Denne protokol er en vejledning til gennemførelse af interferens refleksion mikroskopi på et standard fluorescens mikroskop til etiket-fri, høj-kontrast, høj-hastighed billeddannelse af microtubuler ved hjælp af in vitro-overflader assays.
Der er flere metoder til visualisering af rensede biomolekyler nær overflader. Total-intern refleksion fluorescens (TIRF) mikroskopi er en almindeligt anvendt metode, men har den ulempe, at det kræver fluorescerende mærkning, som kan forstyrre aktiviteten af molekylerne. Også, foto blegning og foto skader er bekymringer. I tilfælde af microtubuler, har vi konstateret, at billeder af lignende kvalitet til tirf kan opnås ved hjælp af interferens refleksion mikroskopi (IRM). Dette antyder, at IRM kan være en generel teknik til visualisering af dynamikken i store biomolekyler og oligomerer in vitro. I dette papir viser vi, hvordan et fluorescens mikroskop kan modificeres blot for at opnå IRM-billeder. IRM er nemmere og betydeligt billigere at implementere end andre kontrast teknikker, såsom mikrokopiering af differentialinterferens eller interferometrisk spredning af mikroskopi. Det er også mindre modtagelige for overfladedefekter og opløsning urenheder end Darkfield mikroskopi. Ved hjælp af IRM, sammen med den billedanalyse software, der er beskrevet i dette papir, er synsfeltet og billedhastigheden kun begrænset af kameraet. med en scmos kamera og bred-felt belysning mikrotubulus længde kan måles med præcision op til 20 Nm med en båndbredde på 10 Hz.
Label-gratis billeddannelse af mikrotubuler er af interesse, da det omgår behovet for fluorescerende mærkning af Tubulin at generere kontrast i billederne. Fluorescerende mærkning har flere ulemper: det er ikke muligt, hvis proteinkoncentrationen er lav1 og foto blegning og foto skade begrænse observationstiden. Flere teknikker er blevet brugt til at billed label-fri microtubuler, herunder video-forstærket differential interferens kontrast mikroskopi (dic) og Darkfield mikroskopi2,3,4,5. For nylig, interferometrisk spredning mikroskopi (iSCAT)6, roterende-sammenhængende-spredning mikroskopi (Rocs)7 og rumlige lys interferens mikroskopi (slim)8, er også blevet brugt. Alle disse teknikker er i stand til at billedbehandlings mikrotubuli og har vist sig at være værdifulde for at studere mikrotubulus dynamik. Men, hver har deres egne begrænsninger. I DIC afhænger kontrasten af vinklen mellem mikrotubulen og Nomarski prisme aksen. I Darkfield nedbrydes mikrotubulus signalet af spredt lys fra urenheder eller overflader defekter. Selvom iSCAT udviser ekstraordinær følsomhed (ned til enkelte proteiner) og ROCS kan billede microtubuli dybere ind i prøven, begge metoder er teknisk krævende, der kræver laser scannere.
Denne protokol viser, hvordan interferens refleksion mikroskopi (IRM)9,10 kan oprettes som en alternativ teknik til Label-fri billeddannelse af microtubuler. IRM er let at implementere, da det kun kræver tilføjelse af et billigt 50/50-spejl til et standard fluorescerende mikroskop. Når den bruges sammen med den software, der er beskrevet her, frembringer IRM højkontrast-mikrotubulære billeder, kan afbilde store synsfelter ved høj hastighed, kræver en engangsjustering og kan nemt kombineres med andre teknikker såsom fluorescens Imaging.
Denne protokol viste en vellykket brug af IRM til afbildning og måling af dynamikken i mikrotubulen. Der skal udvises omhu for korrekt at indstille belysningen numerisk blænde, da det har den stærkeste indvirkning på billedets kontrast. Også ved hjælp af høje numeriske blænde (NA) mål er vigtigt for at få høj opløsning/høj kontrast billeder, som højere NA mål har højere lys indsamling magt i forhold til lav NA mål. Den renere overflade og løsninger, der anvendes lavere støj som snavs ender med at binde sig til overfladen og tilføje (i løbet af eksperimentet) speckle som støj til billederne. Erhvervelse af et baggrundsbillede er vigtigt, samt det fjerner belysning inhomogeniteter, statisk støj og overflade uregelmæssigheder.
En anbefalet modifikation er at introducere et langt pass filter (> 600 nm) i belysnings vejen. Spektret af hvide lyskilder indeholder typisk bølgelængder i UV, som kan beskadige mikrotubuler. Desuden er det praktisk at bruge lang bølgelængde til IRM, når du kombinerer IRM med fluorescens (f. eks. når man studerer virkningen af mikrotubulus associerede proteiner (kort) på dynamikken i mikrotubulen). Vær opmærksom på, at ved billeddannelse i perioder med tidsforskydning formindsker eksempel afdrift (især langs den optiske akse) billedets kontrast på grund af afvigelsen af billedplanet fra baggrunds planet. Moderne mikroskoper er ofte udstyret med stabiliseringsmekanismer (f. eks. perfekt fokus (Nikon), bestemt fokus. 2 (Zeiss), IX3-ZDC2 (Olympus)). En alternativ løsning er at termisk stabilisere opsætningen enten passivt eller aktivt18 eller ved at korrigere for drift19,20,21. Endelig kan mikrotubulus kontrast øges ved at reducere størrelsen af felt membranen (en 70% åbning er godt valg, da det er en balance mellem stigende kontrast og synsfelt størrelse)15.
Mens IRM er egnet til billedbehandlings mikrotubuler, er det ikke følsomt nok til at detektere enkelte proteiner. For en sådan anvendelse, iSCAT er en mere passende teknik. Tilsvarende er fluorescens og iSCAT bedre egnet, hvis sporings præcision på mindre end 10 nm er nødvendig. For IRM er den målte længde sporings præcision ~ 20 Nm som vist i figur 7.
Brug af IRM i Surface-assays kan gå ud over mikrotubuler; for eksempel kan molekylære motorer mærkes med guld nanopartikler og spores, når de interagerer med mikrotubuler. Desuden kan en mere avanceret form for IRM, kendt som reflekterende interferens kontrast mikroskopi (RICM)22 , i princippet bruges til yderligere at forbedre microtubuler kontrast og opnå højere sporings præcision.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Anna Luchniak og Yin-Wei Kuo for kritisk læsning og kommentarer til protokollen.
Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | An inverted microscope used for perfoming the expriments |
50/50 beam splitter | Chroma | 21000 | When buying make sure to choose the splitter dimensions that fit the cube used in the microscope |
NIKON PLAN FLUOR 100X/0.5-1.3 Iris objective | Nikon | MRH02902 | Imaging objective. This objective has a NA adjusting iris that was opened to NA 1.3 |
Mucasol universal detergent | Sigma-aAldrich | Z637181-2L | Used for cleaning coverslips and slides |
plastic paraffin film (commerical name Parafilm M) | Sigma-aAldrich | P7793 | Used for constructing flow channels |
Anti-TAMRA antibody | Invitrogen | A-6397 | Used to bind TAMRA labeled molecules (e.g. microtubules) to the sample surface. RRID (AB_2536196) |
Poloxamer 407 (commercial name Pluronic F-127) | Sigma-aAldrich | Used for blocking the channel surface to prevent nonspecific binding | |
40 nm gold nanoparticles | Sigma-aAldrich | 753637 | Used as a control sample |
20 nm gold nanoparticles | Sigma-aAldrich | 753610 | Used as a control sample |
Zyla 4.2 Camera | Andor | Zyla 4.2 | 2048×2048 pixles (6.5µm pixel size) with quantum efficiency of 72% and 16bit dynamic range |
Feista tracking software | https://www.bcube-dresden.de/fiesta/wiki/FIESTA | ||
Stabilized microtubles | prepared in house (see references in text) |