Summary
Этот протокол описывает систему брожения в партии в пробирке фекальной микробиоты человека, используя инулин (известный пребиотик и один из наиболее широко изученных модуляторов микробиоты), чтобы продемонстрировать использование этой системы в оценке эффектов конкретных вмешательства по составу фекальной микробиоты и метаболической деятельности.
Abstract
Появление микрофлоры кишечника в ряде заболеваний человека требует прорыва новых инструментов, методов и технологий. Такие усовершенствования необходимы для расшифровки использования модуляторов микробиома для пользы для здоровья человека. Однако крупномасштабный скрининг и оптимизация модуляторов для проверки модуляции микробиома и прогнозирования связанных с этим преимуществ для здоровья может быть практически затруднена из-за необходимости большого числа животных и/или людей. С этой целью модели in vitro или ex vivo могут способствовать предварительному скринингу модуляторов микробиома. При этом, он оптимизирован и продемонстрирован ex vivo фекальные микробиоты культуры системы, которые могут быть использованы для изучения последствий различных мероприятий кишечного микробиома модуляторов, включая пробиотики, пребиотики и другие пищевые ингредиенты, в стороне от нутрицевтики и препараты, о разнообразии и составе микрофлоры кишечника человека. Инулин, один из наиболее широко изученных пребиотических соединений и модуляторов микробиома, используется в качестве примера здесь, чтобы изучить его влияние на здоровый состав фекальной микробиоты и его метаболической деятельности, таких как фекальные рН и фекальные уровни органических кислот включая лактат и короткоцепочечные жирные кислоты (СКФО). Протокол может быть полезен для исследований, направленных на оценку воздействия различных вмешательств модуляторов на профили фекальных микробиот и прогнозирование их воздействия на здоровье.
Introduction
Микробиота человека представляет собой сложное сообщество, состоящее из бактерий, археев, вирусов и эукариотических микробов1, которые населяют человеческое тело внутри и снаружи. Недавние данные установили фундаментальную роль кишечной микробиоты и микрофлоры кишечника (вся коллекция микробов и их генов, найденных в желудочно-кишечном тракте человека) в различных заболеваниях человека, включая ожирение, диабет, сердечно-сосудистых заболеваний, и рак1,2,3. Кроме того, микроорганизмы, живущие в нашем кишечнике производят широкий спектр метаболитов, которые существенно влияют на наше здоровье, а также может способствовать патофизиологии нескольких заболеваний, а также различные метаболические функции4, 5. Аномальные изменения (возмущения) в составе и функции этой кишечной микробной популяции обычно называют "кишка дисбиоз". Дисбиоз обычно ассоциируется с нездоровым состоянием хозяина и, следовательно, может быть дифференцирован от нормального (гомеостатического) микробного сообщества, связанного со здоровым состоянием контроля хозяина. Специфические модели дисбиоза микрофлоры кишечника часто встречаютсяпри различных заболеваниях 1,2,3,6,7.
Брожение непереваренной пищи, особенно ферментируемых углеводов/волокон, кишечной микробиотой не только дает энергию, но и производит различные метаболиты, включая короткоцепочечные жирные кислоты (СКФА), лактат, кормуковый, углекислый газ, метана, водорода и этанола6. Кроме того, кишечная микробиота также производит ряд других биологически активных веществ, таких как фолат, биотин, триметиламин- N-оксид, серотонин, триптофан, гамма-аминобутирная кислота, допамин, норадреналин, ацетилхолин, гистамин, дезоксихоловая кислота и 4-этилфенилов сульфат. Это происходит в первую очередь за счет использования внутренних метаболических флюсов в нише хозяина-микроба,которая способствует нескольким процессам тела, метаболическим функциям и эпигенетическим изменениям 1,8,9, 10. Однако воздействие различных вмешательств на такие микробные продукты остается незаметным или неясным из-за отсутствия простых, эффективных и воспроизводимых протоколов. Состав микробиоты кишечника человека является чрезвычайно сложной и разнообразной экосистемой, и поэтому многие вопросы о его роли в здоровье человека и патологии болезней по-прежнему остаются без ответа. Влияние многих распространенных модуляторов микробиома кишечника (например, пробиотиков, пребиотиков, антибиотиков, фекальной трансплантации и инфекций) на состав и метаболические функции кишечной микробиоты остаются в значительной степени неуловимыми. Кроме того, изучение и проверка этих эффектов in vivo затруднена, особенно потому, что большинство питательных веществ и метаболитов, вырабатываемых микрофлорой кишечника, поглощаются или удаляются одновременно и быстро в кишечнике; поэтому измерение производства, количества и переработки этих метаболитов (например, SCFA) in vivo по-прежнему остается практическим вызовом. Действительно, физиологические модели, такие как животные и человеческие субъекты имеют решающее значение для определения роли микрофлоры кишечника и его модуляции на здоровье хозяина, но они не могут быть пригодны для крупномасштабного скрининга различных типов модуляторов микробиома из-за этические, денежные или временные ограничения. С этой целью, in vitro и/или ex vivo модели, такие как культивирование кишечной микробиоты in vitro, а затем вмешательство с различными модуляторами микробиоты, могут предложить возможности экономии времени и денег и, следовательно, могут позволить предварительный или крупномасштабный скрининг различные компоненты (такие как пробиотики, пребиотики и другие интервенционные соединения) для изучения/прогнозирования их воздействия на разнообразие фекальной микробиоты, состав и метаболические профили. Исследования с использованием таких in vitro и ex vivo систем микрофлоры кишечника могут способствовать дальнейшему пониманию взаимодействий хозяина-микробиома, которые способствуют здоровью и болезням хозяина, а также могут привести к поиску новых методов лечения, нацеленных на микробиом улучшить здоровье хозяина и профилактики илечения различных заболеваний 1.
Хотя системы культуры микрофлоры кишечника in vitro не могут по-настоящему воспроизвести фактические кишечные условия, несколько лабораторий пытались разработать такие модели, некоторые из которых были признаны практически осуществимыми в некоторой степени и успешно использовались для различных целей. Одной из последних моделей кишечника является симулятор кишечной микробной экосистемы человека, который имитирует весь желудочно-кишечный тракт человека, включая желудок, тонкий кишечник и различные области толстой кишки. Однако такие технически сложные модели могут быть недоступны для других научно-исследовательских учреждений во всем мире. Поэтому по-прежнему существует острая необходимость в разработке новых альтернативных моделей, которые являются относительно простыми, доступными и практичными для лабораторий, изучающих модуляторы микробиома и их воздействие на микрофлору кишечника и здоровье хозяев. Таким образом, использование in vitro (или ex vivo) фекальной системы культуры микробиоты было бы полезно для изучения последствий таких мероприятий11,12. В частности, влияние различных пребиотиков на способность брожения микробиоты с точки зрения периодических изменений в разнообразии и составе микрофлоры кишечника, фекальных рН, а также уровни микробных метаболитов, включая СКФА и лактат, могут быть изучены 13. В этом случае, используя инулин (один из наиболее широко изученных пребиотических компонентов) в качестве примера модулятора микробиома, пошаговым протоколом этой простой системы пакетной культуры ex vivo microbiota описан, чтобы продемонстрировать его использование для оценки изменения в фекальной микробиоты и микробных метаболитов после вмешательства с модуляторами микробиома.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ВНИМАНИЕ: Проконсультируйтесь с соответствующими листами данных о материальной безопасности и следуйте инструкциям и руководящим принципам для соответствующего обучения уровня биобезопасности 2 (BSL-2). Следуйте всем меркам культивирования в рамках стандартных правил биобезопасности и используйте шкаф BSL-2 с использованием асептических условий. Кроме того, образцы фекальных препаратов различных моделей и испытуемых людей могут иметь потенциальный риск распространения микробных заболеваний. Немедленно обратитесь за медицинской помощью в случае возникновения каких-либо травм и инфекций. Кроме того, использование образцов стула для человека и животных должно быть одобрено через институциональные этические комитеты и должно соответствовать протоколам использования образцов и предметной информации.
1. Подготовка культурных сми
-
Подготовка культурных носителей, подготовка девяти видов фондовых решений
- Решение А (1000 мл): Растворите 5,4 г хлорида натрия (NaCl), 2,7 г фосфата калия диводорода (KH2PO4),0,16 г дигидрата хлорида кальция (CaCl2H2O), 0,12 г г гхлорида магния (MgCl2) No 6H2O), 0,06 г тетрагидрата хлорида марганца (MnCl2No4H2O), 0,06 г г гексагидрата кобальтового хлорида (CoCl2Х6Г2O) и 5,4 г сульфата аммония (NH4)2SO4, в деионизированной воде, чтобы сделать общий объем до 1000 мл.
- Раствор B (1000 мл): Растворите 2,7 г фосфата водорода калия (K2HPO4) в деионизированной воде, чтобы сделать общий объем до 1000 мл.
- Дрейский минеральный раствор (1000 мл): Растворите 500 мг дитиленедиамин-тетраацетата дигидрата (Na2EDTA), 200 мг ферромного сульфата гептагидрата (FeSO4no7H2O), 10 мг сульфата цинка гептагидрата (ЗнСО4) No 7H2O), 3 мг марганца (II) хлорида тетрагидрата (MnCl2No 4H2O), 30 мг фосфорной кислоты (H3PO4), 20 мг CoCl2No 6H2O, 1 мг хлоридного дигидрата (CuCl2 2H2O), 2 мг никеля (II) хексагидрат хлорид (NiCl2No 6H2O) и 3 мг натрия молибдат дигидрат (Na2MOO42H2O) в деионизированной воде, чтобы сделать общий объем до 1000 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это решение является светочувствительным, поэтому убедитесь, что они хранятся в темных/черных или алюминиевых обернутых трубках/бутылках. - Водорастворимый витаминный раствор (1000 мл): Растворите 100 мг гидрохлорида тиамина (Тиамин-HCl), 100 мг D-пантотеновой кислоты, 100 мг ниацина, 100 мг пиридовина, 5 мг P-аминобензойной кислоты и 0,25 мг витамина B12 1000 мл.
- Салат: раствор биотина (1000 мл): Растворите 10 мг фолиевой кислоты, 2 мг Д-биотина и 100 мг бикарбоната аммония (NH4HCO3) в деионизированной воде, чтобы сделать общий объем до 1000 мл.
- Раствор рибофлавина (1000 мл): Растворите 10 мг рибофлавина в растворе 5 мМ HEPES (1,19 г/л), чтобы сделать общий объем до 1000 мл.
- Гемин раствор (10 мл): Растворить 5000 мг гемина в гидроксиде натрия 10 мм (NaOH) (0,4 г/л) раствором, чтобы сделать общий объем до 10 мл.
- Короткоцепочечная жирная кислотная смесь (10 мл): Смешайте 2,5 мл N-валерата, 2,5 мл изовалерата, 2,5 мл изобутирата и 2,5 мл: DL-й-метилбутират.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это решение рекомендуется использовать в дым капот, чтобы избежать запаха и паров. - Резазурин (1000 мл): Растворите 1 г резазурина в деионизированной воде и сделать общий объем до 1000 мл.
-
Средний используется для анаэробного брожения in vitro
- Для приготовления этого носителя смешайте 330 мл раствора А, 330 мл раствора B, 10 мл минерального раствора Trace, 20 мл водорастворитого витаминного раствора, 5 мл фолиевой кислоты: биотиновый раствор, 5 мл раствора рибофлавина; 2,5 мл раствора гемин, 0,4 мл смеси короткоцепочечных жирных кислот, 1 мл экстракта резазурина, 0,5 г дрожжевого экстракта, 4 г карбоната натрия (Na2CO3),0,5 г Cysteine HCl-HCl-H2O и 0,5 г триптикеса, и добавить 296,1 мл дистиллятов.
- Проверьте рН и убедитесь, что это около 7,0, если нет, настроить рН с 1 N HCl или 1 N NaOH. Стерилизовать путем вакуумной фильтрации средств массовой информации с помощью фильтра бутылки под асептической рабочей станцией.
- Кроме того, смешать все компоненты (кроме витамина и гемин решений) и автоклав на 121 кв в течение 20 минут и дайте ему остыть до комнатной температуры. Одновременно, фильтр-стерилизовать витаминов и hemin решений с использованием 0,22 мембранных фильтров и добавить их в автоматическом и охлажденных средств массовой информации перед дозированием.
2. Подготовка анаэробной камеры и необходимых материалов
- Храните все материалы, растворы и инструменты, необходимые для эксперимента по брожению внутри анаэробной камеры по крайней мере 48 ч до начала эксперимента, чтобы гарантировать, что любой остаточный кислород, связанный с инструментами и растворимым кислородом в буферах / решениях удалены и все материалы акклиматизированы к установленным анаэробным условиям.
ПРИМЕЧАНИЕ: Материалы, необходимые внутри анаэробной камеры (48 ч ранее эксперимента, чтобы начать): (i) ферментации средств; ii) анаэробное решение (подготовлено в соответствии с разделом 4.1), (iii) вихрь, iv) баланс взвешивания, (v) муслина сырные ткани, (vi) ножницы, (vii) воронка, (viii) 1.5, 2.0, 15, 50 mL трубки, (ix) pipettor (2, 20, 200 и 1,000 л) и совместимые наконечники трубы, (x) pipet и pipets (5 и 10 мл), (xi) бумажные ткани, (xii) маркеры, (xiii) трубка стоит для различных труб, (xiv) ящик для отходов, (xv) O2 индикатор и (xvi) 70% этанол спрей бутылку (дезинфицирующее средство).
3. Подготовка труб и волокон
- Вес 300 мг инулина и передачи в трубку 50 мл с последующим асептически добавление 26 мл брожения средств уже подготовлены и хранятся в анаэробной камере. Подготовьте одну пустую трубку для каждого типа фекального образца и экспериментальной трубки (ы) (в зависимости от количества исследуемых соединений), в тройном.
- Оставьте эти трубки внутри анаэробной камеры около 24 ч, чтобы позволить гидратации образцов перед началом эксперимента брожения. Убедитесь, что температура трубки составляет 37 градусов по Цельсию во время прививки, поэтому довести трубки в инкубаторе заключены в анаэробной камере.
4. Подготовка Инокулума
- Анаэробный раствор разбавления (не менее 48 ч до начала эксперимента брожения): Растворите 5 г NaCl, 2 г глюкозы и 0,3 г cysteine-HCl в деионизированной воде и сделайте общий объем до 1000 мл. Autoclave и хранить его внутри анаэробной камеры по крайней мере 48 ч перед использованием.
- Фекальный препарат инокулума (в день эксперимента брожения): Взвесить 5 г свежего фекального образца в конической трубке 50 мл, добавить анаэробный раствор разбавления для конечного объема 50 мл (1:10 w/v) и вихря в течение 15 мин или до полного однородного. Фильтр гомогенизированной смеси через 4 слоя стерильной марли (автоклавированной) и использовать его немедленно для прививки в трубках, содержащих средства массовой информации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фекальные образцы из группы испытуемых могут быть объединены, если экспериментальная цель состоит в том, чтобы сравнить влияние данного соединения / ингредиента на общее здоровое по сравнению с больными фекальной микробиоты в целом.
5. Брожение и отбор проб
- Подготовка труб в соответствии с разделом 4.2 и прививать пустые / контрольные и экспериментальные трубки с 4 мл разбавленного и фильтрованного фекалийного инокулума. Инкубировать привитые трубки при 37 градусах Цельсия внутри анаэробной камеры. Встряхните трубки один раз в час, переворачивая осторожно, чтобы повторно приостановить волокна и инокулум.
- Собирайте образцы так часто, как это необходимо, например, ежечасно до 0, 3, 6, 9 и 24 ч во время брожения, взяв образец аликвота 2 мл в 2 мл трубки из соответствующих брожения труб.
- Измерьте рН aliquots с помощью лабораторного счетчика рН (путем прямого вставки электрода рН в образец); центрифуга оставшийся образец на 14000 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия. Немедленно заморозить супернатант и гранулы в жидком азоте, а после оснастки замораживания, хранить супернатант для анализа SCFAs и гранулы для анализа микробиома при -80 градусов по Цельсию.
6. Короткоцепочечные жирные кислоты (SCFAs) и Количественная оценка Лактата
ПРИМЕЧАНИЕ: SCFAs и лактат в супернатант культуры микробиома могут быть измерены точно в соответствии с методами, подробно описанными в другом месте13,14,15,16.
- Кратко, оттепель оснастки замороженных супернациантов, полученных в разделе 5 из контрольного и очистных образцов на льду и выполнять все дальнейшие этапы обработки на льду. Фильтр супернатанта через 0,45 мембранного фильтра и использовать безклеточные образцы для измерения концентраций SCFAs и лактата с помощью системы HPLC с детектором DAD на 210 нм, оснащенный колонкой HPX-87H. Используйте впрыски объем 10 л для каждого образца и используйте H2SO4 (0.005 N), чтобы утереть столбец при скорости потока 0,6 мл/мин при 35 градусах Цельсия.
7. Фекальный анализ микробиома
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните анализ микробиома после методов и конвейера подробновдругом месте 7,13,14,17.
- Кратко, извлечь геномную днк из приблизительно 200 мг фекальных гранул суспензии с помощью фекального комплекта экстракции ДНК13.
- Усиль гиперизменную область бактериального гена 16S rRNA с помощью штрих-кодированных грунтовок в рамках метода, описанного в другом месте13, используя грунтовые последовательности, описанные в протоколе проекта микробиома Земли18.
- Очистите полученные амобъективы с помощью магнитных бусин октворений и количественно очищайтесь пикогрином или эквивалентным методом. Объедините очищенные продукты ПЦР в равной концентрации моляров и последовательности на секвенсоре13.
- Обработка результирующих последовательностей для де-мультиплексирования, качественной фильтрации и кластеризации, таксономического назначения и редефакции, а также анализа вниз по течению с помощью количественного анализа в микробной экологии (КИИМЕ) программного обеспечения в зависимости от описанных методов Капорасо и др.19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Протокол используется для демонстрации влияния специфического пребиотика (т.е. инулина на состав микробиоты и метаболическую активность с точки зрения изменений в фекальной рН и концентрации лактата и СКФА в фекалиях здоровых людей различные временные точки после лечения инулином). Фекальные рН, фекальные уровни лактата и СКФА(рисунок1), а также состав микробиоты (рисунок2 и рисунок3) измеряются на 0 (базовый), 9 и 24 ч инкубации с или без инулина. Результаты демонстрируют, как фекальный состав микробиоты и ее метаболической деятельности модулируются во время брожения в пробирке с или без лечения инулина.
Рисунок 1: Изменения в фекальных рН (а), лактате (b) и короткоцепочечных жирных кислотах viz. ацетат (c), пропионате (d) и бутирате (e) в фекалиях при 0 (базовый), 9 и 24 h анаэробного брожения с или без инулина. Значения, представленные здесь, являются средними и SEM тройных образцов. * . злт; 0,05, П.л.;0,01, П.л.; 0,001, по сравнению с базовым уровнем. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Изменения в разнообразии и составе микробиоты в человеческих калах на 0 (базовый), 9 и 24 ч анаэробного брожения с или без инулина. (a) Взвешенные и (b) невзвешенные показатели Unifrac бета-разнообразия, визуализированные с помощью анализа основных координат (PCoA). (c-f) Индексы альфа-разнообразия viz. филогенетического разнообразия (PD всего дерева (c); богатство видов (Chao1; г); наблюдаемое количество оперативных таксономических единиц (OTUs, e); и даженесты видов (индекс Шеннон, f)). Относительное обилиеосновных фила (г) и родов (ч). Значения, представленные здесь, являются средними и SEM тройных образцов. * P злт; 0,05, Q)P йlt; 0,01, по сравнению с базовым уровнем. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Линейный дискриминационный анализ (LDA) размер эффекта (LEfSe) анализ кишечной микробиоты изменения после 9 ч и 24 ч инкубации с (INU) или без (CTL) инулин. Таксономическая кладограмма, полученная из анализа LEfSe 16S последовательностей (относительное изобилие 0,5%) представляющие дифференциально обильные таксонмеждутирования между различными группами образцов. Яркость каждой точки пропорциональна ее размеру эффекта (т.е. обилию таксона). Только такса, проходящие LDA пороговое значение в размере 2,4, показаны здесь. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Представленная здесь модель брожения фекальных ферментаций в пробирке является простой односерийной моделью, чтобы приблизить воздействие различных субстратов и микробных штаммов (например, пребиотиков и пробиотиков) на состав фекальной микробиоты человека, а также ее метаболической деятельности с точки зрения фекальных уровней рН и SCFAs. Результаты, представленные в этом проекте, показывают, что прививка инулина уменьшает фекальный рН и значительно повышает уровень СКФА и лактата в обработанных инулинами фекальных образцах по сравнению с необработанной фекальной микробиотой культуры (Рисунок 1). Кроме того, кишечная микробиота подпись также, как представляется, отличаются между инулин-обработанных и необработанных образцов(Рисунок 2 и Рисунок 3). Эти данные иллюстрируют, как эта система может отражать влияние инулина на разнообразие и состав фекальных микробиомов, а также его метаболическую деятельность. Кроме того, в зависимости от конкретных экспериментальных целей и гипотез, с помощью этой системы можно измерить целый ряд других факторов. Кроме того, в дополнение к секвенированию генов 16S rRNA, другие анализы, такие как секвенирование всего микробного метагенома (с использованием секвенсора всего генома) или qPCR и методы культуры, ориентированные на конкретные однородные или множественные роды, виды и штаммы (например, бифидобактерии, лактобактерии, Аккермансия, Энтеробактерии,Клостридия и др.) также могут быть выполнены. Кроме того, различные хроматографические процедуры для анализа СКФА, такие как LC-MS, GC, GC-MS, GC-FID и HPLC, также могут быть использованы на основе экспериментальных требований и доступности. Тем не менее следует отметить, что подготовка выборки к этим процедурам может варьироваться в зависимости от инструментов и условий, необходимых для эксплуатации20.
Хотя использование свежего фекального образца даст наилучшие воспроизводимые результаты; однако, оснастки замороженных фекальных образцов (как используется в эксперименте, представленном в этом вопросе) также может быть использован эффективно, как большинство бактерий могут быть возрождены из него после реанимированы до температуры тела и не более разложения происходит после замораживания21. Использование замороженных образцов может быть особенно выгодным, когда невозможно получить свежие фекальные образцы от конкретного донора (ы) в запланированный день эксперимента, или от того же донора, когда эксперимент должен быть воспроизведен. Следует отметить, однако, что фекальные образцы должны быть заморожены с использованием жидкого азота и немедленно храниться при -80 градусов по Цельсию до дальнейшего использования. Кроме того, чтобы избежать воздействия замороженных фекальных образцов на воздух (кислород), образцы следует как можно скорее/сразу после вывоза из морозильной камеры и использовать сразу же (следует избегать повторного оттаивания). Все последующие эксперименты, включая оттаивание образцов, подготовку и обработку инокулума, должны проводиться внутри анаэробной камеры.
Кишечная органическая среда и рН во время расплода питательных веществ в толстой кишке очень важны, особенно с учетом того факта, что аномально сниженный рН указывает на повышенную кислотность из-за использования субстрата. Таким образом, более быстрое снижение рН может соответствовать более быстрому использованию субстрата22. Хотя в этой модели рН не контролируется, однако, включение идентичных необработанных контроля настоятельно рекомендуется сделать прямое сравнение. SCFAs производится в толстой кишке в результате брожения неперевариваемых полисахаридов кишечной микробиоты может дополнительно влиять на различные механизмы, связанные с поддержанием здоровья хозяина. Эти метаболиты способствуют глюконеогенеза и липидного биосинтеза, выступают в качестве источника энергии для колоноцитов, а также могут иметь преимущества для здоровья, включая иммунную модуляцию, контролируемые / улучшенные функции кишечного барьера, и нейромодуляции23, 24,25,26. Кроме того, SCFAs, как известно, влияют на несколько биологических путей, включая гормоны, эндоканнабиноидной системы, пролиферации клеток и смерти, здоровье костей, поглощение минералов, подвижность кишечника, рН кишечника, и инвертное воздействие на микрофлору кишечника и микробной метаболической функции. Таким образом, знание профиля и концентрации кишечных / фекальных SCFAs может быть важным компонентом при оценке эффективности конкретных модуляторов микробиоты6. Конечно, помимо SCFAs, микрофлора кишечника также производит много других важных метаболитов (например, аммоний, витамины, гистамин). Таким образом, супернатантные образцы, собранные в ходе таких экспериментов по брожению в пробирке, также могут быть оценены для глобального анализа метаболомики метаболитов, полученных из кишечника, которые могут находиться под влиянием конкретных модуляторов микробиома.
Описанная здесь система имеет много преимуществ, таких как легкость, простота, эффективность затрат и общая приемлемость экспериментальной установки. Тем не менее, Есть несколько ограничений, а также. Например, система не относится к взаимодействию пребиотиков (или других используемых вмешательств) в верхней пищеварительной системе (например, слюне, желудке, тонком кишечнике) перед воздействием микробиоты толстой кишки. Однако такие шаги могут быть приняты и включены в соответствии с конкретными экспериментальными требованиями. Кроме того, кислой и / или ферментативный процесс гидролизов, возможно, должны быть выполнены до брожения при использовании конкретных субстратов, включая цельную пищу или удобоваримые продукты, потому что только неперевариваемая часть таких продуктов достигает толстой кишки, чтобы быть ферментированным ниже кишечной микробиоты. Кроме того, состав кишечной микробиоты может меняться из-за специфических культурных условий во время брожения. Например, было отмечено, что до 9 ч инкубационного, микробиоты изменения гораздо ближе к нормальной, чем на 24 ч. Однако, после 24 ч инкубации, хотя уровень рН и SCFAs значительно увеличился, состав микрофлоры кишечника показал, что количество протеобактерий увеличилось, в то время как микробное разнообразие уменьшилось. Тем не менее, остается неизвестным, как точно и близко увеличение накопления микробных метаболитов сопровождается пониженной фекальной рН связано с конкретными микробиотами подписей.
Таким образом, в настоящем кратком изложен простой протокол для имитации экосистемы микрофлоры ex vivo. Система позволяет исследователям проверить различные вмешательства для модуляции разнообразия микробиоты, состава и метаболической функции, которые могут влиять на различные особенности кишечника хозяина и общее состояние здоровья.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы с благодарностью признают финансовую поддержку со стороны Центра по диабету, ожирению и метаболизму и клинического и трансляционного научного центра, Школы медицины Уэйк-Форест, Министерства обороны (Грант номер: W81XWH-18-1-0118), Кермит Гленн Филлипс II Кафедра сердечно-сосудистой медицины; Национальные институты здравоохранения финансировали Центр пожилых американцев Клода Д. Пеппера (финансируется P30AG122232); R01AG18915; R01DK114224 и Клинический и трансляционный научный центр (Клинический научно-исследовательский отдел, финансируемый UL1TR001420), также с благодарностью признаны. Мы также благодарим добровольцев за предоставление фекальных образцов, и других наших членов лаборатории за их техническую помощь в ходе этого эксперимента.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | 217255 | |
| Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 | TGI | C2388 | Toxic |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2•2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | Irritating |
| Cobaltous Chloride Hexahydrate (CoCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | 255599 | |
| Cupric Chloride Dihydrate (CuCl2•2H2O) | Acros organics | 2063450000 | Toxic, Irritating |
| Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C121800 | |
| D-biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| D-Pantothenic acid | Alfa Aesar | A16609 | |
| Disodium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrate (Na2EDTA) | Biorad | 1610729 | |
| DL-α-methylbutyrate | Sigma-Aldrich | W271918 | |
| Ferrous Sulfate Heptahydrate (FeSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | F8263 | Toxic |
| Folic acid | Alfa Aesar | J62937 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | |
| Hepes | Alfa Aesar | A14777 | |
| Isobutyrate | Alfa Aesar | L04038 | |
| Isovalerate | Alfa Aesar | A18642 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Manganese Chloride Tetrahydrate (MnCl2•4H2O) | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Niacin (Nicotinic acid) | Sigma-Aldrich | N4126 | |
| Nickel(Ii) Chloride Hexahydrate (NiCl2•6H2O) | Alfa Aesar | A14366 | Toxic |
| N-valerate | Sigma-Aldrich | 240370 | |
| P-aminobenzoic acid | MP China | 102569 | Toxic, Irritating |
| Phosphoric Acid (H3PO4) | Sigma-Aldrich | P5811 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5504 | |
| Potassium Hydrogen Phosphate (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | 1551128 | |
| Pyridoxine | Alfa Aesar | A12041 | |
| Resazurin | Sigma-Aldrich | R7017 | |
| Riboflavin | Alfa Aesar | A11764 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | 1613757 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher BioReagents | 7647-14-5 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Chemicals | S320 | |
| Sodium Molybdate Dihydrate (Na2MoO4•2H2O) | Acros organics | 206375000 | |
| Thiamine Hydrochloride (Thiamin-HCl) | Acros organics | 148991000 | |
| Trypticase | BD Biosciences | 211921 | |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161 | |
| Zinc Sulfate Heptahydrate (ZnSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
| 0.22 µm membrane filter | |||
| AMPure magnetic purification beads | Agencourt | ||
| Anaerobic chamber with incubatore | Forma anaerobic system, Thermo Scientific, USA | ||
| Bottle filter | Corning | ||
| Cheesecloth | |||
| Illumina MiSeq sequencer | Miseq reagent kit v3 | ||
| pH meter | |||
| Qiagen PowerFecal kit | Qiagen | ||
| Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software | |||
| Qubit-3 fluorimeter | InVitrogen | ||
| Vortex | Thermoscientific | ||
| Waters-2695 Alliance HPLC system | Waters Corporation |
References
- Shreiner, A. B., Kao, J. Y., Young, V. B. The gut microbiome in health and in disease. Current Opinion in Gastroenterology. 31 (1), 69-75 (2015).
- Xu, Z., Knight, R. Dietary effects on human gut microbiome diversity. British Journal of Nutrition. 113, 1-5 (2015).
- Jiang, C., Li, G., Huang, P., Liu, Z., Zhao, B. The gut microbiota and Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimers Disease. 58 (1), 1-15 (2017).
- Clemente, J. C., Ursell, L. K., Parfrey, L. W., Knight, R. The impact of the gut microbiota on human health: an integrative view. The Journal Cell. 148 (6), 1258-1270 (2012).
- Yadav, H., Jain, S., Marotta, F. Probiotics mediated modulation of gut flora might be biotherapeutical approach obesity and type 2 diabetes. Metabolomics : Open Access. 1 (3), 1-3 (2011).
- Ahmadi, S., et al. Dietary Polysaccharides in the Amelioration of Gut Microbiome Dysbiosis and Metabolic Diseases. Obesity and Control Theries: Open Access. 4 (3), (2017).
- Nagpal, R., et al. Obesity-Linked Gut Microbiome Dysbiosis Associated with Derangements in Gut Permeability and Intestinal Cellular Homeostasis Independent of Diet. Journal of Diabetes Research. , 1-9 (2018).
- Paul, B., et al. Influences of diet and the gut microbiome on epigenetic modulation in cancer and other diseases. Journal of Clinical Epigenetics. 7 (1), 112 (2015).
- O’mahony, S., Clarke, G., Borre, Y., Dinan, T., Cryan, J. Serotonin tryptophan metabolism and the brain-gut-microbiome axis. Journal of Behavioural Brain Research. 277, 32-48 (2015).
- Sharon, G., et al. Specialized metabolites from the microbiome in health and disease. Journal of Cell Metabolism. 20 (5), 719-730 (2014).
- Faber, T. A., Bauer, L. L., Price, N. P., Hopkins, A. C., Fahey, G. C. In vitro digestion and fermentation characteristics of temulose molasses, a coproduct of fiberboard production, and select temulose fractions using canine fecal inoculum. Journal of Agricultural Food Chemistry. 59 (5), 1847-1853 (2011).
- Bourquin, L. D., Titgemeyer, E. C., Fahey, G. C. Vegetable fiber fermentation by human fecal bacteria: cell wall polysaccharide disappearance and short-chain fatty acid production during in vitro fermentation and water-holding capacity of unfermented residues. Journal of Nutrition. 123 (5), 860-869 (1993).
- Nagpal, R., et al. Human-origin probiotic cocktail increases short-chain fatty acid production via modulation of mice and human gut microbiome. Scientific Reports. 8 (1), 12649 (2018).
- Nagpal, R., et al. Comparative microbiome signatures and short-chain fatty acids in mouse, rat, non-human primate and human feces. Frontiers in Microbiology. 9, 2897 (2018).
- Thangamani, S., Guinan, J., Wang, S., Yadav, H. Antibiotic-induced decreases in the levels of microbial-derived short-chain fatty acids promote gastrointestinal colonization of Candida albicans. bioRxiv. , 428474 (2018).
- Ahmadi, S., et al. Prebiotics from acorn and sago prevent high-fat diet-induced insulin resistance via microbiome-gut-brain axis modulation. The Journal of Nutritional Biochemistry. , (2019).
- Nagpal, R., et al. Gut Microbiome Composition in Non-human Primates Consuming a Western or Mediterranean Diet. Frontiers in Nutrition. 5, 28 (2018).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME Journal. 6 (8), 1621-1624 (2012).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
- Garcia-Villalba, R., et al. Alternative method for gas chromatography-mass spectrometry analysis of short-chain fatty acids in faecal samples. Journal of Seperation Science. 35 (15), 1906-1913 (2012).
- Lee, C. H., et al. Frozen vs Fresh Fecal Microbiota Transplantation and Clinical Resolution of Diarrhea in Patients With Recurrent Clostridium difficile Infection: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 315 (2), 142-149 (2016).
- Chen, M. -H., et al. In vitro fermentation of xylooligosaccharides produced from Miscanthus× giganteus by human fecal microbiota. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64 (1), 262-267 (2015).
- Cook, S., Sellin, J. Short chain fatty acids in health and disease. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 12 (6), 499-507 (1998).
- Rastelli, M., Knauf, C., Cani, P. D. Gut microbes and health: a focus on the mechanisms linking microbes, obesity, and related disorders. Obesity. 26 (5), 792-800 (2018).
- Zou, J., et al. Fiber-mediated nourishment of gut microbiota protects against diet-induced obesity by restoring IL-22-mediated colonic health. Cell Host & Microbe. 23 (1), e44 41-53 (2018).
- Dinan, T. G., Cryan, J. F. Gut–brain axis in 2016: Brain–gut–microbiota axis—mood, metabolism and behaviour. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (2), 69 (2017).
