Summary
يصف هذا البروتوكول نظام تخمير في المختبر للزراعة الدفعية من ميكروبيوتا البراز البشري، وذلك باستخدام الإينولين (البريبايوتيك المعروف واحد من أكثر المغيرات المجهرية دراسة على نطاق واسع) لإثبات استخدام هذا النظام في تقدير آثار محددة التدخلات على تكوين ميكروبيوتا البراز والأنشطة الأيضية.
Abstract
الدور الناشئ للميكروبيوم الأمعاء في العديد من الأمراض البشرية يتطلب اختراقا من الأدوات والتقنيات والتكنولوجيات الجديدة. وثمة حاجة إلى هذه التحسينات لفك رموز استخدام المغيرات الميكروبيوم لفوائد صحة الإنسان. ومع ذلك، فإن الفحص الواسع النطاق والتحسين الأمثل للمعدّات للتحقق من تعديل الميكروبيوم والتنبؤ بالفوائد الصحية ذات الصلة قد يكون صعباً من الناحية العملية بسبب الحاجة إلى عدد كبير من الحيوانات و/أو البشر. ولهذا الغرض، يمكن لنماذج الجسم الحي في المختبر أو في الجسم الحي السابق أن تيسر الفحص الأولي لمغيرات الميكروبيوم. هنا, هو الأمثل وثبت نظام ثقافة ميكروبيوتا البراز السابقين التي يمكن استخدامها لدراسة آثار التدخلات المختلفة من المغيرين ميكروبيوم الأمعاء بما في ذلك البروبيوتيك, البريبايوتكس وغيرها من المكونات الغذائية, وبصرف النظر عن المغذيات والمخدرات، على تنوع وتكوين ميكروبيوتا الأمعاء البشرية. يستخدم الإينولين، وهو واحد من المركبات البريبايوتيك الأكثر دراسة على نطاق واسع وأجهزة التحويرات الميكروبيوم، كمثال هنا لدراسة تأثيره على تكوين ميكروبيوتا البراز الصحي وأنشطته الأيضية، مثل درجة الحموضة البرازية ومستويات البراز من الأحماض العضوية بما في ذلك اللاكتات والأحماض الدهنية قصيرة السلسلة (SCFAs). وقد يكون البروتوكول مفيداً للدراسات الرامية إلى تقدير آثار التدخلات المختلفة للمعوّلين على ملامح الكائنات المجهرية البرازية والتنبؤ بآثارها الصحية.
Introduction
الكائنات الحية الدقيقة البشرية هي مجتمع معقد يتكون من البكتيريا والآثار والفيروسات والميكروبات eukaryotic1، التي تسكن جسم الإنسان داخليا وخارجيا. وقد أثبتت الأدلة الحديثة الدور الأساسي لميكروبيوتا الأمعاء وميكروبيوم الأمعاء (مجموعة كاملة من الميكروبات وجيناتها الموجودة في الجهاز الهضمي البشري) في مختلف الأمراض البشرية بما في ذلك السمنة والسكري، أمراض القلب والأوعية الدموية، والسرطان1،2،3. بالإضافة إلى ذلك، الكائنات الحية الدقيقة التي تعيش في الأمعاء لدينا تنتج مجموعة واسعة من الأيض التي تؤثر بشكل كبير على صحتنا ويمكن أن تسهم أيضا في الفيزيولوجيا المرضية للعديد من الأمراض، فضلا عن مجموعة متنوعة من الوظائف الأيضية4، 5.التغيرات غير الطبيعية (الاضطرابات) في تكوين ووظيفة هذه المجموعة الميكروبية الأمعاء وتسمى عموما باسم "dysbiosis الأمعاء". عادة ما يرتبط Dysbiosis مع حالة غير صحية من المضيف، وبالتالي يمكن تمييزها عن المجتمع الميكروبي العادي (المثلية) المرتبطة بحالة السيطرة الصحية للمضيف. أنماط محددة من خلل biosbiosis ميكروبيوم الأمعاء غالبا ما توجد في مختلف الأمراض المختلفة1،2،3،6،7.
تخمير المواد الغذائية غير المهضومة، ولا سيما الكربوهيدرات القابلة للتخمير / الألياف، من قبل ميكروبيوتا الأمعاء ليس فقط تنتج الطاقة ولكن أيضا تنتج الأيض متباينة بما في ذلك الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة (SCFAs)، اللاكتات، فورمات، ثاني أكسيد الكربون، الميثان والهيدروجين والإيثانول6. وبالإضافة إلى ذلك، فإن ميكروبيوتا الأمعاء تنتج أيضا عددا من المواد النشطة بيولوجيا أخرى مثل الفولات، البيوتين، تريميثيلامين-Nأكسيد، السيروتونين، التربتوفان، حمض غاما أمينوبوتيريك، الدوبامين، بافراز، أستيل، الهستامين، حمض الديوكسيكوليك، وكبريتات الإيثيل فينيل 4. يحدث هذا في المقام الأول من خلال استخدام التدفقات الأيضية الجوهرية داخل محراب الميكروب المضيف، والذي يساهم في العديد من عمليات الجسم، وظائف التمثيل الغذائي والتغيرات الجينيّة1،8،9، 10. ومع ذلك، فإن آثار مختلف التدخلات على هذه المنتجات الميكروبية لا تزال غير واضحة أو غير واضحة بسبب عدم وجود بروتوكولات سهلة وفعالة ويمكن استنساخها. تكوين ميكروبيوتا الأمعاء البشرية هو نظام بيئي معقد للغاية ومتنوعة، وبالتالي، فإن العديد من الأسئلة حول دورها في صحة الإنسان وأمراض الأمراض لا تزال دون إجابة. آثار العديد من المغيرات ميكروبيوم الأمعاء الشائعة (على سبيل المثال، البروبيوتيك، البريبايوتكس، المضادات الحيوية، زرع البراز والالتهابات) على تكوين وظائف التمثيل الغذائي للميكروبيوتا المعوية لا تزال بعيدة المنال إلى حد كبير. وبالإضافة إلى ذلك، فإن فحص هذه الآثار والتحقق منها في الجسم الحي أمر صعب، لا سيما لأن معظم العناصر الغذائية والأيض التي تنتجها ميكروبيوتا الأمعاء يتم امتصاصها أو التخلص منها في وقت واحد وبسرعة في الأمعاء. ولذلك، فإن قياس إنتاج وكمية ومعالجة هذه الأيض (على سبيل المثال، SCFAs) في الجسم الحي لا يزال يشكل تحديا ً عملياً. في الواقع، النماذج الفسيولوجية مثل الحيوانات والمواضيع البشرية حاسمة لتحديد دور ميكروبيوم الأمعاء وتعديلها على صحة المضيف، ولكن هذه قد لا تكون مناسبة لفحص على نطاق واسع لأنواع مختلفة من المغيرات ميكروبيوم بسبب القيود الأخلاقية أو النقدية أو الزمنية. ولهذا الغرض، يمكن أن توفر نماذج في المختبر و/أو الجسم الحي السابق، مثل زراعة الكائنات المجهرية في المختبر ومن ثم التدخل مع مغيرات الميكروبيوتا المختلفة، فرصاً لتوفير الوقت والمال، وبالتالي يمكن أن تسمح بالفحص الأولي أو الواسع النطاق مكونات مختلفة (مثل البروبيوتيك, البريبايوتكس, وغيرها من المركبات التدخلية) لدراسة / التنبؤ بآثارها على تنوع ميكروبيوتا البراز, تكوين وملامح التمثيل الغذائي. وقد تسهل الدراسات التي تستخدم هذه النظم المختبرية والذاتية للميكروبيوم الأمعاء ية المزيد من الفهم للتفاعلات بين المضيف والميكروبيوم التي تسهم في استضافة الصحة والمرض، ويمكن أن تؤدي أيضا إلى إيجاد علاجات جديدة تستهدف الميكروبيوم إلى تحسين صحة المضيف والوقاية من الأمراض المختلفة وعلاجها1.
على الرغم من أن أنظمة زراعة ميكروبيوتا الأمعاء في المختبر لا يمكن تكرار حقا الظروف المعوية الفعلية، وقد سعت عدة مختبرات لتطوير مثل هذه النماذج، وقد تم العثور على بعض منها عمليا إلى حد ما، وقد استخدمت بنجاح ل أغراض مختلفة. واحدة من نماذج الأمعاء الأخيرة هو محاكاة النظام الإيكولوجي الميكروبي المعوي البشري، الذي يحاكي الجهاز الهضمي البشري بأكمله، بما في ذلك المعدة والأمعاء الدقيقة، ومناطق مختلفة من القولون. غير أن هذه النماذج المعقدة تقنيا قد لا تكون متاحة لمرافق البحوث الأخرى في جميع أنحاء العالم. ولذلك، لا تزال هناك حاجة ماسة لتطوير نماذج بديلة جديدة بسيطة نسبيا وبأسعار معقولة وعملية للمختبرات التي تدرس المغيرات ميكروبيوم وآثارها على ميكروبيوتا الأمعاء وصحة المضيف. وبالتالي، فإن استخدام في المختبر (أو فيالجسم الحي) نظام زراعة ميكروبيوتا البراز سيكون مفيدا لدراسة آثار مثل هذه التدخلات11،12. وعلى وجه التحديد، يمكن دراسة تأثير البريبايوتكس المختلفة على قدرة التخمير الميكروبيوتا من حيث التغيرات الدورية في تنوع الأمعاء المجهرية وتكوينها، ودرجة الحموضة البرازية، ومستويات الأيض الميكروبي بما في ذلك SCFAs واللاكتات 13.هنا، باستخدام الإينولين (واحدة من المكونات البريبايوتيك الأكثر دراسة على نطاق واسع) كمثال على المغير ميكروبيوم، يتم وصف بروتوكول خطوة بخطوة من هذا النظام بسيطة ex فيفو ميكروبيوتا دفعة الثقافة لإثبات استخدامه لتقدير التغيرات في ميكروبيوتا البراز والأيض الميكروبية بعد التدخل مع المغيرات ميكروبيوم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تنبيه: راجع أوراق بيانات سلامة المواد المناسبة واتبع التعليمات والمبادئ التوجيهية للتدريب المناسب من المستوى 2 للسلامة الأحيائية (BSL-2). اتبع جميع خطوات الزراعة وفقا لقواعد السلامة البيولوجية القياسية واستخدام مجلس الوزراء BSL-2 باستخدام الظروف العقيمة. وعلاوة على ذلك، قد تنطوي عينات البراز المأخوذة من نماذج مختلفة وأشخاص بشريين على خطر محتمل يتمثل في انتشار الأمراض المنقولة بالميكروبات. التماس المساعدة الطبية على الفور في حدوث أي إصابة والعدوى. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي الموافقة على استخدام عينات البراز البشري والحيواني من خلال اللجان الأخلاقية المؤسسية ويجب أن تمتثل للبروتوكولات لاستخدام العينات والمعلومات المتعلقة بالمواضيع.
1. إعداد وسائل الإعلام الثقافية
-
إعداد وسائل الإعلام الثقافية، وإعداد تسعة أنواع من حلول الأسهم
- الحل أ (1000 مل): حل 5.4 غرام من كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)، 2.7 غرام من فوسفات ثنائي الهيدروجين البوتاسيوم (KH2PO4)،0.16 غرام من ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيوم (CaCl2·2H2O)، 0.12 غرام من مسدس كلوريد المغنيسيوم (MgCl2) ·6H2O)، 0.06 غرام من رباعي هيدرات كلوريد المنغنيز (MnCl2·4H2O)، 0.06 غرام من سداسي هيدرات كلوريد الكوبالت (CoCl2·6H2O)، و 5.4 غرام من كبريتات الأمونيوم (NH4)2SO4، في المياه منزوعة الأيونات لجعل الحجم الإجمالي إلى 1000 مل.
- الحل B (1000 مل): حل 2.7 غرام فوسفات الهيدروجين البوتاسيوم (K2HPO4) في المياه منزوعة الأيونات لجعل الحجم الإجمالي إلى 1000 مل.
- حل معدني أثر (1000 مل): حل 500 ملغ من ثنائي الصوديوم إيثيلينديامين-تيتراسيتات ثنائي الهيدرات (Na2EDTA)، 200 ملغ من كبريتات الحديد هيبتاهيدرات (فيسو4·7H2O)، 10 ملغ من كبريتات الزنك هيبتامهيدرات (ZnSO4 ·7H2O)، 3 ملغ من المنغنيز (II) كلوريد رباعي الهيدرات (MnCl2·4H2O)، 30 ملغ من حمض الفوسفوريك (H3PO4)،20 ملغ من CoCl2·6H2O، 1 ملغ من ثنائي هيدرات كلوريد الكوبريك (CoCl2) ·2H2O)، 2 ملغ من النيكل (II) كلوريد هيكسهيدرات (نيكل2·6H2O) و 3 ملغ من ثنائي هيدرات موليبديت الصوديوم (Na2MoO4·2H2O) في المياه منزوعة الأيونات لجعل الحجم الإجمالي إلى 1000 مل.
ملاحظة: هذا الحل حساس للضوء، وبالتالي ضمان أن يتم تخزينها في الظلام / الأسود أو الألومنيوم ملفوفة أنابيب / زجاجات. - محلول فيتامين قابل للذوبان في الماء (1000 مل): حل 100 ملغ من هيدروكلوريد الثيامين (ثيامين-حمض الهيدروكلوريك)، 100 ملغ من حمض البانتوثيك د، 100 ملغ من النياسين، 100 ملغ من البيريدوكسين، 5 ملغ من حمض P-aminobenzoic و 0.25 ملغ من فيتامين B12 في الماء منزوع الأيونات لجعل الحجم الإجمالي إلى 1000 مل.
- حمض الفوليك: محلول البيوتين (1000 مل): حل 10 ملغ من حمض الفوليك، 2 ملغ من D-البيوتين و 100 ملغ من بيكربونات الأمونيوم (NH4HCO3)في المياه منزوعة الأيونات لجعل الحجم الإجمالي إلى 1000 مل.
- محلول الريبوفلافين (1000 مل): حل 10 ملغ من الريبوفلافين في 5 م م HEPES (1.19 غرام / لتر) الحل لجعل الحجم الإجمالي إلى 1000 مل.
- حل الهيمن (10 مل): حل 5000 ملغ من الهيمين في هيدروكسيد الصوديوم 10 مل (هيدروكسيد الصوديوم NaOH) (0.4 غرام / لتر) الحل لجعل الحجم الإجمالي إلى 10 مل.
- مزيج الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة (10 مل): الجمع بين 2.5 مل من N-valerate، 2.5 مل من isovalerate، 2.5 مل من إيزوبوتيرات و 2.5 مل: DL-α-ميثيل بوتيرات.
ملاحظة: ينصح باستخدام هذا الحل في غطاء محرك الدخان لتجنب الرائحة والأبخرة. - ريسازورين (1000 مل): حل 1 غرام من ريسازورين في الماء منزوع الأيونات وجعل الحجم الإجمالي إلى 1000 مل.
-
متوسطة تستخدم للتخمير اللاهوائي في المختبر
- لإعداد هذه الوسائط، مزيج 330 مل من الحل A، 330 مل من الحل B، 10 مل من محلول المعادن النزرة، 20 مل من محلول فيتامين قابل للذوبان في الماء، 5 مل من محلول الفوليك: البيوتين، 5 مل من محلول الريبوفلافين. 2.5 مل من محلول الهيمين، 0.4 مل من مزيج الأحماض الدهنية سلسلة قصيرة، 1 مل من ريسازورين، 0.5 غرام من استخراج الخميرة، 4 غرام من كربونات الصوديوم (Na2CO3)،0.5 غرام من سيستين HCl-H2O، و 0.5 غرام من تريبتيكيس، وإضافة 296.1 مل من الماء المقطر.
- تحقق من الحموضة والتأكد من أنها حوالي 7.0، إن لم يكن، وضبط الحموضة مع 1 N حمض الهيدروكلوريك أو 1 N هيدروكسيد الصوديوم. تعقيم عن طريق فراغ تصفية وسائل الإعلام باستخدام مرشح زجاجة تحت محطة العمل العقيم.
- بدلا من ذلك، مزيج جميع المكونات (باستثناء الفيتامينات وحلول الهيمين) والأوتوكلاف في 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة والسماح لها تبرد إلى درجة حرارة الغرفة. في وقت واحد، تصفية تعقيم الفيتامينات وحلول الهيمين باستخدام مرشحات غشاء 0.22 م وإضافة هذه إلى وسائل الإعلام الأوتوكلاف والمبردة قبل الاستغناء.
2. إعداد الغرفة اللاهوائية والمواد المطلوبة
- الحفاظ على جميع المواد والحلول والأدوات اللازمة لتجربة التخمير داخل الغرفة اللاهوائية على الأقل 48 ساعة قبل بدء التجربة، لضمان أن أي الأكسجين المتبقية المرتبطة بالأدوات والأكسجين القابل للذوبان في المخازن المؤقتة / الحلول إزالة ويتم التأقلم مع جميع المواد إلى الظروف اللاهوائية مجموعة.
ملاحظة: المواد اللازمة داخل الغرفة اللاهوائية (48 ساعة في وقت سابق من التجربة لبدء): '1' وسائل التخمير؛ '2' الحل اللاهوائي (المعد وفقا للباب 4-1) و '3' الدوامة، '4' وزن التوازن، '5' قماش جبن الشاش، '6' مقص، '7' قمع، '8' 1.5، 2.0، 15، 50 مل أنابيب، '9' pipettor (2، 20، 200 و 1000 ميكرولتر) ونصائح الأنابيب المتوافقة، '1' بندقية الأنابيب والأنابيب (5 و 10 مل)، '11' أنسجة الورق، (12) علامات، '13' أنبوب تقف على أنابيب مختلفة، (14) صندوق النفايات، (15) O2 المؤشر و (16) 70٪ زجاجة رذاذ الإيثانول (مطهر).
3. إعداد الأنابيب والألياف
- الوزن 300 ملغ من الإينولين ونقل إلى أنبوب 50 مل تليها إضافة مطهرة من 26 مل من وسائل الإعلام التخمير أعدت بالفعل وتخزينها في غرفة اللاهوائية. إعداد أنبوب واحد فارغ لكل نوع عينة البراز وأنبوب (ق) التجريبية (وفقا لعدد المركبات التي يجري اختبارها)، في ثلاثة أضعاف.
- ترك هذه الأنابيب داخل الغرفة اللاهوائية لحوالي 24 ساعة للسماح ترطيب العينات قبل البدء في تجربة التخمير. تأكد من درجة حرارة الأنبوب 37 درجة مئوية في وقت التلقيح، وبالتالي جلب الأنابيب في الحاضنة المغلقة داخل الغرفة اللاهوائية.
4. إعداد التلقيح
- محلول التخفيف اللاهوائي (على الأقل 48 ساعة قبل تجربة التخمير): حل 5 غرام من حمض الكلى، 2 غرام من الجلوكوز و 0.3 غرام من سيستين-حمض الهيدروكلوريك في الماء منزوع الأيونات وجعل الحجم الإجمالي إلى 1000 مل. الأوتوكلاف وتخزينهداخل الغرفة اللاهوائية على الأقل 48 ساعة قبل الاستخدام.
- إعداد التلقيح البرازي (في يوم تجربة التخمير): وزن 5 غرام من عينة البراز الطازجة في أنبوب مخروطي 50 مل، إضافة محلول التخفيف اللاهوائي ة لحجم نهائي من 50 مل (1:10 ث / الخامس) ودوامة لمدة 15 دقيقة أو حتى متجانسة تماما. تصفية الخليط المتجانس من خلال 4 طبقات من القماش الجبن المعقم (الأوتوكلاف) واستخدامه على الفور لتلقيح في الأنابيب التي تحتوي على وسائل الإعلام.
ملاحظة: يمكن تجميع عينات البراز من مجموعة من المواضيع إذا كان الهدف التجريبي هو مقارنة تأثير مركب معين / عنصر على الميكروبيوتا البرازية الصحية عموما مقابل المرضى بشكل عام.
5. التخمير وأخذ العينات
- إعداد أنابيب وفقا للقسم 4.2 وتلقيح فارغة / السيطرة والأنابيب التجريبية مع 4 مل من التلقيح البراز المخفف والمصفاة. احتضان الأنابيب المطعّمة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية داخل الغرفة اللاهوائية. هز الأنابيب مرة كل ساعة عن طريق عكس بلطف لإعادة تعليق الألياف والتلقيح.
- جمع العينات في كثير من الأحيان حسب الحاجة، على سبيل المثال، كل ساعة إلى 0، 3، 6، 9 و 24 ساعة أثناء التخمير عن طريق أخذ عينة aliquot 2 مل إلى أنبوب 2 مل من أنابيب التخمير المعنية.
- قياس الرقم الهيدروجيني للaliquots باستخدام مقياس الرقم الهيدروجيني المختبري (عن طريق إدخال قطب الأس الهيدروجيني مباشرة في العينة)؛ الطرد المركزي العينة المتبقية في 14،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. تجميد فورا supernatant وبيليه في النيتروجين السائل، وبعد تجميد المفاجئة، وتخزين supernatant لتحليل SCFAs وبيليه لتحليل ميكروبيوم في -80 درجة مئوية.
6. سلسلة قصيرة الأحماض الدهنية (SCFAs) واللاكتات القياس الكمي
ملاحظة: يمكن قياس SCFAs واللاكتات في supernatant من ثقافة ميكروبيوم بالضبط وفقا للأساليب المفصلة في أماكن أخرى13،14،15،16.
- وباختصار، إذابة المضادات الشديدة المجمدة التي تم الحصول عليها في القسم 5 من عينات التحكم والعلاج على الجليد وتنفيذ جميع خطوات المعالجة الأخرى على الجليد. تصفية supernatant من خلال مرشح غشاء 0.45 م واستخدام عينات خالية من الخلايا لقياس تركيزات SCFAs واللاكتات باستخدام نظام HPLC مع كاشف DAD في 210 نانومتر، ومجهزة عمود HPX-87H. استخدام حجم حقن 10 درجة مئوية لكل عينة واستخدام H2SO4 (0.005 N) لelute العمود بمعدل تدفق 0.6 مل / دقيقة عند 35 درجة مئوية.
7. تحليل ميكروبيوم البراز
ملاحظة: إجراء تحليل ميكروبيوم باتباع الأساليبوخطوط الأنابيب مفصلة في أماكن أخرى 7،13،14،17.
- باختصار، استخراج الحمض النووي الجينومي من ما يقرب من 200 ملغ من الكريات الطين البراز باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي البراز13.
- تضخيم المنطقة المتغيرة من الجين 16S rRNA البكتيرية باستخدام التمهيديات الباركود وفقا للطريقة الموصوفة في مكان آخر13، وذلك باستخدام تسلسل التمهيدي كما هو موضح في بروتوكول مشروع ميكروبيوم الأرض18.
- تنقية amplicons الناتجة مع حبات تنقية المغناطيسي وكمية من قبل Picogreen أو طريقة مماثلة. تجمع منتجات PCR النقية في تركيز الأضراس على قدم المساواة وتسلسل على جهاز التسلسل13.
- معالجة التسلسلات الناتجة لإزالة تعدد الإرسال، وتصفية الجودة والتجميع، والإحالة التصنيفية والتخصيص النادر، والتحليلات النهائية باستخدام برنامج الرؤى الكمية في علم البيئة الميكروبية (QIIME) وفقًا للأساليب الموضحة في Caporaso et al.19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويستخدم البروتوكول لإثبات تأثير البريبايوتيك محددة (أي الإينولين على تكوين الكائنات المجهرية والأنشطة الأيضية من حيث التغيرات في الأس الهيدروجيني البرازي وتركيز اللاكتات وSCFAs في براز البشر الأصحاء على مدى نقاط زمنية مختلفة بعد العلاج مع الإينولين). يتم قياس الرقم الهيدروجيني البرازي، ومستويات البراز مناللاكتات وSCFAs (الشكل 1)، وتكوين الكائنات الحية الدقيقة (الشكل2 والشكل 3)في 0 (خط الأساس)، 9 و 24 ساعة من الحضانة مع أو بدون الإينولين. وتبين النتائج كيف يتم تعديل تكوين ميكروبيوتا البراز وأنشطته الأيضية أثناء التخمير في المختبر مع أو بدون علاج الإينولين.
الشكل 1: التغيرات في درجة الحموضة البرازية (أ) واللاكتات (ب) والأحماض الدهنية قصيرة السلسلة أي خلات (ج) وبروبيونات (د) وبوتيرات (ه) في براز الإنسان عند 0 (خط الأساس) و9 و24 ساعة من التخمير اللاهوائي مع الإينولين أو بدونه. القيم المعروضة هنا هي يعني ± SEM من عينات ثلاثية. * P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, vs. baseline. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التغيرات في تنوع الكائنات الحية الدقيقة والتركيب في البراز البشري عند 0 (خط الأساس)، 9 و 24 ساعة من التخمير اللاهوائي مع أو بدون الإينولين. (أ) التدابير غير المرجحة و(ب) غير المرجحة للتنوع بيتا تصور باستخدام تحليل إحداثيات المبدأ (PCoA). (ج-و) مؤشرات التنوع ألفا أي التنوع الجيني (PD شجرةكاملة ( ج)؛ وثراء الأنواع (Chao1; (د) عدد الوحدات التصنيفية التشغيلية (OTUs, e); والأنواع [إفنسّ] ([شنّون] فهرسة, [و])). وفرة نسبية من فيلا الرئيسية (ز) وجنس (ح). القيم المعروضة هنا هي يعني ± SEM من عينات ثلاثية. * P < 0.05, **P < 0.01, vs. baseline. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحليل حجم تأثير التحليل التمييزي الخطي (LDA) (LEfSe) للتغيرات في ميكروبيوتا الأمعاء بعد 9 ح و 24 ساعة حضانة مع (INU) أو بدون الإينولين (CTL). تخطيط الكلى التصنيفي المستمد من تحليل LEfSe لتسلسل 16S (الوفرة النسبية ≥ 0.5٪) تمثل taxa وفيرة بشكل تفاضلي بين مجموعة مختلفة من العينات. سطوع كل نقطة يتناسب مع حجم تأثيرها (أي وفرة taxon). يتم عرض قيمة عتبة LDA التي تمر فقط من >2.4 هنا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نموذج تخمير الطين البراز في المختبر المعروض هنا هو نموذج بسيط من دفعة واحدة لتقريب آثار ركائز مختلفة وسلالات الميكروبية (على سبيل المثال، البريبايوتكس والبروبيوتيك) على تكوين ميكروبيوتا البراز البشري وكذلك الأنشطة الأيضية من حيث مستويات الحموضة البرازية وSCFAs. وتبين النتائج المعروضة هنا أن تلقيح الإينولين يقلل من درجة الحموضة البرازية ويزيد بشكل كبير من مستويات SCFAs واللاكتات في عينة البراز المعالجة بالإينولين بالمقارنة مع ثقافة ميكروبيوتا البرازية غير المعالجة (الشكل1). وبالإضافة إلى ذلك، يبدو أيضا أن توقيع ميكروبيوتا الأمعاء يختلف بين العينات المعالجة بالإينولين والعينات غير المعالجة (الشكل2 والشكل 3). هذه البيانات مثال على كيفية هذا النظام يمكن أن تعكس آثار الإينولين على تنوع ميكروبيوم البراز وتكوين ها، فضلا عن أنشطته الأيضية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا، اعتمادا على أهداف وفرضيات تجريبية محددة، قياس مجموعة متنوعة من العوامل الأخرى باستخدام هذا النظام. وعلاوة على ذلك، بالإضافة إلى التسلسل الجيني لـ 16S rRNA، تحاليل أخرى مثل تسلسل الجينوم الميكروبي الكامل (باستخدام جهاز تسلسل الجينوم الكامل) أو أساليب qPCR والثقافة التي تستهدف أجناساً واحدة أو متعددة محددة، وأنواعاً وسلالات (على سبيل المثال، بيفيدوباكتيريا، الملبنة، أكرمانسيا، البكتيرياالمعوية، كلوستريديا، الخ. يمكن أيضا أن تنفذ. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضاً استغلال الإجراءات الكروماتوغرافية المختلفة لتحليل الـ SCFAs، مثل LC-MS وGC وGC-MS وGC-FID وHPLC على أساس المتطلبات التجريبية والتوافر. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن إعداد العينات لهذه الإجراءات قد يختلف وفقا للصكوك والشروط اللازمة للتشغيل20.
على الرغم من أن استخدام عينة البراز الطازجة من شأنه أن يؤدي إلى أفضل النتائج القابلة للاستنساخ؛ ومع ذلك، المفاجئة عينة البراز المجمدة (كما هو مستخدم في التجربة المعروضة هنا) يمكن أيضا أن تستخدم بشكل فعال كما يمكن إحياء معظم البكتيريا منه مرة واحدة تنشيط لدرجة حرارة الجسم ولا مزيد من التحلل يحدث بعد تجميد21. ويمكن أن يكون استخدام العينة المجمدة مفيداً بوجه خاص عندما يستحيل الحصول على عينات برازية جديدة من جهة (جهات) مانحة محددة في اليوم المقرر من التجربة، أو من نفس المتبرع عندما تحتاج التجربة إلى تكرارها. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أنه ينبغي تجميد عينات البراز باستخدام النيتروجين السائل وتخزينها على الفور عند -80 درجة مئوية حتى مواصلة استخدامها. وبالإضافة إلى ذلك، ولتجنب تعرض عينات البراز المجمدة في الهواء (الأكسجين)، ينبغي نقل العينات إلى الغرفة اللاهوائية في أقرب وقت ممكن/ مباشرة بعد إخراجها من الثلاجة واستخدامها على الفور (ينبغي تجنب الذوبان المتكرر). وينبغي إجراء جميع التجارب اللاحقة بما في ذلك ذوبان العينات، وإعداد التلقيح وتجهيزه داخل الغرفة اللاهوائية.
البيئة العضوية المعوية ودرجة الحموضة أثناء تخمير المواد الغذائية في الأمعاء الغليظة مهمة جدا ً خاصة بالنظر إلى حقيقة أن انخفاض درجة الحموضة بشكل غير طبيعي يشير إلى زيادة الحموضة بسبب استخدام الركيزة. وبالتالي، يمكن أن يتوافق الحد من درجة الحموضة أسرع لاستخدام الركيزة أسرع22. على الرغم من أنه في هذا النموذج، لم يتم التحكم في درجة الحموضة، ومع ذلك، ينصح بشدة إدراج السيطرة غير المعالجة متطابقة لإجراء مقارنات مباشرة. يمكن أن تؤثر الـ SCFAs المنتجة في القولون نتيجة لتخمير السكريات غير القابلة للهضم بواسطة ميكروبيوتا الأمعاء على الآليات المتنوعة المتعلقة بالحفاظ على صحة المضيف. هذه الأيض تسهم في تكوين الجلوكوز والدهون الحيوية، بمثابة مصدر للطاقة لخلايا القولون، ويمكن أن يكون لها أيضا فوائد صحية بما في ذلك التشكيل المناعي، والسيطرة عليها / تحسين وظائف حاجز الأمعاء، والتشكيل العصبي23، 24،25،26. وبالإضافة إلى ذلك، ومن المعروف أيضا أن SCFAs تؤثر على العديد من المسارات البيولوجية بما في ذلك الهرمونات، ونظام endocannabinoid، وانتشار الخلايا والموت، وصحة العظام، وامتصاص المعادن، وحركية الأمعاء، والحموضة الأمعاء، والآثار المعكوسة على ميكروبيوم الأمعاء و وظيفة التمثيل الغذائي الميكروبية. ولذلك، فإن معرفة ملامح وتركيزات SCFAs المعوية / البراز يمكن أن يكون عنصرا هاما في حين تقييم فعالية المغيرات ميكروبيوتا محددة6. وبطبيعة الحال، إلى جانب SCFAs، ميكروبيوم الأمعاء تنتج أيضا العديد من الأيض الهامة الأخرى (على سبيل المثال، الأمونيوم والفيتامينات والهيستامين). وبالتالي، يمكن أيضا تقييم العينات الفائقة التي تم جمعها خلال مثل هذه التجارب التخمير في المختبر لتحليلات الميتابولات العالمية لاكتشاف الأيض الجديدة المستمدة من ميكروبيوم الأمعاء التي يمكن أن تتأثر بمغيرات ميكروبيوم محددة.
النظام الموصوف هنا له العديد من المزايا، مثل سهولة وبساطة وفعالية التكلفة، وإمكانية التبني العام للإعداد التجريبي. ومع ذلك، هناك قيود قليلة أيضا. على سبيل المثال، لا يتعلق النظام بتفاعل البريبايوتكس (أو التدخلات الأخرى المستخدمة) في الجهاز الهضمي العلوي (مثل اللعاب والمعدة والأمعاء الدقيقة) قبل التعرض لميكروبيوتا الأمعاء الغليظة. غير أنه يمكن اعتماد هذه الخطوات وإدراجها وفقا لمتطلبات تجريبية محددة. أيضا، قد تحتاج إلى إجراء عملية تحلل حمضي و/أو أنزيمي قبل التخمير إذا كان استخدام ركائز محددة بما في ذلك الغذاء الكامل أو الطعام القابل للهضم لأن الجزء غير القابل للهضم فقط من هذه الأطعمة يصل إلى القولون ليتم تخميرها من قبل أقل ميكروبيوتا الأمعاء. وبالإضافة إلى ذلك، قد يتحول تكوين ميكروبيوتا الأمعاء بسبب ظروف ثقافية محددة أثناء التخمير. على سبيل المثال، لوحظ أن ما يصل إلى 9 ساعة من الحضانة، والتغيرات microbiota هي أقرب بكثير إلى العادي من 24 ساعة. ومع ذلك، بعد 24 ساعة من الحضانة، على الرغم من أن مستويات درجة الحموضة وSCFAs زادت بشكل كبير، أظهر تكوين ميكروبيوتا الأمعاء أن عدد البكتيريا البروتيوبكتريا زاد في حين انخفض التنوع الميكروبي. ومع ذلك، لا يزال من غير المعروف كيف يرتبط التراكم المتزايد للأيض الميكروبي المقترن بانخفاض الحموضة البرازية بتوقيعات مجهرية محددة.
وباختصار، يرد في هذه الوثيقة وصف لبروتوكول بسيط لمحاكاة النظام الإيكولوجي للميكروبيوتا في الجسم الحي السابق. ويمكّن النظام الباحثين من اختبار تدخلات مختلفة لتعديل تنوع الكائنات المجهرية والتركيب والوظيفة الأيضية التي يمكن أن تؤثر على السمات المتنوعة للمعوية المضيفة والصحة العامة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وينوه المؤلفون بامتنان بالدعم التمويلي المقدم من مركز السكري والسمنة والتمثيل الغذائي ومركز العلوم السريرية والترجمة، وكلية ويك فورست للطب، وتمويل وزارة الدفاع (رقم المنحة: W81XWH-18-1-0118)، كيرميت غلين فيليبس الثاني كرسي في طب القلب والأوعية الدموية; ومولت المعاهد الوطنية للصحة مركز كلود د. بيبر لكبار السن الأمريكيين (بتمويل من P30AG12232)؛ R01AG18915; R01DK114224 ومركز العلوم السريرية والترجمة (وحدة البحوث السريرية، بتمويل من UL1TR001420)، هو أيضا لحسن الحظ المعترف بها. كما نشكر المتطوعين على تقديم عينات البراز، وأعضاء المختبر الآخرين على ما يقدمونه من مساعدة تقنية خلال هذه التجربة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | 217255 | |
| Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 | TGI | C2388 | Toxic |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2•2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | Irritating |
| Cobaltous Chloride Hexahydrate (CoCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | 255599 | |
| Cupric Chloride Dihydrate (CuCl2•2H2O) | Acros organics | 2063450000 | Toxic, Irritating |
| Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C121800 | |
| D-biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| D-Pantothenic acid | Alfa Aesar | A16609 | |
| Disodium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrate (Na2EDTA) | Biorad | 1610729 | |
| DL-α-methylbutyrate | Sigma-Aldrich | W271918 | |
| Ferrous Sulfate Heptahydrate (FeSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | F8263 | Toxic |
| Folic acid | Alfa Aesar | J62937 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | |
| Hepes | Alfa Aesar | A14777 | |
| Isobutyrate | Alfa Aesar | L04038 | |
| Isovalerate | Alfa Aesar | A18642 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Manganese Chloride Tetrahydrate (MnCl2•4H2O) | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Niacin (Nicotinic acid) | Sigma-Aldrich | N4126 | |
| Nickel(Ii) Chloride Hexahydrate (NiCl2•6H2O) | Alfa Aesar | A14366 | Toxic |
| N-valerate | Sigma-Aldrich | 240370 | |
| P-aminobenzoic acid | MP China | 102569 | Toxic, Irritating |
| Phosphoric Acid (H3PO4) | Sigma-Aldrich | P5811 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5504 | |
| Potassium Hydrogen Phosphate (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | 1551128 | |
| Pyridoxine | Alfa Aesar | A12041 | |
| Resazurin | Sigma-Aldrich | R7017 | |
| Riboflavin | Alfa Aesar | A11764 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | 1613757 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher BioReagents | 7647-14-5 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Chemicals | S320 | |
| Sodium Molybdate Dihydrate (Na2MoO4•2H2O) | Acros organics | 206375000 | |
| Thiamine Hydrochloride (Thiamin-HCl) | Acros organics | 148991000 | |
| Trypticase | BD Biosciences | 211921 | |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161 | |
| Zinc Sulfate Heptahydrate (ZnSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
| 0.22 µm membrane filter | |||
| AMPure magnetic purification beads | Agencourt | ||
| Anaerobic chamber with incubatore | Forma anaerobic system, Thermo Scientific, USA | ||
| Bottle filter | Corning | ||
| Cheesecloth | |||
| Illumina MiSeq sequencer | Miseq reagent kit v3 | ||
| pH meter | |||
| Qiagen PowerFecal kit | Qiagen | ||
| Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software | |||
| Qubit-3 fluorimeter | InVitrogen | ||
| Vortex | Thermoscientific | ||
| Waters-2695 Alliance HPLC system | Waters Corporation |
References
- Shreiner, A. B., Kao, J. Y., Young, V. B. The gut microbiome in health and in disease. Current Opinion in Gastroenterology. 31 (1), 69-75 (2015).
- Xu, Z., Knight, R. Dietary effects on human gut microbiome diversity. British Journal of Nutrition. 113, 1-5 (2015).
- Jiang, C., Li, G., Huang, P., Liu, Z., Zhao, B. The gut microbiota and Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimers Disease. 58 (1), 1-15 (2017).
- Clemente, J. C., Ursell, L. K., Parfrey, L. W., Knight, R. The impact of the gut microbiota on human health: an integrative view. The Journal Cell. 148 (6), 1258-1270 (2012).
- Yadav, H., Jain, S., Marotta, F. Probiotics mediated modulation of gut flora might be biotherapeutical approach obesity and type 2 diabetes. Metabolomics : Open Access. 1 (3), 1-3 (2011).
- Ahmadi, S., et al. Dietary Polysaccharides in the Amelioration of Gut Microbiome Dysbiosis and Metabolic Diseases. Obesity and Control Theries: Open Access. 4 (3), (2017).
- Nagpal, R., et al. Obesity-Linked Gut Microbiome Dysbiosis Associated with Derangements in Gut Permeability and Intestinal Cellular Homeostasis Independent of Diet. Journal of Diabetes Research. , 1-9 (2018).
- Paul, B., et al. Influences of diet and the gut microbiome on epigenetic modulation in cancer and other diseases. Journal of Clinical Epigenetics. 7 (1), 112 (2015).
- O’mahony, S., Clarke, G., Borre, Y., Dinan, T., Cryan, J. Serotonin tryptophan metabolism and the brain-gut-microbiome axis. Journal of Behavioural Brain Research. 277, 32-48 (2015).
- Sharon, G., et al. Specialized metabolites from the microbiome in health and disease. Journal of Cell Metabolism. 20 (5), 719-730 (2014).
- Faber, T. A., Bauer, L. L., Price, N. P., Hopkins, A. C., Fahey, G. C. In vitro digestion and fermentation characteristics of temulose molasses, a coproduct of fiberboard production, and select temulose fractions using canine fecal inoculum. Journal of Agricultural Food Chemistry. 59 (5), 1847-1853 (2011).
- Bourquin, L. D., Titgemeyer, E. C., Fahey, G. C. Vegetable fiber fermentation by human fecal bacteria: cell wall polysaccharide disappearance and short-chain fatty acid production during in vitro fermentation and water-holding capacity of unfermented residues. Journal of Nutrition. 123 (5), 860-869 (1993).
- Nagpal, R., et al. Human-origin probiotic cocktail increases short-chain fatty acid production via modulation of mice and human gut microbiome. Scientific Reports. 8 (1), 12649 (2018).
- Nagpal, R., et al. Comparative microbiome signatures and short-chain fatty acids in mouse, rat, non-human primate and human feces. Frontiers in Microbiology. 9, 2897 (2018).
- Thangamani, S., Guinan, J., Wang, S., Yadav, H. Antibiotic-induced decreases in the levels of microbial-derived short-chain fatty acids promote gastrointestinal colonization of Candida albicans. bioRxiv. , 428474 (2018).
- Ahmadi, S., et al. Prebiotics from acorn and sago prevent high-fat diet-induced insulin resistance via microbiome-gut-brain axis modulation. The Journal of Nutritional Biochemistry. , (2019).
- Nagpal, R., et al. Gut Microbiome Composition in Non-human Primates Consuming a Western or Mediterranean Diet. Frontiers in Nutrition. 5, 28 (2018).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME Journal. 6 (8), 1621-1624 (2012).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
- Garcia-Villalba, R., et al. Alternative method for gas chromatography-mass spectrometry analysis of short-chain fatty acids in faecal samples. Journal of Seperation Science. 35 (15), 1906-1913 (2012).
- Lee, C. H., et al. Frozen vs Fresh Fecal Microbiota Transplantation and Clinical Resolution of Diarrhea in Patients With Recurrent Clostridium difficile Infection: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 315 (2), 142-149 (2016).
- Chen, M. -H., et al. In vitro fermentation of xylooligosaccharides produced from Miscanthus× giganteus by human fecal microbiota. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64 (1), 262-267 (2015).
- Cook, S., Sellin, J. Short chain fatty acids in health and disease. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 12 (6), 499-507 (1998).
- Rastelli, M., Knauf, C., Cani, P. D. Gut microbes and health: a focus on the mechanisms linking microbes, obesity, and related disorders. Obesity. 26 (5), 792-800 (2018).
- Zou, J., et al. Fiber-mediated nourishment of gut microbiota protects against diet-induced obesity by restoring IL-22-mediated colonic health. Cell Host & Microbe. 23 (1), e44 41-53 (2018).
- Dinan, T. G., Cryan, J. F. Gut–brain axis in 2016: Brain–gut–microbiota axis—mood, metabolism and behaviour. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (2), 69 (2017).
