Summary
Bu protokol, insan dışkı Mikrobiyota bir in vitro toplu kültür fermantasyon sistemi açıklar, inulin kullanarak (iyi bilinen bir prebiyotik ve en yaygın olarak okudu Mikrobiyota Modulators) belirli etkileri tahmin bu sistemin kullanımını göstermek için dışkı mikrobiota kompozisyon ve metabolik faaliyetler üzerinde müdahaleler.
Abstract
Çeşitli insan hastalıklarında bağırsak mikrobiyomunun gelişmekte olan rolü yeni araçlar, teknikler ve teknolojiler bir atılım gerektirir. Bu tür iyileştirmeler, insan sağlığı faydaları için Mikrobiyom modülatörlerin kullanımını deşifre etmek için gereklidir. Ancak, Mikrobiyom modülasyonunu doğrulamak ve ilgili sağlık avantajlarını tahmin etmek için modülatörlerin büyük ölçekli tarama ve optimizasyonu, çok sayıda hayvan ve/veya insan konularına ihtiyaç nedeniyle pratik olarak zor olabilir. Bu amaçla, in vitro veya ex vivo modeller Mikrobiyom modülatörlerin ön taramasına olanak verebilir. Burada, optimize edilmiş ve probiyotikler, prebiyotik ve diğer gıda maddeleri de dahil olmak üzere gut Mikrobiyom modülatörlerin çeşitli müdahalelerin etkilerini incelemek için kullanılabilecek bir ex vivo dışkı mikrobiota kültür sistemi göstermiştir, kenara Nutraceuticals ve ilaçlar, çeşitlilik ve insan bağırsak mikrobiota bileşimi üzerinde. INULİN, en yaygın olarak çalışan prebiyotik bileşikler ve Mikrobiyom modülatörlerinden biri, burada sağlıklı dışkı mikrobiota kompozisyon ve onun metabolik faaliyetleri üzerinde etkisini incelemek için bir örnek olarak kullanılır, dışkı pH ve organik asitlerin dışkı seviyeleri gibi lakdamak ve kısa zincir yağ asitleri (SCFAs) dahil. Protokol, farklı modülatörlerin dışkı mikrobiota profillerinde ve sağlık etkilerini tahmin etme konusundaki etkilerini tahmin etme amaçlı çalışmalar için yararlı olabilir.
Introduction
İnsan Mikrobiyota bakteri, antik, virüsler ve ökaryotik mikroplardan oluşan kompleks bir topluluktur1, insan vücudunun dahili ve dıştan olması. Son kanıtlar, obezite, diyabet dahil olmak üzere çeşitli insan hastalıklarında bağırsak Mikrobiyota ve bağırsak mikrobiyomu (mikropların ve genlerinin tüm koleksiyonu insan gastrointestinal sistem içinde bulunan) temel rolünü kurduk kardiyovasküler hastalıklar, ve kanser1,2,3. Ayrıca, bizim gut yaşayan mikroorganizmalar önemli ölçüde sağlığımızı etkileyen metabolitler geniş bir spektrum üretmek ve ayrıca çeşitli hastalıkların patofizyolojisi yanı sıra çeşitli metabolik fonksiyonlar katkıda bulunabilir4, 5. Bu bağırsak mikrobiyal nüfusun bileşimi ve fonksiyonunda anormal değişiklikler (perturbations) genellikle "gut dysbiosis" olarak adlandırılır. Dysbiosis genellikle ev sahibinin sağlıksız bir devlet ile ilişkilidir ve bu nedenle normal (homeostatik) mikrobiyal topluluktan ev sahibi sağlıklı bir kontrol durumu ile ilişkili ayırt edilebilir. Gut Mikrobiyom dysbiosis spesifik desenler genellikle çeşitli hastalıklarda bulunur1,2,3,6,7.
Sindirilmemiş gıda fermantasyon, özellikle fermente karbonhidratlar/lifler, gut Mikrobiyota tarafından sadece enerji verir değil, aynı zamanda kısa zincir yağ asitleri (scfas), lakdamak, formate, karbondioksit dahil olmak üzere farklı metabolitler üretir metan, hidrojen ve etanol6. Buna ek olarak, gut Mikrobiyota da folat gibi diğer biyoaktif maddelerin bir dizi üretir, biotin, trimethylamine-N-oksit, serotonin, triptofan, gama-aminobutirik asit, dopamin, norepinefrin, asetilkolin, histamin, desoksikolik asit, ve 4-etilfenil sülfat. Bu, öncelikle, çeşitli vücut süreçleri, metabolik fonksiyonlar ve epigenetik değişiklikler1,8,9katkıda ev sahibi mikrobe niş içinde içsel metabolik Cereyanlar kullanımı ile oluşur 10' a kadar. Ancak, bu tür mikrobiyal ürünlere yönelik çeşitli müdahalelerin etkileri, kolay, verimli ve tekrarlanabilir protokollerin olmaması nedeniyle belirsizliğini koruyor. İnsan bağırsak mikrobiota kompozisyon son derece karmaşık ve çeşitli ekosistem, ve dolayısıyla, insan sağlığı ve hastalık patolojisinde rolü hakkında birçok soru hala cevapsız kalır. Birçok ortak bağırsak Mikrobiyom modülatörlerinin etkileri (örn., probiyotikler, Prebiyotikler, antibiyotikler, dışkı nakli ve enfeksiyonlar) bağırsak mikrobiota bileşimi ve metabolik fonksiyonları büyük ölçüde zor kalır. Buna ek olarak, muayene ve bu etkilerini doğrulama in vivo zordur, özellikle çünkü bağırsak mikrobiota tarafından üretilen besin ve metabolitlerin çoğu emilir veya aynı anda ve hızlı bir şekilde bağırsakta bertaraf; Bu nedenle, bu metabolitlerin üretim, miktar ve işlenmesi ölçümü (örn., SCFAs) in vivo hala pratik bir zorluk kalır. Nitekim, hayvanlar ve insan konuları gibi fizyolojik modeller, bağırsak mikrobiyomunun rolünü belirlemek ve ana sağlık üzerindeki modülasyonu için kritik öneme sahiptir, ancak bu durum nedeniyle farklı Mikrobiyom modülatörlerinin büyük ölçekli taramaları için uygun olmayabilir. Etik, parasal veya zaman kısıtlamaları. Bu amaçla, in vitro ve/veya ex vivo modelleri, gut Mikrobiyota in vitro kültürü gibi ve daha sonra farklı Mikrobiyota modülatörler ile müdahale, zaman sunabilir ve para tasarrufu fırsatları ve dolayısıyla ön veya büyük ölçekli tarama için izin verebilir çeşitli bileşenler (probiyotikler gibi, Prebiyotikler, ve diğer girişimsel bileşikler) incelemek/dışkı mikrobiota çeşitlilik üzerindeki etkilerini tahmin, kompozisyon ve metabolik profiller. Gut mikrobiyomunun böyle in vitro ve ex vivo sistemlerini kullanan çalışmalar, ana sağlık ve hastalığa katkıda bulunan ana bilgisayar-Mikrobiyom etkileşimlerinin daha fazla anlayışını kolaylaştırabilir ve aynı zamanda mikrobiyomu hedefleyen yeni tedaviler bulmaya yol açabilir Ana sağlık iyileştirmek ve önlemek ve çeşitli hastalıklar tedavi1.
İn vitro gut Mikrobiyota kültür sistemleri gerçekten gerçek bağırsak koşullarını çoğaltmak olmasa da, birkaç laboratuar bazı ölçüde uygulanabilir bulundu ve başarıyla kullanılan bu tür modeller geliştirmek için çaba var farklı amaçlar. Son bağırsak modellerinden biri, mide, ince bağırsak ve kolon farklı bölgeleri de dahil olmak üzere tüm insan gastrointestinal sistemi taklit eden ınsan bağırsak mikrobiyal ekosisteminin simülatörüdür. Ancak, bu tür teknik karmaşık modeller dünya çapında diğer araştırma tesisleri için erişilebilir olmayabilir. Bu nedenle, Mikrobiyom modülatörleri ve bağırsak Mikrobiyota ve ana sağlık üzerindeki etkilerini okuyan laboratuvarlar için nispeten basit, uygun fiyatlı ve pratik yeni alternatif modellerin geliştirilmesi için kritik bir ihtiyaç hala vardır. Bu nedenle, bir in vitro kullanımı (veya ex vivo) dışkı Mikrobiyota kültür sistemi bu tür müdahalelerin etkilerini incelemek için yararlı olacaktır11,12. Özellikle, bağırsak mikrobiota çeşitlilik ve kompozisyon periyodik değişiklikler açısından mikrobiota fermantasyon kapasitesi üzerinde farklı prebiyotikler etkisi, dışkı pH ve SCFAs ve lakdamak dahil mikrobiyal metabolitlerin seviyeleri incelenebilir 13. burada, Mikrobiyom Modülatörün bir örneği olarak inulin (en yaygın olarak çalışılan prebiyotik bileşenlerden biri) kullanarak, bu basit ex vivo Mikrobiyota toplu kültür sisteminin bir adım-adım protokolü, tahmin etmek için kullanımını göstermek için açıklanmıştır Mikrobiyom modülatörleri ile müdahale aşağıdaki dışkı Mikrobiyota ve mikrobiyal metabolitleri değişiklikler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
DIKKAT: uygun malzeme güvenliği veri sayfalarına başvurun ve uygun Biyogüvenlik seviyesi 2 (BSL-2) eğitimiyle ilgili talimatları ve yönergeleri izleyin. Standart Biyogüvenlik kurallarına göre tüm kültür adımlarını izleyin ve aseptik koşulları kullanarak bir BSL-2 kabine kullanın. Dahası, farklı modellerden ve insan konularından gelen dışkı numuneleri mikrobiyal kaynaklı hastalıkların yayılması riski olabilir. Hemen herhangi bir yaralanma ve enfeksiyon oluşumunda tıbbi yardım isteyin. Buna ek olarak, insan ve hayvan dışkı örneklerinin kullanımı kurumsal etik komiteler aracılığıyla onaylanmalıdır ve örnekleri ve konu bilgilerini kullanmak için protokoller ile uyumlu olmalıdır.
1. kültür ortamının hazırlanması
-
Kültür ortamının hazırlanması, dokuz çeşit stok çözümü hazırlamak
- Çözüm A (1.000 ml): sodyum klorür (NaCl), 2,7 g potasyum dihiddrogen fosfat (KH2Po4), 0,16 g kalsiyum klorür dihydrat (CAcl2· 2H2O), 0,12 g magnezyum klorür hekzahidrat (MgCl 2), 5,4 g çözülür · 6h2O), 0,06 g manganez klorür hidrat (MNCL2· 4h2o), 0,06 g Kobaltoz klorür hekzahidrat (COCL2· 6h2o) ve 5,4 g amonyum sülfat (NH4)2so4, deiyonize suda 1.000 mL toplam hacmi yapmak için.
- B çözümü (1.000 mL): çözülür 2,7 g potasyum hidrojen fosfat (K2HPO4) deiyonize suda toplam hacmi yapmak için 1000 mL.
- İzleme mineral solüsyonu (1.000 mL): çözülen 500 mg disodyum etylenediamin-tetraacetate dihydrat (na2EDTA), 200 mg demir sülfat Heptahydrat (feso4· 7h2O), 10 mg çinko sülfat Heptahydrat (znso4 · 7h2o), 3 mg manganez (II) klorür tetrahydrat (MNCL2· 4h2O), 30 mg fosforik asit (H3Po4), 20 mg COCL2· 6h2o, 1 mg kuprik klorür dihydrat (CuCl2 · 2H2o), 2 mg nikel (II) klorür hekzahidrat (nicl2· 6h2o) ve 3 mg sodyum molibtarih dihidrat (na2MoO4· 2H2O) deiyonize suda toplam hacmi yapmak için 1.000 ml.
Not: Bu çözüm hafif hassastır, bu nedenle koyu/siyah veya alüminyum sarılmış tüpler/şişeler içinde depolanmasını sağlar. - Su çözünebilir vitamin çözeltisi (1.000 mL): çözülür 100 tiamin hidroklorür mg (tiamin-HCl), 100 mg D-pantothenik asit, 100 mg Niasin, 100 pyridoxin mg, 5 mg P-aminobenzoik asit ve 0,25 vitamin B12 vitamini deiyonize su için toplam hacmi yapmak 1.000 mL.
- Folat: biotin çözeltisi (1.000 mL): çözülür 10 mg folik asit, 2 mg D-biotin ve 100 Amonyum Bikarbonat mg (NH4HCO3) deiyonize suda toplam hacmi yapmak için 1.000 ml.
- Riboflavin solüsyonu (1.000 mL): 5 mM HEPES (1,19 g/L) çözeltisi içinde 10 mg riboflavin çözülür ve toplam hacmi 1.000 mL 'ye doğru hale getirmek için.
- Hemin çözeltisi (10 mL): 10 mM sodyum hidroksit (NaOH) (0,4 g/L) çözeltisi 10 mL toplam hacmi yapmak için Hemin 5.000 mg eritin.
- Kısa zincir yağ asidi Mix (10 ml): birleştirmek 2,5 ml N-valerate, 2,5 ml isovalerate, 2,5 ml izobütirat ve 2,5 ml: DL-α-metilbutyrate.
Not: Bu çözüm koku ve dumanı önlemek için duman kaputu kullanmak için tavsiye edilir. - Resazurin (1.000 mL): Deiyonize suda 1 g resazurin çözülür ve 1.000 mL 'ye toplam hacim yapın.
-
İn vitro anaerobik fermantasyon için kullanılan orta
- Bu medya hazırlamak için, mix 330 mL çözüm A, 330 mL çözüm B, 10 mL ız mineral çözeltisi, 20 mL su çözünebilir vitamin solüsyonu, 5 mL folat: biotin çözeltisi, 5 mL riboflavin çözeltisi; 2,5 mL Hemin solüsyon, 0,4 mL kısa zincir yağ asidi karışımı, 1 mL Resazurin, 0,5 g maya özü, 4 gr sodyum karbonat (na2Co3), 0,5 g Cysteine HCL-H2O, ve 0,5 g Trypticase, ve ekleyin 296,1 ml distile su.
- PH kontrol ve 7,0 civarında olduğundan emin olun, değilse, 1 N HCl veya 1 N NaOH ile pH ayarlayın. Aseptik iş istasyonu altında bir şişe filtresi kullanarak medyayı filtreleyen vakum ile sterilize edin.
- Alternatif olarak, tüm bileşenleri (vitamin ve Hemin çözümleri hariç) ve 121 °C ' de otoklav 20 dakika boyunca karıştırın ve oda sıcaklığına kadar soğumasını bırakın. Aynı anda, 0,22 μm membran filtrelerini kullanarak vitamin ve Hemin çözümlerini filtreleyebilir ve bunları dağıtmadan önce Otoklavlanmış ve soğutmalı ortama ekleyin.
2. anaerobik odası ve gerekli malzemenin hazırlanması
- Tüm malzemeler, çözümler ve aletler ve tamponlar/çözümlerde çözünür oksijen ile ilişkili herhangi bir kalıntı oksijen sağlamak için, deney başlamadan önce en az 48 h anaerobik odası içinde fermantasyon deneyi için gerekli tüm malzemeleri tutun kaldırıldı ve tüm malzemeler set anaerobik koşullara acclimatied vardır.
Not: Anaerobik oda içinde gerekli malzemeler (48 h daha önce deneme başlatmak için): (i) fermantasyon medya; (ii) anaerobik çözüm (Bölüm 4,1 göre hazırlanmıştır), (iii) vortexer, (iv) tartım dengesi, (v) muslin peynir bezleri, (vi) makas, (vii) huni, (viii) 1,5, 2,0, 15, 50 ml tüpler, (IX) pipetör (2, 20, 200 ve 1.000 μL) ve uyumlu pipet uçları, (x) tabanca Pipet ve pipetler (5 ve 10 mL), (XI) kağıt dokularda, (XII) belirteçleri, (XIII) tüp farklı tüpler için standları, (XIV) atık kutusu, (XV) O2 göstergesi ve (vvı) 70% etanol sprey şişesi (dezenfektan).
3. tüpler ve liflerin hazırlanması
- Ağırlık 300 mg inulin ve transfer bir 50 ml tüp sonra aseptik eklenmesi 26 fermantasyon medya ml zaten hazırlanmış ve anaerobik odasında saklanır. Her dışkı numune tipi ve deneysel tüp (ler) için bir boş Tüp hazırlayın (test edilen bileşiklerin sayısına göre), triplicate.
- Fermantasyon deneyi başlamadan önce numunelerin hidrasyon sağlamak için yaklaşık 24 saat anaerobik odası içinde bu tüpler bırakın. İnoculation sırasında tüp sıcaklığının 37 °C olduğundan emin olun, bu nedenle tüplerin anaerobik oda içinde yer alan inkükosit içine getirin.
4. Inoculum hazırlanması
- Anaerobik seyreltme solüsyonu (fermantasyon deneyinden önce en az 48 h): Deiyonize suda 5 gr NaCl, 2 gr glikoz ve 0,3 gr Cysteine-HCl ' y i çözülür ve toplam hacmi 1.000 mL 'ye yapın. Autoclave kullanmadan önce en az 48 h anaerobik odası içinde saklayın.
- Dışkı inokulumunu hazırlığı (fermantasyon deneyi gününde): 50 ml konik tüpte 5 gr taze dışkı numunesi tartmak, 50 ml (1:10 w/v) son hacmi ve 15 dakika veya tamamen homojenize olana kadar girdap için anaerobik seyreltme çözeltisi ekleyin. Homojenize karışımı 4 kat steril tinoloth (Otoklav) ile filtreleyin ve medya içeren tüplerde inokülasyon için hemen kullanın.
Not: Eğer deneysel amaç genel olarak sağlıklı karşı hastalıklı dışkı Mikrobiyota verilen bir bileşik/madde etkisini karşılaştırmak için konularda bir grup dışkı örnekleri havuzlanmış olabilir.
5. fermantasyon ve örnekleme
- 4,2 bölümüne göre tüpleri hazırlayın ve 4 ml seyreltilmiş ve filtrelenmiş dışkı inoculum ile boş/kontrol ve deneysel tüpler aşılamak. Aşı tüpleri 37 °c ' de anaerobik odanın içinde inkübe etmek. Lifleri ve inoculum yeniden askıya hafifçe ters çevirerek her saat bir kez tüpler sallayın.
- Örnek olarak gerekli sıklıkta, örneğin, 0, 3, 6, 9 ve 24 saat fermantasyon sırasında 2 ml kısım numune alarak fermente edilen tüplerin 2 ml tüpüne kadar saat toplamak.
- Bir laboratuvar pH metre kullanarak plakaya pH ölçmek (doğrudan örnekteki pH elektrot ekleyerek); kalan numuneyi 14.000 x g 'de 4 °c ' de 10 dakika Santrifüjden ayırabilirsiniz. Hemen sıvı nitrojen içinde süpernatant ve Pelet dondurmak ve ek donma sonra, scfas Analizi ve Mikrobiyom analizi için Pelet için süpernatant saklayın-80 °c.
6. kısa zincir yağ asitleri (SCFAs) ve Lakdamak ölçümü
Not: Mikrobiyom kültürünün süpernatant içinde scfas ve lakdamak tam olarak başka bir yerde ayrıntılı yöntemlerle ölçülebilir13,14,15,16.
- Kısaca, buz üzerindeki kontrol ve tedavi örneklerinden Bölüm 5 ' te elde edilen dondurulmuş süpernatantların çözülmesi ve buzun üzerindeki tüm diğer işleme adımlarını yürütmek. 0,45 μm membran filtre ile süpernatant filtre ve HPX-87h sütun ile donatılmış, 210 nm 'de baba dedektörü ile HPLC sistemi kullanarak scfas ve lakdamak konsantrasyonlarını ölçmek için hücre içermeyen örnekleri kullanın. Her örnek için 10 μL hacminin enjekte edilmesini kullanın ve saat 35 °C ' de 0,6 mL/dak akış hızında sütunu elute etmek için H2so4 (0,005 N) kullanın.
7. dışkı Mikrobiom Analizi
Not: Başka yerlerde7,13,14,17ayrıntılı yöntemleri ve boru hattı takip Mikrobiyom analizi gerçekleştirin.
- Kısaca, yaklaşık 200 mg dışkı Bulamaç peleti bir dışkı DNA ekstraksiyon kiti13kullanarak genomik DNA ayıklamak.
- Bakteriyel 16S rRNA geni hiperdeğişken bölgesini, başka bir yerde açıklanan yönteme göre barkodlu astar kullanarak yükseltmek13, toprak microbiome proje Protokolü18açıklandığı gibi primer dizileri kullanarak.
- Elde edilen amplikonlar manyetik arıtma boncuklar ile arındırın ve picogreen veya eşdeğer bir yöntem tarafından ölçmek. Temizleşmiş PCR ürünlerini eşit molar konsantrasyonu ve sıralı bir sequencer13' te havuzla.
- Mikrobiyal ekoloji (QıNıME) yazılımına niceliksel Öngörüler 'i kullanarak tanımlanan yöntemlere göre de-multiplexing, kalite filtreleme ve kümeleme, taksononomik atama ve rarefaction ve aşağı akış analizleri için elde edilen dizileri işleme Caporaso ve ark.19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokol belirli bir prebiyotik etkisini göstermek için kullanılır (yani, Mikrobiyota bileşimi ve metabolik faaliyetler üzerinde inulin dışkı pH değişiklikleri açısından ve lakdamak ve SCFAs konsantrasyonu sağlıklı insan konularının dışkı içinde İnulin ile tedavi aşağıdaki farklı zaman noktaları). Dışkı pH 'sı, lakdamak ve scfas 'ın dışkı seviyeleri (Şekil 1) ve Mikrobiyota bileşimi (Şekil 2 ve Şekil 3), inulin ile veya olmadan 0 (temel), 9 ve 24 h kuluçta ölçülür. Sonuçlar, iç vitro fermantasyon sırasında veya inulin tedavisi olmadan nasıl dışkı mikrobiota bileşimi ve metabolik faaliyetlerinin modülü olduğunu göstermektedir.
Şekil 1: dışkı pH (a), lakdamak (b) ve kısa zincir yağ asitleri viz. asetat (c), propiyonat (d) ve butirat (e) 0 (temel) insan dışkı, 9 ve 24 h anaerobik fermantasyon ile veya inulin olmadan. Burada sunulan değerler triplicate örnekleri Mean ± SEM vardır. * P < 0,05, * *p < 0,01, * * *p < 0,001, vs. Baseline. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Mikrobiyota çeşitlilik ve kompozisyonu insan dışkı içinde 0 (temel), 9 ve 24 h anaerobik fermantasyon ile veya inulin olmadan değişir. (a) ağırlıklı ve (b) Beta çeşitliliğinin ağırlıklı Unifrac önlemleri Ilke koordinat Analizi (pcoa) kullanılarak görselleştirildi. (c-f) Alfa çeşitliliğinin endeksler. fitogenetik çeşitlilik (PD tüm ağaç (c); türler zenginliği (Chao1; d); Operasyonel taksononomik birimler (OTUs, e) sayısı gözlenen; ve türler (Shannon endeksi, f)). Büyük Soylarına (g) ve cins (h) göreli bolluk. Burada sunulan değerler triplicate örnekleri Mean ± SEM vardır. * P < 0,05, * *p < 0,01, vs. Baseline. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: doğrusal diskriminant analizi (lda) efekt boyutu (lefse) gut Mikrobiyota değişiklikleri analiz sonra 9 h ve 24 h kuluçta (Inu) veya olmadan (CTL) inulin. 16 ' ların sıraları (bağıl bolluk ≥% 0,5) LEfSe analizinden elde edilen taksononomik cladogram örneklerin farklı grup arasında farklılaşarak bol takson temsil eder. Her noktanın parlaklığı etkisi boyutuna (yani, takson bolluk) ile orantılıdır. Burada sadece takson geçirme lda eşik değeri > 2.4 gösterilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan in vitro dışkı Bulamaç fermantasyon modeli, farklı substratlar ve mikrobiyal suşları (örn. prebiyotik ve probiyotikler) etkileri yaklaşık olarak insan dışkı mikrobiota bileşimi üzerinde basit bir tek toplu model yanı sıra onun dışkı pH ve SCFAs seviyeleri açısından metabolik faaliyetler. Burada sunulan sonuçlar iniyanenin inokülasyon dışkı pH azaltır ve önemli ölçüde INULİN-tedavi dışkı mikrobiota kültürü ile karşılaştırıldığında iç-tedavisi dışkı numunede SCFAs ve lakdamak düzeylerini artırır göstermektedir (Şekil 1). Buna ek olarak, bağırsak mikrobiota imzası da inulin tedavi ve tedavi edilmemiş örnekler arasında farklı görünüyor (Şekil 2 ve Şekil 3). Bu veriler, bu sistemin inulin 'in dışkı Mikrobiyom çeşitliliği ve bileşimi üzerindeki etkilerini ve metabolik faaliyetlerini nasıl yansıttığını örnek olarak gösterir. Ayrıca, belirli deneysel hedefler ve hipotezler bağlı olarak, diğer faktörler çeşitli bu sistem kullanılarak da ölçülebilir. Ayrıca, 16S rRNA gen sıralamasının yanı sıra, tüm mikrobiyal metagenom sıralamaları (tüm genom Sequencer kullanarak) veya qPCR ve kültür yöntemlerinin belirli tek veya birden çok Genera, türler ve suşları (örn. Bifidobakteriler, laktobacilli, Akkermansia, enterobacteriacaea, Clostridia, vb.) de çalıştırılabilir. Buna ek olarak, LC-MS, GC, GC-MS, GC-FıD ve HPLC gibi SCFAs analizine yönelik farklı kromatografik prosedürler, deneysel gereksinim ve müsaitliğe göre de yararlanılabilir. Bununla birlikte, bu prosedürler için numune hazırlama işleminin20işletim için gerekli olan araç ve koşullara göre değişiklik gösterebileceğini unutulmamalıdır.
Taze dışkı numunesinin kullanımı en iyi tekrarlanabilir sonuçları verse de; Ancak, dondurulmuş dışkı örneği (burada sunulan deneyde kullanılan gibi) aynı zamanda bakterilerin çoğu bir kez vücut sıcaklığına resüsite ve daha fazla dekompozisyon donma sonra olur yeniden canlandırılmış olabilir olarak verimli kullanılabilir. Dondurulmuş numuneyi kullanmak, deneyin planlanan gününde özel donörlerden veya bir denemenin çoğaltılması gerektiğinde aynı donörden taze dışkı örnekleri elde etmek imkansız olduğunda özellikle avantajlı olabilir. Ancak, dışkı numunelerinin sıvı nitrojen kullanılarak dondurulmasına ve hemen-80 °C ' ye kadar daha fazla kullanıma kadar saklandığını unutulmamalıdır. Buna ek olarak, hava (oksijen) dondurulmuş dışkı numunelerinin pozlama önlemek için, numuneler en kısa sürede/hemen dondurucudan dışarı aldıktan sonra ve hemen kullanılan anaerobik odasına transfer edilmelidir (tekrarlanan çözme kaçınılmalıdır). Örnek çözme, inokulumunu hazırlama ve işleme gibi sonraki tüm deneyler anaerobik odanın içinde yapılmalıdır.
Bağırsak organik çevre ve pH büyük bağırsak içinde besin fermantasyon sırasında özellikle anormal azaltılmış pH alt substrat kullanımı nedeniyle artan asitliği gösterir gerçeğini açısından çok önemlidir. Bu nedenle, daha hızlı pH azaltma daha hızlı substrat kullanımı için karşılık olabilir22. Ancak, bu modelde, pH kontrol edilmedi, ancak, özdeş olmayan tedavi kontrol dahil olmak üzere doğrudan karşılaştırmalar yapmak için tavsiye edilir. Bağırsak mikrobiota tarafından sindirilemez polisakkaritler fermantasyonu sonucunda kolon üretilen SCFAs daha da ana sağlık bakım ile ilgili çeşitli mekanizmalar etkileyebilir. Bu metabolitler glukoneogenesis ve lipid biyosentezi katkıda, kolonanosit için bir enerji kaynağı olarak hareket, ve ayrıca bağışıklık modülasyonu dahil olmak üzere sağlık yararları olabilir, kontrollü/geliştirilmiş bağırsak bariyer fonksiyonları, ve nöromodulasyon23, 24,25,26. Ayrıca, SCFAs da hormonlar, Endokanabinoid sistemi, hücre proliferasyonu ve ölüm, kemik sağlığı, mineral emilimi, bağırsak motilitesi, intestinal pH ve bağırsak mikrobiyomu üzerinde ters etkileri de dahil olmak üzere çeşitli biyolojik yollar etkileyen bilinmektedir ve mikrobiyal metabolik fonksiyon. Bu nedenle, belirli Mikrobiyota modülatörlerin etkinliğini değerlendirirken profil ve bağırsak/dışkı scfas konsantrasyonları önemli bir bileşen olabilir6. Tabii ki, SCFAs dışında, bağırsak mikrobiyomu da diğer birçok önemli metabolitleri üretir (örneğin, amonyum, vitaminler, histamin). Bu nedenle, bu tür in vitro fermantasyon denemeleri sırasında toplanan süpernatant numuneler, belirli Mikrobiyom modülatörlerinden etkilenebilen yeni bağırsak mikrobiyomunu türeyen metabolitleri keşfetmek için küresel metabolomikler analizleri için de değerlendirilebilir.
Burada açıklanan sistem kolaylığı, basitlik, maliyet etkinliği ve deneysel ayarlama genel benimsemi gibi birçok avantajı vardır. Ancak, orada da birkaç sınırlamalar vardır. Örneğin, sistem, üst sindirim sisteminde (örneğin, tükürük, mide, ince bağırsak) prebiyotik (veya kullanılan diğer müdahalelerin), büyük bağırsaktaki Mikrobiyota maruz kalmadan önce etkileşimi ile ilgilidir. Ancak, bu tür adımlar benimsenebilir ve belirli deneysel gereksinimlerine göre eklenebilir. Ayrıca, bir asidik ve/veya enzimatik hidroliz süreci fermente olmak için tüm gıda veya sindirilebilir gıda dahil olmak üzere belirli substratlar kullanarak, çünkü bu tür gıdaların sadece sindirilebilir kısmı kolon ulaşır nedeniyle fermantasyon yapılması gerekebilir alt bağırsak mikrobiota. Buna ek olarak, bağırsak mikrobiota bileşimi fermantasyon sırasında belirli kültür koşulları nedeniyle vardiya olabilir. Örneğin, en fazla 9 h inkübasyon, Mikrobiyota değişiklikleri daha normale 24 saat daha yakın olduğunu gözlemlenmiştir. Ancak pH ve SCFAs seviyelerinin büyük ölçüde artmasına karşın, 24 saat inkübasyon yapıldıktan sonra, bağırsak Mikrobiyota bileşimi, mikrobiyal çeşitlilik azalırken Proteobacteria sayılarının arttığını gösterdi. Ancak, ne kadar tam ve yakından mikrobiyal metabolitlerin artan birikiminin indirdi dışkı pH ile birlikte spesifik mikrobiota imzaları ile ilişkili olduğu bilinmiyor kalır.
Özetle, ex vivo Mikrobiyota ekosistemini simüle etmek için basit bir protokol burada açıklanmıştır. Sistem araştırmacılar mikrobiota çeşitliliği, kompozisyon ve ana bağırsak ve genel sağlık çeşitli özelliklerini etkileyebilir metabolik fonksiyon modülasyonu için farklı girişimler test etmek sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar minnetle diyabet, obezite ve metabolizma ve klinik ve translasyonel Bilim Merkezi, uyandırma orman Okulu tıp, Bölüm Savunma Fonu (Grant numarası: W81XWH-18-1-0118) için merkezi 'nden fon desteği kabul Kardiyovasküler tıp Kermit Glenn Phillips II koltuğu; Ulusal Sağlık Enstitüleri Claude D. Pepper eski Amerikalılar Merkezi (P30AG12232 tarafından finanse) finanse; R01AG18915; R01DK114224 ve klinik ve translasyonel Bilim Merkezi (klinik araştırma birimi, UL1TR001420 tarafından finanse edilen), aynı zamanda minnetle kabul edilir. Biz de dışkı örnekleri sağlamak için gönüllülere teşekkür ederiz, ve teknik için diğer laboratuar üyeleri bu deney sırasında yardımcı olur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | 217255 | |
| Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 | TGI | C2388 | Toxic |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2•2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | Irritating |
| Cobaltous Chloride Hexahydrate (CoCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | 255599 | |
| Cupric Chloride Dihydrate (CuCl2•2H2O) | Acros organics | 2063450000 | Toxic, Irritating |
| Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C121800 | |
| D-biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| D-Pantothenic acid | Alfa Aesar | A16609 | |
| Disodium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrate (Na2EDTA) | Biorad | 1610729 | |
| DL-α-methylbutyrate | Sigma-Aldrich | W271918 | |
| Ferrous Sulfate Heptahydrate (FeSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | F8263 | Toxic |
| Folic acid | Alfa Aesar | J62937 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | |
| Hepes | Alfa Aesar | A14777 | |
| Isobutyrate | Alfa Aesar | L04038 | |
| Isovalerate | Alfa Aesar | A18642 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Manganese Chloride Tetrahydrate (MnCl2•4H2O) | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Niacin (Nicotinic acid) | Sigma-Aldrich | N4126 | |
| Nickel(Ii) Chloride Hexahydrate (NiCl2•6H2O) | Alfa Aesar | A14366 | Toxic |
| N-valerate | Sigma-Aldrich | 240370 | |
| P-aminobenzoic acid | MP China | 102569 | Toxic, Irritating |
| Phosphoric Acid (H3PO4) | Sigma-Aldrich | P5811 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5504 | |
| Potassium Hydrogen Phosphate (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | 1551128 | |
| Pyridoxine | Alfa Aesar | A12041 | |
| Resazurin | Sigma-Aldrich | R7017 | |
| Riboflavin | Alfa Aesar | A11764 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | 1613757 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher BioReagents | 7647-14-5 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Chemicals | S320 | |
| Sodium Molybdate Dihydrate (Na2MoO4•2H2O) | Acros organics | 206375000 | |
| Thiamine Hydrochloride (Thiamin-HCl) | Acros organics | 148991000 | |
| Trypticase | BD Biosciences | 211921 | |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161 | |
| Zinc Sulfate Heptahydrate (ZnSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
| 0.22 µm membrane filter | |||
| AMPure magnetic purification beads | Agencourt | ||
| Anaerobic chamber with incubatore | Forma anaerobic system, Thermo Scientific, USA | ||
| Bottle filter | Corning | ||
| Cheesecloth | |||
| Illumina MiSeq sequencer | Miseq reagent kit v3 | ||
| pH meter | |||
| Qiagen PowerFecal kit | Qiagen | ||
| Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software | |||
| Qubit-3 fluorimeter | InVitrogen | ||
| Vortex | Thermoscientific | ||
| Waters-2695 Alliance HPLC system | Waters Corporation |
References
- Shreiner, A. B., Kao, J. Y., Young, V. B. The gut microbiome in health and in disease. Current Opinion in Gastroenterology. 31 (1), 69-75 (2015).
- Xu, Z., Knight, R. Dietary effects on human gut microbiome diversity. British Journal of Nutrition. 113, 1-5 (2015).
- Jiang, C., Li, G., Huang, P., Liu, Z., Zhao, B. The gut microbiota and Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimers Disease. 58 (1), 1-15 (2017).
- Clemente, J. C., Ursell, L. K., Parfrey, L. W., Knight, R. The impact of the gut microbiota on human health: an integrative view. The Journal Cell. 148 (6), 1258-1270 (2012).
- Yadav, H., Jain, S., Marotta, F. Probiotics mediated modulation of gut flora might be biotherapeutical approach obesity and type 2 diabetes. Metabolomics : Open Access. 1 (3), 1-3 (2011).
- Ahmadi, S., et al. Dietary Polysaccharides in the Amelioration of Gut Microbiome Dysbiosis and Metabolic Diseases. Obesity and Control Theries: Open Access. 4 (3), (2017).
- Nagpal, R., et al. Obesity-Linked Gut Microbiome Dysbiosis Associated with Derangements in Gut Permeability and Intestinal Cellular Homeostasis Independent of Diet. Journal of Diabetes Research. , 1-9 (2018).
- Paul, B., et al. Influences of diet and the gut microbiome on epigenetic modulation in cancer and other diseases. Journal of Clinical Epigenetics. 7 (1), 112 (2015).
- O’mahony, S., Clarke, G., Borre, Y., Dinan, T., Cryan, J. Serotonin tryptophan metabolism and the brain-gut-microbiome axis. Journal of Behavioural Brain Research. 277, 32-48 (2015).
- Sharon, G., et al. Specialized metabolites from the microbiome in health and disease. Journal of Cell Metabolism. 20 (5), 719-730 (2014).
- Faber, T. A., Bauer, L. L., Price, N. P., Hopkins, A. C., Fahey, G. C. In vitro digestion and fermentation characteristics of temulose molasses, a coproduct of fiberboard production, and select temulose fractions using canine fecal inoculum. Journal of Agricultural Food Chemistry. 59 (5), 1847-1853 (2011).
- Bourquin, L. D., Titgemeyer, E. C., Fahey, G. C. Vegetable fiber fermentation by human fecal bacteria: cell wall polysaccharide disappearance and short-chain fatty acid production during in vitro fermentation and water-holding capacity of unfermented residues. Journal of Nutrition. 123 (5), 860-869 (1993).
- Nagpal, R., et al. Human-origin probiotic cocktail increases short-chain fatty acid production via modulation of mice and human gut microbiome. Scientific Reports. 8 (1), 12649 (2018).
- Nagpal, R., et al. Comparative microbiome signatures and short-chain fatty acids in mouse, rat, non-human primate and human feces. Frontiers in Microbiology. 9, 2897 (2018).
- Thangamani, S., Guinan, J., Wang, S., Yadav, H. Antibiotic-induced decreases in the levels of microbial-derived short-chain fatty acids promote gastrointestinal colonization of Candida albicans. bioRxiv. , 428474 (2018).
- Ahmadi, S., et al. Prebiotics from acorn and sago prevent high-fat diet-induced insulin resistance via microbiome-gut-brain axis modulation. The Journal of Nutritional Biochemistry. , (2019).
- Nagpal, R., et al. Gut Microbiome Composition in Non-human Primates Consuming a Western or Mediterranean Diet. Frontiers in Nutrition. 5, 28 (2018).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME Journal. 6 (8), 1621-1624 (2012).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
- Garcia-Villalba, R., et al. Alternative method for gas chromatography-mass spectrometry analysis of short-chain fatty acids in faecal samples. Journal of Seperation Science. 35 (15), 1906-1913 (2012).
- Lee, C. H., et al. Frozen vs Fresh Fecal Microbiota Transplantation and Clinical Resolution of Diarrhea in Patients With Recurrent Clostridium difficile Infection: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 315 (2), 142-149 (2016).
- Chen, M. -H., et al. In vitro fermentation of xylooligosaccharides produced from Miscanthus× giganteus by human fecal microbiota. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64 (1), 262-267 (2015).
- Cook, S., Sellin, J. Short chain fatty acids in health and disease. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 12 (6), 499-507 (1998).
- Rastelli, M., Knauf, C., Cani, P. D. Gut microbes and health: a focus on the mechanisms linking microbes, obesity, and related disorders. Obesity. 26 (5), 792-800 (2018).
- Zou, J., et al. Fiber-mediated nourishment of gut microbiota protects against diet-induced obesity by restoring IL-22-mediated colonic health. Cell Host & Microbe. 23 (1), e44 41-53 (2018).
- Dinan, T. G., Cryan, J. F. Gut–brain axis in 2016: Brain–gut–microbiota axis—mood, metabolism and behaviour. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (2), 69 (2017).
