Summary
Questo protocollo descrive un sistema di fermentazione in vitro a coltura batch del microbiota fecale umano, utilizzando l'inulina (un prebiotico ben noto e uno dei modulatori microbiota più studiati) per dimostrare l'uso di questo sistema nella stima degli effetti di interventi sulla composizione del microbiota fecale e sulle attività metaboliche.
Abstract
Il ruolo emergente del microbioma intestinale in diverse malattie umane richiede una svolta di nuovi strumenti, tecniche e tecnologie. Tali miglioramenti sono necessari per decifrare l'utilizzo dei modulatori del microbioma per i benefici per la salute umana. Tuttavia, lo screening su larga scala e l'ottimizzazione dei modulatori per convalidare la modulazione del microbioma e prevedere i benefici relativi alla salute può essere praticamente difficile a causa della necessità di un gran numero di animali e/o soggetti umani. A tal fine, i modelli in vitro o ex vivo possono facilitare lo screening preliminare dei modulatori del microbioma. Qui, è ottimizzato e dimostrato un sistema di coltura microbiota fecale ex vivo che può essere utilizzato per esaminare gli effetti di vari interventi di modulatori di microbioma intestinale tra cui probiotici, prebiotici e altri ingredienti alimentari, oltre a nutraceutici e droghe, sulla diversità e la composizione del microbiota intestinale umano. L'inulina, uno dei composti prebiotici e modulatori del microbioma più studiati, viene utilizzato come esempio qui per esaminarne l'effetto sulla composizione sana del microbiota fecale e sulle sue attività metaboliche, come il pH fecale e i livelli fecali di acidi organici compresi gli acidi grassi lattati e a catena corta (SCFA). Il protocollo può essere utile per studi volti a stimare gli effetti di diversi interventi di modulatori sui profili microbiota fecale e a prevedere il loro impatto sulla salute.
Introduction
Il microbiota umano è una comunità complessa composta da batteri, archei, virus e microbi eucarioti1, che abitano il corpo umano internamente ed esternamente. Prove recenti hanno stabilito il ruolo fondamentale del microbiota intestinale e del microbioma intestinale (l'intera raccolta di microbi e dei loro geni presenti nel tratto gastrointestinale umano) in varie malattie umane, tra cui l'obesità, il diabete, malattie cardiovascolari e il cancro1,2,3. Inoltre, i microrganismi che vivono nel nostro intestino producono un ampio spettro di metaboliti che influenzano significativamente la nostra salute e possono anche contribuire alla fisiopatologia di diverse malattie, nonché una varietà di funzioni metaboliche4, 5.I cambiamenti anomali (perturbazioni) nella composizione e nella funzione di questa popolazione microbica intestinale sono generalmente definita come "disbiosi intestinale". La disbiosi è di solito associata a uno stato malsano dell'ospite e quindi può essere differenziata dalla normale comunità microbica (omeostatica) associata a uno stato di controllo sano dell'ospite. Modelli specifici di disbiosi del microbioma intestinale si trovano spesso in varie malattie diverse1,2,3,6,7.
La fermentazione di alimenti non digeriti, in particolare i carboidrati/fibre fermentabili, da parte del microbiota intestinale non solo produce energia, ma produce anche metaboliti divergenti tra cui acidi grassi a catena corta (SFA), lattati, formate, anidride carbonica, metano, idrogeno ed etanolo6. Inoltre, il microbiota intestinale produce anche una serie di altre sostanze bioattive come folato, biotina, trimetilamina-N-ossido, serotonina, tritofano, acido gamma-aminobutirico, dopamina, noradrenalina, acetilcolina, istamina, deossicolico acido, e 4-ethylphenyl solfato. Ciò avviene principalmente attraverso l'utilizzo di flussi metabolici intrinseci all'interno della nicchia host-microbe, che contribuisce in diversi processi del corpo, funzioni metaboliche e cambiamenti epigenetici1,8,9, 10. Tuttavia, gli effetti di vari interventi su tali prodotti microbici rimangono sconosciuti o poco chiari a causa della mancanza di protocolli facili, efficienti e riproducibili. La composizione del microbiota intestinale umano è un ecosistema estremamente complesso e diversificato, e quindi, molte domande sul suo ruolo nella salute umana e nella patologia della malattia rimangono ancora senza risposta. Gli effetti di molti modulatori comuni del microbioma intestinale (ad esempio, probiotici, prebiotici, antibiotici, trapianti fecali e infezioni) sulla composizione e sulle funzioni metaboliche del microbiota intestinale rimangono in gran parte sfuggenti. Inoltre, l'esame e la convalida di questi effetti in vivo è difficile, in particolare perché la maggior parte dei nutrienti e dei metaboliti prodotti dal microbiota intestinale vengono assorbiti o smaltiti simultaneamente e rapidamente nell'intestino; pertanto, misurare la produzione, la quantità e la lavorazione di questi metaboliti (ad esempio, SCFA) in vivo rimane ancora una sfida pratica. Infatti, modelli fisiologici come animali e soggetti umani sono fondamentali per determinare il ruolo del microbioma intestinale e la sua modulazione sulla salute dell'ospite, ma questi potrebbero non essere adatti per lo screening su larga scala di diversi tipi di modulatori del microbioma a causa vincoli etici, monetari o temporali. A tal fine, i modelli in vitro e/o ex vivo, come la coltura del microbiota intestinale in vitro e poi intervenendo con diversi modulatori del microbiota, possono offrire opportunità di risparmio di tempo e denaro e quindi possono consentire uno screening preliminare o su larga scala vari componenti (come probiotici, prebiotici e altri composti interventistici) per esaminare/prevedere i loro effetti sulla diversità del microbiota fecale, composizione e profili metabolici. Studi che utilizzano tali sistemi in vitro ed ex vivo del microbioma intestinale possono facilitare un'ulteriore comprensione delle interazioni ospite-microbioma che contribuiscono alla salute e alla malattia dell'ospite e potrebbero anche portare a trovare nuove terapie che colpisce il microbioma migliorare la salute dell'ospite e prevenire e trattare varie malattie1.
Anche se i sistemi di coltura del microbiota intestinale in vitro non sono in grado di replicare realmente le condizioni intestinali effettive, diversi laboratori si sono sforzati di sviluppare tali modelli, alcuni dei quali sono stati ritenuti attuabili in una certa misura e sono stati utilizzati con successo per scopi diversi. Uno dei modelli intestinali recenti è il Simulatore dell'ecosistema microbico intestinale umano, che imita l'intero tratto gastrointestinale umano, tra cui lo stomaco, l'intestino tenue e diverse regioni del colon. Tuttavia, tali modelli tecnicamente complessi potrebbero non essere accessibili ad altre strutture di ricerca in tutto il mondo. Pertanto, c'è ancora una necessità critica per lo sviluppo di nuovi modelli alternativi che sono relativamente semplici, convenienti e pratici per i laboratori che studiano i modulatori del microbioma e i loro effetti sul microbiota intestinale e sulla salute dell'ospite. Quindi, l'uso di un sistema di coltura del microbiota fecale in vitro (o ex vivo) sarebbe utile per studiare gli effetti di tali interventi11,12. In particolare, l'effetto di diversi prebiotici sulla capacità di fermentazione del microbiota in termini di cambiamenti periodici nella diversità e nella composizione del microbiota intestinale, nel pH fecale e nei livelli di metaboliti microbici, tra cui SCFA e lattato, può essere studiato 13. L'uso dell'inulina (uno dei componenti prebiotici più studiati) come esempio del modulatore del microbioma, viene descritto un protocollo passo-passo di questo semplice sistema di coltura in batch ex vivo microbiota per dimostrare il suo uso per stimare cambiamenti nel microbiota fecale e metaboliti microbici a seguito dell'intervento con i modulatori del microbioma.
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Protocol
INFORMATIVA: consultare le schede tecniche di sicurezza dei materiali appropriate e seguire le istruzioni e le linee guida per l'adeguata formazione sul livello di biosicurezza 2 (BSL-2). Seguire tutti i passaggi di coltura secondo le regole standard di biosicurezza e utilizzare un cabinet BSL-2 utilizzando condizioni asettiche. Inoltre, campioni fecali provenienti da diversi modelli e soggetti umani possono avere il rischio potenziale di diffondere malattie microbiche. Immediatamente cercare aiuto medico nel verificarsi di eventuali lesioni e infezioni. Inoltre, l'uso di campioni di feci umane e animali dovrebbe essere approvato attraverso comitati etici istituzionali e deve essere conforme ai protocolli per utilizzare campioni e informazioni sull'argomento.
1. Preparazione dei mezzi di coltura
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Preparazione dei mezzi di coltura, preparare nove tipi di soluzioni azionarie
- Soluzione A (1.000 mL): Sciogliere 5,4 g di cloruro di sodio (NaCl), 2,7 g di fosfato di diidrogeno di potassio (KH 2 PO 4 ), 0,16 g di disidratazione del cloruro di calcio (CaCl 2 x 2H 2 O), 0,12 g di esaramazione di cloruro di magnesio (KH 2 PO 4), 0,16 g di diidrato al cloruro di calcio (CaCl 2 x 2H 2 O), 0,12 g di esaramfativo di cloruro di magnesio (Kh 2 PO 4), 0,16 g di disidratazione del cloruro di calcio (CaCl 2H 2 O), 0,12 g di esaramate di cloruro di magnesio (KH 2 PO 4), 0,16 g di disidratazione al cloruro di calcio (CaCl2x 2H2O), 0,12 g di esaramtenerato di cloro di magnesio (KH2PO4),0,16 g di disidrat 0,6H2O), 0,06 g di cloruro di manganese tetraidrato (MnCl2n. 4H2O), 0,06 g di esaditosi al cloruro di cobalto (CoCl2x 6H2O) e 5,4 g di solfato di ammonio (NH4)2SO4 , in acqua deionizzata per fare volume totale a 1.000 mL.
- Soluzione B (1.000 mL): Sciogliere 2,7 g di fosfato di idrogeno di potassio (K2HPO4) in acqua deionizzata per fare volume totale a 1000 mL.
- Soluzione minerale traccia (1.000 mL): Sciogliere 500 mg di disinumo etilenea-tetraaceta didisidato (Na2EDTA), 200 mg di eptaidrato ferroso solfato (FeSO4x 7H2O), 10 mg di zinco solfato eptahydrato 7H2O), 3 mg di manganese(II) tetraidrato cloruro (MnCl2-4H2O), 30 mg di acido fosforico (H3PO4),20 mg di CoCl2x 6H2O, 1 mg di diidrato cloruro cupo (CuCl2 2H2O), 2 mg di esadito al cloruro di nichel (II) (NiCl2x 6H2O) e 3 mg di disidratazione molybdate di sodio (Na2MoO4x 2H2O) in acqua deionizzata per fare volume totale a 1.000 mL.
NOT: Questa soluzione è sensibile alla luce, quindi assicurarsi di essere conservato in tubi/bottiglie avvolti in scure/nere o alluminio. - Soluzione di vitamina solubile in acqua (1.000 mL): sciogliere 100 mg di cloruro di tiamina (Thiamin-HCl), 100 mg di acido D-pantotenico, 100 mg di niacina, 100 mg di piridosina, 5 mg di acido P-aminobenzoico e 0,25 mg di vitamina B12 inisolata 1.000 mL.
- Folato: soluzione di biotina (1.000 mL): sciogliere 10 mg di acido folico, 2 mg di biotina D e 100 mg di bicarbonato di ammonio (NH4HCO3)in acqua deionizzata per fare volume totale a 1.000 mL.
- Soluzione Riboflavin (1.000 mL): sciogliere 10 mg di Riboflavin in soluzione HEPES (1,19 g/L) per fare volume totale a 1.000 mL.
- Soluzione di emina (10 mL): Sciogliere 5.000 mg di Emin in 10 mM di idrossido di sodio (NaOH) (0,4 g/L) soluzione per rendere il volume totale a 10 mL.
- Miscela di acidi grassi a catena corta (10 mL): combina 2,5 mL di N-valerate, 2,5 mL di isovalerato, 2,5 mL di isobutyrate e 2,5 mL: DL-z-metilbutyrate.
NOT: Questa soluzione è consigliata per l'uso in cappuccio fumi per evitare odori e fumi. - Resazurin (1.000 mL): Dissolvere 1 g di resazurin in acqua deionizzata e fare volume totale a 1.000 mL.
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Medio utilizzato per la fermentazione anaerobica in vitro
- Per preparare questo supporto, mescolare 330 mL di soluzione A, 330 mL di soluzione B, 10 mL di soluzione minerale Trace, 20 mL di soluzione vitamina solubile in acqua, 5 mL di soluzione Folate:biotin, soluzione 5 mL di Riboflavin; 2,5 mL di soluzione Hemin, 0,4 mL di mix di acidi grassi a catena corta, 1 mL di Resazurin, 0,5 g di estratto di lievito, 4 g di carbonato di sodio (Na2CO3),0,5 g di Cysteine HCl-H2O e 0,5 g di Trypticase, e aggiungere 296,1 mL di acqua distillata.
- Controllare il pH e assicurarsi che sia intorno a 7,0, in caso contrario, regolare il pH con 1 N HCl o 1 N NaOH. Sterilizzare filtrando a vuoto i supporti utilizzando un filtro bottiglia sotto la postazione di lavoro asettica.
- In alternativa, mescolare tutti i componenti (ad eccezione delle soluzioni di vitamina e orina) e autoclave a 121 gradi centigradi per 20 min e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente. Allo stesso tempo, filtrano le soluzioni di vitamina e orina utilizzando filtri a membrana da 0,22 m e le aggiungono ai supporti autoclavi e raffreddati prima dell'erogazione.
2. Preparazione della camera anaerobica e del materiale richiesto
- Mantenere tutti i materiali, le soluzioni e gli strumenti necessari per l'esperimento di fermentazione all'interno della camera anaerobica almeno 48 h prima dell'inizio dell'esperimento, per garantire che l'ossigeno residuo associato agli utensili e all'ossigeno solubile nei tamponi/soluzioni sia e tutti i materiali sono acclimatati alle condizioni anaerobiche impostate.
NOT: Materiali necessari all'interno della camera anaerobica (48 h prima dell'esperimento per iniziare): (i) supporti di fermentazione; (ii) soluzione anaerobica (preparata secondo la sezione 4.1), (iii) vortice, (iv) pesatura, (v) panni di formaggio di mussola, (vi) forbici, (vii) imbuto, (viii) 1.5, 2.0, 15, 50 mL tubi, (ix) pir (2, 20, 200 e 1.000 - L) e punte pipet compatibili, (x) pistola pipet e pipet (5 e 10 mL), (xi) tessuti di carta, (xii) marcatori, (xiii) tubo sta per diversi tubi, (xiv) scatola dei rifiuti, (xv) O2 indicatore e (xvi) 70% bottiglia spray etanolo (disinfettante).
3. Preparazione di tubi e fibre
- Peso 300 mg di inulina e trasferimento in un tubo da 50 mL seguito dall'aggiunta apetica di 26 mL di supporti di fermentazione già preparati e conservati nella camera anaerobica. Preparare un tubo vuoto per ogni tipo di campione fecale e tubo sperimentale (in base al numero di composti sottoposti a test), in triplice copia.
- Lasciare questi tubi all'interno della camera anaerobica per circa 24 h per consentire l'idratazione dei campioni prima di iniziare l'esperimento di fermentazione. Assicurarsi che la temperatura del tubo sia di 37 gradi centigradi al momento dell'inoculazione, quindi portare i tubi nell'incubatrice racchiusa all'interno della camera anaerobica.
4. Preparazione dell'Inoculum
- Soluzione di diluizione anaerobica (almeno 48 h prima dell'esperimento di fermentazione): sciogliere 5 g di NaCl, 2 g di glucosio e 0,3 g di Cysteine-HCl in acqua deionizzata e fare volume totale a 1.000 mL. Autoclave e conservarlo all'interno della camera anaerobica almeno 48 h prima dell'uso.
- Preparazione fecale inoculum (al giorno dell'esperimento di fermentazione): Pesare 5 g di campione fecale fresco in un tubo conico da 50 ml, aggiungere una soluzione di diluizione anaerobica per un volume finale di 50 mL (1:10 w/v) e vortice per 15 min o fino a quando completamente omogeneizzato. Filtrare la miscela omogeneizzata attraverso 4 strati di garza sterile (autoclaved) e utilizzarlo immediatamente per l'inoculazione nei tubi contenenti supporti.
NOT: I campioni fecali di un gruppo di soggetti possono essere raggruppati se l'obiettivo sperimentale è quello di confrontare l'effetto di un dato composto/ingrediente sul microbiota fecale sano e malato in generale.
5. Fermentazione e campionamento
- Preparare i tubi secondo la sezione 4.2 e inoculare i tubi vuoti/controllo e sperimentali con 4 mL di inoculum fecale diluito e filtrato. Incubare i tubi inoculati a 37 gradi centigradi all'interno della camera anaerobica. Agitare i tubi una volta ogni ora invertendo delicatamente per ri-sospendere le fibre e l'inoculum.
- Raccogliere i campioni con la frequenza necessaria, ad esempio ogni ora a 0, 3, 6, 9 e 24 h durante la fermentazione, prelevando un campione di 2 mL in un tubo da 2 mL dai rispettivi tubi di fermentazione.
- Misurare il pH degli aliquot utilizzando un misuratore di pH di laboratorio (inserendo direttamente l'elettrodo di pH nel campione); centrifugare il campione rimanente a 14.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi. Congelare immediatamente il supernatante e il pellet in azoto liquido e, dopo lo schiocco, conservare il supernatante per l'analisi sCFAs e il pellet per l'analisi del microbioma a -80 gradi centigradi.
6. Acidi grassi a catena corta (SCFA) e Quantificazione lattato
NOT: Gli SCFA e il lattato nel supernatale della coltura del microbioma possono essere misurati esattamente secondo i metodi descritti altrove13,14,15,16.
- In breve, scongelare i supernatanti congelati a scatto ottenuti nella sezione 5 da campioni di controllo e trattamento sul ghiaccio ed eseguire tutte le ulteriori fasi di lavorazione sul ghiaccio. Filtrare il supernatante attraverso un filtro a membrana di 0,45 m e utilizzare i campioni privi di cellule per misurare le concentrazioni di SCFA e lattato utilizzando il sistema HPLC con rilevatore DAD a 210 nm, dotato di una colonna HPX-87H. Per ogni campione, iniettare un volume di 10 gradi e utilizzare H2SO4 (0,005 N) per esolutare la colonna a una portata di 0,6 mL/min a 35 gradi centigradi.
7. Analisi del microbioma fecale
NOT: Eseguire l'analisi del microbioma seguendo i metodi e la pipeline dettagliata altrove7,13,14,17.
- In breve, estrarre DNA genomico da circa 200 mg di pellet di liquami fecali utilizzando un kit di estrazione del DNA fecale13.
- Amplifica la regione ipervariabile del gene batterico 16S rRNA utilizzando i primer con codice a barre secondo il metodo descritto altrove13, utilizzando le sequenze primer come descritto nel protocollo del progetto del microbioma terrestre18.
- Purificare gli amplificatori risultanti con perline di purificazione magnetica e quantificare con Picogreen o un metodo equivalente. Mettere in comune i prodotti PCR purificati in uguale concentrazione molare e sequenza su un sequencer13.
- Elaborare le sequenze risultanti per il demultiplexing, il filtraggio della qualità e il clustering, l'assegnazione tassonomica e la rarefazione e le analisi a valle utilizzando il software Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) secondo i metodi descritti da Caporaso etal.
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Representative Results
Il protocollo è utilizzato per dimostrare l'effetto di un prebiotico specifico (cioè l'inulina sulla composizione del microbiota e sulle attività metaboliche in termini di cambiamenti nel pH fecale e la concentrazione di lattato e SCFA nelle feci di soggetti umani sani diversi punti temporali dopo il trattamento con inulina). Il pH fecale, i livelli fecali di lattato e SCFA (Figura1) e la composizione del microbiota (Figura 2 e Figura 3) sono misurati a 0 (linea di base), 9 e 24 h di incubazione con o senza inulina. I risultati dimostrano come la composizione del microbiota fecale e le sue attività metaboliche siano modulate durante la fermentazione in vitro con o senza trattamento inulina.
Figura 1: Cambiamenti nel pH fecale (a), lattato (b) e acidi grassi a catena corta viz. acetato (c), propionato (d) e butilato (e) nelle feci umane a 0 (linea di base), 9 e 24 h di fermentazione anaerobica con o senza inulina. I valori qui presentati sono Media - SEM di campioni triplicati. * P < 0,05, srl< 0,01, P < 0,001, e linea di base. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Cambiamenti nella diversità e composizione del microbiota nelle feci umane a 0 (linea di base), 9 e 24 h di fermentazione anaerobica con o senza inulina. (a) Misure Unifrac ponderate e (b) non ponderate della diversità beta visualizzate mediante l'analisi delle coordinate di principio (PCoA). (c-f) Indici di diversità alfa viz. phylogenetica (PD albero intero (c); ricchezza delle specie (Chao1; d); numero osservato di unità tassonomiche operative (OCU, e); e l'uniformità delle specie (indice Shannon, f)). Abbondanza relativa di phyla maggiore (g) e generi (h). I valori qui presentati sono Media - SEM di campioni triplicati. * P < 0,05, P < 0,01, vs linea di base. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Analisi lineare dell'effetto discriminante (LDA) (LEfSe) delle modifiche del microbiota intestinale dopo incubazione di 9 h e 24 h con (INU) o senza (CTL) inulina. Cladogramma tassonomico derivato dall'analisi LEfSe di sequenze 16S (abbondanza relativa - 0,5%) che rappresenta i taxa differenzialmente abbondanti tra diversi gruppi di campioni. La luminosità di ogni punto è proporzionale alla sua dimensione dell'effetto (cioè l'abbondanza di taxon). Qui vengono mostrati solo i taxa che superano il valore soglia LDA di >2.4. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il modello di fermentazione dei liquami fecali in vitro qui presentato è un semplice modello monolotto per approssimare gli effetti di diversi substrati e ceppi microbici (ad esempio, prebiotici e probiotici) sulla composizione del microbiota fecale umano e la sua attività metaboliche in termini di pH fecale e livelli di SCFAs. I risultati qui presentati dimostrano che l'inoculazione dell'inulina diminuisce il pH fecale e aumenta significativamente i livelli di SCFA e lattato in esemplari fecali trattati inulina rispetto alla coltura di microbiota fecale non trattata (Figura 1). Inoltre, la firma del microbiota intestinale sembra essere diversa tra i campioni trattati in inulina e quelli non trattati (Figura2 e Figura 3). Questi dati esemplificano come questo sistema possa riflettere gli effetti dell'inulina sulla diversità e composizione del microbioma fecale, nonché le sue attività metaboliche. Inoltre, a seconda di specifici obiettivi sperimentali e ipotesi, è possibile misurare una varietà di altri fattori utilizzando questo sistema. Inoltre, oltre al sequenziamento genico rRNA 16S, altre analisi come il sequenziamento del metagenoma microbico intero (utilizzando il sequencer dell'intero genoma) o qPCR e metodi di coltura mirati a specifici generi singoli o multipli, specie e ceppi (ad es. bifidobatteri, lactobacilli, Akkermansia, Enterobacteriacaea, clostridia, ecc.) può anche essere eseguito. Inoltre, diverse procedure cromatiche per l'analisi di SCFA, come LC-MS, GC, GC-MS, GC-FID e HPLC possono anche essere sfruttate in base a requisiti sperimentali e disponibilità. Tuttavia, va notato che la preparazione del campione per queste procedure può variare in base agli strumenti e alle condizioni necessarie per l'operazione20.
Anche se l'uso di campioni fecali freschi produrrebbe i migliori risultati riproducibili; tuttavia, il campione fecale congelato a scatto (come usato nell'esperimento qui presentato) può anche essere usato in modo efficace poiché la maggior parte dei batteri può essere rianimata da esso una volta rianimata alla temperatura corporea e non si verifica più decomposizione dopo il congelamento21. L'uso di campioni congelati può essere particolarmente vantaggioso quando è impossibile ottenere campioni fecali freschi da donatori specifici il giorno previsto dell'esperimento o dallo stesso donatore quando è necessario replicare un esperimento. Va notato, tuttavia, che i campioni fecali devono essere congelati a scatto con azoto liquido e immediatamente conservati a -80 gradi centigradi fino a un ulteriore utilizzo. Inoltre, per evitare l'esposizione dei campioni fecali congelati all'aria (ossigeno), i campioni devono essere trasferiti alla camera anaerobica il prima possibile/immediatamente dopo aver tolto dal congelatore e utilizzato subito (si dovrebbe evitare lo scongelamento ripetuto). Tutti gli esperimenti successivi, tra cui lo scongelamento del campione, la preparazione e l'elaborazione dell'inoculo devono essere effettuati all'interno della camera anaerobica.
L'ambiente organico intestinale e il pH durante la fermentazione dei nutrienti nell'intestino crasso sono molto importanti soprattutto in considerazione del fatto che un pH anormalmente ridotto indica una maggiore acidità a causa dell'utilizzo del substrato. Quindi, una riduzione più rapida del pH può corrispondere a un utilizzo più rapido del substrato22. Anche se, in questo modello, il pH non è stato controllato, tuttavia, l'inclusione di un controllo identico non trattato è altamente raccomandata per fare confronti diretti. Le SCFA prodotte nel colon a seguito della fermentazione di polisaccaride indigeribili da parte del microbiota intestinale possono influenzare ulteriormente diversi meccanismi legati al mantenimento della salute dell'ospite. Questi metaboliti contribuiscono alla gluconeogenesi e alla biosintesi dei lipidi, agiscono come fonte di energia per i colonciti e possono anche avere benefici per la salute, tra cui la modulazione immunitaria, le funzioni di barriera intestinale controllata/migliorata e la neuromodulazione23, 24,25,26. Inoltre, gli SCFA sono noti anche per influenzare diversi percorsi biologici tra cui ormoni, sistema endocannabinoide, proliferazione cellulare e morte, salute ossea, assorbimento minerale, motilità intestinale, pH intestinale, e invertire gli effetti sul microbioma intestinale e funzione metabolica microbica. Pertanto, la conoscenza del profilo e delle concentrazioni di SCFA intestinali/fecali può essere una componente importante mentre valuta l'efficacia di specifici modulatori microbiota6. Naturalmente, oltre alle SCFA, il microbioma intestinale produce anche molti altri metaboliti importanti (ad esempio, ammonio, vitamine, istamina). Di conseguenza, gli esemplari sovrnatali raccolti durante tali esperimenti di fermentazione in vitro possono anche essere valutati per analisi metabolomiche globali per scoprire nuovi metaboliti derivati dal microbioma intestinale che possono essere influenzati da specifici modulatori di microbioma.
Il sistema qui descritto presenta molti vantaggi, come la facilità, la semplicità, l'efficacia dei costi e l'aflungabilità generale dell'assetto sperimentale. Tuttavia, ci sono anche poche limitazioni. Ad esempio, il sistema non riguarda l'interazione di prebiotici (o altri interventi utilizzati) nel sistema digestivo superiore (ad esempio, saliva, stomaco, intestino tenue) prima di essere esposti al microbiota dell'intestino crasso. Tuttavia, tali misure possono essere adottate e incorporate secondo specifici requisiti sperimentali. Inoltre, potrebbe essere necessario eseguire un processo di idrolisi acida e/o enzimatica prima della fermentazione se si utilizzano substrati specifici, tra cui alimenti interi o digeribili, perché solo la parte indigeribile di tali alimenti raggiunge il colon per essere fermentata dal basso microbiota intestinale. Inoltre, la composizione del microbiota intestinale può cambiare a causa di specifiche condizioni di coltura durante la fermentazione. Ad esempio, è stato osservato che fino a 9 h di incubazione, i cambiamenti del microbiota sono molto più vicini alla normalità che a 24 ore. Tuttavia, dopo 24 h di incubazione, anche se i livelli di pH e SCFA sono aumentati notevolmente, la composizione del microbiota intestinale ha mostrato che il numero di proteobatteri è aumentato mentre la diversità microbica si riduceva. Tuttavia, non è noto come con precisione e strettamente l'aumento dell'accumulo di metaboliti microbici accompagnati con il pH fecale abbassato sia associato a specifiche firme di microbiota.
In sintesi, un semplice protocollo per simulare l'ecosistema microbiota ex vivo è descritto qui. Il sistema consente ai ricercatori di testare diversi interventi per la modulazione della diversità, composizione e funzione metabolica del microbiota che possono influenzare diverse caratteristiche della salute intestinale e generale dell'ospite.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono con gratitudine il supporto di finanziamento del Center for Diabetes, Obesity and Metabolism e del Clinical and Translational Science Center, della Wake Forest School of Medicine, del Department of Defense funding (Numero di sovvenzione: W81XWH-18-1-0118), la kermit Glenn Phillips II Presidente in Medicina Cardiovascolare; il National Institutes of Health ha finanziato il Claude D. Pepper Older Americans Center (finanziato da P30AG12232); R01AG18915; R01DK114224 e il Clinical and Translational Science Center (Clinical Research Unit, finanziato da UL1TR001420), sono stati riconosciuti per fortuna. Ringraziamo anche i volontari per aver fornito campioni fecali e gli altri membri del laboratorio per i loro aiuti tecnici durante questo esperimento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | 217255 | |
| Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 | TGI | C2388 | Toxic |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2•2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | Irritating |
| Cobaltous Chloride Hexahydrate (CoCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | 255599 | |
| Cupric Chloride Dihydrate (CuCl2•2H2O) | Acros organics | 2063450000 | Toxic, Irritating |
| Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C121800 | |
| D-biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| D-Pantothenic acid | Alfa Aesar | A16609 | |
| Disodium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrate (Na2EDTA) | Biorad | 1610729 | |
| DL-α-methylbutyrate | Sigma-Aldrich | W271918 | |
| Ferrous Sulfate Heptahydrate (FeSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | F8263 | Toxic |
| Folic acid | Alfa Aesar | J62937 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | |
| Hepes | Alfa Aesar | A14777 | |
| Isobutyrate | Alfa Aesar | L04038 | |
| Isovalerate | Alfa Aesar | A18642 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Manganese Chloride Tetrahydrate (MnCl2•4H2O) | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Niacin (Nicotinic acid) | Sigma-Aldrich | N4126 | |
| Nickel(Ii) Chloride Hexahydrate (NiCl2•6H2O) | Alfa Aesar | A14366 | Toxic |
| N-valerate | Sigma-Aldrich | 240370 | |
| P-aminobenzoic acid | MP China | 102569 | Toxic, Irritating |
| Phosphoric Acid (H3PO4) | Sigma-Aldrich | P5811 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5504 | |
| Potassium Hydrogen Phosphate (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | 1551128 | |
| Pyridoxine | Alfa Aesar | A12041 | |
| Resazurin | Sigma-Aldrich | R7017 | |
| Riboflavin | Alfa Aesar | A11764 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | 1613757 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher BioReagents | 7647-14-5 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Chemicals | S320 | |
| Sodium Molybdate Dihydrate (Na2MoO4•2H2O) | Acros organics | 206375000 | |
| Thiamine Hydrochloride (Thiamin-HCl) | Acros organics | 148991000 | |
| Trypticase | BD Biosciences | 211921 | |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161 | |
| Zinc Sulfate Heptahydrate (ZnSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
| 0.22 µm membrane filter | |||
| AMPure magnetic purification beads | Agencourt | ||
| Anaerobic chamber with incubatore | Forma anaerobic system, Thermo Scientific, USA | ||
| Bottle filter | Corning | ||
| Cheesecloth | |||
| Illumina MiSeq sequencer | Miseq reagent kit v3 | ||
| pH meter | |||
| Qiagen PowerFecal kit | Qiagen | ||
| Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software | |||
| Qubit-3 fluorimeter | InVitrogen | ||
| Vortex | Thermoscientific | ||
| Waters-2695 Alliance HPLC system | Waters Corporation |
References
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