Summary
Dit protocol is een leidraad voor het implementeren van interferentie reflectie microscopie op een standaard fluorescentiemicroscoop voor etiket-vrije, hoog-contrast, High-Speed beeldvorming van microtubuli met behulp van in vitro oppervlakken assays.
Abstract
Er zijn verschillende methoden voor het visualiseren van gezuiverde biomoleules in de buurt van oppervlakken. Total-inwendige reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie is een veelgebruikte methode, maar heeft het nadeel dat het fluorescerende labeling vereist, die kan interfereren met de activiteit van de moleculen. Ook, fotobleaching en foto schade zijn zorgen. In het geval van microtubuli hebben we geconstateerd dat beelden van vergelijkbare kwaliteit als TIRF kunnen worden verkregen met behulp van interferentie reflectie microscopie (IRM). Dit suggereert dat IRM een algemene techniek kan zijn voor het visualiseren van de dynamiek van grote biomoleules en oligomeren in vitro. In dit artikel laten we zien hoe een fluorescentiemicroscoop eenvoudig kan worden aangepast om IRM-afbeeldingen te verkrijgen. IRM is gemakkelijker en aanzienlijk goedkoper om te implementeren dan andere contrast technieken zoals differentiële interferentie contrast micro copy of interferometrische verstrooiing microscopie. Het is ook minder vatbaar voor oppervlakte defecten en oplossing onzuiverheden dan Darkfield microscopie. Met behulp van IRM, samen met de software voorbeeld analyse die in dit document wordt beschreven, wordt het gezichtsveld en de framesnelheid alleen beperkt door de camera; met een sCMOS-camera en breedveld verlichting kan de lengte van de microtubuli met precisie worden gemeten tot 20 nm met een bandbreedte van 10 Hz.
Introduction
Etiket-vrije beeldvorming van microtubuli is van belang als het omzeilt de behoefte aan fluorescerende labeling van tubuline voor het genereren van contrast in de beelden. Fluorescerende labeling heeft verschillende nadelen: het is niet haalbaar als de eiwitconcentratie laag is1 en fotobleaching en foto schade de observatietijd beperken. Er zijn verschillende technieken gebruikt om label vrije microtubuli te gebruiken, waaronder video-Enhanced differentiële interferentie contrast microscopie (DIC) en Darkfield microscopie2,3,4,5. Recentelijk zijn ook interferometrische verstrooiing microscopie (iSCAT)6, roterende-coherente-verstrooiing microscopie (Rocs)7 en ruimtelijke licht interferentie microscopie (slank)8gebruikt. Al deze technieken zijn geschikt voor het maken van microtubuli-images en bleken waardevol te zijn voor het bestuderen van de dynamiek in de microtube. Echter, elk hebben hun eigen beperkingen. In DIC hangt het contrast af van de hoek tussen de microtubulus en de Nomarski prisma as. In Darkfield wordt het microtubulus signaal afgebroken door verstrooid licht van onzuiverheden of oppervlakken defecten. Hoewel iscat buitengewone gevoeligheid vertoont (tot enkelvoudige eiwitten) en Rocs de microtubuli dieper in het monster kan afbeelden, zijn beide methoden technisch veeleisend, waardoor laserscanners nodig zijn.
Dit protocol demonstreert hoe interferentie reflectie microscopie (IRM)9,10 kan worden ingesteld als een alternatieve techniek voor het labelen van de microtubuli-vrije beeldvorming. IRM is eenvoudig te implementeren omdat het alleen de toevoeging van een goedkope 50/50-spiegel aan een standaard fluorescerende Microscoop vereist. Wanneer gebruikt in combinatie met de software die hier wordt beschreven, produceert IRM hoogcontrast microtubulus beelden, kan grote kijk velden op hoge snelheid beeld, vereist een eenmalige uitlijning, en kan gemakkelijk worden gecombineerd met andere technieken zoals fluorescentie Imaging.
Protocol
1. Microscoop modificatie en objectief objectief
- Plaats een 50/50-spiegel in het filter wiel van de fluorescerende Microscoop met behulp van een geschikte filter kubus (Figuur 1). Behandel de 50/50 spiegel met zorg zo vaak hebben ze een antireflectiecoating.
Opmerking: we gebruikten een 50/50 spiegel in een lege filter kubus van de Microscoop. De 50/50 spiegel wordt geplaatst waar de dichroïde spiegel zich bevindt. - Gebruik een hoge vergroting/hoge NA olie doelstelling.
Opmerking: in dit protocol hebben we een doelstelling van 100x/1.3 NA gebruikt.
2. voorbereiding van de kamer om microtubuli aan het oppervlak te hechten
- Reinig de Microscoop-dia's en afdek stroken van 22 mm x 22 mm (voor een staande Microscoop) of een dekslip van 22 mm x 22 mm en 18 mm x 18 mm (voor omgekeerde microscopen). Wijzig het oppervlak indien nodig. Reinig bijvoorbeeld de afdek stroken met een alkalisch reinigingsmiddel (Zie tabel met materialen), gevolgd door 100% ethanol met gedestilleerde water wasses tussen en na11.
- Snijd 3 mm brede stroken plastic paraffine folie (Zie tabel van de materialen) met behulp van een scheermesje en een andere Microscoop dia als een rand.
- Plaats twee plastic paraffinestrips 3 mm uit elkaar op een schone 22 x 22mm cover slip. Plaats dan een Afdekstrook van 18 mm x 18 mm om een kanaal te vormen. Als u een rechtopstaande Microscoop gebruikt, plaatst u de strips bovenop een schone Microscoop-dia en plaatst u vervolgens een dekglaasje bovenop.
- Plaats de afdekfolie (of glijbaan) op een warmte blok bij 100 °C voor 10-30 s voor de paraffine film om een verzegeld kanaal te vormen.
- Debiet in 50 μg/mL antilichaam (in Brinkley buffer 1980 (BRB80)) door perfusie met behulp van een pipet. Inincuberen gedurende 10 min.
Let op: we gebruiken anti-Rhodamine antilichamen om Rhodamine-gelabelde microtubuli zaden aan het oppervlak te binden. Als alternatief kan avidin worden gebruikt voor het binden van biotin-gelabelde microtubulus zaden of biotinyleerd Gold deeltjes. Om microtubuli simpelweg te bekijken in de afwezigheid van tubuline in oplossing (d.w.z. een niet-dynamische assay), kan een anti-tubulonantilichaam worden gebruikt. - Was vijf keer met BRB80 buffer. Het wordt aanbevolen om de oplossingen te filteren met behulp van een 0,22 μm filter.
- Debiet in 1% poloxameer 407 (een triblock copolymeer) in BRB80 om het oppervlak te blokkeren tegen niet-specifieke binding. Inincuberen gedurende 10 min.
- Was vijf keer met BRB80 buffer.
- Het monster is klaar om op de Microscoop te worden geplaatst. Om te voorkomen dat het monster uitdroogt, voegt u twee druppels BRB80 buffer aan de uiteinden van het kanaal toe en vult u indien nodig aan.
3. Microscoop uitlijning
- Plaats het monster op de Microscoop. Schakel de epi-verlichtings lichtbron in.
- Focus op het monster oppervlak. U zult meerdere oppervlakken observeren omdat het doel naar boven en naar beneden wordt verplaatst door reflectie van het licht van de optiek binnen het optische pad. Een goede methode om het monster oppervlak te vinden is om zich te concentreren op de rand van de paraffine film. Zodra het oppervlak is gevonden, stelt u het gezichtsveld in op het midden van de kamer.
- Plaats het velddiafragma in het gezichtsveld door het halverwege te sluiten en de aanpassings schroeven te gebruiken. Eenmaal uitgelijnd, open het diafragma.
Opmerking: schroef aanpassing hoeft slechts sporadisch te worden gedaan, misschien elke 3-6 maanden of bij het oplossen van problemen. - Schuif in de lens van Bertrand om de uitreis pupil (achterste brandvlak) van de doelstelling te bekijken.
- Sluit het diafragma (AD) buiten de randen van de uittrede leerling van het doel.
- Gebruik de aanpassings schroeven om de advertentie met de uittrede leerling te centreren. Dubbel Controleer door de advertentie te openen en de randen te matchen met die van de uitreis leerling.
Opmerking: deze aanpassing hoeft slechts sporadisch te gebeuren. - Stel het diafragma in op ongeveer 2/3 van de NA van het doel. Zie rubriek 7 voor gedetailleerde procedures voor het optimaliseren van het diafragma.
4. beeldvormende gestabiliseerde microtubuli of 40 nm goud deeltje
Opmerking: gestabiliseerde microtubuli en gouden nanodeeltjes dienen als goede controlemonsters. Het wordt aanbevolen om het beeldoppervlak aangesloten microtubuli of gouden nanodeeltjes als een eerste stap om te beoordelen van de prestaties van IRM en helpen bij het instellen van de optimale opening diafragma (sectie 7).
- Stel de belichtingstijd van de camera in op 10 MS en pas de belichting aan om het dynamische bereik van de camera bijna te verzadigen.
- Stroom in 10 μL guanylyl-(alpha, Beta)-methyleen-difosfonaat (gmpccp)-of taxol-gestabiliseerde microtubuli in BRB804,12,13 (of 40 nm goud deeltjes) door perfusie met behulp van een pipet op een nieuw monster en monitor binding door het oppervlak te Imaging. Zodra 10-20 microtubuli zijn gebonden binnen het gezichtsveld, was het monster 2x met BRB80.
Opmerking: met een goed uitgelijnde Microscoop moeten de microtubuli zichtbaar zijn zonder achtergrond aftrekken. - Verkrijg 10 beelden door een timelapse in te stellen met 1 seconde vertragingsperiode gedurende 10 seconden (bij 10 MS belichting).
- Een achtergrondafbeelding verkrijgen. Om dit te doen, verplaats het werkgebied met behulp van de stage controller of computer software langs de lange as van het kanaal tijdens het verkrijgen van 100 beelden zonder vertraging (d.w.z. streaming dicht bij 100 fps @ 10 MS blootstelling).
Opmerking: de achtergrond is de mediaan van de 100 afbeeldingen. Door de mediaan te nemen, blijven het verlichtingsprofiel en andere stationaire functies zoals vuil op de optiek behouden terwijl al het andere wordt uitgefilterd. Er mag geen helling op het monster, omdat dit zal leiden tot verandering in de axiale positie als het podium wordt verplaatst en uiteindelijk degraderen de achtergrondafbeelding. Als de helling niet kan worden vermeden, dan is een alternatieve methode om gemiddelde achtergrondafbeeldingen te verwerven voordat de zaden stromen. - Voor het verwerken en analyseren van de afbeeldingen gaat u naar stap 6.
5. Dynamics voor Imaging microtubulus
- Voor de dynamiek van de microtubuli met behulp van Brain tubulin, stelt u de verwarmingstemperatuur van het monster in op 37 °C.
- Stroom in 10 μL GMPCCP-gestabiliseerde microtubulus zaden in BRB8011 door perfusie met behulp van een pipet om een nieuw monster en controleer ze binden aan het oppervlak door het oppervlak Live te Imaging (d.w.z. tijdens het streamen). Zodra 10-20 zaden zijn gebonden met gezichtsveld, was het monster met 2x kanaal volume met BRB80 (BRB80 moet worden voorverwarmd tot 37 °C of ten minste bij kamertemperatuur).
Opmerking: met een goed uitgelijnde Microscoop moeten de zaden zichtbaar zijn zonder achtergrond aftrekken. - Stroom in de polymerisatie-mix (7,5 μM zonder label tubuline + 1 mM calciumguanosine trifosfaat (GTP) + 1 mM Dithiothreitol (DTT) in BRB80-buffer). Voor het meten van de groei van microtubulten, stelt u een time-lapse in met behulp van de acquisitie software om elke 5 seconden een beeld te verwerven (0,2 frames per seconde (fps)) gedurende 15 minuten.
- Om het contrast te verbeteren, verkrijgt u 10 afbeeldingen (in plaats van één) op elk tijdstip en gemiddeld. Voor krimp van micro tubulus, afbeeldingen ophalen bij 100 fps door de tijdvertraging op 0 in te stellen en een belichtingstijd van 10 MS (hogere FPS is mogelijk met kleinere gebieden van belang, afhankelijk van de gebruikte camera).
- Verkrijg een achtergrondafbeelding zoals in stap 4,4.
6. beeldverwerking en-analyse
Opmerking: voor analyse gebruikt dit protocol Fiji14 , maar de lezer is vrij om alle software te gebruiken die zij/hij geschikt vindt.
- Open opgeslagen achtergrondafbeeldingen.
- Bereken de mediane afbeelding (d.w.z. achtergrond) met behulp van image ≫ Stack ≫ Z-project ≫ mediaan.
- Open microtubulus Dynamics Movie als een stapel (hetzelfde voor niet-dynamische microtubuli) met behulp van bestand > open.
- Trek de achtergrondafbeelding van de stapel af met behulp van proces ≫ afbeeldings Calculator. Controleer de optie "32Bit (float) resultaat".
- Voor dynamische microtubuli tekent u met het gereedschap lijn een lijn langs de microtubulus van belang en voegt u deze toe aan de regio van interesse Manager door op "t" te drukken. Herhalen voor alle microtubuli van belang.
- Voer voor dynamische microtubuli de macro multi-Kymo uit (aanvullend bestand 1). De macro genereert een video en een kymograph voor elke micro-tubulus in de ROI Manager. Elke microtubulus krijgt een unieke identificator.
- Voor dynamische microtubuli voert u de macro Kymo-analyse uit (aanvullend bestand 2) en volgt u de stappen om de groeipercentages en krimp percentages van de microtubuli te meten.
7. grootte diafragma membraan
Opmerking: een belangrijke factor voor het verkrijgen van hoog contrast afbeeldingen van microtubuli met IRM is het instellen van de belichting numerieke diafragma (Ina) correct10,15. De Ina kan worden gewijzigd door de grootte van de inkomende verlichtingsbalk te wijzigen bij de uitreis pupil van de doelstelling, die wordt bepaald door de grootte van de advertentie (de advertentie bevindt zich op een geconjugeerde vlak met de afslag pupil (rugfocal vlak) van de doelstelling , Figuur 1):
waar dad de diameter is van het diafragma diafragma, is fobjectief de brandpuntsafstand van de doelstelling en dEP de uitreis pupil diameter van het doel. Meestal wordt de advertentie volledig opengelaten voor fluorescentie-beeldvorming, zodat de Ina gelijk is aan het navan de doelstelling. In een fluorescentiemicroscoop geeft de advertentie schaal niet de diameter aan, zodat de Ina niet kan worden berekend. Het is mogelijk om het advertentieformaat te kalibreren met behulp van een doelstelling. Toch is het niet nodig omdat de advertentie grootte zou worden vastgesteld op de grootte die het hoogste contrast oplevert.
- Bereid een monster van fluorescently gelabelde gestabiliseerde microtubuli vast aan het oppervlak (stappen 4.1-4.2).
Opmerking: we gebruikten tetramethylrhodamine gelabelde microtubuli16 (ex: 550 nm, em: 580 nm). - Breng microtubuli scherp in de focus met behulp van de scherpstel knop van de Microscoop, terwijl deze fluorescentend wordt uitgevoerd (als microtubuli niet zijn gelabeld, beeld ze met IRM15 of dic5).
- Stel camera blootstelling in op 10 MS met behulp van de camera software.
Opmerking: deze blootstelling is willekeurig en een blootstelling van 100 MS zou ook werken. - Sluit de advertentie af tot de kleinste opening. Pas de belichting aan om het dynamische bereik van de camera of maximaal mogelijk te verzaderen.
Opmerking: gebruik als richtlijn de zoektabel die gewoonlijk wordt geleverd door de verwervings software. - Verkrijg 10 afbeeldingen (door elke seconde een afbeelding te streamen of te nemen) van een gezichtsveld met 10 + microtubuli.
- Verkrijg een achtergrondafbeelding zoals in stap 4,4.
- Verander de grootte van de advertentie en herhaal stap 7.5-7.6 voor het hele advertentie openings bereik (van gesloten tot de afslag pupilgrootte, Figuur 2). Telkens wanneer het advertentieformaat wordt gewijzigd, past u de verlichtings intensiteit aan die van stap 7,4.
- Voor elk verworven gezichtsveld trekt u de bijbehorende achtergrond af met behulp van proces > afbeeldings Calculator en kiest u "aftrekken" in het vervolgkeuzemenu. Zorg ervoor dat de optie ' 32Bit (float) result ' is aangevinkt. Dan gemiddelde de resulterende beelden met behulp van image > stack ≫ Z project > gemiddelde.
- Meet de signaal-naar-achtergrondruis verhouding (SBR) van de microtubuli gedefinieerd als de gemiddelde intensiteit van het microtubulus signaal (intensiteit van de microtubulus minus de intensiteit van de achtergrond) gedeeld door de standaarddeviatie van de achtergrond ( Figuur 3).
- Bepaal de optimale advertentie grootte (d.w.z. optimale Ina) door de gemiddelde SBR van de microtubuli voor elke openingsgrootte te berekenen en stel het advertentieformaat in op degene die de hoogste SBR produceert (Figuur 2). Het is mogelijk dat er een reeks advertentieformaten is die vergelijkbaar contrast15produceren.
Representative Results
Zoals hierboven vermeld, moeten microtubuli met een goed uitgelijnde microscoop zichtbaar zijn zonder achtergrond aftrekken (figuur 4a). Door de achtergrond af te trekken (figuur 4b) wordt het contrast van de microtubulus (figuur 4c) versterkt. Om het contrast verder te verbeteren, kunnen gemiddelden of Fourier-filtering of een combinatie van beide worden gebruikt (figuur 4D, F, E). De lijn scans in figuur 4G toont de incrementele verbetering van de beeldkwaliteit. Let op de vermindering van achtergrondruis met elke verwerkingsstap.
Voorbeelden van kymografieën van microtubulus dynamiek gegenereerd uit timelapse-films worden weergegeven in afbeelding 5. De Video's werden verworven op twee frame rates: 0,2 fps (Slow) en 100 fps (snel). De eerste is geschikt voor het meten van de groeisnelheden, terwijl de laatste is meer geschikt voor het meten van krimp percentage dat is een orde van grootte sneller dan de groeisnelheid.
Voor het geval waarin gouden nanodeeltjes worden gebruikt voor het instellen van de Microscoop, wordt een voorbeeldafbeelding weergegeven in Figuur 6. Gouden nanodeeltjes werden passief aan het oppervlak bevestigd. Terwijl 40 nm deeltjes worden aanbevolen, is het ook mogelijk om 20 nm-deeltjes te beeld, maar met een lager contrast.
Figuur 1. Schematische weergave van IRM. A) epi-verlichting uit de lichtbron passeert het diafragma voordat de 50/50-spiegel wordt bereikt. Het diafragma diafragma stelt de breedte van de straal in, dus de verlichting NA. De 50/50 spiegel weerspiegelt gedeeltelijk het licht tot de doelstelling om het monster te verlichten. Licht weerspiegeld uit het monster wordt verzameld en vervolgens geprojecteerd op de camerachip (door de buis lens) waar het interfereert om het beeld te genereren. Beeldcontrast is het resultaat van de interferentie tussen het licht dat wordt gereflecteerd door de glas/water-interface (I1) en het licht dat wordt gereflecteerd door de water/microtubule-interface (I2). Afhankelijk van de microtubulus/oppervlakte-afstand (h) zal het optische pad verschil tussen I1 en I2 resulteren in een constructief (helder signaal) of destructief (donker signaal) of iets daartussenin. Als bijvoorbeeld licht met een golflengte van 600 nm wordt gebruikt voorbeeld vorming, zal het contrast schakelen tussen donker en helder wanneer de hoogte van de microtubulus met ongeveer 100 nm verandert. Het sterretje geeft geconjugeerde vlakken aan (gewijzigd van15). (B) voorbeeld van de 50/50-spiegel installatie. Een geschikte filter kubus werd geopend en de spiegel werd ingebracht waar een dichroïde spiegel meestal zit. De spiegel was georiënteerd volgens de instructies van de fabrikant. Vervolgens werd de kubus in het filter wiel ingebracht, dat terug naar de Microscoop werd ingebracht (niet weergegeven). Tijdens de installatie werden handschoenen gebruikt, en de spiegel werd alleen gehouden door de randen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2. Optimale diafragma-instelling. (A) hetzelfde gezichtsveld werd afgebeeld bij verschillende openingen van het diafragma membraan zonder achtergrond aftrekken. Visueel steeg het contrast naarmate de grootte van het diafragma werd verhoogd tot het een plateau bereikte en daarna begon te degraderen. Dit werd bevestigd door (B) SBR metingen van afbeeldingen met achtergrond aftrek. Foutbalken zijn standaarddeviatie. Schaal staven zijn 500 μm (AD) en 3 μm (microtubuli). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3. Meetsignaal-naar-achtergrondruis verhouding. Microtubuli werden geïsoleerd in regio's van belang. Elke regio van belang was thresholded om de microtubulus van de achtergrond te scheiden. Het gemiddelde microtubulus signaal werd verkregen uit een lijnscan over de microtubulus. De breedte van de scanlijn is ingesteld op gelijk aan de lengte van de microtubulus. Op deze manier is elk punt op de scan een gemiddelde van de signalen van alle pixels langs de as van de microtubulus die evenwijdig zijn aan dat punt. De achtergrondruis is de standaarddeviatie van alle pixels onder de drempelwaarde afgesneden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4. Beeldverwerking. Na het verkrijgen van RAW-beelden (A)werd de achtergrond (B) afgetrokken (C) om het contrast van de microtubulus te verbeteren. Om het contrast verder te verbeteren waren de afbeeldingen ofwel gemiddeld (D) of Fourier gefilterd (E) of beide (F). De lijn scans (G), waarvan de locatie wordt aangegeven door de rode stippellijn in (a) zijn kleur die overeenkomt met de verschillende afbeeldingen in (a) tot (F). De getallen in de onderste hoek zijn gemiddelde SBRs gemeten voor het gehele gezichtsveld. De schaalbalk is 5 μm (gewijzigd van15). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5. Voorbeelden van kymografen. A) kymograph-voorbeelden van de dynamiek van microtubulus gegenereerd uit timelapse-films verkregen bij 0,2 fps. (B) kymograph een voorbeeld van een krimp gebeurtenis gegenereerd op basis van een film verworven op 100 fps. Onderbroken lijnen markeren de zaden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6. Voorbeeld van gouden nanodeeltjes die zijn afgebeeld met IRM. Gouden nanodeeltjes van de maten 20 en 40 nm werden passief aan het oppervlak bevestigd. Er zijn 10 afbeeldingen verkregen. Na het aftrekken van de achtergrond werden de afbeeldingen gemiddeld om het contrast te verbeteren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7. Microtubule lengte bijhouden precisie in IRM-afbeeldingen. Gestabiliseerde microtubuli (d.w.z. vaste lengtes) werden 200x op 100 fps afgebeeld en vervolgens gemiddeld tot 10 fps om het contrast te verbeteren. Vervolgens werden de lengtes van de Microtubules gemeten met behulp van Fiesta17 tracking software. Voor elke microtubulus werden de gemiddelde lengte en standaarddeviatie berekend zoals weergegeven in de figuur (onderbroken lijn staat voor de gemiddelde en effen rode lijnen de standaarddeviatie, lengte = 3971 ± 20 Nm. De algemene trackingprecisie was het gemiddelde van de standaarddeviatie van alle gevolgde microtubuli (n = 6 microtubuli x 20 gegevenspunten = 120 gegevenspunten). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend bestand 1. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 2. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Dit protocol demonstreerde het succesvolle gebruik van IRM voorbeeld vorming en meting van de microtubulus dynamiek. Voorzichtigheid is geboden om het numerieke diafragma van de belichting correct in te stellen, omdat het de sterkste invloed heeft op het beeldcontrast. Ook is het gebruik van hoge numerieke diafragma (NB) doelstellingen belangrijk voor het verkrijgen van afbeeldingen met hoge resolutie/hoog contrast, omdat de hogere NA-doelstelling hogere licht verzamelkracht heeft in vergelijking met lage NA-doelstellingen. Het reinigingsmiddel het oppervlak en de oplossingen gebruikt hoe lager het lawaai als vuil uiteindelijk aan het oppervlak te hechten en toe te voegen (in de loop van het experiment) spikkel als ruis aan de beelden. Acquisitie van een achtergrondbeeld is belangrijk en het verwijdert verlichtings homogeniteiten, statische ruis en oppervlakte onregelmatigheden.
Een aanbevolen modificatie is het introduceren van een lang doorlaat filter (> 600 nm) in het verlichtings traject. Het spectrum van witte lichtbronnen bevat meestal golflengten in de UV die microtubuli kunnen beschadigen. Bovendien is het gebruik van lange golflengte voor IRM handig bij het combineren van IRM met fluorescentie (bijv. bij het bestuderen van het effect van microtubulus geassocieerde eiwitten (kaarten) op de dynamiek van de micro tubulus). Houd er rekening mee dat bij Imaging voor verbruikte periode van tijd, sample drift (vooral langs de optische as) het contrast van het beeld verlaagt vanwege de afwijking van het afbeeldings vlak van het achtergrond vlak. Moderne microscopen zijn vaak uitgerust met stabilisatiemechanismen (bijv. perfecte scherpstelling (Nikon), duidelijke focus. 2 (Zeiss), IX3-ZDC2 (Olympus)). Een alternatieve oplossing is het thermisch stabiliseren van de Setup, passief of actief18 of door het corrigeren van drift19,20,21. Ten slotte kan het contrast van de microtubulus worden vergroot door de grootte van het velddiafragma te verkleinen (een 70% opening is een goede keuze omdat het een evenwicht is tussen het vergroten van het contrast en het gezichtsveld)15.
Hoewel IRM geschikt is voor microtubuli met Imaging, is het niet gevoelig genoeg om enkelvoudige eiwitten te detecteren. Voor een dergelijke toepassing is iSCAT een geschiktere techniek. Evenzo zijn fluorescentie en iSCAT beter geschikt als het bijhouden van precisie van minder dan 10 nm nodig is. Voor IRM is de meetnauwkeurigheid gemeten lengte ~ 20 nm, zoals weergegeven in afbeelding 7.
Het gebruik van IRM in oppervlakte-assays kan verder gaan dan microtubuli; moleculaire motoren kunnen bijvoorbeeld worden geëtiketteerd met gouden nanodeeltjes en worden bijgehouden terwijl ze omgaan met microtubuli. Daarnaast is een meer geavanceerde vorm van IRM bekend als reflecterende interferentie contrast microscopie (RICM)22 kan, in principe, worden gebruikt om microtubuli contrast verder te verbeteren en hogere traceer nauwkeurigheid te verkrijgen.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Anna Luchniak en Yin-Wei Kuo voor kritische lezing en opmerkingen over het protocol.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | An inverted microscope used for perfoming the expriments |
| 50/50 beam splitter | Chroma | 21000 | When buying make sure to choose the splitter dimensions that fit the cube used in the microscope |
| NIKON PLAN FLUOR 100X/0.5-1.3 Iris objective | Nikon | MRH02902 | Imaging objective. This objective has a NA adjusting iris that was opened to NA 1.3 |
| Mucasol universal detergent | Sigma-aAldrich | Z637181-2L | Used for cleaning coverslips and slides |
| plastic paraffin film (commerical name Parafilm M) | Sigma-aAldrich | P7793 | Used for constructing flow channels |
| Anti-TAMRA antibody | Invitrogen | A-6397 | Used to bind TAMRA labeled molecules (e.g. microtubules) to the sample surface. RRID (AB_2536196) |
| Poloxamer 407 (commercial name Pluronic F-127) | Sigma-aAldrich | Used for blocking the channel surface to prevent nonspecific binding | |
| 40 nm gold nanoparticles | Sigma-aAldrich | 753637 | Used as a control sample |
| 20 nm gold nanoparticles | Sigma-aAldrich | 753610 | Used as a control sample |
| Zyla 4.2 Camera | Andor | Zyla 4.2 | 2048x2048 pixles (6.5µm pixel size) with quantum efficiency of 72% and 16bit dynamic range |
| Feista tracking software | https://www.bcube-dresden.de/fiesta/wiki/FIESTA | ||
| Stabilized microtubles | prepared in house (see references in text) |
References
- Widlund, P. O., et al. One-step purification of assembly-competent tubulin from diverse eukaryotic sources. Molecular Biology of the Cell. 23 (22), 4393-4401 (2012).
- Walker, R. A., et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).
- Hotani, H., Horio, T. Dynamics of microtubules visualized by darkfield microscopy: Treadmilling and dynamic instability. Cell Motility and the Cytoskeleton. 10 (1-2), 229-236 (1988).
- Gittes, F., Mickey, B., Nettleton, J., Howard, J. Flexural rigidity of microtubules and actin filaments measured from thermal fluctuations in shape. The Journal of Cell Biology. 120 (4), 923-934 (1993).
- Bormuth, V., Howard, J., Schäffer, E. LED illumination for video-enhanced DIC imaging of single microtubules. J Microsc. 226 (Pt 1), 1-5 (2007).
- Andrecka, J., Ortega Arroyo, J., Lewis, K., Cross, R. A., Kukura, P. Label-free Imaging of Microtubules with Sub-nm Precision Using Interferometric Scattering Microscopy. Biophysical Journal. 110 (1), 214-217 (2016).
- Koch, M. D., Rohrbach, A. Label-free Imaging and Bending Analysis of Microtubules by ROCS Microscopy and Optical Trapping. Biophysical Journal. 114 (1), 168-177 (2018).
- Kandel, M. E., Teng, K. W., Selvin, P. R., Popescu, G. Label-Free Imaging of Single Microtubule Dynamics Using Spatial Light Interference Microscopy. ACS Nano. 11 (1), 647-655 (2017).
- Curtis, A. S. G. The Mechanism of Adhesion of Cells to Glass. The Journal of Cell Biology. 20 (2), 199-215 (1964).
- Weber, I. [2] Reflection interference contrast microscopy. Methods in Enzymology. 361, 34-47 (2003).
- Gell, C., et al. Chapter 13 - Microtubule Dynamics Reconstituted In Vitro and Imaged by Single-Molecule Fluorescence Microscopy. Methods in Cell Biology. 95, 221-245 (2010).
- Nitzsche, B., et al. Chapter 14 - Studying Kinesin Motors by Optical 3D-Nanometry in Gliding Motility Assays. Methods in Cell Biology. 95, 247-271 (2010).
- Schiff, P. B., Fant, J., Horwitz, S. B. Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol. Nature. 277 (5698), 665-667 (1979).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Mahamdeh, M., Simmert, S., Luchniak, A., Schäffer, E., Howard, J. Label-free high-speed wide-field imaging of single microtubules using interference reflection microscopy. Journal of Microscopy. 272 (1), 60-66 (2018).
- Hyman, A., et al. [39] Preparation of modified tubulins. Methods in Enzymology. 196, 478-485 (1991).
- Ruhnow, F., Zwicker, D., Diez, S. Tracking Single Particles and Elongated Filaments with Nanometer Precision. Biophysical Journal. 100 (11), 2820-2828 (2011).
- Mahamdeh, M., Schäffer, E. Optical tweezers with millikelvin precision of temperature-controlled objectives and base-pair resolution. Optics Express. 17 (19), 17190-17199 (2009).
- Kim, K., Saleh, O. A. Stabilizing method for reflection interference contrast microscopy. Applied Optics. 47 (12), 2070-2075 (2008).
- Ortega Arroyo, J., Cole, D., Kukura, P. Interferometric scattering microscopy and its combination with single-molecule fluorescence imaging. Nature Protocols. 11 (4), 617-633 (2016).
- Carter, A. R., King, G. M., Ulrich, T. A., Halsey, W., Alchenberger, D., Perkins, T. T. Stabilization of an optical microscope to 0.1 nm in three dimensions. Appl Opt. 46 (3), 421-427 (2007).
- Limozin, L., Sengupta, K. Quantitative Reflection Interference Contrast Microscopy (RICM) in Soft Matter and Cell Adhesion. ChemPhysChem. 10 (16), 2752-2768 (2009).
