50/50 ayna, dikroik aynanın bulunduğu yere eklenir. - Yüksek büyütme/yüksek NA yağ amacı kullanın.
Not: Bu protokolde, bir 100x/1.3 NA amacı kullandık.
2. mikrotübülleri yüzeye yapışmasına yönelik oda hazırlığı
- Temiz mikroskop slaytlar ve 22 mm x 22 mm kapak (dik mikroskop için) veya 22 mm x 22 mm ve 18 mm x 18 mm kapak (ters mikroskoplar için). Yüzeyi gerektiği gibi değiştirin. Örneğin, bir alkalin deterjan kullanarak coverfları temizleyin ( malzeme tablosunabakın) ve ardından% 100 etanol ile damıtılmış su yıkama ile11arasında ve sonralar.
- 3 mm genişliğinde plastik parafin filmi keser (bkz. malzeme tablosu) bir tıraş bıçağı ve bir kenar olarak başka bir mikroskop slayt kullanarak.
- Temiz 22 x 22mm kapak kayma üzerinde 3 mm ayrı iki plastik parafin Film şeritler yerleştirin. Sonra bir kanal oluşturmak için 18 mm x 18 mm lamel magazini yerleştirin. Dikey mikroskop kullanıyorsanız, şeritleri temiz bir mikroskop kaydırağı üzerine yerleştirin ve ardından üstüne bir lamel magazini yerleştirin.
- Lamel magazini (veya slayt) bir ısı bloğu üzerinde 100 ° c için 10-30 s için parafin film için mühürlü bir kanal oluşturmak için yerleştirin.
- Bir pipet kullanarak perfüzyon ile 50 μg/mL antikor (Brinkley buffer 1980 (BRB80)) içinde akış. 10 dakika boyunca kulyur.
Not: Biz yüzeye Rhodamine etiketli Mikrotubul tohumları bağlamak için anti-Rhodamine antikorları kullanıyoruz. Alternatif olarak, avidin biotin etiketli Mikrotubul tohumları veya biyotinlenmiş altın parçacıklar bağlamak için kullanılabilir. Sadece çözelti içinde tübülin yokluğunda mikrotübüller bakmak için (yani, olmayan bir dinamik tahlil), bir anti-tübülin antikor kullanılabilir. - BRB80 tampon ile beş kez yıkayın. 0,22 μm filtre kullanılarak çözümlerin filtrelendiği tavsiye edilir.
- Akış içinde 1% Poloksamer 407 (bir triblock kopolimmer) içinde BRB80 özel olmayan bağlama karşı yüzeyi engellemek için. 10 dakika boyunca kulyur.
- BRB80 tampon ile beş kez yıkayın.
- Örnek mikroskop üzerine yerleştirilmeye hazırdır. Numunenin kurumasını önlemek için, kanalın ucunda BRB80 tampon iki damlacıkları ekleyin ve gerektiğinde yenilenir.
3. mikroskop hizalama
- Numuneyi mikroskop aşamasına yerleştirin. Epi-aydınlatma ışık kaynağını açın.
- Örnek yüzeye odaklanın. Objektif, optik yolun içindeki optik ışığın arka yansımasından dolayı yukarı ve aşağı taşındığında birden fazla yüzeyi gözlemleyecektir. Örnek yüzeyi bulmak için iyi bir yöntem parafin film kenarına odaklanmak için. Yüzey bulunduğunda, görünüm alanını odanın merkezine ayarlayın.
- Alanı diyaframı orta yöne kapatarak ve ayar vidalarını kullanarak görüş alanına Ortala. Bir kez hizalanır, diyaframı yeniden açın.
Not: vida ayarı sadece spor, belki de her 3-6 ay veya sorun giderme sırasında yapılması gerekir. - Hedefe çıkış öğrenci (geri odak düzlem) görüntülemek için Bertrand objektif kaydırın.
- Objektif çıkış öğrenci kenarlarının ötesinde diyafram diyafram (AD) kapatın.
- AD 'yi çıkış öğrenciyle ortalamak için ayar vidalarını kullanın. AD 'yi açarak ve kenarlarını çıkış öğrencilerinden biriyle eşleştirerek çift kontrol edin.
Not: Bu ayarlama yalnızca spor yapmak gerekir. - Objektif NA yaklaşık 2/3 diyafram diyaframı ayarlayın. Diyafram diyaframını optimize etmek için ayrıntılı prosedürler için Bölüm 7 ' ye bakın.
4. görüntüleme stabilize mikrotübüller veya 40 Nm altın parçacık
Not: stabilize mikrotübüller ve altın nanopartiküller iyi kontrol örnekleri olarak hizmet vermektedir. IRM performansını değerlendirmek ve optimal diyafram diyafram açıklığı (Bölüm 7) ayarlamasına yardımcı olmak için ilk adım olarak görüntü yüzeyine bağlı mikrotübüller veya altın nanopartiküller için tavsiye edilir.
- Kameranın pozlama süresini 10 MS 'ye ayarlayın ve aydınlatması kamera dinamik aralığını neredeyse doyurmak için ayarlayın.
- BRB804,12,13 (veya 40 Nm altın partikülleri) içinde 10 μL guanylyl-(Alfa, Beta)-metilen-difosforat (gmpccp)-veya Taxol-stabilize mikrotübüller içinde akış yeni bir örnek ve monitör için bir pipet kullanarak perfüzyon yüzey görüntüleme tarafından bağlayıcı. Bir kez 10-20 mikrotübüller görünüm alanı içinde bağlı, BRB80 ile örnek 2x yıkayın.
Not: iyi uyumlu bir mikroskop ile mikrotübüller arka plan çıkarma olmadan görünür olmalıdır. - 10 saniye süreyle 1 saniyelik gecikme süresi (10 MS pozlama) ile bir zaman atlamalı ayarlayarak 10 görüntü kazanın.
- Bir arka plan görüntüsü edinin. Bunu yapmak için, aşama denetleyicisi veya bilgisayar yazılımını kanal uzun eksen boyunca kullanarak sahne alanı hareket ettirirken, gecikme olmadan 100 görüntü alırken (örn. 100 fps 'ye yakın akış, 10 MS pozlama).
Not: arka plan 100 görüntülerin medyan olur. Medyan alarak, aydınlatma profili ve diğer sabit özellikleri optik üzerinde kir gibi her şey filtrelenmiş iken korunur. Bu aşama taşınır ve sonuçta arka plan görüntüsünü düşürerek Aksiyel pozisyonda değiştirmek için yol açacaktır gibi örnek üzerinde eğim olmamalıdır. Eğim kaçınılamıyor, daha sonra alternatif bir yöntem tohum akan önce ortalama arka plan görüntüleri elde etmektir. - Görüntüleri işleme ve analiz etmek için adım 6 ' ya gidin.
5. görüntüleme Mikrotubul dinamikleri
- Beyin tubulin kullanarak Mikrotubul dinamikleri için, numune ısıtıcı sıcaklığını 37 °c ' ye ayarlayın.
- BRB8011 ' de 10 μL gmpccp-stabilize Mikrotubul tohumları ile yeni bir örneğe pipet kullanarak perfüzyon ile akış yapın ve yüzeyi canlı görüntüleyerek yüzeye bağlaması izleyin (yani, akış sırasında). Bir kez 10-20 tohumlar görüş alanı ile bağlı, BRB80 ile 2x Kanal hacmi kullanarak örnek yıkayın (BRB80 37 °C veya oda sıcaklığında en az prewarmed olmalıdır).
Not: iyi uyumlu bir mikroskop Ile tohum arka plan çıkarma olmadan görünür olmalıdır. - Polimerizasyon karışımı akışı (7,5 μM etiketsiz tübülin + 1 mm guanozin trifosfat (GTP) + 1 mm dithiothreitol (DTT) BRB80 buffer). Mikrotubul büyümesini ölçmek için, her 5 saniyede bir görüntü elde etmek için satın alma yazılımını kullanarak bir zaman atlamalı ayarlayın (0,2 saniye başına kare (fps)) 15 dakika.
- Kontrastı geliştirmek için her zaman noktasında 10 görüntü (bir yerine) alın ve bunları ortalama. Mikrotubul küçülme için, 0 ve 10ms bir pozlama süresi (daha yüksek fps kullanılabilir kamera bağlı olarak ilgi küçük bölgeler ile mümkündür) zaman gecikmesi ayarlayarak 100 fps 'de görüntüleri elde.
- Adım 4,4 gibi bir arka plan görüntüsü edinin.
6. görüntü işleme ve analiz
Not: analiz Için, bu protokol Fiji14 kullanır ama okuyucu o/o uygun bulmak herhangi bir yazılım kullanmak için ücretsizdir.
- Kaydedilmiş arka plan görüntülerini açın.
- Görüntü ≫ Stack ≫ Z projesi ≫ Mediankullanarak Median görüntüyü (Yani arka plan) hesaplayın.
- Açık Mikrotubul dinamiği film bir yığın olarak (aynı dinamik olmayan microtubules için) Dosya > kullanarak açın.
- İşlem ≫ görüntü hesap makinesikullanarak yığından arka plan görüntüsünü çıkarın. "32bit (float) sonucu" seçeneğini kontrol ettiğinizden emin olun.
- Dinamik microtubules için Çizgi aracını kullanarak bir çizgi ilgi microtubül boyunca çizin ve "t" tuşuna basarak faiz Yöneticisi bölgesine ekleyin. Tüm mikrotübüller ilgi için tekrarlayın.
- Dinamik microtubules için Multi-Kymo makroyu çalıştırın (ek dosya 1). Makro, YG yöneticisinde her microtubül için bir video ve bir kymograf oluşturur. Her Mikrotubul benzersiz bir tanımlayıcı alacak.
- Dinamik microtubules için Kymo-analiz makro (Tamamlayıcı dosya 2) çalıştırın ve büyüme hızları ve mikrotubüllerin küçülme oranlarını ölçmek için kendi adımlarını izleyin.
7. diyafram diyaframı boyutu
Not: IRM kullanarak mikrotübüller yüksek kontrast görüntüleri elde etmek için önemli bir faktör aydınlatma sayısal diyafram (ına) doğru10,15ayarı. Ina , AD (ad) boyutu ile kontrol edilen hedef çıkış öğrencide gelen aydınlatma ışın boyutunu değiştirerek değiştirilebilir (reklam çıkış öğrenci ile bir Konjugat düzleminde bulunur (arka odak düzlem) amacı , Şekil 1):
dad diyafram diyaframının çapıdır, famacı , hedefin odak uzaklığı ve dEP , hedefin çıkış öğrenci çapıdır. Genellikle, AD floresan görüntüleme için tamamen açık bırakılır, bu nedenle ına eşittir hedefin na. Floresan Mikroskobu, AD ölçeği çapını göstermez, böylece ına hesaplanamaz. Reklam boyutunu bir amaç yardımıyla kalibre etmek mümkündür. Ancak, AD boyutu en yüksek kontrastı üreten boyuta sabitlenenden beri gerekli değildir.
- Yüzeye yapışan floresan etiketli stabilize mikrotübüllerin bir örneğini hazırlayın (4.1-4.2 adımları).
Not: Biz mikrotubules etiketli tetrametilrhodamin kullanılan16 (ör: 550 nm, Em: 580 Nm). - Mikrotübüller, mikrotübüller etiketli değilse, mikro odaklama düğmesi kullanarak odak içine getirmek (mikrotübüller etiketlenmiş değilse, IRM15 veya DIC5ile görüntü).
- Kamera yazılımını kullanarak kamera pozlama 10 MS ayarlayın.
Not: Bu pozlama rasgele ve 100 ms bir pozlama de çalışır. - AD 'yi en küçük açısına kapatın. Işığı neredeyse kameranın dinamik aralığını veya mümkün olan en yüksek seviyede doyurmak için ayarlayın.
Not: bir kılavuz olarak, genellikle edinme yazılımı tarafından sağlanan görünüm tablosunu kullanın. - 10 + microtubules içeren bir bakış alanı 10 görüntü (akış veya her saniye bir görüntü alarak) elde.
- Adım 4,4 gibi bir arka plan görüntüsü edinin.
- AD boyutunu değiştirin ve tüm AD açılış aralığı için 7.5-7.6 arasındaki adımları yineleyin (kapalı gelen öğrenci boyutu, Şekil 2). AD boyutu her değiştiğinde, aydınlatma yoğunluğunu 7,4 adım ile eşleşecek şekilde ayarlayın.
- Alınan her görüş alanı için, işlem > görüntü Hesaplayıcı kullanarak ilgili arka planı çıkarın ve açılır menüden "çıkarma" seçeneğini seçin. "32bit (float) sonucu" seçeneğinin işaretli olduğundan emin olun. Ardından, görüntü > yığını ≫ Z projesini ortalama >kullanarak elde edilen görüntüleri ortalama.
- Mikrotubüllerin ortalama yoğunluğu olarak tanımlanan mikrotubulların sinyal-arka plan gürültü oranını (SBR) ölçüm (mikrotubülün yoğunluğu, arka planın yoğunluğu eksi) arka planda standart sapmaya bölünmüştür ( Şekil 3).
- Her açılış boyutu için mikrotübüllerin ortalama SBR değerini hesaplayarak ve AD boyutunu en yüksek SBR (Şekil 2) üreten birine ayarlamak suretiyle en uygun ad boyutunu (yani optimum ına) belirleyin. Karşılaştırılabilir kontrast üreten bir dizi AD boyutu vardır mümkündür15.
Representative Results
Yukarıda belirtildiği gibi, iyi uyumlu bir mikroskop ile, mikrotübüller arka plan çıkarma olmadan görünür olmalıdır (Şekil 4A). Arka planı çıkarma (Şekil 4b) mikrotubülün kontrastını geliştirir (Şekil 4c). Kontrastı daha da geliştirmek için, ortalama veya Fourier filtreleme veya her ikisinin bir kombinasyonu kullanılabilir (Şekil 4d, F, E). Şekil 4g 'de çizgi taramaları görüntü kalitesinin artımlı gelişimini gösterir. Her işlem adımıyla arka plan gürültüsünün azalmasına dikkat edin.
Zaman atlamalı filmlerden oluşturulan Mikrotubul dinamiklerinin kymograf örnekleri Şekil 5' te gösterilir. Videolar iki kare oranlarında elde edildi: 0,2 fps (yavaş) ve 100 fps (hızlı). Önceki büyüme hızını ölçmek için uygundur, ikincisi daha hızlı büyüme oranından daha büyüklüğü bir sırası olan küçülme hızını ölçmek için uygundur.
Mikroskop kurmak için altın nanopartiküller kullanıldığı durumda Şekil 6' da örnek bir görüntü gösterilir. Altın nanopartiküller pasif olarak yüzeye takılmış. 40 Nm partikülleri tavsiye edilirken, 20 Nm parçacıkların yansımasına karşın daha düşük bir kontrastı da mümkündür.
Şekil 1. IRM 'nin şematik gösterimi. (A) epi-ışık kaynağından aydınlatma 50/50 aynaya ulaşmadan önce diyafram diyaframından geçer. Diyafram diyafram kiriş genişliği böylece aydınlatma NA ayarlar. 50/50 ayna, numuneyi aydınlatmak için ışık hedefini kısmen yansıtır. Örnek yansıyan ışık toplanır ve sonra görüntü oluşturmak için müdahale nerede kamera yongası (tüp objektif) üzerine yansıtılır. Görüntü kontrastı, cam/su arayüzünden (I2) yansıyan ışık ile su/mikrotubule arayüzünden (II$) yansıyan ışık arasındaki parazitin sonucudur. Mikrotubüs/yüzey mesafesine (h) bağlı olarak, I2 ve ı$ arasındaki optik yol farkı, yapıcı (parlak sinyal) veya yıkıcı (koyu sinyal) veya arasında herhangi bir şeye neden olacaktır. Örneğin, 600 nm dalga boyu ile ışık görüntüleme için kullanıldığında, kontrast yaklaşık 100 Nm ile Mikrotubul yüksekliği değiştiğinde koyu ve parlak arasında geçiş yapar. Yıldız işareti, Konjugat düzlemlerini gösterir (15' ten değiştirildi). (B) 50/50 yansıtma yükleme örneği. Uygun bir filtre küpü açıldı ve dikrotik aynaya genellikle oturduğu yerde ayna takılmış. Ayna, üretici yönergelerine göre yönlendirilmiş. Sonra küp geri mikroskop (gösterilmez) yerleştirilen filtre tekerleğine yerleştirilir. Kurulum sırasında eldiven kullanıldı ve ayna sadece kenarlar tarafından tutulur. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2. Optimum Aperture diyafram ayarı. (A) aynı görüş alanı, arka plan çıkarma olmadan farklı diyafram diyafram açıklıkları görüntülenmiş. Görsel olarak kontrast, diyafram diyaframın boyutu arttıkça bir plato ulaşıncaya kadar arttı ve daha sonra kötüleşmesine başladı. Bu, arka planda ayrılan görüntülerin (B) SBR ölçümleriyle doğrulandı. Hata çubukları standart sapmadır. Ölçek çubukları 500 μm (AD) ve 3 μm (microtubules) ' dir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3. Sinyal-arka plan gürültü oranını ölçme. Microtubules ilgi bölgelerde izole edildi. Her bölge ilgi arka planda Mikrotubul ayırmak için thresholded. Mikrotubul üzerinden ortalama mikrotubule sinyali bir hat taramasından alınmıştır. Tarama çizgisi genişliği microtubül uzunluğuna eşit olarak ayarlandı. Bu şekilde, taramanın her noktası, bu noktaya paralel olan Mikrotubul ekseni boyunca tüm piksellerin sinyallerinin ortalamasıdır. Arka plan gürültüsü, eşik altındaki tüm piksellerin standart sapmasını keser. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4. Görüntü işleme. RAW görüntüler aldıktan sonra (A), arka plan (B) çıkarılır (C) Mikrotubul kontrast geliştirmek için. Kontrastı daha da iyileştirmek için görüntülerin ortalamaları (D) veya Fourier filtrelenmiş (E) veya her ikisi (F). Konumu ( a ) içindeki kesikli kırmızı çizgiyle gösterilen çizgi taramaları ( G), (a) ile ( F)arasındaki çeşitli görüntülerle eşleştirilir. Alt köşedeki Sayılar, tüm görüş alanı için ölçülen ortalama SBRs 'dir. Ölçek çubuğu 5 μm (15' ten değiştirildi). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 5. Kymograf örnekleri. (A) 0,2 fps 'de elde edilen zaman atlamalı filmlerden üretilen Mikrotubul dinamiklerinin kymograph örnekleri. (B) 100 fps 'de elde edilen bir filmden oluşturulan bir küçülme olayının bir örneğini tasvir eden kymograph. Kesikli çizgiler tohumları işaretler. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 6. IRM ile görüntülenmiş altın nanopartiküller örneği. Altın nanopartiküller 20 ve 40 Nm boyutları pasif yüzeye bağlı. 10 görüntü alınmıştır. Arka plan çıkarma sonrasında, yansımaları karşıtlığı artırmak için ortalamaları vardı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 7. IRM görüntülerde Microtubule uzunluğu Izleme hassasiyeti. Stabilize mikrotübüller (yani, sabit uzunlukları) 100 fps daha sonra 10 fps kontrast geliştirmek için ortalamalı 200x görüntülenmiştir. Ardından, microtubules ' uzunlukları Fiesta17 izleme yazılımı kullanılarak ölçülmüştür. Her microtubül için ortalama uzunluğu ve standart sapma şeklinde gösterildiği gibi hesaplanır (kesik çizgi ortalama ve katı kırmızı çizgiler standart sapmayı temsil eder, uzunluk = 3971 ± 20 Nm. Genel izleme hassasiyeti tüm izlenen mikrotübüller standart sapması ortalamasıdır (n = 6 mikrotübüller x 20 veri noktaları = 120 veri noktaları). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Ek dosya 1. Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.
Ek dosya 2. Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Bu protokol, Mikrotubul dinamiklerinin görüntülenmesi ve ölçülmesi için IRM 'nin başarılı bir şekilde kullanımını göstermiştir. Görüntü kontrastı üzerinde en güçlü etkiye sahip olduğu için doğru aydınlatma sayısal diyafram ayarlamak için bakım verilmelidir. Ayrıca, yüksek sayısal diyafram (NA) hedefleri kullanarak yüksek çözünürlük/yüksek kontrast görüntüleri almak için önemlidir, yüksek NA amacı düşük NA hedeflerine kıyasla daha yüksek ışık toplama gücü vardır. Temizleyici yüzey ve çözümler, kir yüzeye iliştirmek kadar düşük gürültü kullanılan ve (deney boyunca) ekleme görüntüleri için gürültü gibi lekeli. Bir arka plan görüntüsü edinme önemli yanı sıra aydınlatma inhomojenler, statik gürültü ve yüzey düzensizlikleri kaldırır.
Önerilen değişiklik, aydınlatma yolundaki uzun geçiş filtresini (> 600 Nm) tanıtmaktır. Beyaz ışık kaynaklarının spektrumları genellikle mikrotubüllere zarar verebilecek UV 'de dalga boylarını içerir. Ayrıca, IRM için uzun dalga uzunluğunun kullanılması, IRM 'i floresan ile birleştirerek (örneğin, Mikrotubul ilişkili proteinlerin (haritalar) Mikrotubul dinamiklerine etkisini inceleyerek) kullanışlı bir şekilde gelir. Zaman harcanan süre için görüntüleme, örnek Drift (özellikle optik eksen boyunca) arka plan düzleminden görüntü düzleminin sapması nedeniyle görüntü kontrastı azalır unutmayın. Modern mikroskoplar genellikle stabilizasyon mekanizmaları (örn. mükemmel odaklama (Nikon), kesin Focus. 2 (Zeiss), ıXON-ZDC2 (Olympus)) ile donatılmıştır. Alternatif bir çözüm termal veya pasif veya aktif18 veya drift19,20,21için düzelterek kurulum stabilize etmektir. Son olarak, Mikrotubul kontrast alan diyafram boyutunu azaltarak artırılabilir (bir 70% açılış iyi bir seçimdir artan kontrast ve görüş boyutu alanı arasında bir denge olduğu gibi)15.
IRM görüntüleme mikrotubülleri için uygun iken tek proteinleri algılamak için yeterince hassas değildir. Bu tür bir uygulama için, ıscat daha uygun bir tekniktir. Benzer şekilde, flüoresan ve ıscat, 10 Nm 'den az hassas izleme gerektiğinde daha uygundur. IRM için ölçülen uzunluk izleme hassasiyeti Şekil 7' de gösterildiği gibi ~ 20 Nm 'dir.
Yüzeyde ıRM kullanımı microtubules ötesinde olabilir; Örneğin, moleküler motorlar altın nanopartikülleri ile etiketlenmiş ve microtubules ile etkileşime girdikleri gibi izleniyor olabilir. Ayrıca yansıtıcı girişim kontrast mikroskopisi olarak bilinen ıRM daha gelişmiş bir formu (RICM)22 olabilir, prensip olarak, daha fazla mikrotubules kontrast geliştirmek ve daha yüksek izleme hassasiyeti elde etmek için kullanılabilir.
Disclosures
Yazarlar, ifşa etmek için ilgi çatışması yok.
Acknowledgments
Yazarlar önemli okuma ve protokol hakkında yorumlar için Anna Luchniak ve Yin-Wei Kuo teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | An inverted microscope used for perfoming the expriments |
| 50/50 beam splitter | Chroma | 21000 | When buying make sure to choose the splitter dimensions that fit the cube used in the microscope |
| NIKON PLAN FLUOR 100X/0.5-1.3 Iris objective | Nikon | MRH02902 | Imaging objective. This objective has a NA adjusting iris that was opened to NA 1.3 |
| Mucasol universal detergent | Sigma-aAldrich | Z637181-2L | Used for cleaning coverslips and slides |
| plastic paraffin film (commerical name Parafilm M) | Sigma-aAldrich | P7793 | Used for constructing flow channels |
| Anti-TAMRA antibody | Invitrogen | A-6397 | Used to bind TAMRA labeled molecules (e.g. microtubules) to the sample surface. RRID (AB_2536196) |
| Poloxamer 407 (commercial name Pluronic F-127) | Sigma-aAldrich | Used for blocking the channel surface to prevent nonspecific binding | |
| 40 nm gold nanoparticles | Sigma-aAldrich | 753637 | Used as a control sample |
| 20 nm gold nanoparticles | Sigma-aAldrich | 753610 | Used as a control sample |
| Zyla 4.2 Camera | Andor | Zyla 4.2 | 2048x2048 pixles (6.5µm pixel size) with quantum efficiency of 72% and 16bit dynamic range |
| Feista tracking software | https://www.bcube-dresden.de/fiesta/wiki/FIESTA | ||
| Stabilized microtubles | prepared in house (see references in text) |
References
- Widlund, P. O., et al. One-step purification of assembly-competent tubulin from diverse eukaryotic sources. Molecular Biology of the Cell. 23 (22), 4393-4401 (2012).
- Walker, R. A., et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).
- Hotani, H., Horio, T. Dynamics of microtubules visualized by darkfield microscopy: Treadmilling and dynamic instability. Cell Motility and the Cytoskeleton. 10 (1-2), 229-236 (1988).
- Gittes, F., Mickey, B., Nettleton, J., Howard, J. Flexural rigidity of microtubules and actin filaments measured from thermal fluctuations in shape. The Journal of Cell Biology. 120 (4), 923-934 (1993).
- Bormuth, V., Howard, J., Schäffer, E. LED illumination for video-enhanced DIC imaging of single microtubules. J Microsc. 226 (Pt 1), 1-5 (2007).
- Andrecka, J., Ortega Arroyo, J., Lewis, K., Cross, R. A., Kukura, P. Label-free Imaging of Microtubules with Sub-nm Precision Using Interferometric Scattering Microscopy. Biophysical Journal. 110 (1), 214-217 (2016).
- Koch, M. D., Rohrbach, A. Label-free Imaging and Bending Analysis of Microtubules by ROCS Microscopy and Optical Trapping. Biophysical Journal. 114 (1), 168-177 (2018).
- Kandel, M. E., Teng, K. W., Selvin, P. R., Popescu, G. Label-Free Imaging of Single Microtubule Dynamics Using Spatial Light Interference Microscopy. ACS Nano. 11 (1), 647-655 (2017).
- Curtis, A. S. G. The Mechanism of Adhesion of Cells to Glass. The Journal of Cell Biology. 20 (2), 199-215 (1964).
- Weber, I. [2] Reflection interference contrast microscopy. Methods in Enzymology. 361, 34-47 (2003).
- Gell, C., et al. Chapter 13 - Microtubule Dynamics Reconstituted In Vitro and Imaged by Single-Molecule Fluorescence Microscopy. Methods in Cell Biology. 95, 221-245 (2010).
- Nitzsche, B., et al. Chapter 14 - Studying Kinesin Motors by Optical 3D-Nanometry in Gliding Motility Assays. Methods in Cell Biology. 95, 247-271 (2010).
- Schiff, P. B., Fant, J., Horwitz, S. B. Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol. Nature. 277 (5698), 665-667 (1979).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Mahamdeh, M., Simmert, S., Luchniak, A., Schäffer, E., Howard, J. Label-free high-speed wide-field imaging of single microtubules using interference reflection microscopy. Journal of Microscopy. 272 (1), 60-66 (2018).
- Hyman, A., et al. [39] Preparation of modified tubulins. Methods in Enzymology. 196, 478-485 (1991).
- Ruhnow, F., Zwicker, D., Diez, S. Tracking Single Particles and Elongated Filaments with Nanometer Precision. Biophysical Journal. 100 (11), 2820-2828 (2011).
- Mahamdeh, M., Schäffer, E. Optical tweezers with millikelvin precision of temperature-controlled objectives and base-pair resolution. Optics Express. 17 (19), 17190-17199 (2009).
- Kim, K., Saleh, O. A. Stabilizing method for reflection interference contrast microscopy. Applied Optics. 47 (12), 2070-2075 (2008).
- Ortega Arroyo, J., Cole, D., Kukura, P. Interferometric scattering microscopy and its combination with single-molecule fluorescence imaging. Nature Protocols. 11 (4), 617-633 (2016).
- Carter, A. R., King, G. M., Ulrich, T. A., Halsey, W., Alchenberger, D., Perkins, T. T. Stabilization of an optical microscope to 0.1 nm in three dimensions. Appl Opt. 46 (3), 421-427 (2007).
- Limozin, L., Sengupta, K. Quantitative Reflection Interference Contrast Microscopy (RICM) in Soft Matter and Cell Adhesion. ChemPhysChem. 10 (16), 2752-2768 (2009).
