Summary
פרוטוקול זה מתאר את מערכת התסיסה התרבותית של תרבות האצווה האנושית של מיקרוביוטה בצואה, באמצעות אינולין (באופן מוכר, ואחד מהמיקרוביוטה הנפוצים ביותר) כדי להדגים את השימוש במערכת זו בהערכת השפעות ספציפיות התערבויות על הרכב microbiota צואה ופעילויות מטבולית.
Abstract
התפקיד המתעוררים של מיקרובידום הבטן במספר מחלות אנושיות דורש פריצת דרך של כלים חדשים, טכניקות וטכנולוגיות. שיפורים כאלה נחוצים כדי לפענח את הניצול של מודולים microbiome עבור הטבות בריאות האדם. עם זאת, ההקרנה בקנה מידה גדול אופטימיזציה של מודולטורים כדי לאמת אפנון microbiome ולנבא יתרונות בריאותיים קשורים עשוי להיות קשה כמעט בשל הצורך במספר רב של בעלי חיים ו/או בעלי האדם. לשם כך, במודלים של מבחנה או vivo ex יכול להקל על הקרנה ראשונית של מאפטורים מיקרובידום. בזאת, הוא ממוטב והפגינו לשעבר מערכת התרבות microbiota vivo הצואה שניתן להשתמש בהם כדי לבחון את ההשפעות של התערבויות שונות של מאפטורים במעיים של המעי, כולל פרוביוטיקה, prebiotics ורכיבים אחרים מזון, מלבד ותרופות, על הגיוון וההרכב של מיקרוביוטה המעי האנושי. אינולין, אחד התרכובות הנפוצות ביותר במחקר prebio, ו microbiome מודולטורים, משמש כדוגמה כאן כדי לבחון את השפעתו על הרכב מיקרוביוטה צואה בריא ופעילויות מטבולית שלה, כגון בצואה pH ורמות צואה של חומצות אורגניות כולל חומצות שומן לקטט ושרשרת קצרות (SCFAs). הפרוטוקול עשוי להיות שימושי עבור מחקרים שנועדו להערכת ההשפעות של התערבויות שונות של מודולטורים על פרופילי microbiota צואה ובניבוי השפעות בריאותיות.
Introduction
Microbiota האדם היא קהילה מורכבת המורכבת של חיידקים, הארכנות, וירוסים ו-איקריוטית חיידקים1, כי לאכלס את גוף האדם פנימי וחיצוני. העדויות האחרונות הקימו את התפקיד הבסיסי של המעיים microbiota ואת המעיים מיקרובידום (האוסף כולו של חיידקים והגנים שלהם נמצא במערכת העיכול האנושית) במחלות אנושיות שונות כולל השמנה, סוכרת, מחלות לב וכלי דם, וסרטן1,2,3. בנוסף, המיקרואורגניזמים החיים בבטן שלנו לייצר ספקטרום רחב של מטבוליטים אשר משפיעים באופן משמעותי על הבריאות שלנו, יכול גם לתרום הפתופסולוגיה של מחלות מספר, כמו גם מגוון של פונקציות מטבוליות4, 5. שינויים חריגים (רטבאליות) בקומפוזיציה ובתפקוד של אוכלוסיית המעיים הזאת מכונים בדרך כלל כ "תחושת בטן". דיסביוזיס משויך בדרך כלל עם מצב לא בריא של המארח ולכן ניתן לבדיל מן הקהילה הטבעית (הומאטית) הקשורים במצב בריא של המארח. דפוסים ספציפיים של המעיים מיקרובידום דיסביוזיס מצויים לעתים קרובות במחלות שונות1,2,3,6,7.
התסיסה של מזון בלתי מתעכל, במיוחד פחמימות fermentable/סיבים, על ידי מיקרוביוטה בטן לא רק תשואות אנרגיה אלא גם מייצרת מטבוליטים מפוצלים כולל חומצות שומן קצרות שרשרת (SCFAs), לקטט, formate, פחמן דו חמצני, מתאן, מימן, ואתנול6. בנוסף, מיקרוביוטה המעיים מייצרת גם מספר חומרים ביולוגיים אחרים כגון חומצה פולית, ביוטין, טרימטוליאמין-N-תחמוצת, סרוטונין, טריפטופן, חומצה גמא-עמינח בוטירית, דופמין, נוראדרנלין, אצטילכולין, היסטמין, חומצה דאוקסיכופילית ו-4-אתיל סולפט. הדבר מתרחש בעיקר באמצעות הניצול של פלקסים מטבולית פנימית בתוך נישה חיידק מארח, אשר תורמת בכמה תהליכי הגוף, פונקציות מטבולית ושינויים אפיגנטיים1,8,9, . בסדר, עשר עם זאת, ההשפעות של התערבויות שונות על מוצרים מסוג זה להישאר אירעה או לא ברור בשל היעדר קל, יעיל ומהווה פרוטוקולים להיות ברורים. הרכב מיקרוביוטה של הבטן האנושית הוא מערכת אקולוגית מורכבת ומגוונת ביותר, ולכן, שאלות רבות לגבי תפקידה בבריאות האדם ובמחלות המחלה עדיין נשארות ללא מענה. ההשפעות של הרבה במעי המשותף מודולטורים הנפוצים (למשל, פרוביוטיקה, prebiotics, אנטיביוטיקה, השתלת צואה וזיהומים) על הרכב פונקציות מטבולית של microbiome המעי להישאר חמקמק במידה רבה. בנוסף, הבדיקה והאימות של תופעות אלה ב vivo הוא קשה, במיוחד משום שרוב החומרים המזינים ומטבוליטים המיוצרים על ידי מיקרוביוטה המעיים נספגים או נפטרים של בו זמנית ובמהירות בבטן; לכן, מדידת הייצור, כמות ועיבוד של מטבוליטים אלה (g., SCFAs) ב vivo עדיין נשאר אתגר מעשי. אכן, מודלים פיזיולוגיים כגון בעלי חיים ונושאים אנושיים הם קריטיים לקביעת התפקיד של מיקרובידום המעיים והאפנון שלה על בריאות מארח, אבל אלה לא יכול להיות מתאים הקרנת בקנה מידה גדול של סוגים שונים של מודולים microbiome בשל אילוצי מוסר, כספיים או זמן. לשם כך, ב-vivo מבחנה ו/או לשעבר מודלים, כגון culturing של מיקרוביוטה במבחנה ולאחר מכן להתערב עם מודולים microbiota שונים, יכול להציע זמן וכסף הזדמנויות ומכאן יכול לאפשר הקרנה ראשונית או בקנה מידה גדול של מרכיבים שונים (כגון פרוביוטיקה, prebiotics, ותרכובות התערבותית אחרים) כדי לבחון/לנבא את ההשפעות שלהם על הגיוון microbiota צואה, קומפוזיציה ופרופילים מטבוליים. מחקרים באמצעות כגון מערכות מחוץ לvivo לשעבר של מיקרובידום הבטן עשוי להקל על הבנה נוספת של המארחים-microbiome מארח שתורמים לארח בריאות ומחלות, והוא יכול גם להוביל למציאת טיפולים חדשניים המטרה מיקרובידום ל שפר בריאות המארחת ולמנוע ולטפל במחלות שונות1.
למרות שמערכות התרבות של מיקרוביוטה בבטן החוץ לא יכולות לשכפל באמת את תנאי המעיים הממשיים, מספר מעבדות השתדלו לפתח מודלים כאלה, שחלקם נמצאו מעשי במידה מסוימת והשתמשו בהם בהצלחה ל מטרות שונות. אחד מדגמי הבטן האחרונים הוא סימולטור של המערכת האקולוגית של מעיים אנושיים, אשר מחקה את מערכת העיכול האנושית כולה, כולל הקיבה, המעי הדק, ואזורים שונים של המעי הגס. עם זאת, מודלים מורכבים מבחינה טכנית לא יהיו נגישים למתקני מחקר אחרים ברחבי העולם. לכן, יש עדיין צורך קריטי לפיתוח דגמים חלופיים חדשים, כי הם פשוטים יחסית, במחיר סביר ומעשי עבור מעבדות לימוד מודולים microbiome ואת ההשפעות שלהם על המעיים microbiome ובריאות מארח. מכאן, השימוש של מבחנה (או ex vivo) מערכת התרבות מיקרוביוטה הצואה יהיה שימושי ללמוד את ההשפעות של התערבויות כאלה11,12. באופן ספציפי, את ההשפעה של prebiotics שונים על קיבולת תסיסה microbiota מבחינת שינויים תקופתיים מגוון מיקרוביוטה הבטן והרכב, ה-pH צואה, ואת רמות של מטבוליטים מיקרוביאלית כולל SCFAs ו לקטט ניתן ללמוד 13. בזאת, באמצעות אינולין (אחד הרכיבים הנפוצים ביותר לחקור prebiotic יוטי) כדוגמה של מודול microbiome, הפרוטוקול צעד אחר צעד של מערכת האצווה vivo microbiome פשוטה זו לשעבר מתוארים כדי להדגים את השימוש בה כדי להעריך את ה שינויים במיקרוביוטה הצואה ומיקרוטבוליטים בעקבות התערבות עם מודולים מיקרובידום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
התראה: עיין בגיליונות הנתונים של בטיחות החומרים המתאימים ופעל לפי ההנחיות וההנחיות להכשרה מתאימה ברמת בטיחות ברמה 2 (BSL-2). בצע את כל השלבים culturing לפי כללי אבטחה טיחות סטנדרטי להשתמש בקבינט bsl-2 בתנאים אספטי. יתר על כן, דגימות צואה מדגמים שונים ונושאים אנושיים עשויים להיות סיכון פוטנציאלי להפצת מחלות המועברות בחיידקים. פנו מיד לעזרה רפואית בהתרחשות כל פציעה וזיהום. בנוסף, יש לקבל את השימוש בדגימות הצואה של בני אדם ובעלי חיים באמצעות ועדות אתיות מוסדית ולהיות מתאימות לפרוטוקולים לשימוש בדגימות ובמידע על הנושא.
1. הכנת המדיה התרבותית
-
הכנת מדיית התרבות, הכנת תשעה סוגים של פתרונות מניות
- פתרון A (1,000 mL): התמוססות 5.4 g של נתרן כלוריד (היום), 2.7 גרם של אשלגן דו-חמצני ימן פוספט (KH2PO4), 0.16 g של סידן כלוריד דו-חמצני ידרוקסיד (cacl2· 2h2O), 0.12 g של מגנזיום כלוריד הקסאומיים (mgcl .2 · 6h2o), 0.06 גרם של מנגן כלוריד הטטרמים (mncl 2 · 4h2o), 0.06 g של הקסאואוס כלוריד (cocl2· 6h2o), ו 5.4 g של אמוניום סולפט (NH4)2כל כך4, במים מפוהים כדי להפוך את הנפח הכולל ל 1,000 mL.
- פתרון B (1,000 mL): התמוססות 2.7 g אשלגן מימן פוספט (K2HPO4) במים מוכי להפוך נפח כולל ל 1000 mL.
- מעקב פתרון מינרלי (1,000 mL): התמוססות 500 mg של ניתרן ethylenediamine-טטראצטט ניתרן ידרוקסיד (Na2edta), 200 מ"ג של סולפט ברזלי הפטבמים (feso4· 7h2O), 10 מ ג של אבץ סולפט הפטבמים (לייפוסו4 · 7H2o), 3 מ ג של מנגן (II) כלוריד (MnCl2· 4h2O), 30 מ ג של חומצה זרחתית (H3PO4), 20 מ"ג שלcocl 2 · 6h2O, 1 מ ג של cupric כלוריד dihydrate ידרוקסיד (cucl2 · 2H2o), 2 מ ג ניקל (II) כלוריד הקסהמים (nicl2· 6h2o) ו 3 מ"ג של נתרן molybdate dihydrate (Na2MoO4· 2h2o) במים מאוהים כדי להפוך נפח כולל ל 1,000 mL.
הערה: פתרון זה הוא רגיש באור, ולכן להבטיח להיות מאוחסן בצינורות כהים/שחור או אלומיניום עטוף/בקבוקים. - פתרון ויטמין מסיס מים (1,000 mL): התמוססות 100 מ"ג של תיאמין הידרוכלוריד (תיאמין-HCl), 100 מ"ג של D-פנטטאז חומצה, 100 mg של ניאצין, 100 mg של pyridoxine, 5 מ"ג של P-האמיזואיקון חומצה ו-0.25 mg של ויטמין B12 במים מוכי להפוך את הנפח 1,000 מ ל.
- חומצה פולית: הפתרון ביוטין (1,000 mL): התמוססות 10 מ"ג של חומצה פולית, 2 מ ג של D-ביוטין ו 100 מ"ג של אמוניום ביקרבונט (NH4hco3) במים מיועמים כדי להפוך נפח כולל ל 1,000 mL.
- הריבופלאווין פתרון (1,000 mL): לפזר 10 מ"ג של ריבופלאווין ב 5 מ"מ HEPES (1.19 g/L) פתרון כדי להפוך את הנפח הכולל ל 1,000 mL.
- הפתרון hemin (10 מ ל): לפזר 5,000 מ"ג של Hemin ב 10 מ"מ נתרן הידרוקסיד (NaOH) (0.4 g/L) פתרון כדי להפוך את הנפח הכולל ל 10 mL.
- שרשרת נמוכה חומצת שומן ערבוב (10 מ ל): לשלב 2.5 mL של N-valerate 2.5 מ ל של isovalerate 2.5 mL של שיעור איזובוטיש ו2.5 mL: DL-α-מתילבוטיש.
הערה: פתרון זה מומלץ להשתמש בתוך מאדים כדי למנוע ריח ואדים. - Resazurin (1,000 mL): לפזר 1 גרם של resazurin מים מוכי להפוך את הנפח הכולל ל 1,000 mL.
-
מדיום משמש לתסיסה אנאירובית מחוץ לגוף
- כדי להכין מדיה זו, לערבב 330 mL של פתרון A, 330 mL של פתרון B, 10 מ ל של פתרון מינרלים עקבות, 20 מ ל של פתרון ויטמין מסיס מים, 5 מ ל חומצה פולית: ביוטין פתרון, 5 מ ל של פתרון הריבופלאווין; 2.5 מ ל של הפתרון Hemin, 0.4 mL של שרשרת שומן קצר לערבב חומצת, 1 מ ל של Resazurin, 0.5 g של תמצית שמרים, 4 גרם של נתרן פחמתי (Na2CO3), 0.5 g של cysteine HCl-H2O, ו-0.5 g של טריטיקרה, ולהוסיף 296.1 mL של מים מזוקקים.
- בדוק את ה-pH ולוודא שזה בסביבות 7.0, אם לא, להתאים את ה-pH עם 1 N HCl או N NaOH. עיקור על ידי ואקום סינון התקשורת באמצעות מסנן בקבוק תחת תחנת העבודה אספטי.
- לחילופין, מערבבים את כל הרכיבים (למעט הויטמין והפתרונות המין) ומ121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות ומצננים את טמפרטורת החדר. במקביל, מסננים לחטא ויטמין ופתרונות המין באמצעות מסננים 0.22 יקרומטר ממברנה ולהוסיף אותם לתוך מדיה אוטומטית ומקורר לפני החילוק.
2. הכנת חדר אנאירובי וחומר נדרש
- שמור את כל החומרים, הפתרונות והכלים הדרושים לניסוי התסיסה בתוך החדר האנאירובי לפחות 48 h לפני תחילת הניסוי, כדי להבטיח כי כל שרידי חמצן הקשורים כלים וחמצן מסיסים במאגרים/פתרונות הוא להסיר את כל החומרים הם ההסתגלות לתנאים אנאירובית להגדיר.
הערה: חומרים הדרושים בתוך קאמרית אנאירובית (48 h מוקדם יותר של ניסוי להתחיל): (i) מדיה תסיסה; (ii) פתרון אנאירובי (מוכן לפי סעיף 4.1), (iii) vortexer, (iv) איזון במשקל, (v) מולין גבינה בגדים, (vi) מספריים, (vii) משפך, (viii) 1.5, 2.0, 15, 50 מ"ל צינורות, (ix) הפיפטורים (2, 20, 200 ו-1,000 μL) ולקבל טיפים תואמים pipet, (x) אקדח pipet ו pipet מחמד (5 ו 10 mL), (xi) נייר רקמות, (xii) סמנים, (xiii) הצינור עומד על צינורות שונים, (xiii) פסולת תיבת, (15) O2 אינדיקטור ו (השישה עשר) 70% אתנול בקבוק תרסיס (חיטוי).
3. הכנת צינורות וסיבים
- משקל 300 מ ג של אינולין והעברה לצינור 50 mL ואחריו בתוספת הספטטית של 26 מ ל של מדיית תסיסה כבר מוכן ומאוחסן בחדר אנאירובית. הכינו צינורית אחת ריקה לכל סוג דגימת צואה ושפופרת ניסוי (של) (על פי מספר התרכובות שנבדקו), בטרילקאט.
- השאירו את הצינורות האלה בתוך החדר האנאירובי למשך כ -24 שעות כדי לאפשר לחות של דגימות לפני תחילת ניסוי התסיסה. ודא שטמפרטורת הצינור היא 37 ° c בזמן החיסונים, ולכן הביאו את הצינורות בחממה התחומה בתוך התא האנאירובי.
4. הכנת הרשת
- תמיסת דילול אנאירובית (לפחות 48 h לפני ניסוי תסיסה): התמוססות 5 גרם של הנרוג, 2 גר' גלוקוז ו-0.3 g של Cysteine-HCl במים ממוהים והפוך נפח כולל ל 1,000 mL. אוטוקלב ולאחסן אותו בתוך התא אנאירובי לפחות 48 h לפני השימוש.
- הכנת הצואה (ביום הניסוי התסיסה): שוקל 5 גרם של דגימת צואה טרייה בצינור ה50 mL, להוסיף תמיסת דילול אנאירובית עבור נפח סופי של 50 mL (1:10 w/v) ו מערבולת עבור 15 דקות או עד הומוגניים לחלוטין. מסננים את התערובת הומוגניים באמצעות 4 שכבות של גזה סטרילי (אוטוקלבד) ולהשתמש בו מיד לחיסון הצינורות המכילים מדיה.
הערה: דגימות צואה מתוך קבוצה של נושאים יכול להיות ממאגר אם המטרה הניסיונית היא להשוות את ההשפעה של תרכובת נתונה/המרכיב על בריא כללי לעומת הצואה החולה microbiota בכלל.
5. תסיסה ודיגום
- הכינו צינורות בהתאם לסעיף 4.2 ו-האיחסן ריק/בקרה וצינורות ניסיוני עם 4 מ ל של בצואה מדולל ומסוננים. דגירה את הצינורות מחוסן ב 37 ° c בתוך התא אנאירובי. לנער את הצינורות פעם בשעה על ידי היפוך בעדינות כדי להשעות מחדש את הסיבים והאינואוטים.
- לאסוף דגימות לעתים קרובות לפי הצורך, למשל, מדי שעה כדי 0, 3, 6, 9 ו 24 h במהלך התסיסה על ידי לקיחת 2 מ ל המדגם לתוך שפופרת 2 mL מצינורות המתאימים ההתאמה.
- למדוד את ה-pH של האליבורטים באמצעות מד pH מעבדה (על ידי הכנסת ישירות את האלקטרודה pH במדגם); צנטריפוגה את המדגם הנותר ב 14,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c. הקפא מיד את הסופרנטאנט ואת הגלולה בחנקן נוזלי, ולאחר הקפאת ההקפאה, אחסן את הסופרנטנט לניתוח SCFAs וכלי הגלולה לניתוח microbiome ב-80 ° c.
6. חומצות שומן קצרות (SCFAs) ולקטט קוונפיקציה
הערה: Scfas ולקטט ב-supernatant של תרבות microbiome ניתן למדוד בדיוק על פי השיטות המפורטות במקום אחר13,14,15,16.
- בקצרה, להפשיר את הצמד הקפואים supernatants שהתקבלו בסעיף 5 מתוך שליטה דגימות הטיפול על קרח ולבצע את כל הצעדים לעיבוד נוסף על הקרח. לסנן את supernatant באמצעות מסנן ממברנה 0.45 יקרומטר ולהשתמש בדגימות ללא תא כדי למדוד את ריכוזי scfas ו לקטט באמצעות מערכת המדידה עם גלאי אבא ב 210 nm, מצויד בטור hpx-87. השתמש בנפח ההכנסה של 10 μL לכל דוגמה והשתמש ב-H2SO4 (0.005 N) כדי לבצע העמודה בקצב הזרימה של 0.6 mL/Min ב-35 ° c.
7. ניתוח מיקרובידום בצואה
הערה: בצע ניתוח microbiome בעקבות שיטות וצינור מפורט במקומות אחרים7,13,14,17.
- בקצרה, לחלץ דנ א גנומית מתוך כ 200 מ"ג של כדורי להשתהות בצואה באמצעות ערכת ה-DNA בצואה החילוץ ערכה13.
- להגביר את האזור hypervariable שתנה של הגן החיידקי של 16S rRNA באמצעות התחל מקודד לפי השיטה המתוארת במקום אחר13, באמצעות רצפים פריימר כפי שמתואר בתוך האדמה Microbiome פרויקט בפרוטוקול18.
- לטהר את הגברה וכתוצאה מכך עם חרוזי טיהור מגנטיים ומכמת על ידי Picogreen או שיטה מקבילה. מאגר מוצרי ה-PCR המטוהרים בריכוז מולרי שווה וברצף על מערך13.
- לעבד את הרצפים הנובעים עבור דה-ריבוב, סינון איכות וקיבוץ באשכולות, הקצאת מיסים, ואקום, וניתוח במורד הזרם באמצעות תובנות כמותיים לתוך מיקרוביאלית (QIIME) תוכנה לפי השיטות המתוארות על ידי קאוראסו ואח '19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוטוקול משמש כדי להדגים את ההשפעה של ביוביוטיקה ספציפית (כלומר, אינולין על הרכב microbiota ופעילויות מטבוליות במונחים של שינויים ב-pH צואה ואת הריכוז של לקטט ו scprea בצואה של נושאים אנושיים בריאים על נקודות זמן שונות לאחר הטיפול עם אינולין). ה-pH צואה, רמות צואה של לקטט ו SCFAs (איור 1), ואת הרכב microbiota (איור 2 ואיור 3) נמדדים ב 0 (בסיס), 9 ו-24 שעות של דגירה עם או בלי אינולין. התוצאות להפגין כיצד הרכב microbiota צואה ופעילויות מטבוליות שלה מאופנן במהלך תסיסה מחוץ לחומרים עם או בלי טיפול אינולין.
איור 1: שינויים ב-pH בצואה (a), לקטט (ב) וחומצות שומן קצרות שרשרת. אצטט (c), propionate (ד) ו בוטיט (e) בצואה אנושית ב 0 (בסיס), 9 ו 24 h של תסיסה אנאירובית עם או בלי אינולין. ערכים שהוצגו כאן הם ממוצע ± SEM של דגימות טרילקייט. * P < 0.05, * *p < 0.01, * * *p < 0.001, לעומת הבסיס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: שינויים במגוון המיקרוביוטה ובקומפוזיציה בצואת האדם ב -0 (קו בסיס), 9 ו -24 שעות של תסיסה אנאירובית עם או בלי אינולין. (a) משוקלל ו (ב) אמצעים unifrac משוקלל של ביתא מגוון דמיינו באמצעות ניתוח קואורדינטות העיקרון (pcoa). (c-f) מדדי הגיוון האלפא כלומר. הגיוון הפילוגנטי (c); מינים עושר (Chao1; d); מספר היחידות התפעוליות (OTUs, e); ואפילו מינים (מדד שאנון, f)). השפע היחסי של מייג phyla (g) ו סוגים (h). ערכים שהוצגו כאן הם ממוצע ± SEM של דגימות טרילקייט. * P < 0.05, * *P < 0.01, לעומת הבסיס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ניתוח ליניארי מבדיל (אידה) גודל אפקט (LEfSe) ניתוח של שינויים מיקרוביוטה בבטן בעקבות 9 h ו 24 הדגירה הבאה עם (לנו) או ללא (CTL) inulin. Cladogram מטקמי נגזר ניתוח LEfSe של רצפי 16S (שפע יחסי ≥ 0.5%) המייצג את הטקבין הנפוץ ביותר בין קבוצה שונה של דגימות. הבהירות של כל נקודה היא פרופורציונלית לגודל האפקט שלה (כלומר, השפע טקסון). ניתן לראות כאן רק את ערך הסף החולף של > 2.4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מודל תסיסה בצואה מבחנה מוצג כאן הוא מודל פשוט אצווה יחיד לקירוב ההשפעות של מצעים שונים וזנים מיקרוביאלית (למשל, prebiotics ו פרוביוטיקה) על ההרכב של האדם microbiota בצואה, כמו גם ה פעילות מטבולית במונחים של הצואה pH ו SCFAs רמות. התוצאות המוצגות בזאת להפגין כי החיסונים של אינולין מקטין את ה-pH בצואה ומגדיל באופן משמעותי את רמות scfas ו לקטט בדגימה בצואה מטופלים אינולין לעומת התרבות המיקרוביוטה בצואה שאינם מטופלים (איור 1). בנוסף, חתימת המעיים מיקרוביוטה מופיעה גם כשונה מדגימות שאינן מטופלות ובלתי מטופלות (איור 2 ואיור 3). נתונים אלה להדגים כיצד מערכת זו יכולה לשקף את ההשפעות של אינולין על הגיוון microbiome בצואה וקומפוזיציה, כמו גם פעילויות מטבולית שלה. בנוסף, בהתאם למטרות נסיוניות ספציפיות והשערות, ניתן גם למדוד מגוון גורמים אחרים באמצעות מערכת זו. יתרה מזאת, בנוסף לרצף הגנים של ה -16 rRNA, ניתוחים אחרים כגון רצף של מבני מתכת שלמים (באמצעות רצף הגנום כולו) או qPCR ושיטות התרבות ממוקדות ביחיד או מספר כללי, מינים וזנים (למשל, bifidobacteria, לקטטבק, אקקרמנסיה, בידור, ה, קלוסטרידיה, וכו '. ניתן גם לבצע. בנוסף, הליכים כרומטוגרפיים שונים לניתוח של SCFAs, כגון LC-MS, GC, GC-MS, GC-לפיד, ו-בדיקות יכול גם להיות מנוצלת על בסיס דרישה ניסיונית וזמינות. עם זאת, יש לציין כי הכנה לדוגמה להליכים אלה עשויה להשתנות בהתאם למכשירים ולתנאים הנדרשים לפעולה20.
למרות שהשימוש בדגימה מצואה טרייה תניב תוצאות מיטביות; עם זאת, הצמד מדגם צואה קפוא (כפי שנעשה בשימוש בניסוי המוצג בזאת) יכול לשמש גם יסתיר כמו רוב החיידקים ניתן להחיות ממנו פעם החייאה לתוך טמפרטורת הגוף ולא עוד ריקבון קורה אחרי ההקפאה21. השימוש במדגם קפוא יכול להיות יתרון במיוחד כאשר אי אפשר לקבל דגימות צואה טריות מתורמים ספציפיים ביום המתוכנן של הניסוי, או מאותו תורם כאשר הניסוי צריך להיות משוכפל. יש לציין, עם זאת, כי דגימות צואה צריך להיות מוקפא באמצעות חנקן נוזלי באופן מיידי מאוחסן ב-80 ° צ' עד שימוש נוסף. בנוסף, כדי למנוע את החשיפה של דגימות צואה קפוא לאוויר (חמצן), את הדגימות יש להעביר לחדר אנאירובי בהקדם האפשרי/מיד לאחר היציאה מן המקפיא ובשימוש מיד (התעליה חוזרת יש להימנע). כל הניסויים הבאים כולל הפשרה לדוגמה, הכנה לייצור ועיבוד צריך להיעשות בתוך החדר אנאירובי.
הסביבה אורגני המעיים ו-pH במהלך תסיסה מזינים במעי גדול חשובים מאוד במיוחד לנוכח העובדה כי pH מופחת באופן חריג מעיד על חומציות מוגברת בשל ניצול מצע. מכאן, הפחתת pH מהירה יותר יכול להתאים ניצול מצע מהיר יותר22. למרות, במודל זה, ה-pH לא נשלט, עם זאת, הכללת שליטה לא מטופלים זהה מומלץ מאוד לבצע השוואות ישירות. Scfas המיוצר במעי הגס כתוצאה התסיסה של אבל פוליסכרידים על ידי המעיים microbiota יכול להשפיע עוד יותר על מנגנונים שונים הקשורים לתחזוקת הבריאות המארחת. אלה מטבוליטים לתרום גלוקונאוגנזה ו biosynthesis השומנים, לפעול כמקור אנרגיה עבור הקולונציטים, והוא יכול גם לקבל יתרונות בריאותיים כולל אפנון החיסונית, נשלט/משופר מכשול התפקוד התפקודי, ו נוירומודולציה23, 24,25,26. בנוסף, scfas ידוע גם להשפיע על מסלולים ביולוגיים כולל הורמונים, מערכת אנדוקאנביאיד, התפשטות התא ומוות, עצם בריאות, ספיגת מינרלים, הבטן לתנועתיות, מעיים pH, והיפוך השפעות על המעיים מיקרובידום ו פונקציה מטבולית מיקרוביאלית. לכן, הידע של הפרופיל והריכוזים של המעי/צואה SCFAs יכול להיות מרכיב חשוב תוך הערכת היעילות של מודול microbiota ספציפיים6. כמובן, מלבד SCFAs, מיקרובידום בטן גם מייצרת רבים מטבוליטים חשובים אחרים (g., אמוניום, ויטמינים, היסטמין). מכאן, דגימות supernatant שנאספו במהלך כזה בניסויים תסיסה מבחנה יכול להיות גם מוערך עבור ניתוחים טבולומיקס הכללית כדי לגלות במעי הרומן microbiome נגזר מטבוליטים, כי ניתן להשפיע על ידי מודולים ספציפיים microbiome.
למערכת המתוארת כאן יתרונות רבים, כגון הקלות, הפשטות, יעילות העלות והמאמצים הכלליים של הגדרת הניסוי. עם זאת, ישנן גם מספר מגבלות. לדוגמה, המערכת אינה נוגעת לאינטראקציה של prebiotics (או התערבויות אחרות בשימוש) במערכת העיכול העליונה (למשל, רוק, בטן, המעי הדק) לפני שנחשפים microbiota של המעי הגס. עם זאת, צעדים כאלה יכולים להיות מאומצים ומשולבים בהתאם לדרישות נסיוניות ספציפיות. כמו כן, ייתכן שיהיה צורך לבצע תהליך הידרוליזה חומצי ו/או אנזימטיות לפני תסיסה אם באמצעות מצעים מסוימים, לרבות מזון שלם או מזון מעכל, משום שרק החלק האבל של מאכלים כאלה מגיע למעי הגס להיות מותסס על ידי התחתון . בטן מיקרוביוטה בנוסף, ההרכב של מיקרוביוטה המעיים עשוי לנוע עקב תנאי תרבות ספציפיים במהלך התסיסה. לדוגמה, זה נצפה כי עד 9 שעות של דגירה, שינויים microbiota הם הרבה יותר קרוב נורמלי מאשר 24 h. עם זאת, לאחר 24 שעות של דגירה, למרות רמת pH ו SCFAs גדל באופן משמעותי, הרכב מיקרוביוטה בטן הראה כי החיידקים הגדילה מוגברת בעוד הגיוון חיידקים מופחת. עם זאת, הוא נשאר ידוע כיצד בדיוק ומקרוב את הצטברות מוגברת של מיקרוטבוליטים מיקרוביאלית בליווי ה-pH הוריד את הצואה קשורה עם חתימות microbiota ספציפיים.
לסיכום, פרוטוקול פשוט לדמות מערכת האקולוגית vivo microbiota לשעבר מתוארת להלן. המערכת מאפשרת לחוקרים לבדוק התערבויות שונות עבור אפנון של גיוון microbiota, קומפוזיציה מטבולית פונקציה שיכולה להשפיע על תכונות מגוונות של המעי המארח הבריאות הכללית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
המחברים מכירים בהכרת תודה את תמיכתם של המרכז לסוכרת, השמנת יתר ומטבוליזם ומרכז המדע הקליני והטרנסלtional, בית הספר לרפואה של יער ההתעוררות, מחלקת מימון ההגנה (מספר מענק: W81XWH-18-1-0118), הכיסא השני של קרמיט גלן פיליפס ב רפואת לב וכלי דם; המכון הלאומי לבריאות במימון קלוד ד. פפר מבוגרים אמריקאים מרכז (ממומן על ידי P30AG12232); R01AG18915; R01DK114224 ומרכז המדע הקליני וטרנסלtional (יחידת המחקר הקליני, ממומן על ידי UL1TR001420), מודה גם למרבה המזל. אנו מודים גם למתנדבים שסיפקו דגימות צואה, וחברי המעבדה האחרים שלנו לעזרה טכנית במהלך ניסוי זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | 217255 | |
| Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 | TGI | C2388 | Toxic |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2•2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | Irritating |
| Cobaltous Chloride Hexahydrate (CoCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | 255599 | |
| Cupric Chloride Dihydrate (CuCl2•2H2O) | Acros organics | 2063450000 | Toxic, Irritating |
| Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C121800 | |
| D-biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| D-Pantothenic acid | Alfa Aesar | A16609 | |
| Disodium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrate (Na2EDTA) | Biorad | 1610729 | |
| DL-α-methylbutyrate | Sigma-Aldrich | W271918 | |
| Ferrous Sulfate Heptahydrate (FeSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | F8263 | Toxic |
| Folic acid | Alfa Aesar | J62937 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | |
| Hepes | Alfa Aesar | A14777 | |
| Isobutyrate | Alfa Aesar | L04038 | |
| Isovalerate | Alfa Aesar | A18642 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Manganese Chloride Tetrahydrate (MnCl2•4H2O) | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Niacin (Nicotinic acid) | Sigma-Aldrich | N4126 | |
| Nickel(Ii) Chloride Hexahydrate (NiCl2•6H2O) | Alfa Aesar | A14366 | Toxic |
| N-valerate | Sigma-Aldrich | 240370 | |
| P-aminobenzoic acid | MP China | 102569 | Toxic, Irritating |
| Phosphoric Acid (H3PO4) | Sigma-Aldrich | P5811 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5504 | |
| Potassium Hydrogen Phosphate (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | 1551128 | |
| Pyridoxine | Alfa Aesar | A12041 | |
| Resazurin | Sigma-Aldrich | R7017 | |
| Riboflavin | Alfa Aesar | A11764 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | 1613757 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher BioReagents | 7647-14-5 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Chemicals | S320 | |
| Sodium Molybdate Dihydrate (Na2MoO4•2H2O) | Acros organics | 206375000 | |
| Thiamine Hydrochloride (Thiamin-HCl) | Acros organics | 148991000 | |
| Trypticase | BD Biosciences | 211921 | |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161 | |
| Zinc Sulfate Heptahydrate (ZnSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
| 0.22 µm membrane filter | |||
| AMPure magnetic purification beads | Agencourt | ||
| Anaerobic chamber with incubatore | Forma anaerobic system, Thermo Scientific, USA | ||
| Bottle filter | Corning | ||
| Cheesecloth | |||
| Illumina MiSeq sequencer | Miseq reagent kit v3 | ||
| pH meter | |||
| Qiagen PowerFecal kit | Qiagen | ||
| Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software | |||
| Qubit-3 fluorimeter | InVitrogen | ||
| Vortex | Thermoscientific | ||
| Waters-2695 Alliance HPLC system | Waters Corporation |
References
- Shreiner, A. B., Kao, J. Y., Young, V. B. The gut microbiome in health and in disease. Current Opinion in Gastroenterology. 31 (1), 69-75 (2015).
- Xu, Z., Knight, R. Dietary effects on human gut microbiome diversity. British Journal of Nutrition. 113, 1-5 (2015).
- Jiang, C., Li, G., Huang, P., Liu, Z., Zhao, B. The gut microbiota and Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimers Disease. 58 (1), 1-15 (2017).
- Clemente, J. C., Ursell, L. K., Parfrey, L. W., Knight, R. The impact of the gut microbiota on human health: an integrative view. The Journal Cell. 148 (6), 1258-1270 (2012).
- Yadav, H., Jain, S., Marotta, F. Probiotics mediated modulation of gut flora might be biotherapeutical approach obesity and type 2 diabetes. Metabolomics : Open Access. 1 (3), 1-3 (2011).
- Ahmadi, S., et al. Dietary Polysaccharides in the Amelioration of Gut Microbiome Dysbiosis and Metabolic Diseases. Obesity and Control Theries: Open Access. 4 (3), (2017).
- Nagpal, R., et al. Obesity-Linked Gut Microbiome Dysbiosis Associated with Derangements in Gut Permeability and Intestinal Cellular Homeostasis Independent of Diet. Journal of Diabetes Research. , 1-9 (2018).
- Paul, B., et al. Influences of diet and the gut microbiome on epigenetic modulation in cancer and other diseases. Journal of Clinical Epigenetics. 7 (1), 112 (2015).
- O’mahony, S., Clarke, G., Borre, Y., Dinan, T., Cryan, J. Serotonin tryptophan metabolism and the brain-gut-microbiome axis. Journal of Behavioural Brain Research. 277, 32-48 (2015).
- Sharon, G., et al. Specialized metabolites from the microbiome in health and disease. Journal of Cell Metabolism. 20 (5), 719-730 (2014).
- Faber, T. A., Bauer, L. L., Price, N. P., Hopkins, A. C., Fahey, G. C. In vitro digestion and fermentation characteristics of temulose molasses, a coproduct of fiberboard production, and select temulose fractions using canine fecal inoculum. Journal of Agricultural Food Chemistry. 59 (5), 1847-1853 (2011).
- Bourquin, L. D., Titgemeyer, E. C., Fahey, G. C. Vegetable fiber fermentation by human fecal bacteria: cell wall polysaccharide disappearance and short-chain fatty acid production during in vitro fermentation and water-holding capacity of unfermented residues. Journal of Nutrition. 123 (5), 860-869 (1993).
- Nagpal, R., et al. Human-origin probiotic cocktail increases short-chain fatty acid production via modulation of mice and human gut microbiome. Scientific Reports. 8 (1), 12649 (2018).
- Nagpal, R., et al. Comparative microbiome signatures and short-chain fatty acids in mouse, rat, non-human primate and human feces. Frontiers in Microbiology. 9, 2897 (2018).
- Thangamani, S., Guinan, J., Wang, S., Yadav, H. Antibiotic-induced decreases in the levels of microbial-derived short-chain fatty acids promote gastrointestinal colonization of Candida albicans. bioRxiv. , 428474 (2018).
- Ahmadi, S., et al. Prebiotics from acorn and sago prevent high-fat diet-induced insulin resistance via microbiome-gut-brain axis modulation. The Journal of Nutritional Biochemistry. , (2019).
- Nagpal, R., et al. Gut Microbiome Composition in Non-human Primates Consuming a Western or Mediterranean Diet. Frontiers in Nutrition. 5, 28 (2018).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME Journal. 6 (8), 1621-1624 (2012).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
- Garcia-Villalba, R., et al. Alternative method for gas chromatography-mass spectrometry analysis of short-chain fatty acids in faecal samples. Journal of Seperation Science. 35 (15), 1906-1913 (2012).
- Lee, C. H., et al. Frozen vs Fresh Fecal Microbiota Transplantation and Clinical Resolution of Diarrhea in Patients With Recurrent Clostridium difficile Infection: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 315 (2), 142-149 (2016).
- Chen, M. -H., et al. In vitro fermentation of xylooligosaccharides produced from Miscanthus× giganteus by human fecal microbiota. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64 (1), 262-267 (2015).
- Cook, S., Sellin, J. Short chain fatty acids in health and disease. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 12 (6), 499-507 (1998).
- Rastelli, M., Knauf, C., Cani, P. D. Gut microbes and health: a focus on the mechanisms linking microbes, obesity, and related disorders. Obesity. 26 (5), 792-800 (2018).
- Zou, J., et al. Fiber-mediated nourishment of gut microbiota protects against diet-induced obesity by restoring IL-22-mediated colonic health. Cell Host & Microbe. 23 (1), e44 41-53 (2018).
- Dinan, T. G., Cryan, J. F. Gut–brain axis in 2016: Brain–gut–microbiota axis—mood, metabolism and behaviour. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (2), 69 (2017).
