Summary
Detta protokoll beskriver ett in vitro-system för jäsning av Human fekal bakterieflora, med hjälp av inulin (en välkänd prebiotika och en av de mest studerade Mikrobiota modulatorer) för att demonstrera användningen av detta system för att uppskatta effekterna av specifika interventioner på fekal bakterieflora sammansättning och metaboliska aktiviteter.
Abstract
Den framväxande roll Gut mikrobiomet i flera mänskliga sjukdomar kräver ett genombrott av nya verktyg, tekniker och teknik. Sådana förbättringar behövs för att dechiffrera utnyttjandet av mikrobiomet modulatorer för människors hälsa fördelar. Men den storskaliga screening och optimering av modulatorer för att validera mikrobiomet modulering och förutsäga relaterade hälsofördelar kan vara praktiskt taget svårt på grund av behovet av ett stort antal djur och/eller försökspersoner. För detta ändamål kan in vitro-eller ex vivo-modeller underlätta preliminär screening av mikrobiomet modulatorer. Häri, det är optimerat och visat en ex vivo fekal bakterieflora kultur system som kan användas för att undersöka effekterna av olika ingrepp i Gut mikrobiomet modulatorer inklusive probiotika, prebiotika och andra livsmedelsingredienser, bortsett från nutraceuticals och droger, om mångfalden och sammansättningen av den mänskliga Gut bakterieflora. Inulin, en av de mest studerade prebiotiska föreningar och mikrobiomet modulatorer, används som ett exempel här för att undersöka dess effekt på friska fekal bakterieflora sammansättning och dess metaboliska aktiviteter, såsom fekal pH och fekal nivåer av organiska syror inklusive laktat och kortkedjiga fettsyror (SCFAs). Protokollet kan vara användbart för studier som syftar till att uppskatta effekterna av olika interventioner av modulatorer på fekal bakterieflora profiler och att förutsäga deras hälsoeffekter.
Introduction
Den mänskliga bakterieflora är en komplex gemenskap bestående av bakterier, Archaea, virus och eukaryota mikrober1, som lever i den mänskliga kroppen internt och externt. De senaste bevisen har fastställt den grundläggande roll som Gut bakterieflora och Gut mikrobiomet (hela samlingen av mikrober och deras gener som finns i den mänskliga mag-tarmkanalen) i olika mänskliga sjukdomar, inklusive fetma, diabetes, hjärt-kärlsjukdomar och cancer1,2,3. Dessutom, de mikroorganismer som lever i vår Gut producera ett brett spektrum av metaboliter som signifikant påverkar vår hälsa och kan också bidra till patofysiologin av flera sjukdomar samt en mängd metabola funktioner4, 5. onormala förändringar (perturbationer) i sammansättningen och funktionen av denna Gut mikrobiella populationen betecknas allmänt som "Gut dysbios". Dysbios är vanligtvis förknippad med ett ohälsosamt tillstånd av värden och därmed kan skiljas från den normala (homeostatiska) mikrobiell gemenskap som är associerad med en hälsosam kontroll tillstånd av värden. Specifika mönster av Gut mikrobiomet dysbios finns ofta i olika olika sjukdomar1,2,3,6,7.
Jäsning av osmält mat, särskilt jäsbara kolhydrater/fibrer, genom tarmen bakterieflora inte bara ger energi utan också producerar olika metaboliter inklusive kortkedjiga fettsyror (scfas), laktat, formate, koldioxid, metan, väte och etanol6. Dessutom, den Gut bakterieflora producerar också ett antal andra bioaktiva substanser såsom folat, biotin, trimethylamine-N-oxid, serotonin, tryptofan, gamma-aminosmörsyra, dopamin, noradrenalin, acetylkolin, histamin, deoxycholsyra och 4-etylfenylsulfat. Detta sker främst genom utnyttjande av inneboende metaboliska flöden inom värd-Microbe nisch, som bidrar i flera kroppens processer, metaboliska funktioner och epigenetiska förändringar1,8,9, 10. Effekterna av olika interventioner på sådana mikrobiella produkter förblir dock otydliga eller oklara på grund av bristen på enkla, effektiva och reproducerbara protokoll. Sammansättningen av Human Gut bakterieflora är ett mycket komplext och mångsidigt ekosystem, och därför är många frågor om dess roll i människans hälsa och sjukdoms patologi fortfarande obesvarade. Effekterna av många vanliga Gut mikrobiomet modulatorer (t. ex., probiotika, prebiotika, antibiotika, fekal transplantation och infektioner) på sammansättningen och metaboliska funktioner i tarmbakterieflora fortfarande i stort sett svårfångade. Dessutom är det svårt att undersöka och validera dessa effekter in vivo, särskilt eftersom de flesta av de näringsämnen och metaboliter som produceras i tarmfloran absorberas eller bortskaffas samtidigt och snabbt i tarmen. Därför är det fortfarande en praktisk utmaning att mäta produktionen, mängden och bearbetningen av dessa metaboliter (t. ex. SCFAs) in vivo. Faktum är att fysiologiska modeller som djur och försökspersoner är avgörande för att fastställa den roll som Gut mikrobiomet och dess modulering på värd hälsan, men dessa kanske inte lämpar sig för storskalig screening av olika typer av mikrobiomet modulatorer på grund av etiska, monetära eller tidsbegränsningar. I detta syfte kan in vitro-och/eller ex vivo-modeller, såsom odling av tarmfloran in vitro och sedan ingripa med olika Mikrobiota-modulatorer, erbjuda tids-och penga sparande möjligheter och kan därför möjliggöra preliminär eller storskalig screening av olika komponenter (såsom probiotika, prebiotika, och andra interventionella föreningar) att undersöka/förutsäga deras effekter på fekal bakterieflora mångfald, sammansättning och metabola profiler. Studier som använder sådana in vitro-och ex vivo-system i tarmen mikrobiome kan underlätta ytterligare förståelse av värd-mikrobiomet interaktioner som bidrar till värd hälsa och sjukdom, och kan också leda till att hitta nya terapier som riktar sig till mikrobiomet att förbättra värd hälsa och förebygga och behandla olika sjukdomar1.
Även om kultur systemen in vitro Gut bakterieflora inte riktigt kan replikera de faktiska tarm förhållandena har flera laboratorier strävat efter att utveckla sådana modeller, av vilka några har hittats praktiskt i viss utsträckning och har använts framgångsrikt för olika ändamål. En av de senaste Gut modellerna är simulatorn av människans intestinal mikrobiella ekosystem, som härmar hela människans mag-tarmkanalen, inklusive magen, tunntarm, och olika regioner i tjocktarmen. Sådana tekniskt komplicerade modeller kan dock inte vara tillgängliga för andra forskningsanläggningar över hela världen. Därför finns det fortfarande ett kritiskt behov av utveckling av nya alternativa modeller som är relativt enkla, överkomliga och praktiska för laboratorier som studerar mikrobiomet modulatorer och deras effekter på tarmfloran och värd hälsan. Därför skulle användningen av ett in vitro-(eller ex vivo) fekalt Mikrobiota-kultursystem vara användbart för att studera effekterna av sådana interventioner11,12. Specifikt, effekten av olika prebiotika på bakterieflora jäsning kapacitet i form av periodiska förändringar i tarmfloran mångfald och sammansättning, fekal pH, och nivåerna av mikrobiella metaboliter inklusive SCFAs och laktat kan studeras 13. häri, med hjälp av inulin (en av de mest studerade prebiotiska komponenter) som ett exempel på mikrobiomet modulator, ett steg-för-steg-protokoll i detta enkla ex vivo bakterieflora batch-kultursystem beskrivs för att visa dess användning för att uppskatta förändringar i fekal bakterieflora och mikrobiella metaboliter efter intervention med mikrobiomet modulatorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
FÖRSIKTIGHET: konsultera lämpliga material säkerhets data blad och följ instruktionerna och riktlinjerna för lämplig utbildning i biosäkerhetsnivå 2 (BSL-2). Följ alla odlings stegen enligt de vanliga biosäkerhets reglerna och Använd ett BSL-2-skåp med aseptiska förhållanden. Dessutom kan fekala prover från olika modeller och försökspersoner ha potentiell risk för spridning av mikrobiella sjukdomar. Omedelbart söka medicinsk hjälp i händelse av skada och infektion. Dessutom bör användningen av avföring från människor och djur godkännas genom institutionella etiska kommittéer och måste följa protokoll för att använda prover och ämnesinformation.
1. förberedelse av odlingsmedier
-
Förberedelse av kulturmedia, Förbered nio typer av lagerlösningar
- Lösning A (1 000 mL): Lös upp 5,4 g natriumklorid (NaCl), 2,7 g kaliumdivätefosfat (KH2Po4), 0,16 g kalciumkloriddihydrat (CaCl2· 2H2O), 0,12 g magnesiumklorid hexahydrat (mgcl2 · 6H2o), 0,06 g manganklorid tetrahydrat (mncl2· 4h2O), 0,06 g kobalthaltiga klo RID hexahydrat (cocl2· 6H2o), och 5,4 g ammoniumsulfat (NH4)2so4, i avjoniserat vatten för att göra den totala volymen till 1 000 mL.
- Lösning B (1 000 mL): Lös upp 2,7 g kalium vätefosfat (K2HPO4) i avjoniserat vatten för att göra den totala volymen till 1000 mL.
- Spår mineral lösning (1 000 mL): Lös upp 500 mg dinatriumetylendiaminacetat-tetraacetatdihydrat (na2EDTA), 200 mg järnsulfat heptahydrat (FeSO4· 7h2O), 10 mg zinksulfat heptahydrat (znso4 · 7h2o), 3 mg mangan (II) kloridtetrahydrat (mncl2· 4h2o), 30 mg fosforsyra (H3Po4), 20 mg cocl2· 6H2o, 1 mg koppar chloride dihydrat (cucl2 · 2H2o), 2 mg nickel (II) klo RID hexahydrat (nicl2· 6H2o) och 3 mg natriummolybdatdihydrat (na2Moo4· 2H2o) i avjoniserat vatten för att göra den totala volymen till 1 000 ml.
Anmärkning: Denna lösning är ljuskänslig, därför se till att lagras i mörkt/svart eller aluminium lindade rör/flaskor. - Vattenlöslig vitamin lösning (1 000 mL): Lös upp 100 mg tiaminhydroklorid (tiamin-HCl), 100 mg D-pantotensyra, 100 mg niacin, 100 mg pyridoxin, 5 mg P-Aminobenzoic syra och 0,25 mg vitamin B12 i avjoniserat vatten för att göra den totala volymen till 1 000 mL.
- Folat: biotin lösning (1 000 mL): lös 10 mg folsyra, 2 mg D-biotin och 100 mg ammoniumbikarbonat (NH4HCO3) i avjoniserat vatten för att göra den totala volymen till 1 000 ml.
- Riboflavin lösning (1 000 mL): lös 10 mg riboflavin i 5 mM HEPES (1,19 g/L) lösning för att göra den totala volymen till 1 000 mL.
- Hemin lösning (10 mL): Lös 5 000 mg Hemin i 10 mM natriumhydroxid (NaOH) (0,4 g/L) lösning för att göra den totala volymen till 10 mL.
- Kortkedjiga fettsyror (10 mL): kombinera 2,5 mL N-valerat, 2,5 mL isovalerate, 2,5 mL isobutyrat och 2,5 mL: DL-α-metylbutyrat.
Anmärkning: Denna lösning rekommenderas att använda i draghuv för att undvika lukt och rök. - Resazurin (1 000 mL): Lös 1 g resazurin i avjoniserat vatten och gör total volym till 1 000 mL.
-
Medel som används för in vitro anaerob fermentering
- För att förbereda detta material, blanda 330 mL lösning A, 330 mL lösning B, 10 mL spår mineral lösning, 20 mL vattenlöslig vitamin lösning, 5 mL folat: biotin lösning, 5 mL riboflavin lösning; 2,5 mL Hemin lösning, 0,4 mL kort kedja fettsyra mix, 1 mL Resazurin, 0,5 g jästextrakt, 4 g natriumkarbonat (na2Co3), 0,5 g cystein HCL-H2O, och 0,5 g trypticase, och tillsätt 296,1 ml destillerat vatten.
- Kontrollera pH och se till att det är runt 7,0, om inte, justera pH med 1 N HCl eller 1 N NaOH. Sterilisera genom vakuum filtrering mediet med hjälp av en flaska filter under aseptisk arbetsstation.
- Alternativt, blanda alla komponenter (utom vitamin och Hemin Solutions) och autoklav vid 121 ° c i 20 min och låt den svalna till rumstemperatur. Samtidigt, filter-sterilisera vitamin och Hemin lösningar med 0,22 μm membranfilter och tillsätt dessa till autoklaverade och kylda Media innan dispensering.
2. beredning av anaerob kammare och erforderligt material
- Förvara alla material, lösningar och verktyg som behövs för jäsnings försöket inuti anaerob kammaren minst 48 h innan experimentet påbörjas, för att säkerställa att eventuellt kvarvarande syre i samband med verktyg och lösligt syre i buffertar/lösningar avlägsnas och allt material acklimatiseras till de inställda anaeroba förhållandena.
Anmärkning: Material som behövs inuti anaerob kammare (48 h tidigare experiment för att starta): (i) jäsning Media; II) anaerob lösning (upprättad enligt avsnitt 4,1), III) vortexer, (IV) vägning balans, (v) Muslin ost dukar, (vi) sax, (VII) tratt, (VIII) 1,5, 2,0, 15, 50 mL rör, (IX) multikanalspipettor (2, 20, 200 och 1 000 μL) och kompatibla Pipettera tips, (x) Gun Pipettera och glaspipetter (5 och 10 ml), (XI) pappers vävnader, (XII) markörer, (XIII) Rörstativ för olika rör, (XIV) avfalls låda, (XV) O2 indikator och (XVI) 70% etanol sprayflaska (desinfektionsmedel).
3. beredning av rör och fibrer
- Vikt 300 mg inulin och överföring till en 50 mL tub följt av aseptiskt tillägg av 26 mL fermenterings medier som redan förberetts och lagrats i anaerob kammaren. Förbered ett blank rör för varje fekal prov typ och experimentella röret (s) (enligt antalet föreningar som testas), i tre exemplar.
- Lämna dessa rör inne i anaerob kammare för cirka 24 h för att möjliggöra hydrering av prover innan jäsnings försöket. Se till att rör temperaturen är 37 ° c vid inympningen, ta därför rören i inkubatorn inneslutna i anaerob kammaren.
4. beredning av Inoculum
- Anaerob utspädnings lösning (minst 48 h före jäsnings experiment): Lös 5 g NaCl, 2 g glukos och 0,3 g cystein-HCl i avjoniserat vatten och gör total volym till 1 000 mL. Autoklav och förvara den inne i anaerob kammare minst 48 h före användning.
- Fekal inokulum beredning (vid dagen för jäsning experiment): väg 5 g färskt fekal prov i en 50 ml koniskt rör, tillsätt anaerob utspädning lösning för en slutlig volym av 50 ml (1:10 w/v) och Vortex i 15 min eller tills helt homogeniseras. Filtrera den homogeniserade blandningen genom 4 lager av steril cheesecloth (autoklav) och använda den omedelbart för inympning i rören som innehåller Media.
Anmärkning: Fekal prover från en grupp av försökspersoner kan poolas om det experimentella målet är att jämföra effekten av en given förening/ingrediens på övergripande friska kontra sjuka fekal bakterieflora i allmänhet.
5. jäsning och provtagning
- Förbered rören enligt avsnitt 4,2 och Inokulera blank/kontroll och experimentella rör med 4 mL utspädd och filtrerad fekal inoculum. Inkubera de inokulerade rören vid 37 ° c inuti anaerob kammaren. Skaka rören en gång i timmen genom att invertera försiktigt att åter avbryta fibrerna och inoculum.
- Samla in prover så ofta som behövs, till exempel varje timme till 0, 3, 6, 9 och 24 h under jäsningen genom att ta ett 2 mL alikvoter ut i en 2 mL tub från respektive fermenterande rör.
- Mät pH-värdet i alikvoter med hjälp av ett laboratorium pH-mätare (genom att direkt sätta in pH-elektroden i provet); Centrifugera det resterande provet vid 14 000 x g i 10 min vid 4 ° c. Omedelbart frysa supernatanten och pelleten i flytande kväve, och efter Snap frysning, lagra supernatanten för scfas analys och pellet för mikrobiomet analys vid-80 ° c.
6. kortkedjiga fettsyror (SCFAs) och Laktatkvantifiering
Anmärkning: Den scfas och laktat i supernatanten av mikrobiomet kulturen kan mätas exakt enligt de metoder som beskrivs på annat håll13,14,15,16.
- Kortfattat, Tina Snap frysta samman supernatanterna erhållits i avsnitt 5 från kontroll och behandling prover på is och utföra alla ytterligare bearbetning steg på isen. Filtrera supernatanten genom ett membranfilter på 0,45 μm och Använd de cellfria proverna för att mäta koncentrationerna av SCFAs och laktat med HPLC-system med DAD-detektor på 210 nm, utrustad med en HPX-87H-kolonn. Använd injicera volymen 10 μL för varje prov och Använd H2so4 (0,005 N) för att eluera kolonnen med en flödeshastighet på 0,6 mL/min vid 35 ° c.
7. fekal Microbiome analys
Anmärkning: Utföra mikrobiomet analys enligt de metoder och pipeline som beskrivs på annat håll7,13,14,17.
- Kortfattat, extrahera genomisk DNA från cirka 200 mg fekal flytgödsel pellets med hjälp av en fekal DNA Extraction Kit13.
- Förstärka den hypervariabla regionen av bakterien 16S rRNA gen med hjälp av barkodade primers enligt den metod som beskrivs på annat håll13, med hjälp av primer sekvenser som beskrivs i jorden Microbiome Project Protocol18.
- Rena de resulterande amplikonerna med magnetisk rening pärlor och kvantifiera med picogreen eller en likvärdig metod. Poolade de renade PCR-produkterna i lika molar koncentration och sekvens på en sequencer13.
- Bearbeta de resulterande sekvenserna för de-multiplexering, kvalitets filtrering och klustring, taxonomisk tilldelning och rarefaction, och nedströms analyser med hjälp av kvantitativa insikter i mikrobiell ekologi (QIIME) programvara enligt de metoder som beskrivs av Caporaso et al.19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet används för att påvisa effekten av en specifik prebiotiska (dvs inulin på bakterieflora sammansättning och metaboliska aktiviteter i form av förändringar i fekal pH och koncentrationen av laktat och SCFAs i avföring från friska försökspersoner över olika tidpunkter efter behandling med inulin). Fekal pH, fekal nivåer av laktat och SCFAs (figur 1), och sammansättningen av bakterieflora (figur 2 och figur 3) mäts vid 0 (baslinje), 9 och 24 h av inkubation med eller utan inulin. Resultaten visar hur fekal bakterieflora sammansättning och dess metaboliska aktiviteter moduleras vid in vitro-jäsning med eller utan inulinbehandling.
Figur 1: förändringar i fekal pH (a), laktat (b) och kortkedjiga fettsyror dvs acetat (c), propionat (d) och butyrat (e) i mänsklig avföring vid 0 (baslinjen), 9 och 24 h av anaerob jäsning med eller utan inulin. Värden som presenteras här är medelvärdet ± SEM av tre exemplar prover. * P < 0,05, * *p < 0,01, * * *p < 0,001, vs. baslinje. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: förändringar i bakterieflora mångfald och sammansättning i mänsklig avföring vid 0 (baslinjen), 9 och 24 h av anaerob jäsning med eller utan inulin. (a) viktade och (b) oviktade unifrac-mått för beta-mångfald visualiseras med hjälp av Principkoordinatanalys (PCoA). (c-f) Index för alfa-mångfald dvs. fylogenetiska mångfald (PD hela trädet (c); artrikedom (Chao1; d). observerat antal operativa taxonomiska enheter (OTUs, e); och art jämnhet (Shannon index, f)). Relativ förekomst av Major phyla (g) och släkten (h). Värden som presenteras här är medelvärdet ± SEM av tre exemplar prover. * P < 0,05, * *p < 0,01, jämfört med baslinjen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: linjär diskriminantanalys (LDA) effekt storlek (lefse) analys av Gut bakterieflora förändringar efter 9 h och 24 h inkubation med (Inu) eller utan (CTL) inulin. Taxonomiskt Kladogram härrör från LEfSe-analys av 16S-sekvenser (relativ förekomst ≥ 0,5%) som representerar de Differentiellt rikliga taxa mellan olika grupper av prover. Ljusstyrkan för varje punkt är proportionell mot dess effekt storlek (dvs. taxon överflöd). Endast taxa som passerar LDA tröskelvärdet för > 2.4 visas här. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den in vitro fekal flytgödsel jäsning modell som presenteras här är en enkel enda sats modell för att approximera effekterna av olika substrat och mikrobiella stammar (t. ex., prebiotika och probiotika) på sammansättningen av mänskliga fekal bakterieflora samt dess metaboliska aktiviteter i form av fekal pH och SCFAs nivåer. De resultat som presenteras häri visar att inympningen av inulin minskar fekal pH och signifikant ökar nivåerna av SCFAs och laktat i inulin-behandlade fekal prov jämfört med icke-behandlade fekal bakterieflora kultur (figur 1). Dessutom förefaller tarmens Mikrobiota-signatur vara annorlunda mellan inulinbehandlade och obehandlade prover (figur 2 och figur 3). Dessa data exemplifiera hur detta system kan återspegla effekterna av inulin på fekal mikrobiomet mångfald och sammansättning samt dess metaboliska aktiviteter. Dessutom, beroende på specifika experimentella mål och hypoteser, en mängd andra faktorer kan också mätas med hjälp av detta system. Dessutom, förutom 16s rRNA gensekvensering, andra analyser såsom hela mikrobiella Metagenomanalys sekvensering (med hjälp av hela Genome Sequencer) eller qPCR och kulturer metoder riktade mot specifika enskilda eller flera släkten, arter och stammar (t. ex. bifidobakterier, laktobaciller, Akkermansia, enterobacteriacaea, Clostridia, etc.) kan också utföras. Dessutom kan olika kromatografiska procedurer för analys av SCFAs, såsom LC-MS, GC, GC-MS, GC-FID, och HPLC också utnyttjas baserat på experimentella krav och tillgänglighet. Det bör dock noteras att prov preparationen för dessa förfaranden kan variera beroende på vilka instrument och villkor som krävs för operation20.
Även om användningen av färskt fekal prov skulle ge bäst reproducerbara resultat; men Snap fryst fekal prov (som används i experimentet presenteras häri) kan också användas effektivt som de flesta av bakterierna kan återupplivas från det en gång återupplivat till kroppstemperatur och ingen mer nedbrytning sker efter frysning21. Användning av fryst prov kan vara särskilt fördelaktigt om det är omöjligt att erhålla färska fekala prover från specifika givare på planerad dag för experimentet, eller från samma givare när ett experiment behöver replikeras. Det bör dock noteras att fekal proverna ska fästas frusen med flytande kväve och omedelbart lagras vid-80 ° c tills den används ytterligare. För att undvika att de frysta fekala proverna exponeras för luft (syre) bör proverna överföras till den anaeroba kammaren så snart som möjligt/omedelbart efter det att de har tagit ut från frysen och använts på en gång (upprepad upptinning bör undvikas). Alla efterföljande experiment inklusive upptinning, inokulum beredning och bearbetning bör göras inne i anaerob kammare.
Den intestinala organiska miljön och pH under näringsämnes jäsning i tjocktarmen är mycket viktiga särskilt med hänsyn till det faktum att en onormalt reducerad pH indikerar ökad surhetsgrad på grund av substratet utnyttjande. Därför kan snabbare pH-reduktion motsvara snabbare substrat utilization22. Även om, i denna modell, pH inte har kontrollerats, men införandet av identiska icke-behandlade kontroll rekommenderas starkt att göra direkta jämförelser. Den SCFAs produceras i tjocktarmen som en följd av jäsning av svårsmält polysackarider av tarmen bakterieflora kan ytterligare påverka olika mekanismer relaterade till upprätthållandet av värd hälsan. Dessa metaboliter bidrar i gluconeogenes och lipidbiosyntes, fungera som en energikälla för kolonocyter, och kan också ha hälsofördelar inklusive immunmodulering, kontrollerad/förbättrad Gut barriärfunktioner, och neuromodulering23, 24,25,26. Dessutom, scfas är också kända för att påverka flera biologiska vägar inklusive hormoner, endocannabinoida system, cell spridning och död, benhälsa, mineralabsorption, tarmmotilitet, intestinal pH, och Invertera effekter på tarmen mikrobiomet och mikrobiell metabolisk funktion. Därför, kunskap om profilen och koncentrationer av intestinal/fekal scfas kan vara en viktig komponent samtidigt utvärdera effekten av specifika bakterieflora modulatorer6. Naturligtvis, förutom scfas, Gut mikrobiomet producerar också många andra viktiga metaboliter (t. ex., ammonium, vitaminer, histamin). Därför kan de supernatanten prover som samlats in under sådana in vitro-fermenterings experiment också utvärderas för globala metabolomik analyser för att upptäcka nya Gut mikrobiomet-härledda metaboliter som kan påverkas av specifika mikrobiomet modulatorer.
Det system som beskrivs här har många fördelar, såsom lätthet, enkelhet, kostnadseffektivitet, och den allmänna adopterbarheten av den experimentella uppsättningen. Det finns dock några begränsningar också. Till exempel, systemet avser inte samspelet mellan prebiotika (eller andra ingrepp som används) i det övre matsmältningssystemet (t. ex. saliv, mage, tunntarm) innan de utsätts för bakterieflora i tjocktarmen. Sådana åtgärder kan dock antas och införlivas i enlighet med särskilda experimentella krav. Också, en syrlig och/eller enzymatisk hydrolysprocess kan behöva utföras före jäsning om du använder specifika substrat inklusive hela livsmedel eller smältbara livsmedel eftersom endast den svårsmält delen av sådana livsmedel når till tjocktarmen som fermenteras av den lägre Gut bakterieflora. Dessutom kan sammansättningen av Gut bakterieflora skifta på grund av särskilda odlingsförhållanden under jäsningen. Till exempel, det observerades att upp till 9 h av inkubering, bakterieflora förändringar är mycket närmare normal än vid 24 h. Men efter 24 h inkubation, även om pH och SCFAs nivåer ökat kraftigt, Gut bakterieflora sammansättning visade att Proteobacteria räknas ökade medan den mikrobiella mångfalden reduceras. Emellertid, det är fortfarande okänt hur exakt och nära den ökade ackumulationen av mikrobiella metaboliter tillsammans med sänkt fekal pH är associerad med specifika bakterieflora signaturer.
Sammanfattnings, ett enkelt protokoll för att simulera den ex vivo bakterieflora ekosystemet beskrivs häri. Systemet gör det möjligt för forskare att testa olika interventioner för modulering av bakterieflora mångfald, sammansättning och metabolisk funktion som kan påverka olika funktioner i värden tarm och allmänna hälsa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner tacksamt finansiering stöd från centrum för diabetes, fetma och metabolism och den kliniska och translationella Science Center, Wake Forest School of Medicine, Department of Defense finansiering (Grant Number: W81XWH-18-1-0118), den Kermit Glenn Phillips II stol i kardiovaskulär medicin; de nationella instituten för hälso-finansierade Claude D. Pepper äldre amerikaner Center (finansierat av P30AG12232); R01AG18915; R01DK114224 och den kliniska och translationella Science Center (klinisk forskningsenhet, finansierad av UL1TR001420), är också tack och lov erkänt. Vi tackar också volontärer för att tillhandahålla fekal prover, och våra andra Lab medlemmar för deras tekniska hjälper under detta experiment.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | 217255 | |
| Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 | TGI | C2388 | Toxic |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2•2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | Irritating |
| Cobaltous Chloride Hexahydrate (CoCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | 255599 | |
| Cupric Chloride Dihydrate (CuCl2•2H2O) | Acros organics | 2063450000 | Toxic, Irritating |
| Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C121800 | |
| D-biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| D-Pantothenic acid | Alfa Aesar | A16609 | |
| Disodium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrate (Na2EDTA) | Biorad | 1610729 | |
| DL-α-methylbutyrate | Sigma-Aldrich | W271918 | |
| Ferrous Sulfate Heptahydrate (FeSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | F8263 | Toxic |
| Folic acid | Alfa Aesar | J62937 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | |
| Hepes | Alfa Aesar | A14777 | |
| Isobutyrate | Alfa Aesar | L04038 | |
| Isovalerate | Alfa Aesar | A18642 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Manganese Chloride Tetrahydrate (MnCl2•4H2O) | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Niacin (Nicotinic acid) | Sigma-Aldrich | N4126 | |
| Nickel(Ii) Chloride Hexahydrate (NiCl2•6H2O) | Alfa Aesar | A14366 | Toxic |
| N-valerate | Sigma-Aldrich | 240370 | |
| P-aminobenzoic acid | MP China | 102569 | Toxic, Irritating |
| Phosphoric Acid (H3PO4) | Sigma-Aldrich | P5811 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5504 | |
| Potassium Hydrogen Phosphate (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | 1551128 | |
| Pyridoxine | Alfa Aesar | A12041 | |
| Resazurin | Sigma-Aldrich | R7017 | |
| Riboflavin | Alfa Aesar | A11764 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | 1613757 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher BioReagents | 7647-14-5 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Chemicals | S320 | |
| Sodium Molybdate Dihydrate (Na2MoO4•2H2O) | Acros organics | 206375000 | |
| Thiamine Hydrochloride (Thiamin-HCl) | Acros organics | 148991000 | |
| Trypticase | BD Biosciences | 211921 | |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161 | |
| Zinc Sulfate Heptahydrate (ZnSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
| 0.22 µm membrane filter | |||
| AMPure magnetic purification beads | Agencourt | ||
| Anaerobic chamber with incubatore | Forma anaerobic system, Thermo Scientific, USA | ||
| Bottle filter | Corning | ||
| Cheesecloth | |||
| Illumina MiSeq sequencer | Miseq reagent kit v3 | ||
| pH meter | |||
| Qiagen PowerFecal kit | Qiagen | ||
| Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software | |||
| Qubit-3 fluorimeter | InVitrogen | ||
| Vortex | Thermoscientific | ||
| Waters-2695 Alliance HPLC system | Waters Corporation |
References
- Shreiner, A. B., Kao, J. Y., Young, V. B. The gut microbiome in health and in disease. Current Opinion in Gastroenterology. 31 (1), 69-75 (2015).
- Xu, Z., Knight, R. Dietary effects on human gut microbiome diversity. British Journal of Nutrition. 113, 1-5 (2015).
- Jiang, C., Li, G., Huang, P., Liu, Z., Zhao, B. The gut microbiota and Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimers Disease. 58 (1), 1-15 (2017).
- Clemente, J. C., Ursell, L. K., Parfrey, L. W., Knight, R. The impact of the gut microbiota on human health: an integrative view. The Journal Cell. 148 (6), 1258-1270 (2012).
- Yadav, H., Jain, S., Marotta, F. Probiotics mediated modulation of gut flora might be biotherapeutical approach obesity and type 2 diabetes. Metabolomics : Open Access. 1 (3), 1-3 (2011).
- Ahmadi, S., et al. Dietary Polysaccharides in the Amelioration of Gut Microbiome Dysbiosis and Metabolic Diseases. Obesity and Control Theries: Open Access. 4 (3), (2017).
- Nagpal, R., et al. Obesity-Linked Gut Microbiome Dysbiosis Associated with Derangements in Gut Permeability and Intestinal Cellular Homeostasis Independent of Diet. Journal of Diabetes Research. , 1-9 (2018).
- Paul, B., et al. Influences of diet and the gut microbiome on epigenetic modulation in cancer and other diseases. Journal of Clinical Epigenetics. 7 (1), 112 (2015).
- O’mahony, S., Clarke, G., Borre, Y., Dinan, T., Cryan, J. Serotonin tryptophan metabolism and the brain-gut-microbiome axis. Journal of Behavioural Brain Research. 277, 32-48 (2015).
- Sharon, G., et al. Specialized metabolites from the microbiome in health and disease. Journal of Cell Metabolism. 20 (5), 719-730 (2014).
- Faber, T. A., Bauer, L. L., Price, N. P., Hopkins, A. C., Fahey, G. C. In vitro digestion and fermentation characteristics of temulose molasses, a coproduct of fiberboard production, and select temulose fractions using canine fecal inoculum. Journal of Agricultural Food Chemistry. 59 (5), 1847-1853 (2011).
- Bourquin, L. D., Titgemeyer, E. C., Fahey, G. C. Vegetable fiber fermentation by human fecal bacteria: cell wall polysaccharide disappearance and short-chain fatty acid production during in vitro fermentation and water-holding capacity of unfermented residues. Journal of Nutrition. 123 (5), 860-869 (1993).
- Nagpal, R., et al. Human-origin probiotic cocktail increases short-chain fatty acid production via modulation of mice and human gut microbiome. Scientific Reports. 8 (1), 12649 (2018).
- Nagpal, R., et al. Comparative microbiome signatures and short-chain fatty acids in mouse, rat, non-human primate and human feces. Frontiers in Microbiology. 9, 2897 (2018).
- Thangamani, S., Guinan, J., Wang, S., Yadav, H. Antibiotic-induced decreases in the levels of microbial-derived short-chain fatty acids promote gastrointestinal colonization of Candida albicans. bioRxiv. , 428474 (2018).
- Ahmadi, S., et al. Prebiotics from acorn and sago prevent high-fat diet-induced insulin resistance via microbiome-gut-brain axis modulation. The Journal of Nutritional Biochemistry. , (2019).
- Nagpal, R., et al. Gut Microbiome Composition in Non-human Primates Consuming a Western or Mediterranean Diet. Frontiers in Nutrition. 5, 28 (2018).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME Journal. 6 (8), 1621-1624 (2012).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
- Garcia-Villalba, R., et al. Alternative method for gas chromatography-mass spectrometry analysis of short-chain fatty acids in faecal samples. Journal of Seperation Science. 35 (15), 1906-1913 (2012).
- Lee, C. H., et al. Frozen vs Fresh Fecal Microbiota Transplantation and Clinical Resolution of Diarrhea in Patients With Recurrent Clostridium difficile Infection: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 315 (2), 142-149 (2016).
- Chen, M. -H., et al. In vitro fermentation of xylooligosaccharides produced from Miscanthus× giganteus by human fecal microbiota. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64 (1), 262-267 (2015).
- Cook, S., Sellin, J. Short chain fatty acids in health and disease. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 12 (6), 499-507 (1998).
- Rastelli, M., Knauf, C., Cani, P. D. Gut microbes and health: a focus on the mechanisms linking microbes, obesity, and related disorders. Obesity. 26 (5), 792-800 (2018).
- Zou, J., et al. Fiber-mediated nourishment of gut microbiota protects against diet-induced obesity by restoring IL-22-mediated colonic health. Cell Host & Microbe. 23 (1), e44 41-53 (2018).
- Dinan, T. G., Cryan, J. F. Gut–brain axis in 2016: Brain–gut–microbiota axis—mood, metabolism and behaviour. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (2), 69 (2017).
