Een in vitro batch cultuur model om de effecten van Interventionele regimes op menselijke fecale microbiota te schatten

Summary

Dit protocol beschrijft een in vitro batch cultuur fermentatiesysteem van menselijke fecale microbiota, met behulp van inuline (een bekende prebiotisch en een van de meest bestudeerde microbiota modulatoren) om het gebruik van dit systeem te demonstreren bij het inschatten van de effecten van specifieke interventies op fecale microbiota samenstelling en metabole activiteiten.

Abstract

De opkomende rol van het microbioom van de darmen bij verschillende menselijke ziekten vereist een doorbraak van nieuwe instrumenten, technieken en technologieën. Dergelijke verbeteringen zijn nodig om te ontcijferen van het gebruik van microbiome modulatoren voor voordelen voor de menselijke gezondheid. Echter, de grootschalige screening en optimalisatie van modulatoren om te valideren microbiome modulatie en voorspel gerelateerde gezondheidsvoordelen kunnen praktisch moeilijk zijn als gevolg van de noodzaak voor een groot aantal dieren en/of menselijke proefpersonen. Hiertoe kunnen in vitro-of ex vivo-modellen een voorafgaande screening van microbiome-modulatoren vergemakkelijken. Hierin, het is geoptimaliseerd en aangetoond een ex vivo fecale microbiota cultuur systeem dat kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de effecten van verschillende interventies van gut microbiome modulatoren met inbegrip van probiotica, prebiotica en andere voedselingrediënten, afgezien van nutraceuticals en drugs, over de diversiteit en samenstelling van de menselijke gut microbiota. Inuline, een van de meest bestudeerde prebiotische verbindingen en microbiome modulatoren, wordt gebruikt als een voorbeeld hier te onderzoeken van het effect ervan op de gezonde fecale microbiota samenstelling en de metabole activiteiten, zoals fecale pH en de fecale niveaus van organische zuren met inbegrip van lactaat en korte-keten vetzuren (SCFAs). Het protocol kan nuttig zijn voor studies die gericht zijn op het inschatten van de effecten van verschillende interventies van modulatoren op fecale microbiota-profielen en op het voorspellen van hun gevolgen voor de gezondheid.

Introduction

De humane microbiota is een complexe Gemeenschap bestaande uit bacteriën, Archaea, virussen en eukaryotische microben¹, die het menselijk lichaam zowel intern als extern bewonen. Recente bewijzen hebben de fundamentele rol van de darm microbiota en het darm-microbiome (de gehele verzameling van microben en hun genen gevonden in het menselijk maagdarmkanaal) vastgesteld in verschillende menselijke ziekten, waaronder obesitas, diabetes, hart-en vaatziekten, en kanker^1,2,3. Bovendien produceren de micro-organismen die in onze darmen leven een breed spectrum van metabolieten die een aanzienlijke invloed hebben op onze gezondheid en kunnen ook bijdragen aan de pathofysiologie van verschillende ziekten, evenals een verscheidenheid aan metabole functies^{4, 5}. abnormale veranderingen (verstoringen) in de samenstelling en functie van deze darm microbiële populatie worden over het algemeen aangeduid als "gut dysbiosis". Dysbiosis wordt meestal geassocieerd met een ongezonde toestand van de gastheer en kan dus worden onderscheiden van de normale (homeostatische) microbiële Gemeenschap die is gekoppeld aan een gezonde controle staat van de gastheer. Specifieke patronen van gut microbiome dysbiosis worden vaak gevonden in verschillende ziekten^1,2,3,6,7.

De fermentatie van onverteerd voedsel, in het bijzonder de fermenteerbare koolhydraten/vezels, door de darm microbiota levert niet alleen energie op, maar produceert ook afwijkende metabolieten, waaronder korte-keten vetzuren (SCFAs), lactaat, formaat, koolstofdioxide, methaan, waterstof en ethanol⁶. Bovendien, de darm microbiota produceert ook een aantal andere bioactieve stoffen zoals folaat, biotine, trimethylamine-N-oxide, serotonine, tryptofaan, Gamma-aminoboterzuur, dopamine, noradrenaline, acetylcholine, histamine, deoxycholzuur en 4-ethylfenylsulfaat. Dit gebeurt voornamelijk door het gebruik van intrinsieke metabole fluxen binnen de host-microbe niche, die bijdraagt aan verschillende lichaamsprocessen, metabole functies en epigenetische veranderingen^{1,8,9, 10}. De effecten van verschillende interventies op dergelijke microbiële producten blijven echter onkown of onduidelijk vanwege het ontbreken van eenvoudige, efficiënte en reproduceerbare protocollen. De humane gut microbiota samenstelling is een extreem complex en divers ecosysteem, en daarom blijven veel vragen over haar rol in de menselijke gezondheid en ziekte pathologie nog steeds onbeantwoord. De effecten van vele gemeenschappelijke gut microbiome modulatoren (bv., probiotica, prebiotica, antibiotica, fecale transplantatie en infecties) op de samenstelling en metabole functies van de intestinale microbiota blijven grotendeels ongrijpbaar. Bovendien is het onderzoek en de validering van deze effecten in vivo moeilijk, vooral omdat de meeste nutriënten en metabolieten die door de darm microbiota worden geproduceerd, gelijktijdig en snel in de darmen worden geabsorbeerd of afgevoerd; Daarom blijft het meten van de productie, de hoeveelheid en de verwerking van deze metabolieten (bijv. SCFAs) in vivo nog steeds een praktische uitdaging. Inderdaad, fysiologische modellen zoals dieren en menselijke proefpersonen zijn van cruciaal belang voor het bepalen van de rol van gut microbiome en de modulatie ervan op gastheer gezondheid, maar deze mogelijk niet geschikt voor grootschalige screening van verschillende soorten microbiome modulatoren als gevolg van ethische, monetaire of tijdsbeperkingen. Hiertoe kunnen in vitro en/of ex vivo-modellen, zoals het kweken van gut microbiota in vitro en vervolgens interveniëren met verschillende microbiota-modulatoren, tijd-en geldbesparings mogelijkheden bieden en kunnen daarom voorlopige of grootschalige screening van verschillende componenten (zoals probiotica, prebiotica, en andere Interventionele verbindingen) om te onderzoeken/voorspellen hun effecten op de fecale microbiota diversiteit, samenstelling en metabole profielen. Studies met behulp van dergelijke in vitro en ex vivo systemen van het microbioom van de darmen kunnen meer inzicht in de interacties van gastheer-microbiome die bijdragen tot gastheer gezondheid en ziekte te vergemakkelijken, en kan ook leiden tot het vinden van nieuwe therapieën die gericht zijn op de microbiome te verbetering van de gezondheid van de gastheer en voorkomen en behandelen van verschillende ziekten¹.

Hoewel de in vitro gut microbiota cultuur systemen niet echt de werkelijke intestinale omstandigheden kunnen repliceren, hebben verschillende laboratoria getracht dergelijke modellen te ontwikkelen, waarvan sommige tot op zekere hoogte uitvoerbaar zijn bevonden en met succes zijn gebruikt voor verschillende doeleinden. Een van de recente gut modellen is de Simulator van de menselijke intestinale microbiële ecosysteem, die het hele menselijke maagdarmkanaal nabootst, met inbegrip van de maag, dunne darm, en verschillende gebieden van de dikke darm. Dergelijke technisch complexe modellen zijn echter mogelijk niet toegankelijk voor andere onderzoeksfaciliteiten wereldwijd. Daarom is er nog steeds een kritische behoefte aan de ontwikkeling van nieuwe alternatieve modellen die relatief eenvoudig, betaalbaar en praktisch zijn voor laboratoria die de microbiome modulatoren bestuderen en hun effecten op gut microbiota en host Health. Daarom zou het gebruik van een in vitro (of ex vivo) fecaal microbiota-cultuur systeem nuttig zijn voor het bestuderen van de effecten van dergelijke interventies^11,12. Specifiek, het effect van verschillende prebiotica op de microbiota fermentatie capaciteit in termen van periodieke veranderingen in de darm microbiota diversiteit en samenstelling, de fecale pH, en de niveaus van microbiële metabolieten, met inbegrip van SCFAs en lactaat kan worden bestudeerd ¹³. hierin wordt, met behulp van inuline (een van de meest bestudeerde prebiotische componenten) als voorbeeld van de microbiome modulator, een stapsgewijs Protocol van dit eenvoudige ex vivo microbiota batch-cultuur systeem beschreven om het gebruik ervan aan te tonen om de veranderingen in de fecale microbiota en microbiële metabolieten na interventie met de microbiome modulatoren.

Protocol

Let op: Raadpleeg de juiste veiligheidsinformatiebladen en volg de instructies en richtlijnen voor de juiste training voor Biosafety level 2 (BSL-2). Volg alle kweek stappen volgens de standaard bioveiligheidsregels en gebruik een BSL-2 kast met aseptische condities. Bovendien kunnen fecale monsters van verschillende modellen en menselijke proefpersonen potentieel risico lopen om microbiële overgedragen ziekten te verspreiden. Onmiddellijk medische hulp inroepen bij het optreden van een verwonding en infectie. Bovendien moet het gebruik van monsters van menselijke en dierlijke ontlasting worden goedgekeurd via institutionele ethische comités en moet het voldoen aan de protocollen voor het gebruik van monsters en informatie over het onderwerp.

1. voorbereiding van cultuur media

1. Voorbereiding van de cultuur media, bereid negen soorten stockoplossingen voor
   1. Oplossing A (1.000 mL): Los 5,4 g natriumchloride (NaCl), 2,7 g kalium diwaterstoffosfaat (KH₂po₄), 0,16 g calciumchloridedihydraat (CACL₂· 2H₂O), 0,12 g van magnesium chloride-hexahydraat (MgCl₂ · 6h₂o), 0,06 g mangaan chloride-tetrahydraat (mncl₂· 4h₂O), 0,06 g van Cobalteus chloride-hexahydraat (COCl₂· 6h₂O) en 5,4 g ammoniumsulfaat (NH₄)₂so₄, in gedeïoniseerd water om het totale volume te maken tot 1.000 mL.
   2. Oplossing B (1.000 mL): los 2,7 g kalium waterstof fosfaat (K2HPO4) op in gedeïoniseerd water om een totaal volume te maken tot 1000 mL.
   3. Minerale oplossing (1.000 mL): Los 500 mg dinatriumethyleendiamine-tetraacetaatdihydraat op (na₂EDTA), 200 mg ferrosulfaat heptahydraat (Feso₄· 7h₂O), 10 mg Zinksulfaat-heptahydraat (znso₄ · 7h₂o), 3 mg mangaan (II) chloride-tetrahydraat (mncl₂· 4h₂o), 30 mg fosforzuur (H₃po₄), 20 mg COCl₂· 6h₂o, 1 mg koper-chloride dihydraat (cucl₂ · 2H₂o), 2 mg nikkel (II) chloride-hexahydraat (nicl₂· 6h₂o) en 3 mg natriummolybdaat dihydraat (na₂Moo₄· 2H₂O) in gedeïoniseerd water om een totaal volume te maken tot 1.000 ml.
      Opmerking: Deze oplossing is lichtgevoelig, dus zorg ervoor om te worden opgeslagen in donker/zwart of aluminium verpakt buizen/flessen.
   4. In water oplosbare vitamine oplossing (1.000 mL): los 100 mg thiamine hydrochloride (thiamine-HCl), 100 mg D-pantotheenzuur, 100 mg niacine, 100 mg Pyridoxine, 5 mg P-aminobenzoëzuur en 0,25 mg vitamine B12 in gedeïoniseerd water om het totale volume te maken 1.000 mL.
   5. Folaat: Biotine oplossing (1.000 mL): Los 10 mg foliumzuur, 2 mg D-Biotine en 100 mg Ammoniumbicarbonaat (NH₄HCO₃) in gedeïoniseerd water op om een totaal volume te maken tot 1.000 ml.
   6. Riboflavine oplossing (1.000 mL): Los 10 mg riboflavine op in 5 mM HEPES (1,19 g/L) oplossing om een totaal volume te maken tot 1.000 mL.
   7. Hemin-oplossing (10 mL): Los 5.000 mg Hemin op in 10 mM natriumhydroxide (NaOH) (0,4 g/L) oplossing om een totaal volume te maken tot 10 mL.
   8. Korte-keten vetzuur mengsel (10 mL): Combineer 2,5 mL N-valeraat, 2,5 mL isovaleraat, 2,5 mL isobutyraat en 2,5 mL: DL-α-methylbutyraat.
      Opmerking: Deze oplossing wordt aanbevolen om te gebruiken in rook afzuigkap om geur en dampen te voorkomen.
   9. Resazurin (1.000 mL): Los 1 g resazurin op in gedeïoniseerd water en breng het totale volume naar 1.000 mL.
2. Medium gebruikt voor in-vitro anaerobe gisting
   1. Om deze media voor te bereiden, meng 330 mL oplossing A, 330 mL oplossing B, 10 mL trace minerale oplossing, 20 mL in water oplosbare vitamine oplossing, 5 mL folaat: Biotine oplossing, 5 mL riboflavine oplossing; 2,5 mL Hemin oplossing, 0,4 mL van de korte keten vetzuur mengsel, 1 mL Resazurin, 0,5 g gistextract, 4 g natriumcarbonaat (na₂co₃), 0,5 g cysteïne HCL-H₂O, en 0,5 g Trypticase, en voeg 296,1 ml gedistilleerd water toe.
   2. Controleer de pH en zorg ervoor dat het rond 7,0, zo niet, pas de pH met 1 N HCl of 1 N NaOH. Steriliseren door vacuüm de media te filteren met behulp van een fles filter onder het aseptische werkstation.
   3. U ook alle componenten (behalve vitamine-en wijk haemin-oplossingen) en autoclaaf bij 121 °C gedurende 20 minuten mengen en laten afkoelen tot kamertemperatuur. Tegelijkertijd, filter-steriliseren vitamine en wijk haemin oplossingen met behulp van 0,22 μm membraanfilters en voeg deze toe aan de geautoclaveerd en gekoelde media voor het doseren.

2. bereiding van de anaerobe kamer en het vereiste materiaal

1. Houd alle materialen, oplossingen en hulpmiddelen die nodig zijn voor het fermentatie-experiment binnen de anaerobe kamer ten minste 48 uur vóór de aanvang van het experiment, om ervoor te zorgen dat eventuele rest zuurstof in verband met gereedschappen en oplosbare zuurstof in buffers/oplossingen verwijderd en alle materialen worden geacclimatiseerd op de ingestelde anaerobe condities.
   Opmerking: Benodigde materialen in de anaerobe kamer (48 h eerder van het experiment om te starten): i) fermentatie media; II) anaerobe oplossing (bereid overeenkomstig punt 4,1), III) vortexer, (IV) Weeg balans, (v) mousseline kaas doeken, (VI) schaar, (VII) trechter, (VIII) 1,5, 2,0, 15, 50 ml buizen, (IX) Pipet (2, 20, 200 en 1.000 μL) en compatibele pipetpunten, (x) pistool Pipet en pipets (5 en 10 mL), (XI) papier weefsels, (XII) markers, (XIII) buis staat voor verschillende buizen, (XIV) afvalbak, (XV) O₂ indicator en (xvi) 70% ethanol spuitfles (ontsmettingsmiddel).

3. bereiding van buizen en vezels

1. Gewicht 300 mg inuline en overdracht naar een buis van 50 mL gevolgd door de aseptisch optellen van 26 mL fermentatie media die reeds zijn voorbereid en opgeslagen in de anaerobe kamer. Bereid een lege buis voor elk fecaal monster type en experimentele buis (en) (volgens het aantal verbindingen dat wordt getest), in drievand.
2. Laat deze buizen in de anaerobe kamer gedurende ongeveer 24 uur om de hydratatie van monsters te laten voordat het fermentatie experiment begint. Zorg ervoor dat de buistemperatuur 37 °C is op het moment van de inoculatie, breng de buisjes dan in de incubator die zich in de anaerobe kamer bevindt.

4. bereiding van het entmateriaal

1. Anaerobe verdunnings oplossing (ten minste 48 h voor fermentatie-experiment): Los 5 g NaCl, 2 g glucose en 0,3 g cysteïne-HCl op in gedeïoniseerd water en maak een totaal volume tot 1.000 mL. Autoclaaf en bewaar het in de anaerobe kamer ten minste 48 uur voor gebruik.
2. Fecale entmateriaal preparaat (op de dag van de fermentatie-experiment): Weeg 5 g vers fecaal monster in een conische buis van 50 ml, voeg een anaerobe verdunnings oplossing toe voor een eindvolume van 50 ml (1:10 w/v) en Vortex gedurende 15 min of tot volledig gehomogeniseerd. Filtreer het gehomogeniseerde mengsel door 4 lagen steriele kaasdoek (autoclaved) en gebruik het onmiddellijk voor de inoculatie in de buisjes met media.
   Opmerking: De fecale monsters van een groep van onderwerpen kunnen worden gegroepeerd als het experimentele doel is om het effect van een bepaalde samengestelde/ingrediënt op algehele gezonde versus zieke fecale microbiota in het algemeen te vergelijken.

5. fermentatie en bemonstering

1. Bereid buizen volgens de paragraaf 4,2 en inoculeren blanco/controle en experimentele buizen met 4 mL verdund en gefilterd fecaal entmateriaal. Incuberen de inocculeerde buisjes bij 37 °C in de anaerobe kamer. Schud de buizen eenmaal per uur door zachtjes om te keren om de vezels en het entmateriaal opnieuw op te schorten.
2. Verzamel zo vaak als nodig monsters, bijvoorbeeld uur tot 0, 3, 6, 9 en 24 uur tijdens de fermentatie, door een 2 mL aliquot-monster uit te nemen in een buis van 2 mL van de respectieve vergistings buizen.
3. Meet de pH van de aliquots met behulp van een pH-meter in het laboratorium (door de pH-elektrode rechtstreeks in het monster te plaatsen); Centrifugeer het resterende monster bij 14.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c. Onmiddellijk bevriezen van de supernatant en pellet in vloeibare stikstof, en na snap bevriezing, bewaar de supernatant voor SCFAs analyse en pellet voor microbiome analyse bij-80 °C.

6. korte keten vetzuren (SCFAs) en lactaat kwantificering

Opmerking: De scfas en lactaat in de supernatant van microbiome cultuur kunnen exact worden gemeten volgens de methoden die elders^13,14,15,16worden beschreven.

1. In het kort het ontdooien van de in rubriek 5 verkregen bevroren supernatanten uit controle-en behandelings monsters op ijs en voert alle verdere verwerkingsstappen op ijs uit. Filtreer de supernatant door een membraanfilter van 0,45 μm en gebruik de celvrije monsters om de concentraties van SCFAs en lactaat te meten met behulp van een HPLC-systeem met vader detector bij 210 Nm, uitgerust met een HPX-87H-kolom. Gebruik voor elk monster een injectievolume van 10 μL en gebruik H₂, dus₄ (0,005 N) om de kolom te elzen met een debiet van 0,6 mL/min bij 35 °c.

7. fecale Microbiome analyse

Opmerking: Voer microbiome analyse volgens de methoden en pijplijn gedetailleerd elders^7,13,14,17.

1. Kort, extract genomische DNA van ongeveer 200 mg fecale slurry pellets met behulp van een fecale DNA-extractie Kit¹³.
2. Versterk het hypervariabele gebied van het bacteriële 16s rRNA-gen met behulp van de met primers volgens de methode die elders wordt beschreven¹³, met behulp van de primer sequenties zoals beschreven in het Earth microbiome project protocol¹⁸.
3. Reinig de resulterende amplicons met magnetische zuiverings kralen en kwantificeer door Picogreen of een gelijkwaardige methode. Zwembad de gezuiverde PCR-producten in gelijke Molaire concentratie en volgorde op een sequencer¹³.
4. Verwerk de resulterende sequenties voor de-multiplexing, Quality filtering en clustering, taxonomische toewijzing en rarefactie, en downstream analyses door gebruik te maken van de kwantitatieve inzichten in microbiële ecologie (QIIME) software volgens de methoden die worden beschreven door Caporaso et al.¹⁹.

Representative Results

Het protocol wordt gebruikt om het effect van een specifiek prebioticum (d.w.z. inuline op de microbiota-samenstelling en metabolische activiteiten in termen van veranderingen in de fecale pH en de concentratie van lactaat en SCFAs in de uitwerpselen van gezonde menselijke proefpersonen over verschillende tijdspunten na behandeling met inuline). De fecale pH, de fecale niveaus van lactaat en SCFAs (Figuur 1) en de microbiota-samenstelling (Figuur 2 en Figuur 3) worden gemeten bij 0 (baseline), 9 en 24 uur incubatie met of zonder inuline. De resultaten tonen aan hoe fecale microbiota samenstelling en de metabole activiteiten worden gemoduleerd tijdens in vitro fermentatie met of zonder inuline behandeling.

Figuur 1: veranderingen in fecale pH (a), lactaat (b) en korte-keten vetzuren viz. acetaat (c), propionaat (d) en butyraat (e) in menselijke ontlasting bij 0 (baseline), 9 en 24 h van anaerobe gisting met of zonder inuline. De hier gepresenteerde waarden zijn gemiddelde ± SEM van drievat monsters. ^* P < 0,05, ^{* *}p < 0,01, ^{* * *}p < 0,001, VS. baseline. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: veranderingen in de microbiota diversiteit en samenstelling in menselijke uitwerpselen bij 0 (baseline), 9 en 24 h van anaerobe gisting met of zonder inuline. a) gewogen en (b) ongewogen unifrac-maatregelen van bèta-diversiteit gevisualiseerd met behulp van principe Coordinatenanalyse (pcoa). (c-f) Indices van Alfa-diversiteit viz. fylogenetische diversiteit (PD hele boom (c); soortenrijkdom (Chao1; d); waargenomen aantal operationele taxonomische eenheden (Otu's, e); en soort evenheid (Shannon index, f)). Relatieve overvloed aan grote omvat (g) en geslachten (h). De hier gepresenteerde waarden zijn gemiddelde ± SEM van drievat monsters. ^* P < 0,05, ^{* *}p < 0,01, VS. baseline. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: Lineaire Discriminant Analyse (LDA) effect grootte (LEfSe) analyse van gut microbiota veranderingen na 9 h en 24 h incubatie met (INU) of zonder (CTL) inuline. Taxonomische cladogram afgeleid van de LEfSe analyse van 16S sequenties (relatieve abundantie ≥ 0,5%) representatief voor de differentieel overvloedige taxa tussen verschillende groep monsters. De helderheid van elke stip is evenredig aan de grootte van het effect (dat wil zeggen, het taxon overvloed). Alleen taxa passing LDA drempelwaarde van > 2.4 worden hier weergegeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

De in vitro fecale slurry fermentatie model hier gepresenteerd is een eenvoudige single-batch model om de effecten van verschillende substraten en microbiële stammen (bijvoorbeeld prebiotica en probiotica) op de samenstelling van menselijke fecale microbiota evenals haar metabole activiteiten in termen van fecale pH en SCFAs niveaus. De hierin gepresenteerde resultaten tonen aan dat de inoculatie van inuline de fecale pH vermindert en de niveaus van SCFAs en lactaat in inuline behandelde fecale specimen aanzienlijk verhoogt in vergelijking met niet-behandelde fecale microbiota-cultuur (Figuur 1). Bovendien lijkt de handtekening van de gut microbiota ook verschillend te zijn tussen inuline behandelde en onbehandelde monsters (Figuur 2 en Figuur 3). Deze gegevens illustreren hoe dit systeem de effecten van inuline op fecale microbiome diversiteit en samenstelling evenals de metabole activiteiten kan weerspiegelen. Bovendien kunnen, afhankelijk van specifieke experimentele doelstellingen en hypotheses, ook een aantal andere factoren worden gemeten met behulp van dit systeem. Bovendien, naast 16s rRNA gensequencing, andere analyses zoals gehele microbiële meta-sequencing (met behulp van Whole genoom sequencer) of qPCR-en cultuur methoden die gericht zijn op specifieke enkelvoudige of meervoudige geslachten, soorten en stammen (bijv. bifidobacteriën, lactobacilli, Akkermansia, enterobacteriacaea, Clostridia, enz.) kan ook worden uitgevoerd. Daarnaast kunnen verschillende chromatografische procedures voor de analyse van Scfi's, zoals LC-MS, GC, GC-MS, GC-FID en HPLC, ook worden benut op basis van experimentele vereisten en beschikbaarheid. Niettemin moet worden opgemerkt dat de monstervoorbereiding voor deze procedures kan variëren naargelang van de instrumenten en voorwaarden die voor operatie²⁰vereist zijn.

Hoewel het gebruik van verse fecale specimen beste reproduceerbare resultaten zou opleveren; echter, snap bevroren fecale monster (zoals gebruikt in het hier gepresenteerde experiment) kan ook effectief worden gebruikt, omdat de meeste van de bacteriën kunnen worden herleven van het zodra rescitated naar lichaamstemperatuur en niet meer ontleding gebeurt na de bevriezing²¹. Het gebruik van bevroren monsters kan bijzonder voordelig zijn wanneer het onmogelijk is om verse fecale monsters te verkrijgen van specifieke donor (s) op de geplande dag van het experiment, of van dezelfde donor wanneer een experiment moet worden gerepliceerd. Opgemerkt moet echter worden, dat de fecale monsters moeten worden bevroren met behulp van vloeibare stikstof en onmiddellijk opgeslagen bij-80 °C tot verder gebruik. Om te voorkomen dat de bevroren fecale monsters aan de lucht (zuurstof) worden blootgesteld, moeten de monsters bovendien zo snel mogelijk/onmiddellijk na het uit de vriezer halen en direct worden gebruikt, worden overgebracht naar de anaerobe kamer (herhaalde ontdooiing moet worden vermeden). Alle daaropvolgende experimenten, met inbegrip van monster ontdooien, entmateriaal voorbereiding en verwerking, moeten worden uitgevoerd in de anaerobe kamer.

De intestinale organische omgeving en pH tijdens de nutriënten gisting in de dikke darm zijn zeer belangrijk, vooral gezien het feit dat een abnormaal verlaagde pH duidt op een verhoogde zuurgraad als gevolg van het substraat gebruik. Vandaar dat een snellere pH-reductie kan corresponderen met een snellere substraat benutting²². Hoewel, in dit model, de pH niet is gecontroleerd, maar de opname van identieke niet-behandelde controle wordt sterk aanbevolen om directe vergelijkingen te maken. De SCFAs geproduceerd in de dikke darm als gevolg van de fermentatie van onverteerbare polysacchariden door de darm microbiota kan verder beïnvloeden diverse mechanismen met betrekking tot het onderhoud van de gastheer gezondheid. Deze metabolieten bijdragen in gluconeogenese en lipide biosynthese, fungeren als een energiebron voor colonocyten, en kan ook gezondheidsvoordelen met inbegrip van immuun modulatie, gecontroleerde/verbeterde gut barrière functies, en neuromodulatie^{23, 24,25,26}. Bovendien, SCFAs zijn ook bekend om verschillende biologische trajecten met inbegrip van hormonen, endocannabinoïde systeem, celproliferatie en overlijden, bot gezondheid, minerale absorptie, gut motiliteit, intestinale pH, en omkeren effecten op het microbioom van de darmen en microbiële metabole functie. Daarom kan kennis van het profiel en de concentraties van intestinale/fecale SCFAs een belangrijk onderdeel zijn bij het evalueren van de werkzaamheid van specifieke microbiota-modulatoren⁶. Natuurlijk, naast SCFAs, produceert het microbioom van de darmen ook vele andere belangrijke metabolieten (bijv. ammonium, vitaminen, histamine). Vandaar dat de supernatant-specimens die tijdens dergelijke in-vitro fermentatie-experimenten worden verzameld, ook kunnen worden geëvalueerd voor mondiale metabolomica-analyses om nieuwe gut microbiome-afgeleide metabolieten te ontdekken die kunnen worden beïnvloed door specifieke microbiome-modulatoren.

Het hier beschreven systeem heeft vele voordelen, zoals het gemak, de eenvoud, de kosteneffectiviteit en de algemene adoptie van de experimentele opstelling. Er zijn echter ook enkele beperkingen. Het systeem heeft bijvoorbeeld geen betrekking op de interactie van prebiotica (of andere ingrepen die worden gebruikt) in het bovenste spijsverteringsstelsel (bv. speeksel, maag, dunne darm) voordat het wordt blootgesteld aan de microbiota van de dikke darm. Dergelijke stappen kunnen echter worden aangenomen en opgenomen volgens specifieke experimentele vereisten. Er kan ook een zure en/of enzymatische hydrolyse procedure worden uitgevoerd vóór de fermentatie wanneer specifieke substraten worden gebruikt, met inbegrip van volledig voedsel of verteerbare levensmiddelen, omdat alleen het onverteerbare deel van dergelijke levensmiddelen naar de dikke darm reikt om te worden gefermenteerd door de lagere gut microbiota. Bovendien kan de samenstelling van gut microbiota worden verschoven als gevolg van specifieke cultuuromstandigheden tijdens de fermentatie. Bijvoorbeeld, het werd waargenomen dat tot 9 h van incubatie, microbiota veranderingen zijn veel dichter bij normaal dan op 24 h. Echter, na 24 h van incubatie, hoewel de pH-en SCFAs-niveaus aanzienlijk toenam, toonde de samenstelling van gut microbiota aan dat de proteobacteriën toenemen terwijl de microbiële diversiteit verminderde. Echter, het blijft onbekend hoe nauwkeurig en nauw de toegenomen accumulatie van microbiële metabolieten gepaard met de verlaagde fecale pH wordt geassocieerd met specifieke microbiota handtekeningen.

Samenvattend wordt hierin een eenvoudig protocol beschreven om het ex vivo microbiota-ecosysteem te simuleren. Het systeem stelt onderzoekers in staat om verschillende interventies voor de modulatie van de microbiota diversiteit, samenstelling en metabole functie die diverse kenmerken van de gastheer intestinale en algemene gezondheid kan beïnvloeden testen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammonium Bicarbonate (NH4HCO3)	Sigma-Aldrich	217255
Ammonium Sulfate (NH4)2SO4	TGI	C2388	Toxic
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2•2H2O)	Sigma-Aldrich	C3306	Irritating
Cobaltous Chloride Hexahydrate (CoCl2•6H2O)	Sigma-Aldrich	255599
Cupric Chloride Dihydrate (CuCl2•2H2O)	Acros organics	2063450000	Toxic, Irritating
Cysteine-HCl	Sigma-Aldrich	C121800
D-biotin	Sigma-Aldrich	B4501
D-Pantothenic acid	Alfa Aesar	A16609
Disodium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrate (Na2EDTA)	Biorad	1610729
DL-α-methylbutyrate	Sigma-Aldrich	W271918
Ferrous Sulfate Heptahydrate (FeSO4•7H2O)	Sigma-Aldrich	F8263	Toxic
Folic acid	Alfa Aesar	J62937
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Hemin	Sigma-Aldrich	H9039
Hepes	Alfa Aesar	A14777
Isobutyrate	Alfa Aesar	L04038
Isovalerate	Alfa Aesar	A18642
Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2•6H2O)	Sigma-Aldrich	M8266
Manganese Chloride Tetrahydrate (MnCl2•4H2O)	Sigma-Aldrich	221279
Niacin (Nicotinic acid)	Sigma-Aldrich	N4126
Nickel(Ii) Chloride Hexahydrate (NiCl2•6H2O)	Alfa Aesar	A14366	Toxic
N-valerate	Sigma-Aldrich	240370
P-aminobenzoic acid	MP China	102569	Toxic, Irritating
Phosphoric Acid (H3PO4)	Sigma-Aldrich	P5811
Potassium Dihydrogen Phosphate (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5504
Potassium Hydrogen Phosphate (K2HPO4)	Sigma-Aldrich	1551128
Pyridoxine	Alfa Aesar	A12041
Resazurin	Sigma-Aldrich	R7017
Riboflavin	Alfa Aesar	A11764
Sodium carbonate (Na2CO3)	Sigma-Aldrich	1613757
Sodium chloride (NaCl)	Fisher BioReagents	7647-14-5
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher Chemicals	S320
Sodium Molybdate Dihydrate (Na2MoO4•2H2O)	Acros organics	206375000
Thiamine Hydrochloride (Thiamin-HCl)	Acros organics	148991000
Trypticase	BD Biosciences	211921
Vitamin B12	Sigma-Aldrich	V2876
Yeast extract	Sigma-Aldrich	70161
Zinc Sulfate Heptahydrate (ZnSO4•7H2O)	Sigma-Aldrich	Z0251
0.22 µm membrane filter
AMPure magnetic purification beads	Agencourt
Anaerobic chamber with incubatore	Forma anaerobic system, Thermo Scientific, USA
Bottle filter	Corning
Cheesecloth
Illumina MiSeq sequencer	Miseq reagent kit v3
pH meter
Qiagen PowerFecal kit	Qiagen
Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software
Qubit-3 fluorimeter	InVitrogen
Vortex	Thermoscientific
Waters-2695 Alliance HPLC system	Waters Corporation