Detta protokoll är en guide för att implementera störnings reflektions mikroskopi på ett standardfluorescensmikroskop för etiketfri, hög kontrast, höghastighets bild ande av mikrotubuli med in vitro-ytor analyser.
Det finns flera metoder för att visualisera renade biomolekyler nära ytor. Total-intern reflektion fluorescens (TIRF) mikroskopi är en vanlig metod, men har nackdelen att det kräver fluorescerande märkning, som kan störa aktiviteten av molekylerna. Också, Foto blekning och photodamage är bekymmer. När det gäller mikrotubuli, vi har funnit att bilder av liknande kvalitet till TIRF kan erhållas med hjälp av störningar reflektion mikroskopi (IRM). Detta tyder på att IRM kan vara en generell teknik för visualisering av dynamiken i stora biomolekyler och oligomerer in vitro. I det här dokumentet visar vi hur ett fluorescensmikroskop kan modifieras helt enkelt för att erhålla IRM-bilder. IRM är enklare och betydligt billigare att implementera än andra kontrast tekniker som differential interferens kontrast microcopy eller interferometrisk spridning Microscopy. Det är också mindre mottagliga för ytdefekter och lösningsföroreningar än Darkfield-mikroskopi. Med hjälp av IRM, tillsammans med bildanalys programmet som beskrivs i det här dokumentet, begränsas synfältet och bildrutefrekvensen endast av kameran. med en sCMOS kamera och Wide-fält belysning mikrotubuli längd kan mätas med precision upp till 20 nm med en bandbredd på 10 Hz.
Label-fri avbildning av mikrotubuli är av intresse eftersom det kringgår behovet av fluorescerande märkning av tubulin att generera kontrast i bilderna. Fluorescerande märkning har flera nackdelar: det är inte möjligt om protein koncentrationen är låg1 och photoblekning och photodamage begränsa observationstiden. Flera tekniker har använts för att bild etikett-fria mikrotubuli, inklusive video-förstärkt differential interferens kontrast mikroskopi (DIC) och Darkfield mikroskopi2,3,4,5. Nyligen har också interferometrisk spridning mikroskopi (iscat)6, roterande-sammanhängande-spridning mikroskopi (Rocs)7 och rumslig ljus störning mikroskopi (Slim)8, även använts. Alla dessa tekniker kan Imaging mikrotubuli och har visat sig vara värdefulla för att studera mikrotubuli dynamik. Men alla har sina egna begränsningar. I DIC kontrasten beror på vinkeln mellan mikrotubuli och nomarski Prisma axeln. I Darkfield bryts mikrotubulen-signalen ned av spritt ljus från orenheter eller ytdefekter. Även om iSCAT uppvisar extraordinär känslighet (ner till enstaka proteiner) och ROCS kan bild mikrotubuli djupare in i provet, båda metoderna är tekniskt krävande, kräver laser skannrar.
Detta protokoll visar hur interferensreflektions mikroskopi (IRM)9,10 kan ställas in som en alternativ teknik för etikettfri avbildning av mikrotubuli. IRM är lätt att implementera eftersom det bara kräver tillsats av en billig 50/50 spegel till en standard fluorescerande Mikroskop. När det används tillsammans med programvaran som beskrivs här, producerar IRM hög kontrast mikrotubule bilder, kan bild stora fält med hög hastighet, kräver en onetime anpassning, och kan enkelt kombineras med andra tekniker som fluorescens Imaging.
Detta protokoll visade på en lyckad användning av IRM för avbildning och mätning av mikrotubuldynamiken. Försiktighet bör ges för att korrekt ställa in belysningen numerisk bländare eftersom den har starkast inverkan på bildens kontrast. Också, med hög numerisk bländare (NA) mål är viktigt för att få hög upplösning/hög kontrast bilder, eftersom högre NA mål har högre ljus samla makt jämfört med låga NA mål. Den renare ytan och lösningar som används lägre buller som smuts hamnar fästa på ytan och lägga till (under loppet av experimentet) speckle som buller till bilderna. Det är viktigt att förvärva en bakgrundsbild, samtidigt som den avlägsnar inhomogena belysning, statiskt brus och ojämnheter på ytan.
En rekommenderad modifiering är att införa ett lång pass filter (> 600 Nm) i belysnings banan. Spektrumet av vita ljuskällor innehåller typiskt våglängder i UV som kan skada mikrotubuli. Dessutom är det praktiskt att använda lång våglängd för IRM när du kombinerar IRM med fluorescens (t. ex. När du studerar effekten av mikrotubule associerade proteiner (kartor) på mikrotubuledynamik). Tänk på att när avbildning för förbrukas tidsperiod, exempel drift (särskilt längs den optiska axeln) minskar bildkontrasten på grund av avvikelsen av bilden planet från bakgrundsplanet. Moderna Mikroskop är ofta utrustade med stabiliseringsmekanismer (t. ex. perfekt fokus (Nikon), bestämd fokus. 2 (Zeiss), IX3-ZDC2 (Olympus)). En alternativ lösning är att termiskt stabilisera installationen antingen passivt eller aktivt18 eller genom att korrigera för avdrift19,20,21. Slutligen, mikrotubuli kontrast kan ökas genom att minska storleken på fält membran (en 70% öppning är bra val eftersom det är en balans mellan ökande kontrast och synfält storlek)15.
Medan IRM är lämpligt för bild mikrotubuli är det inte tillräckligt känsligt för att detektera enstaka proteiner. För en sådan tillämpning är iSCAT en mer passande teknik. På samma sätt lämpar sig fluorescens och iSCAT bättre om det behövs spårningsprecision på mindre än 10 nm. För IRM är den uppmätta längd spårnings precisionen ~ 20 nm, vilket visas i figur 7.
Användning av IRM i ytanalyser kan gå bortom mikrotubuli; till exempel kan molekyl motorer märkas med Guldnanopartiklar och spåras när de interagerar med mikrotubuli. Dessutom en mer avancerad form av IRM kallas reflekterande interferens kontrast mikroskopi (RICM)22 kan i princip användas för att ytterligare förbättra mikrotubuli kontrast och få högre spårningsprecision.
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Anna Luchniak och Yin-Wei Kuo för kritisk läsning och kommentarer till protokollet.
Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | An inverted microscope used for perfoming the expriments |
50/50 beam splitter | Chroma | 21000 | When buying make sure to choose the splitter dimensions that fit the cube used in the microscope |
NIKON PLAN FLUOR 100X/0.5-1.3 Iris objective | Nikon | MRH02902 | Imaging objective. This objective has a NA adjusting iris that was opened to NA 1.3 |
Mucasol universal detergent | Sigma-aAldrich | Z637181-2L | Used for cleaning coverslips and slides |
plastic paraffin film (commerical name Parafilm M) | Sigma-aAldrich | P7793 | Used for constructing flow channels |
Anti-TAMRA antibody | Invitrogen | A-6397 | Used to bind TAMRA labeled molecules (e.g. microtubules) to the sample surface. RRID (AB_2536196) |
Poloxamer 407 (commercial name Pluronic F-127) | Sigma-aAldrich | Used for blocking the channel surface to prevent nonspecific binding | |
40 nm gold nanoparticles | Sigma-aAldrich | 753637 | Used as a control sample |
20 nm gold nanoparticles | Sigma-aAldrich | 753610 | Used as a control sample |
Zyla 4.2 Camera | Andor | Zyla 4.2 | 2048×2048 pixles (6.5µm pixel size) with quantum efficiency of 72% and 16bit dynamic range |
Feista tracking software | https://www.bcube-dresden.de/fiesta/wiki/FIESTA | ||
Stabilized microtubles | prepared in house (see references in text) |